KR100705755B1 - - Method for preparing ssDNA-SWNT hybrids - Google Patents

- Method for preparing ssDNA-SWNT hybrids Download PDF

Info

Publication number
KR100705755B1
KR100705755B1 KR1020050096096A KR20050096096A KR100705755B1 KR 100705755 B1 KR100705755 B1 KR 100705755B1 KR 1020050096096 A KR1020050096096 A KR 1020050096096A KR 20050096096 A KR20050096096 A KR 20050096096A KR 100705755 B1 KR100705755 B1 KR 100705755B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ssdna
nucleic acid
swnt
target nucleic
base sequence
Prior art date
Application number
KR1020050096096A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
백승현
황응수
최재붕
김영진
차창용
조승범
정혜진
홍상현
Original Assignee
성균관대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 성균관대학교산학협력단 filed Critical 성균관대학교산학협력단
Priority to KR1020050096096A priority Critical patent/KR100705755B1/en
Application granted granted Critical
Publication of KR100705755B1 publication Critical patent/KR100705755B1/en

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • B82B3/0009—Forming specific nanostructures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/08—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor
    • B01J19/10—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor employing sonic or ultrasonic vibrations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B32/00—Carbon; Compounds thereof
    • C01B32/15—Nano-sized carbon materials
    • C01B32/158—Carbon nanotubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B2202/00—Structure or properties of carbon nanotubes
    • C01B2202/20—Nanotubes characterized by their properties
    • C01B2202/22—Electronic properties

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 ssDNA-SWNT(single stranded DNA-single walled carbon nanotube: 단일쇄 DNA-단일벽 탄소 나노튜브) 하이브리드를 제조하는 방법 및 이를 이용한 표적 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing a single stranded DNA-single walled carbon nanotube (ssDNA-SWNT) hybrid and a method for detecting a target nucleic acid using the same.

단일벽 탄소 나노튜브(single walled carbon nanotube) Single walled carbon nanotube

Description

단일쇄 ＤＮＡ-단일벽 탄소 나노튜브 하이브리드를 제조하는 방법{Method for preparing ssDNA-SWNT hybrids}Method for preparing single-chain DNA-single-wall carbon nanotube hybrids {Method for preparing ssDNA-SWNT hybrids}

도 1은 본 발명에 따른 ssDNA-SWNT [single stranded DNA (ssDNA) - Single Walled Carbon Nanotube (SWNT)] 하이브리드의 결합 방법을 도식적으로 설명하는 흐름도이다.1 is a flow chart schematically illustrating a method for binding a single stranded DNA (ssDNA)-Single Walled Carbon Nanotube (SWNT) hybrid according to the present invention.

도 2는 ssDNA-SWNT 복합체를 통한 DNA 결합물에 대한 라만 스펙트럼을 나타낸다.2 shows Raman spectra for DNA conjugates via the ssDNA-SWNT complex.

본 발명은 ssDNA-SWNT(single stranded DNA - Single Walled Carbon Nanotube: 단일쇄 DNA-단일벽 탄소 나노튜브) 하이브리드를 제조하는 방법 및 이를 이용한 표적 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing a single stranded DNA-Single Walled Carbon Nanotube (ssDNA-SWNT) hybrid and a method for detecting a target nucleic acid using the same.

탄소 나노튜브는 하나의 탄소원자가 각각 세 개의 탄소원자에 의해 둘러싸여 결합하고있는 육각형 원자구조의 시크가 말려져 실린더 형태를 이루고 있는 구조를 지칭한다. 일반적으로, 탄소 나노튜브는 수 나노미터의 직경을 갖는 단일벽 나노튜브와 단일벽들이 동심원을 이루면서 여러 겹으로 중첩하여 형성되는 수십 나노미터 직경의 다중벽 나노튜브로 나뉜다. 나노튜브의 구조적 특징에 따라 특이한 물리적 성질을 나타낸다. 나노튜브는 기계적 강도가 강철에 비해 100배까지 될 수 있으며 길이는 2mm까지 될 수 dLT다. 나노튜브의 키랄성 또는 꼬임에 따라 금속 또는 반도체의 전기적 특성을 나타내기도 한다. 탄소 나노튜브는 전기 전도체 및 전자장 방출자로서 사용되어 왔다. 탄소 나노튜브의 전자적 특성은 부분적으로는 튜브의 직경 및 길이에 의해 결정된다.Carbon nanotubes refer to a structure in which the hexagonal chic structure in which one carbon atom is surrounded by three carbon atoms is bonded to form a cylinder. In general, carbon nanotubes are divided into single-walled nanotubes having a diameter of several nanometers and multi-walled nanotubes having a diameter of several tens of nanometers formed by overlapping several layers in concentric circles. Depending on the structural characteristics of the nanotubes, they exhibit unusual physical properties. Nanotubes can be up to 100 times the mechanical strength of steel and can be up to 2mm in length. Depending on the chirality or twisting of the nanotubes, they may also exhibit electrical properties of metals or semiconductors. Carbon nanotubes have been used as electrical conductors and field emitters. The electronic properties of the carbon nanotubes are determined in part by the diameter and length of the tubes.

특정 분석물의 다양한 리간드에의 결합을 검출하기 위한 분자 라벨로서 사용될 수 있는 다양한 태깅 분자를 찾고자 하는 연구의 일환으로서 탄소 나노튜브를 이용한 바이오마커, 바이오센서 등에 대한 연구가 진행 중이다.Biomarkers and biosensors using carbon nanotubes are underway as part of a search for various tagging molecules that can be used as molecular labels to detect binding of specific analytes to various ligands.

미국 특허 공개 제2003/0134267호는 탄소 나노튜브를 이용한 바이오분자 검출용 센서에 대해 기술하고 있고, 미국 특허 제6,821,730호에서는 탄소 나토튜브를 분자 라벨로 사용하여 핵산을 검출하는 방법에 대해 기술하고 있으며, 유럽 특허 공개 제 1 426 470 A1호에서는 2종의 바이오분자를 사용하여 나노튜브를 핵산에 결합시키는 방법에 대해 기술하고 있다.US Patent Publication No. 2003/0134267 describes a sensor for detecting biomolecules using carbon nanotubes, and US Pat. No. 6,821,730 describes a method for detecting nucleic acids using carbon natotubes as molecular labels. European Patent Publication No. 1 426 470 A1 describes a method for binding nanotubes to nucleic acids using two biomolecules.

본 발명은 탄소 나노튜브를 바이오분자와 결합시켜 탄소 나노튜브의 전자 특성을 이용한 바이오물질의 검출에 이용하고자 하는 것으로, 본 발명자는 종래의 바이오분자와 탄소 나노튜브와의 결합 방법을 개선하여 특정 링커를 사용하거나 결합제를 사용하지 않으면서 바이오분자와 탄소 나노튜브의 안정한 결합체를 제조하고자 하였다. 이러한 배경 하에서, 본 발명자는 특정 염기 서열을 갖는 바이오분자에 탄소 나노튜브를 초음파 처리하여 결합시킨 하이브리드를 바이오분자의 검출에 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.The present invention intends to use carbon nanotubes with biomolecules for the detection of biomaterials using the electronic properties of carbon nanotubes. The present inventors have improved the method of combining conventional biomolecules with carbon nanotubes to provide specific linkers. To prepare a stable combination of biomolecules and carbon nanotubes without using or using a binder. Under this background, the present inventors have completed the present invention by confirming that a hybrid obtained by sonicating carbon nanotubes to biomolecules having a specific base sequence can be used for detection of biomolecules.

본 발명의 목적은 ssDNA-SWNT 하이브리드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다,It is an object of the present invention to provide a method for preparing an ssDNA-SWNT hybrid,

본 발명의 또 다른 목적은 ssDNA-SWNT 하이브리드를 사용하여 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting a target nucleic acid using an ssDNA-SWNT hybrid.

본 발명은 ssDNA와 SWNT의 선택적 결합에 의한 ssDNA와 SWNT의 하이브리드(ssDNA-SWNT 하이브리드) 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a hybrid of ssDNA and SWNT (ssDNA-SWNT hybrid) by the selective combination of ssDNA and SWNT.

구체적으로, 본 발명은, (GT)n 염기 서열과 표적 핵산에 대한 프로브 염기 서열을 포함하는 ssDNA를 제조하고 이에 탄소 나노튜브를 결합시켜, ssDNA-SWNT 하이브리드를 제조하는 방법에 관한 것이다. Specifically, the present invention relates to a method for preparing an ssDNA comprising a (GT) n base sequence and a probe base sequence for a target nucleic acid and binding carbon nanotubes to the ssDNA-SWNT hybrid.

상기한 본 발명의 방법에 따라 표적 핵산과 결합하기 위한 프로브 염기 서열은 보존하면서 ssDNA에 안정하게 결합된 탄소 나노튜브를 갖는 ssDNA-SWNT 하이브리드가 제공된다..According to the method of the present invention described above, a ssDNA-SWNT hybrid having a carbon nanotube stably bound to ssDNA is provided while preserving a probe base sequence for binding to a target nucleic acid.

하나의 양태로서 본 발명은 In one aspect, the present invention

(1) (GT)n (n은 10 내지 45 의 정수이다) 염기 서열과 표적 핵산에 대한 프로브 염기 서열을 포함한 단일쇄(ssDNA)를 제조하는 단계;(1) preparing a single chain (ssDNA) comprising (GT) n (n is an integer from 10 to 45) base sequence and a probe base sequence for the target nucleic acid;

(2) 프로브 염기 서열에 상보적인 핵산을 어닐링시키는 단계;(2) annealing the nucleic acid complementary to the probe base sequence;

(3) 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)를 가하고 초음파를 처리하는 단계; 및(3) adding single-walled carbon nanotubes (SWNTs) and sonicating; And

(4) 프로브 염기 서열에 상보적인 핵산을 분리시키는 단계를 포함하여, ssDNA-SWNT 하이브리드를 제조하는 방법에 관한 것이다.(4) a method for producing an ssDNA-SWNT hybrid, comprising the step of isolating a nucleic acid complementary to the probe base sequence.

상기 단계 (1)에서 ssDNA의 총 염기 수는 40 내지 110, 바람직하게는 60 내지 90의 범위이다. 이러한 ssDNA 중 (GT)n 염기 서열의 총 염기 수는 20 내지 90, 바람직하게는 40 내지 70의 범위이다. (GT)n 염기 서열에서 n은 10 내지 45의 정수, 바람직하게는 20 내지 35의 정수이다. 상기 단계에서 사용되는 ssDNA는 당 분 야에 널리 공지된 올리고- 또는 폴리-뉴클레오타이드 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.The total base number of ssDNA in step (1) is in the range of 40 to 110, preferably 60 to 90. The total number of bases of the (GT) n base sequence in such ssDNA is in the range of 20 to 90, preferably 40 to 70. N in the (GT) n base sequence is an integer from 10 to 45, preferably an integer from 20 to 35. The ssDNA used in this step can be prepared using oligo- or poly-nucleotide synthesis methods well known in the art.

상기 단계 (2)는, 단계 (1)에서 제조된 ssDNA 서열 중 표적 핵산에 상보적인 염기 서열이 탄소 나토튜브와 결합하는 것으로부터 이를 보호하기 위해, 탄소 나토튜브와의 결합에 앞서 프로브 염기 서열에 상보적인 핵산을 결합(어닐링)시킨다. 따라서, 단계 (2)에서 사용되는 프로브 염기 서열에 상보적인 핵산은 (GT)n 염기 서열과 결합하거나 (GT)n 염기 서열과 탄소 나노튜브와의 결합을 방해하지 않아야 하며, 이의 염기 수는 바람직하게는 15 내지 35, 보다 바람직하게는 20 내지 30의 범위이다. 상기 단계 (2)의 어닐링은 온도 40 내지 80 ℃도, 바람직하게는 60 내지 65 ℃, 보다 60 ℃ 에서 5분 내지 10분 보다 바람직하게는 5분 동안 수행할 수 있다. 상기한 바와 같이 프로브 염기 서열에 상보적인 핵산을 표적 핵산에 대한 프로브 염기 서열과 결합시킴으로써 SWNT가 (GT)n 염기 서열에 결합될 수 있는 위치가 제공된다. In step (2), the base sequence complementary to the target nucleic acid in the ssDNA sequence prepared in step (1) is protected from binding to the carbon natotube, so as to protect it from the probe base sequence prior to binding with the carbon natotube. Complementary nucleic acid is joined (annealed). Thus, the nucleic acid complementary to the probe base sequence used in step (2) must not bind to (GT) n base sequence or interfere with the binding of (GT) n base sequence to carbon nanotubes, the base number of which is preferably Preferably in the range of 15 to 35, more preferably 20 to 30. The annealing of step (2) may be performed at a temperature of 40 to 80 ° C., preferably at 60 to 65 ° C., more preferably at 60 ° C. for 5 minutes to 10 minutes, more preferably for 5 minutes. As described above, the binding of the nucleic acid complementary to the probe base sequence with the probe base sequence for the target nucleic acid provides a position at which the SWNT can bind to the (GT) n base sequence.

상기 단계 (3)에서 사용하는 탄소 나노튜브는 단일벽 탄소 나노튜브이다. 현재 대량생산이 가능한 단일벽 탄소 나노튜브의 제조 방법은 전기방전법, 레이저증착법, 열분해증착법, 열화학기상증착법, 플라즈마화학기상증착법, HipCo 방법 등이 있다. 그 중에서 대표적인 HipCo 방법(High Pressure Carbon Monoxide)은 금속관에 연속적인 CO 가스를 흘리고 금속관내부의 온도와 가스의 압력을 조정하는 방 법으로 다양한 크기 및 지름으로 구성된 단일벽 탄소 나노튜브를 생산한다. 상기한 HipCo 방법에 따라 탄소 나노튜브가 약 450 mg/h 생산량으로 제조될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 구체적 실시에서 사용된 단일벽 탄소 나노튜브는 평균 지름 1.1 nm, 길이 1 μm, 97 % 고순도의 것이다. 상기한 방법에 따라 제조된 탄소 나노튜브는 금속성 나노튜브와 반도체성 나노튜브가 모두 존재한다. 고순도 반도체성 나노튜브를 금속성 나노튜브로 분리하는 방법은 질산 및 황산 등 여러 가지 산처리를 통해 유도체화 하는 방법을 이용할 수 있다. 반도체성 나노튜브의 경우 근적외선 형광특성 및 라만특성으로 나노바이오영역에서 마커 및 센서로 활용할 수 있다. The carbon nanotubes used in step (3) are single-walled carbon nanotubes. Current production methods of single-walled carbon nanotubes that can be mass-produced include electric discharge, laser deposition, pyrolysis deposition, thermochemical vapor deposition, plasma chemical vapor deposition, and HipCo method. Among them, the representative HipCo method (High Pressure Carbon Monoxide) is a method of flowing a continuous CO gas through a metal tube and adjusting the temperature and pressure of the gas inside the metal tube to produce single-walled carbon nanotubes of various sizes and diameters. According to the HipCo method described above, carbon nanotubes may be prepared at a yield of about 450 mg / h. The single-walled carbon nanotubes used in the specific practice according to the method of the invention are of average diameter 1.1 nm, length 1 μm, 97% high purity. Carbon nanotubes prepared according to the method described above include both metallic nanotubes and semiconducting nanotubes. Separation of high-purity semiconducting nanotubes into metallic nanotubes may be accomplished by derivatization through various acid treatments such as nitric acid and sulfuric acid. Semiconductor nanotubes can be used as markers and sensors in the nanobio area due to their near infrared fluorescence and Raman properties.

본 발명의 목적상, 탄소 나노튜브는 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)이며, HipCo 방법으로 제조된 것이 바람직하게 사용된다. 단계 (3)에서 초음파 처리는 약 3W 내지 8W, 바람직하게는 5W 의 초음파기에서 온도상승을 방지하기 위해 얼음물 중에서 3시간 내지 6시간, 바람직하게는 5시간 동안에서 수행할 수 있다. 상기한 초음파 처리에 의해 SWNT가 (GT)n 염기 서열에 결합된다. 단계 (3)에 따라 단계 (1)의 ssDNA에 SWNT와 프로브 염기 서열에 상보적인 핵산이 하이브리드화된 결합체가 생성된다. For the purposes of the present invention, carbon nanotubes are single-walled carbon nanotubes (SWNTs), and those made by the HipCo method are preferably used. The sonication in step (3) can be carried out in ice water for 3 hours to 6 hours, preferably 5 hours in order to prevent the temperature rise in an ultrasonicator of about 3W to 8W, preferably 5W. The sonication described above binds the SWNTs to the (GT) n base sequence. According to step (3), a conjugate is obtained in which the nucleic acid complementary to the SWNT and the probe base sequence is hybridized to the ssDNA of step (1).

상기 단계 (4)는 단계 (3)에서 생성된 결합체로부터 프로브 염기 서열에 상보적인 핵산을 변성(denaturation) 과정을 통해 분리시킨다. 변성 과정은 예를 들 어 온도 60 내지 65℃ 및 5 내지 10분 동안 수행할 있다. 그 결과, 표적 핵산에 대한 프로브 염기 서열이 노출됨으로써 상보적 염기 서열을 선택적으로 결합할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 “ssDNA-SWNT 하이브리드”는 상기한 단계 (1)의 ssDNA가 SWNT와 하이브리드화를 통해 결합된 결합체를 의미한다.Step (4) separates the nucleic acid complementary to the probe base sequence from the conjugate generated in step (3) through a denaturation process. The modification process can be carried out, for example, at a temperature of 60 to 65 ° C. and for 5 to 10 minutes. As a result, the probe base sequence for the target nucleic acid can be exposed to selectively bind the complementary base sequence. As used herein, the term “ssDNA-SWNT hybrid” refers to a conjugate in which ssDNA of step (1) is coupled to SWNT through hybridization.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 방법으로 제조된 ssDNA-SWNT 하이브리드에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to an ssDNA-SWNT hybrid prepared by the above method.

상기한 본 발명의 방법에 따라 제조되는 ssDNA-SWNT 하이브리드는 젤 전기영동법, 컬럼 크로마토그래피 (column chromatography) 방법 등 으로 분리할 수 있으며, 이렇게 분리된 ssDNA-SWNT 하이브리드는 탄소 나노튜브의 물리적 특성을 이용하여 나노-바이오 마커, 센서 등에 사용될 수 있다. The ssDNA-SWNT hybrid prepared according to the method of the present invention can be separated by gel electrophoresis, column chromatography, etc., and the separated ssDNA-SWNT hybrid uses physical properties of carbon nanotubes. Nano-bio markers, sensors and the like.

따라서, 또 다른 양태로서 본 발명은 상기한 ssDNA-SWNT 하이브리드를 포함하는 바이오센서 또는 추적 마커에 관한 것이다.Thus, as another aspect, the present invention relates to a biosensor or tracking marker comprising the ssDNA-SWNT hybrid described above.

사람의 혈액이나 세포는 근적외선 지역에서 흡광 계수가 작기 때문에 탄소 나노튜브의 근적외선 형광신호를 이용하면 세포에 이식되어 사용될 수 있는 비침습적 광학 나노-바이오 센서를 개발할 수 있다. 나노튜브가 가지는 전자는 전부 표면에 위치하므로 주변환경에 따라 형광신호를 민감하게 변화시킨다. 나노튜브의 형광신호를 이용하여, 효소, 예를 들어 포도당 효소의 농도 측정에 관한 센서, 줄기세포 추적에 관한 마커 등과 같은 다양한 바이오응용연구에 적용할 수 있다.Since human blood or cells have a small absorption coefficient in the near infrared region, the near-infrared fluorescence signal of carbon nanotubes can be used to develop non-invasive optical nano-bio sensors that can be implanted into cells. The electrons of the nanotubes are all located on the surface, so the fluorescent signal is sensitively changed depending on the surrounding environment. The fluorescent signals of nanotubes can be used in various bioapplication studies such as sensors for measuring the concentration of enzymes, for example glucose enzymes, markers for tracking stem cells, and the like.

또 다른 양태로서, 본 발명은 In another aspect, the present invention

(1) 상기한 방법으로 제조된 ssDNA-SWNT 결합체를 표적 핵산과 결합시키는 단계 및 (1) binding the ssDNA-SWNT conjugate prepared by the above method with a target nucleic acid, and

(2) 표적 핵산과 결합된 ssDNA-SWNT 하이브리드를 검출하는 단계를 포함하여, 표적 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.(2) a method for detecting a target nucleic acid, comprising detecting an ssDNA-SWNT hybrid in association with the target nucleic acid.

여러 가지 바이오분자의 DNA 염기서열에 대한 정보를 알면 이를 검출할 수 있는 프로브 서열을 고안하여 ssDNA를 제조할 수 있으며, 이를 본 발명의 방법에 따라 ssDNA-SWNT 하이브리드를 제조함으로써 다양한 시료 중에 포함되어 있는 표적 핵산의 검출에 사용하여 이를 특이적으로 검출할 수 있다.Knowing the information about the DNA sequencing of various biomolecules, ssDNA can be prepared by devising a probe sequence capable of detecting the same, and the ssDNA-SWNT hybrid is prepared according to the method of the present invention, which is included in various samples. It can be used to detect target nucleic acids to specifically detect them.

상기 단계 (1)에서, ssDNA-SWNT 결합체와 표적 핵산과의 결합은 예를 들어 닷 블롯 과정을 통해 수행할 수 있다. 하나의 구체적 예시로서, 표적 핵산이 포함된 완충 용액 (5 x SSC, 0.1% sodium-lauroylsarcosone, 0.02% SDS, 2% blocking reagent)을 니트로셀룰로오스 막 (세공 크기: 0.2um, 결합력:100ug/cm2)에 가교 결합(cross linking)시키고 3 내지 5분 동안 울트라 자외선 처리를 하고, ssDNA-SWNT 하이브리드 용액을 막 위에 로딩시킨 후, 40 내지 55℃에서 바람직하게는 45 ℃에서 2 내지 4 시간 동안 바람직하게는 2시간 동안 인큐베이션 하여 결합시킬 수 있다. 이어서, 세척 완충액으로 3 내지 5회에 걸쳐 불순물들을 제거하여 선택적 결합이 이루어진 ssDNA-SWNT 결합체와 표적핵산만 막 위에 남길 수 있다.In step (1), the binding of the ssDNA-SWNT conjugate with the target nucleic acid may be performed by, for example, a dot blot process. As one specific example, a buffer solution (5 x SSC, 0.1% sodium-lauroylsarcosone, 0.02% SDS, 2% blocking reagent) containing a target nucleic acid was added to a nitrocellulose membrane (pore size: 0.2 um, binding strength: 100 ug / cm 2). Cross-linking) and ultra-ultraviolet treatment for 3 to 5 minutes and loading the ssDNA-SWNT hybrid solution onto the membrane, preferably at 40 to 55 ° C., preferably at 45 ° C. for 2 to 4 hours. Can be combined by incubating for 2 hours. Subsequently, impurities can be removed three to five times with wash buffer, leaving only the ssDNA-SWNT conjugate and target nucleic acid on which the selective binding has been made.

상기 단계 (2)에서, 본 발명에 따라 ssDNA-SWNT 하이브리드와 시료 중의 핵산과의 결합은 탄소 나노튜브가 갖는 물리적 특성을 이용하여 라만 스펙트로스코피, 형광 스펙트로스코피 등의 분광학적인 방법으로 검출할 수 있다. 라만 스펙트로스코피 방법을 이용하는 경우, 미세량의 탄소 나노튜브를 금속성 탄소 나노튜브 또는 반도체성 나노튜브의 여부를 불문하고 1590cm-1 라만주파수에서 G 피이크로 존재여부를 검출할 수 있다. 달리는, 532cm-1, 633cm-1 , 785cm-1 레이저 여기 (excitation)을 이용하여 금속성 또는 반도체성 나노튜브의 특성을 검출할 수 있다. 단일 개수의 탄소 나노튜브도 라만 스펙트로스코피 방법을 이용하면 검출할 수 있음이 공지되어 있으며, 형광 스펙트로스코피 방법을 이용하는 경우, 탄소 나노튜브의 근적외선 근처에서 발생하는 강렬한 형광 특성으로 반도체성 나노튜브의 존재 여부를 검출할 수 있다.In the step (2), the binding of the ssDNA-SWNT hybrid and the nucleic acid in the sample according to the present invention can be detected by spectroscopic methods such as Raman spectroscopy, fluorescent spectroscopy, etc. using physical properties of carbon nanotubes. . In the case of using the Raman spectroscopy method, it is possible to detect the presence of fine carbon nanotubes as G peaks at 1590 cm −1 Raman frequency, regardless of whether they are metallic carbon nanotubes or semiconducting nanotubes. Running, 532cm -1, 633cm -1, 785cm -1, using a laser pumping (excitation) can detect the characteristics of the metallic or semiconducting nanotubes. It is known that a single number of carbon nanotubes can be detected using the Raman spectroscopy method. In the case of using the fluorescence spectroscopy method, the presence of semiconducting nanotubes is due to the intense fluorescence that occurs near the near infrared rays of the carbon nanotubes. It can be detected.

본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 하기 실시예를 제공한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명이 이로써 한 정되는 것은 아니다.In order to illustrate the invention in more detail the following examples are provided. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the present invention is not limited thereto.

실시예Example 1:  One: ssDNAssDNA -- SWNTSWNT 결합체의 제조 Preparation of the conjugate

(GT)n 염기서열을 갖는 ssDNA와 사람 염색체 21번에 고유한 염기서열을 갖는 ssDNA로 구성된 ssDNA(서열번호 1)(GENOTECH Inc.)를 제조하였다. 또한, 표적 DNA에 상응하는 DNA(서열번호 2)(GENOTECH Inc.)를 준비하였다:SsDNA (SEQ ID NO: 1) (GENOTECH Inc.), which consists of ssDNA having the (GT) n base sequence and ssDNA having the unique sequence on human chromosome 21, was prepared. In addition, DNA (SEQ ID NO: 2) corresponding to the target DNA (GENOTECH Inc.) was prepared:

서열번호 1 : SEQ ID NO: 1

5'-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAAAAGCCCCGCCTTGATGAAG-3'5'-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAAAAGCCCCGCCTTGATGAAG-3 '

서열번호 2 :SEQ ID NO 2:

5'-CTTCATCAAGGCGGGGCT-3'5'-CTTCATCAAGGCGGGGCT-3 '

서열번호 1(444.2 ug, 32.3 nmol)의 염기서열과 서열번호 2 (334.4 ug, 57.6 nmol) 의 염기서열을 200 L의 TE 버퍼용액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 넣은 다음 60 ℃에서 5분간 동안 어닐링 하였다. The base sequence of SEQ ID NO: 1 (444.2 ug, 32.3 nmol) and the base sequence of SEQ ID NO: 2 (334.4 ug, 57.6 nmol) were added to 200 L of TE buffer solution (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). Then annealed at 60 ° C. for 5 minutes.

어닐링 복합체와 약 0.3mg 의 SWNT 분말(Carbon Nanotechnology, Inc.)을 튜브에 넣은 다음 튜브를 얼음물 환경에서 3W에서 5 시간 동안 초음파처리 하였다. 이어서, 13000g에서 30분 동안 원심분리 과정을 2회 수행한 후, 90 %의 상층액을 걸러내었다. 분리된 상층액을 온도 60 ℃ 내지 65 ℃ 및 5 내지 10분 동안 변성 과정을 통해 서열번호 2의 염기 서열을 분리시켜 ssDNA-SWNT 하이브리드를 제조하였다. The annealing composite and about 0.3 mg of SWNT powder (Carbon Nanotechnology, Inc.) were placed in a tube, and the tube was sonicated at 3 W for 5 hours in an ice water environment. Subsequently, two centrifugation processes were performed for 30 minutes at 13000 g, and then 90% of the supernatant was filtered out. The ssDNA-SWNT hybrid was prepared by separating the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 through the denaturation process of the separated supernatant at a temperature of 60 ℃ to 65 ℃ and 5 to 10 minutes.

상기 제조된 ssDNA-SWNT 하이브리드는 사람 염색체 21번에 고유하게 존재하는 염기서열을 포함하고 있어 이에 상보적인 서열의 검출에 이용될 수 있다. Since the prepared ssDNA-SWNT hybrid includes a nucleotide sequence uniquely present on human chromosome 21, it can be used for detection of a sequence complementary thereto.

실시예Example 2:  2: 프로브로의To probe 이용 Use

상기 실시예 1에서 제조된 ssDNA-SWNT 하이브리드를 이용하여 사람 세포 DNA에 존재하는 상보적인 염기서열을 서던 블럿 방법으로 검색하였다. 염기서열번호 2가 포함된 사람 섬유아세포 DNA(FLF, Geno technology,Inc.)를 준비하였다.Using the ssDNA-SWNT hybrid prepared in Example 1, the complementary nucleotide sequence present in human cell DNA was searched by Southern blot method. Human fibroblast DNA (FLF, Geno technology, Inc.) containing SEQ ID NO: 2 was prepared.

표적 DNA가 포함된 버퍼용액 (5 x SSC, 0.1% sodium-lauroylsarcosone, 0.02% SDS, 2% blocking reagent)를 니트로셀룰로오스 막에 로딩시킨 다음, ssDNA-SWNT 하이브리드용액과 45 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하여 결합시켰다. 이어서, 세척 완충액으로 3회에 걸쳐 불순물들을 제거한 후, 라만 측정하였다(Renishaw, MicroRaman). 1590cm-1 라만 주파수에서 G-피이크를 확인함으로써 ssDNA-SWNT 하이브리드의 결합을 확인하였다(도 2).A buffer solution containing the target DNA (5 x SSC, 0.1% sodium-lauroylsarcosone, 0.02% SDS, 2% blocking reagent) was loaded onto the nitrocellulose membrane, and then incubated with ssDNA-SWNT hybrid solution at 45 ° C for 2 hours. Combined. The impurities were then removed three times with wash buffer, followed by Raman measurements (Renishaw, MicroRaman). The binding of the ssDNA-SWNT hybrid was confirmed by confirming G-peak at 1590 cm −1 Raman frequency (FIG. 2).

사람 섬유아세포의 DNA에 존재하는 DNA의 양에 따라 탄소나노튜브의 G-피크가 검출되었으며, 음성 대조구로 사용한 대장균(E.coli)의 DNA에 대해서는 G-피크가 전혀 검출되지 않았다.G-peaks of carbon nanotubes were detected according to the amount of DNA present in the DNA of human fibroblasts, and no G-peaks were detected for the DNA of E. coli used as a negative control.

본 발명에 따른 방법으로 ssDNA-SWNT 하이브리드를 높은 생산율로 대량 생산할 수 있으므로, 이를 사용하여 바이오 분야, 면역 및 의학 분야에서 현재 사용되는 고가의 측정 방법들을 대체할 수 있을 것으로 전망된다.Since the method according to the present invention can mass-produce ssDNA-SWNT hybrids at high production rates, it is expected that this method can be used to replace expensive measurement methods currently used in the fields of biotechnology, immunology and medicine.

서열목록 전자파일 첨부 Attach sequence list electronic file

Claims (10)

(1) (GT)n(n은 10 내지 45의 정수이다) 염기 서열과 표적 핵산에 대한 프로브 염기 서열을 갖는 단일쇄 DNA(single stranded DNA: ssDNA)를 제조하는 단계;(1) preparing a single stranded DNA (ssDNA) having a (GT) n (n is an integer of 10 to 45) base sequence and a probe base sequence for a target nucleic acid; (2) 프로브 염기 서열에 상보적인 핵산을 어닐링시키는 단계;(2) annealing the nucleic acid complementary to the probe base sequence; (3) 단계 (2)의 혼합물에 단일벽 탄소 나노튜브(single walled carbon nanotube: SWNT)를 가하고 초음파를 처리하는 단계; 및 (3) adding single walled carbon nanotubes (SWNTs) to the mixture of step (2) and sonicating; And (4) 단계 (3)에서 생성된 단일벽 탄소 나노튜브 및 이에 결합된 핵산 결합체로부터 변성(denaturation) 과정을 통해 프로브 염기 서열에 상보적인 핵산을 분리시키는 단계를 포함하는 표적 핵산 검출용 ssDNA-SWNT 하이브리드를 제조하는 방법.(4) ssDNA-SWNT for detecting a target nucleic acid, comprising the step of separating the nucleic acid complementary to the probe base sequence through a denaturation process from the single-wall carbon nanotube produced in step (3) and the nucleic acid conjugate bound thereto How to make a hybrid. 제1항에 있어서, n이 20 내지 35의 정수인 방법.The method of claim 1 wherein n is an integer from 20 to 35. 제1항에 있어서, 단계 (2)에서 온도 60 ℃ 내지 65 ℃ 및 5 내지 10분 동안 어닐링시키는 방법.The process according to claim 1, wherein the annealing is carried out in step (2) at a temperature of 60 ° C to 65 ° C and for 5 to 10 minutes. 제1항에 있어서, 단계 (3)에서 3W 내지 8W 및 3시간 내지 6시간 동안 초음파 처리하는 방법.The method of claim 1, wherein in step (3), sonication is performed for 3W to 8W and for 3 to 6 hours. 제1항에 있어서, SWNT가 HipCo (High Pressure Carbon Monoxide) 방법으로 제조된 나노튜브인 방법.The method of claim 1, wherein the SWNTs are nanotubes prepared by the HipCo (High Pressure Carbon Monoxide) method. 제 1항의 방법으로 제조된 표적 핵산 검출용 ssDNA-SWNT 하이브리드. SsDNA-SWNT hybrid for detecting a target nucleic acid prepared by the method of claim 1. 제 1항의 방법으로 제조된 ssDNA-SWNT 하이브리드를 포함하는 표적 핵산 검출용 바이오센서. A biosensor for detecting a target nucleic acid comprising an ssDNA-SWNT hybrid prepared by the method of claim 1. 제 1항의 방법으로 제조된 ssDNA-SWNT 하이브리드를 포함하는 표적 핵산 검출용 추적 마커. Tracking marker for detecting a target nucleic acid comprising an ssDNA-SWNT hybrid prepared by the method of claim 1. (1) 제 1항의 방법으로 제조된 ssDNA-SWNT 결합체를 표적 핵산과 결합시키는 단계 및 (1) binding the ssDNA-SWNT conjugate prepared by the method of claim 1 with a target nucleic acid, and (2) 표적 핵산과 결합된 ssDNA-SWNT 하이브리드를 라만 스펙트로스코피 또는 근적외선 형광 스펙트로스코피 방법으로 검출하는 단계를 포함하는, 표적 핵산을 검출하는 방법. (2) A method for detecting a target nucleic acid, comprising detecting the ssDNA-SWNT hybrid in combination with a target nucleic acid by Raman spectroscopy or near infrared fluorescence spectroscopy. 삭제delete
KR1020050096096A 2005-10-12 2005-10-12 - Method for preparing ssDNA-SWNT hybrids KR100705755B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050096096A KR100705755B1 (en) 2005-10-12 2005-10-12 - Method for preparing ssDNA-SWNT hybrids

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050096096A KR100705755B1 (en) 2005-10-12 2005-10-12 - Method for preparing ssDNA-SWNT hybrids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100705755B1 true KR100705755B1 (en) 2007-04-09

Family

ID=38161402

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050096096A KR100705755B1 (en) 2005-10-12 2005-10-12 - Method for preparing ssDNA-SWNT hybrids

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100705755B1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100902081B1 (en) 2007-05-15 2009-06-09 삼성전자주식회사 Method for positioning carbon nanotubes between electrodes, biomolecule detector based on carbon nanotube-probe complexes and detection method using the same
WO2013172579A1 (en) * 2012-05-14 2013-11-21 서울대학교산학협력단 Nanoprobe, and method for detecting target material using same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040132072A1 (en) * 2002-11-21 2004-07-08 Ming Zheng Dispersion of carbon nanotubles by nucleic acids

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040132072A1 (en) * 2002-11-21 2004-07-08 Ming Zheng Dispersion of carbon nanotubles by nucleic acids

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nature materials, 2((5). 338-342(2003).
Science, 302(5650), 1545-1548(2003).

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100902081B1 (en) 2007-05-15 2009-06-09 삼성전자주식회사 Method for positioning carbon nanotubes between electrodes, biomolecule detector based on carbon nanotube-probe complexes and detection method using the same
WO2013172579A1 (en) * 2012-05-14 2013-11-21 서울대학교산학협력단 Nanoprobe, and method for detecting target material using same
KR101460439B1 (en) 2012-05-14 2014-11-12 서울대학교산학협력단 Nanoprobe and method for detecting target substance using the same
US9885716B2 (en) 2012-05-14 2018-02-06 Snu R&Db Foundation Nanoprobe and method for detecting target analyte using the same

Similar Documents

Publication Publication Date Title
He et al. A graphene nanoprobe for rapid, sensitive, and multicolor fluorescent DNA analysis
Huang et al. An ultrasensitive electrochemical DNA biosensor based on graphene/Au nanorod/polythionine for human papillomavirus DNA detection
Achadu et al. Plasmonic/magnetic molybdenum trioxide and graphitic carbon nitride quantum dots-based fluoroimmunosensing system for influenza virus
Kim et al. Fabrication of MERS-nanovesicle biosensor composed of multi-functional DNA aptamer/graphene-MoS2 nanocomposite based on electrochemical and surface-enhanced Raman spectroscopy
Xue et al. Cyclodextrin functionalized graphene–gold nanoparticle hybrids with strong supramolecular capability for electrochemical thrombin aptasensor
Zhou et al. A novel electrochemiluminescent immunosensor based on the quenching effect of aminated graphene on nitrogen-doped carbon quantum dots
Degliangeli et al. Nanotechnology‐based strategies for the detection and quantification of MicroRNA
Hu et al. Nucleic acid-functionalized nanomaterials for bioimaging applications
Ding et al. Fluorescent detection of Mucin 1 protein based on aptamer functionalized biocompatible carbon dots and graphene oxide
Yun et al. Graphene oxide-based fluorescent “turn-on” strategy for Hg2+ detection by using catalytic hairpin assembly for amplification
AU2003304085A1 (en) Nanocylinder-modified surfaces
Wang et al. Fabrication of fluorescent biosensing platform based on graphene oxide-DNA and their application in biomolecule detection
Wang et al. Integrating dye-intercalated DNA dendrimers with electrospun nanofibers: a new fluorescent sensing platform for nucleic acids, proteins, and cells
Chen et al. A novel exonuclease III aided amplification method for sensitive nucleic acid detection based on single walled carbon nanotube induced quenching
Ma et al. Nanomaterial-based biosensors for DNA methyltransferase assay
Qi et al. Graphite nanoparticle as nanoquencher for 17β-estradiol detection using shortened aptamer sequence
Sun et al. Magnetic-enhanced fluorescence sensing of tumor miRNA by combination of MNPs@ PDA with duplex specific nuclease
Wang et al. Recent applications of carbon nanomaterials for microRNA electrochemical sensing
Zhu et al. Turn-on fluorescent assay based on purification system via magnetic separation for highly sensitive probing of adenosine
Zhou et al. Advances in DNA/RNA detection using nanotechnology
Jiang et al. MicroRNA-21 electrochemiluminescence biosensor based on Co-MOF–N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol/Ti3C2T x composite and duplex-specific nuclease-assisted signal amplification
KR100705755B1 (en) - Method for preparing ssDNA-SWNT hybrids
US10323270B2 (en) Kit for detecting nucleic acid and method for detecting nucleic acid
Wang et al. Laser induced graphene electrochemical aptasensor based on tetrahedral DNA for ultrasensitive on-site detection of microcystin-LR
CN116685848A (en) Single molecule nanoparticle nanowires for molecular electronic sensing

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee