KR100704776B1 - 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있고, 외래메발론산 경로에 관련되는 모든 효소를 코딩하는 ｄｎａ로형질전환된 숙주세포를 이용한 메발론산 경로 및비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 모두를 저해하는물질을 탐색하는 방법 - Google Patents

내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있고, 외래메발론산 경로에 관련되는 모든 효소를 코딩하는 ｄｎａ로형질전환된 숙주세포를 이용한 메발론산 경로 및비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 모두를 저해하는물질을 탐색하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 하나 이상의 유전자가 불활성화되어 있는 숙주세포에 메발론산 경로를 갖는 세포의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입시킴으로써 얻어지는, 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 외래 메발론산 경로를 가지고 있고, 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있는 형질전환된 숙주세포 및 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포를 시험 물질의 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는, 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 둘 모두를 저해하는 물질을 탐색하는 방법을 제공한다.
메발론산, 메발론산 경로, 비메발론산 경로

Description

내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있고, 외래 메발론산 경로에 관련되는 모든 효소를 코딩하는 ＤＮＡ로 형질전환된 숙주세포를 이용한 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 모두를 저해하는 물질을 탐색하는 방법{Method for screening a substance capable of inhibiting either or both of the mevalonate pathway and nonmevalonate pathway using a host cell transformed with a DNA encoding all enzymes associated with a foreign mevalonate pathway and having an inactivated indogenous nonmevalonate pathway}
도 1은 IPP의 생합성 경로로서 메발론산 경로 및 비메발론산 경로를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 메발론산 대장균 ΔispC 균주를 포스미도마이신 또는 심바스타틴 의 존재하에서 배양한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있고, 외래 메발론산 경로에 관련된 모든 효소를 코딩하는 DNA가 도입된 형질전환된 숙주세포를 이용한 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 둘 모두를 저해하는 물질을 탐 색하는 방법에 관한 것이다.
이소프레노이드 (isoprenoid)는 공통의 생합성 기원 즉, 단일 전구체인 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)를 갖는 아주 다양한 천연 산물의 군이다. 이소프레노이드 천연산물의 군에는 5 탄소화합물인 IPP로부터 생합성적으로 파생되는 모든 물질이 포함된다. 이소프레노이드는 테르핀 (terpene) 또는 테르페노이드 (terpenoid)라고도 한다.
이소프레노이드의 생합성 경로로서 메발론산 경로 및 비메발론산 경로가 알려져 있다. 메발론산 경로는 대부분의 진핵생물 (예, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)), 식물 세포의 세포질, 일부 박테리아 (예, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 및 파라코커스 제악산티니파시엔스 (Paracoccus zeaxanthinifaciens)) 및 말라리아 세포에 존재하는 것으로 알려져 있다. 비메발론산 경로는 대부분의 박테리아 (예, 대장균), 식물 세포의 색소체 (plastid)에 존재한다. 식물 세포와 방선균은 이들 두 가지 경로를 모두 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
종래 메발론산 경로에 관련된 여러 단계들이 알려져 있었다. 종래 알려진 메발론산 경로는, 아세토아세틸-CoA 티올라제, HMG-CoA 신타제, HMG-CoA 리덕타제, MVA 키나제, MVAP 키나제, MVAPP 데카르복실라제 및 IPP 이소머라제에 의한 반응 단계로 구성된다 (도 1A 참조). 그람 양성 박테리아인 스트렙토코커스 뉴모니애에서는 상기 효소는 각각 atoB, mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2 및 mvaD 유전자에 의하여 코딩되는 것으로 알려져 있다. 또한, mvaK1, mvaK2 및 mvaD 유전자들 (Genbank accession No. AF290098)과 mvaS 및 mvaA 유전자들 (Genbank accession No. AF290099)은 각각 하나의 오페론으로 염색체 상에 존재한다. 또한, 그람 음성 박테리아인 파라코커스 제악산티니파시엔스 (Paracoccus zeaxanthinifaciens)에 있어서, 아세토아세틸-CoA로부터 IPP 합성에 관련되는 효소는 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2 및 mvaD 유전자에 의하여 코딩되고, 이들 모두 하나의 오페론 (Genbank accession No. AJ431696)을 형성하는 것으로 알려져 있다. 또한, 진핵 세포인 사카로마이세스 세레비지애에 있어서, 아세토아세틸-CoA로부터 IPP 합성에 관련되는 효소는 HMGS (Genbank accession No. X96617), HMG1 (Genbank accession No. M22002), ERG12 (Genbank accession No. X55875), ERG8 (Genbank accession No. M63648) 및 ERG19 (Genbank accession No. X97557) 유전자에 의하여 코딩되며, 각각 별도의 오페론에 존재하는 것으로 알려져 있다.
종래 비메발론산 경로에 관련된 여러 단계들이 또한 알려져 있었다. 종래 알려진 비메발론산 경로는, DXP 신타제, DXP 리덕토이소머라제, CDP-ME 신타제, CDP-ME 키나제, MECP 신타제, HMBPP 신타제 및 HMBPP 리덕타제에 의한 반응 단계로 구성된다 (도 1B 참조). 그람 음성 박테리아인 대장균에서는 상기 효소는 각각 dxs (Genbank accession No. AF035440), ispC (Genbank accession No. AB013300), ispD (Genbank accession No. AF230736), ispE (Genbank accession No. AF216300), ispF (Genbank accession No. AE000219), ispG (Genbank accession No. AE000338) 및 ispH (Genbank accession No. AE000113) 유전자에 의하여 코딩되는 것으로 알려져 있다.
메발론산 경로 또는 비메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 물질을 탐색하는 방법은 각 경로에 관여하는 효소를 분리하고, 분리된 효소와 시험 물질을 인 비트로 (in vitro)에서 반응시켜 효소 활성을 저해하는지 여부를 결정함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 메발론산 경로 또는 비메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 물질을 탐색하는 방법은 상기 메발론산 경로 또는 비메발론산 경로에 관련되는 효소를 코딩하는 유전자에 변이를 갖는 변이 균주를 이용함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 국제특허 공개 제WO02/31120호에는 신규한 항생제 및 제초제를 탐색하는데 사용될 수 있는 형질도입된 박테리아 숙주세포 및 그를 이용한 항생제 및 제초제를 탐색하는 방법이 개시되어 있다. 상기 형질도입된 박테리아 숙주세포는 비메발론산 경로의 파괴된 제1 내재적 유전자 및 상기 파괴된 제1 유전자를 기능적으로 대신하는 전이유전자 (transgene)을 포함한다. 상기 형질도입된 박테리아 숙주세포에는 메발론산 (MVA) 경로의 필수적인 유전자를 포함하는 미니 오페론이 또한 도입될 수 있다. 상기 형질도입된 박테리아 숙주세포를 이용하여 항생제 및 제초제를 탐색하는 방법은 상기 파괴된 제1 유전자를 구제하는 화학적 보충물을 포함하는 배지 중에서 상기 균주를 배양하는 단계를 포함한다. 이 방법에 의하면 상기 형질도입된 박테리아 숙주세포를 시험 물질의 존재하에서 배양함으로써 비메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 항생제 및 제초제를 탐색할 수 있다. 그러나, 비메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 물질만을 탐색할 수 있으며, 배지에는 항상 상기 파괴된 제1 유전자를 구제할 수 있는 화학적 보충물과 상기의 미니 오페론의 작용을 위한 메발론산을 포함하고 있어야 한다. 미국특허 공개 제2003/0170662호에는 IPP와 DMAPP의 생합성 경로로서 메발로네이트 경로 및 비메발로네이트 경로 모두를 사용할 수 있는 개체를 이용함으로써 비메발로네이트 경로를 특이적으로 저해하는 물질을 탐색하는 방법을 개시하고 있다. 상기 메발로네이트 경로 및 비메발로네이트 경로 모두를 사용할 수 있는 개체는 메발론산의 존재하에서만 메발로네이트 경로를 사용할 수 있는 개체 또는 부존재하에서도 메발로네이트 경로를 사용할 수 있는 개체들이다. 구체적으로 상기 탐색 방법은 메발론산의 존재하에서만 메발로네이트 경로를 이용할 수 있는 개체를 메발론산의 존재 또는 부존재하에서 시험물질을 포함하는 배지 중에서 배양하고, 메발론산의 존재하에서는 생육하나 메발론산 부존재하에서는 생육하지 않는 물질을 비메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 물질로 선발한다. 또한, 상기 탐색 방법은 메발론산의 부재하에서도 메발로네이트 경로를 이용할 수 있는 형질전환 개체와 비메발론산 경로만을 갖는 야생균주를 메발론산의 부존재하에서 시험물질을 포함하는 배지 중에서 배양하고, 메발론산 경로가 없는 야생균주의 생육만을 저해하는 물질을 비메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 물질로 선발한다. 본 방법에 의하면, 한 종류의 세포를 이용하여 비메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 물질을 탐색할 경우에는 메발론산을 배지에 첨가해야하고 두 종류의 세포를 이용하는 경우에는 메발론산을 첨가할 필요는 없다. 그러나, 본 방법에 의하면 두가지 경우에서 모두 비메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 물질만을 탐색할 수 있다.
따라서, 상기한 종래 기술에 의하더라도 비메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 물질를 탐색하는 동시에 메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 물질을 탐색하 는 방법에 대한 요구는 여전히 남아 있다.
본 발명의 목적은 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있고, 외래 메발론산 경로에 관련된 모든 효소를 코딩하는 DNA가 도입된 균주를 이용하여 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 둘 모두를 저해하는 물질을 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 하나 이상의 유전자가 불활성화되어 있는 숙주세포에 메발론산 경로를 갖는 세포의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입시킴으로써 얻어지는, 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 외래 메발론산 경로를 가지고 있고, 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있는 형질전환된 숙주세포 및 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포를 시험 물질의 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는, 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 둘 모두를 저해하는 물질을 탐색하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 사용되는 상기 숙주세포는 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 하나 이상의 유전자가 불활성화되어 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 대장균, 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typimurium) 및 플라즈모디움 팔시파룸 (Plasmodium falsiparum)이 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 사용되는 상기 숙주세포는 내재적 비메발론산 경로의 하나 이상의 유전자가 불활성화되어 있는 것이다. 유전자를 불활성화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 위치특이적 돌연변이유발 (site specific mutagenesis) 및 상동재조합에 의한 돌연변이 유발법 등이 사용될 수 있다. 상동재조합에 의한 돌연변이 유발법에 의하면, 불활성화시키고자 하는 유전자와 상동서열을 포함하나 일부 서열이 결실되어 있는 DNA를 숙주세포에 도입하고, 세포 내에서 상동재조합이 일어나게 한 다음 불활성화된 세포를 선별함으로써 제조할 수 있다. 불활성화되는 유전자는 내재적 비메발론산 경로에 관여하는 임의의 효소를 코딩하는 유전자일 수 있다. 예를 들면, 1-데옥시-D-자일룰로즈 5-포스페이트 (DXP) 신타제, DXP 리덕토이소머라제, CDP-메틸-D-에리쓰리톨-4-포스페이트 (CDP-ME) 신세타제, CDP-ME 키나제, MECDP 신타제, HMB-PP 신타제 및 HMB-PP 리덕타제를 코딩하는 DNA 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 DNA일 수 있다. 이들 DNA에는 예를 들면, E.coli의 dxs (Genbank accession No. AF035440), ispC (Genbank accession No. AB013300), ispD (Genbank accession No. AF230736), ispE (Genbank accession No. AF216300), ispF (Genbank accession No. AE000219), ispG (Genbank accession No. AE000338) 및 ispH (Genbank accession No. AE000113) 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 ispC (Genbank accession No. AB013300)이다.
본 발명의 방법에 사용되는 상기 형질전환된 숙주세포는 비메발론산 경로의 하나 이상의 유전자가 불활성화되어 있는 숙주세포에 메발론산 경로를 갖는 세포의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입하여 얻어진 것이다. 상기 메발론산 경로를 갖는 세포는 메발론산 경로를 갖는 것이면 특별히 한정되지 않으며 예를 들면, 스트렙토코커스 뉴모니애, 파라코커스 제악산티니파시엔스 및 사카로마이세스 세레비지애가 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, "메발론산 경로에 관여하는 모든 효소"란 메발론산 경로에 필수적으로 관여하는 효소로서 아세토아세틸-CoA로부터 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)를 합성하는 데에 관여하는 모든 효소를 의미한다. 따라서, 상기 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA는 (a) 3-히드록시-3-메틸글루타릴-코엔자임 A (HMG-CoA) 신타제 (EC 4.1.3.5), (b) HMG-CoA 리덕타제 (EC 1.1.1.34), (c) 메발로네이트 키나제 (EC 2.7.1.36), (d) 포스포메발로네이트 키나제 (EC 2.7.4.2) 및 (e) 메발로네이트 디포스페이트 디카르복실라제 (EC 4.1.1.33)를 코딩하는 DNA일 수 있다. 상기 DNA에는 아세토아세틸 CoA 티올라제 (EC 2.3.1.9) 및 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제 (EC 5.3.3.2)를 코딩하는 DNA가 더 포함될 수 있다. 상기 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA는 예를 들면, 알칼리젠스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus) H16 유래의 phbA 유전자 (Genbank accession No. J04987), 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2 및 mvaD 유전자 및 대장균 유래의 idi 유전자 (Genbank accession No. AF119715)를 포함하는 DNA, 파라코커스 제악산티니파시엔스의 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2, mvaD 및 idi 유전자를 포함하는 DNA, 또는 사카로마이세스 세레비지애의 HMGS, HMG1, ERG12, ERG8, ERG19 및 대장균 유 래의 idi 유전자 (Genbank accession No. AF119715)를 포함하는 DNA일 수 있다.
숙주세포에 DNA를 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 형질전환, 형질감염, 형질도입, 전기천공 및 입자충돌법 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 도입되는 상기 DNA는 코딩 서열 뿐만 아니라 상기 코딩 서열의 상류 (5′-비코딩 서열), 내부 및 하류 (3′-비코딩 서열)에 위치하는 조절서열을 포함한다. 상기 조절서열은 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 연관된 코딩 서열의 번역에 영향을 미친다. 상기 조절에는 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐레이션 인지 서열, RNA 가공 부위, 효과기 (effector) 결합 부위 및 스템-루프 구조가 포함될 수 있다. 도입되는 DNA는 DNA 그 자체 또는 운반체에 삽입된 상태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 운반체에는 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"가 포함될 수 있으며, 이들은 세포의 중심 대사의 일부분이 아닌 유전자를 종종 가지고 있으며, 보통 2중가닥 원형 DNA 단편인 염색체외 요소를 말한다. 본 명세서에서 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 상호 교환가능하게 사용된다. 상기 요소는 많은 뉴클레오티드 서열이 연결되거나 재조합되어진 독특한 구조체로서 프로모터 및 적합한 3′비번역 서열과 함께 선택된 유전자 산물을 코딩하는 DNA를 세포에 도입시킬 수 있는, 임의의 원천으로부터 유래된 독립적으로 복제하는 서열, 게놈 삽입 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형 또는 원형, 단일 또는 2중가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터는 pBAD24, pSTV28, 또는 pBBR1MCS이다.
본 발명의 방법은 상기 형질전환된 숙주세포의 생육은 저해하지만 상기 비메 발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포의 생육은 저해하지 않는 시험 물질은 메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 후보 물질로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 숙주세포의 생육은 저해하지 않지만 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포의 생육은 저해하는 시험 물질은 비메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 후보 물질로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 숙주세포 및 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포의 생육을 모두 저해하는 시험 물질은 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 모두를 저해하는 후보 물질로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포는 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 하나 이상의 유전자가 불활성화되어 있는 숙주세포에 메발론산 경로를 갖는 세포의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입시키는데 사용되는 벡터에서 상기 DNA가 포함되어 있지 않은 공벡터가 도입된 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포는 대조군 배양으로서 사용되는 동시에 비메발론산 특이적 저해물질을 탐색하기 위한 실험군이다.
본 발명의 방법의 일 구체예는 다음과 같다. 본 구체예에서는, ispC 유전자 의 불활성화에 의하여 내재적 비메발론산 경로가 불활성화되어 있고, 스트렙토코커스 뉴모니애, 파라코커스 제악산티니파시엔스, 또는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA가 도입된 대장균 (이하 "메발론산 대장균 ΔispC 균주"라 한다)과 상기 DNA를 제외한 공벡터만이 도입된 대장균 (이하 "대조군 대장균"이라 한다)을 사용한다. 먼저, 96웰 또는 384웰 플레이트에 약 200 ㎕의 LB 배지 및 시험 물질 (test substance)을 20 ㎕를 분액장치를 이용하여 2 개조로 분주한 다음, 각각 메발론산 대장균 ΔispC 균주와 대조군 대장균의 배양액 20 ㎕를 접종한다. 이때 초기 세포 농도는 OD600 값이 0.1에 해당하는 농도로 맞추고, 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 일정한 시간 간격 (예, 배양 6 시간 및 12 시간 후)으로 세포 농도를 측정한다. 음성 대조군으로는 시험 물질 대신에 증류수 20 μl를 첨가하고, 양성 대조군으로는 메발론산 대장균 ΔispC 균주 및 대조군 균주에 대하여 각각 심바스타틴 및 포스미도마이신을 첨가한다. 배양 결과, 각각 대조군과 비교하여 시험 물질이 각 균주의 생육을 저해하는 정도를 결정한다. 배양 결과, 메발론산 대장균 ΔispC 균주가 접종된 마이크로웰 플레이트에서만 생육을 저해하는 물질은 메발론산 경로 특이적 저해물질로 판별하고, 대조군 대장균 균주가 접종된 마이크로웰 플레이트에서만 생육을 저해하는 물질은 비메발론산 경로를 특이적으로 저해물질로 판별하고, 두 마이크로웰 플레이트 모두에서 생육을 저해하는 물질은 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 모두를 저해하는 후보 물질로 판별한다.
본 발명은 또한, 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 하나 이상의 유전자가 불활성화되어 있는 숙주세포에 메발론산 경로를 갖는 세포의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입시킴으로써 얻어지는, 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 외래 메발론산 경로를 가지고 있고, 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있는 형질전환된 숙주세포로서,
비메발론산 경로의 ispC (Genbank accession No. AB013300) 유전자가 불활성화되어 있는 대장균에 스트렙토코커스 뉴모니애의 mvaS 및 mvaA (Genbank accession No. AF290099), mvaK1, mvaK2 및 mvaD (Genbank accession No. AF290098), 알칼리젠스 유트로푸스 H16 유래의 유래의 phbA 유전자 (Genbank accession No. J04987) 및 대장균 유래의 idi 유전자 (Genbank accession No. AF119715)를 갖는 DNA, 파라코커스 제악산티니파시엔스의 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2, mvaD 및 idi 유전자들 (Genbank accession No. AJ431696)를 갖는 DNA 및 사카로마이세스 세레비지애의 HMGS (Genbank accession No. X96617), HMG1 (Genbank accession No. M22002), ERG12 (Genbank accession No. X55875), ERG8 (Genbank accession No. M63648), ERG19 (Genbank accession No. X97557) 유전자 및 대장균 유래의 idi 유전자 (Genbank accession No. AF119715)를 갖는 DNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 DNA를 도입하여 얻어지는 숙주세포를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실 시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
이하 본 발명의 실시예에서는 메발론산 경로를 갖는 미생물인 스트렙토코커스 뉴모니애, 파라코커스 제악산티니파시엔스, 또는 사카로마이세스 세레비지애로부터 메발론산 경로에 관연하는 효소들을 코딩하는 DNA를 얻고, 이를 내재적 비메발론산 경로가 ispC 유전자의 결실에 불활성화된 대장균에 도입하여, 내재적 비메발론산 경로가 불활성화되고 외래 메발론산 경로를 갖는 대장균을 제조하였다. 다음으로, 상기 형질전환된 대장균과 상기 DNA를 제외한 공벡터로 형질전환된 내재적 비메발론산 경로를 갖는 대장균을 공지의 메발론산 경로 또는 비멜발론산 경로의 저해물질의 존재하에서 배양하여, 탐색 방법으로 유용한지를 검사하였다. 이하 본 실시예에서 본 발명의 재조합 균주를 제조하는데 사용되는 분자 생물학적 방법은 공지된 방법을 사용하였다 (J. Sambrook & D.W. Russel, (Ed.) Molecular Cloning 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press).
실시예 1 : 스트렙토코커스 뉴모니애 유래 메발론산 경로에 관련되는 모든 효소들을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터의 제조
본 실시예에서는 그람 양성균인 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발론산 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2 및 mvaD 및 알칼리젠스 유트로푸스 H16 유래의 phbA 유전자 (Genbank accession No. J04987) 및 대장균 유래의 idi 유전자 (Genbank accession No. AF119715)를 포함하는 복수 종의 발현벡터를 제조하였다.
먼저, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 염색체를 주형으로 하고, 각각 KpnI과 XbaI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 mvaK1, mvaK2 및 mvaD 유전자를 포함하는 2.8 kb 크기의 오페론 DNA를 증폭하였다. 다음으로, 상기 증폭된 DNA 산물을 KpnI/XbaI 제한효소로 절단하고, KpnI/XbaI으로 절단된 pBAD24 발현 벡터 (Genbank accession No. X81837)에 삽입하여 pDSN12D 벡터를 제조하였다.
다음으로, 대장균 (Escherichia coli) 염색체 DNA를 주형으로 하고, 각각 SmaI과 SphI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 0.55 kb 크기의 idi 유전자 DNA (Genbank accession No. AF119715)를 증폭하였다. 다음으로, 상기 증폭된 DNA 산물을 SmaI/SphI 제한효소로 절단하고, SmaI/SphI으로 절단된 상기 pDSN12D 발현 벡터에 삽입하여 pDSN12Didi 벡터를 제조하였다.
다음으로, 스트렙토코커스 뉴모니애 염색체를 주형으로 하고, 각각 EcoRI과 KpnI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 mvaS 및 mvaA 유전자를 포함하는 2.5 kb 크기의 오페론 DNA (Genbank accession No. AF290099)를 증폭하였다. 다음으로, 상기 증폭된 DNA 산물을 EcoRI/KpnI 제한효소로 절단하고, EcoRI/KpnI으로 절단된 상기 pDSN12Didi 발현 벡 터에 삽입하여 pDSNSA12DI 벡터를 제조하였다.
다음으로, 알칼리젠스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus) H16의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 각각 NheI과 EcoRI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 1.2 kb 크기의 phbA 유전자 DNA (Genbank accession No. J04987)를 증폭하였다. 다음으로, 상기 증폭된 DNA 산물을 NheI/EcoRI 제한효소로 절단하고, NheI/EcoRI으로 절단된 상기 pDSNSA12DI 발현 벡터에 삽입하여 최종적으로 pDASNSA12DI 발현 벡터를 제조하였다. 얻어진 pDASNSA12DI는 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2 및 mvaD 유전자 및 알칼리젠스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus) H16 유래의 phbA 및 대장균 유래의 idi 유전자를 코딩하는 DNA를 포함하고 있다.
상기 pDASNSA12DI 발현 벡터의 제조과정과 유사한 과정을 통하여, pSTV28 벡터 (Takara Shuzo Co., Ltd.)와 pBBR1MCS 벡터 (Genbank accession No. U02374)에도 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2 및 mvaD 유전자 및 대장균 유래의 idi 유전자를 코딩하는 DNA를 도입하여 pSSNSA12DI 및 pBSNSA12DI 발현 벡터를 제조하였다. 발현벡터의 제조에 사용된 pSTV28 벡터는 저카피 수 벡터이며, pBBR1MCS 벡터는 넓은 숙주 범위를 갖는 벡터이다.
실시예 2 : 파라코커스 제악산티니파시엔스 유래 메발론산 경로에 관련되는 모든 효소들을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터의 제조
본 실시예에서는 그람 음성균인 파라코커스 제악산티니파시엔스 유래의 메발론산 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2, mvaD 및 idi 및 대장균 유래의 atoB 유전자를 포함하는 복수 종의 발현벡터를 제조하였다.
먼저, 파라코커스 제악산티니파시엔스 (Paracoccus zeaxanthinifaciens) 염색체를 주형으로 하고, 각각 NheI과 XbaI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 9과 10의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 파라코커스 제악산티니파시엔스 (Paracoccus zeaxanthinifaciens) 유래의 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2, mvaD 및 idi 유전자를 포함하는 6.3 kb 크기의 오페론 DNA를 증폭하였다. 다음으로, 상기 증폭된 DNA 산물을 NheI/XbaI 제한효소로 절단하고, NheI/XbaI으로 절단된 pBAD24 발현 벡터에 삽입하여 pDPZSA12DI 벡터를 제조하였다.
상기 pDPZSA12DI 발현 벡터의 제조과정과 유사한 과정을 통하여, pSTV28 벡터 (Takara Shuzo Co., Ltd.)와 pBBR1MCS 벡터 (Genbank accession No. U02374)에도 파라코커스 제악산티니파시엔스 유래의 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2, mvaD 및 idi 유전자 DNA를 도입하여 pSPZSA12DI 및 pBPZSA12DI 발현 벡터를 제조하였다. 발현벡터의 제조에 사용된 pSTV28 벡터는 저카피 수 벡터이며, pBBR1MCS 벡터는 넓은 숙주 범위를 갖는 벡터이다.
실시예 3 : 사카로마이세스 세레비지애 유래 메발론산 경로에 관련되는 모든 효소들을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터의 제조
본 실시예에서는 진핵 세포인 사카로마이세스 세레비지애 유래의 메발론산 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 HMGS, HMG1, ERG12, ERG8 및 ERG19 및 대장균 유래의 idi 유전자를 포함하는 복수 종의 발현벡터를 제조하였다.
먼저, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 염색체를 주형으로 하고, 각각 PstI과 HindIII, SalI과 PstI, SacI과 SmaI, NcoI과 EcoRI 및 EcoRI과 SalI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 11과 12, 서열번호 13과 14,서열번호 15와 16,서열번호 17과 18 및 서열번호 19과 20의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 각각 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 HMGS (mvaS에 해당), HGM1 (mvaA에 해당), ERG12 (mvaK1에 해당), ERG8 (mvaK2에 해당) 및 ERG19 (mvaD에 해당) 유전자를 포함하는 각각 1.5, 1.5, 1.3, 1.3 및 1.2 kb 크기의 DNA를 증폭하였다.
다음으로, 대장균 염색체 DNA를 주형으로 하고, 각각 SmaI과 SalI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 19와 20의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 0.55 kb 크기의 idi 유전자 DNA를 증폭하였다.
다음으로, 상기 증폭된 DNA 산물을 각각 해당되는 제한효소로 절단하고, pTrc99A 벡터 (Genbank accession No. M22744)에 idi, HMGS, ERG8, ERG19, ERG12 및 HGM1의 순서로 삽입하여 pTSCSA12DI를 제조하였다.
상기 pTSCSA12DI 발현 벡터의 제조과정과 유사한 과정을 통하여, pSTV28, pBBR1MCS 및 pBAD24에도 대장균 유래의 idi 유전자 및 사카로마이세스 세레비지애 유래의 HMGS, ERG8, ERG19, ERG12 및 HGM1 유전자 DNA를 도입하여 pSSCSA12DI, pBSCSA12DI 및 pDSCSA12DI 발현벡터를 제조하였다.
실시예 4: 대장균의 비메발론산 경로의 불활성화 및 외래 메발론산 경로에 관여하는 효소 유전자의 도입
본 실시예에서는 대장균의 비메발론산 경로에 관여하는 DXP 리덕토이소머라제를 코딩하는 ispC 유전자를 불활성시켜 얻어진 균주에 상기 실시예 1 내지 3에서 제작된 외래 메발론산 경로를 갖는 발현 벡터를 도입하여 외래 메발론산 경로를 갖는 대장균 균주를 제조하였다.
실시예 1의 pDSN12Didi 벡터는 메발론산으로부터 IPP 및 DMAPP 합성에 관여하는 메발로산 경로의 효소들을 코딩하는 mvaK1, mvaK2, mvaD 및 idi 유전자를 포함하고 있다. pDSN12Didi를 BamHI과 SalI 제한효소로 절단하면 상기 유전자들이 포함된 DNA 단편이 얻어진다. 이 DNA 단편을 BamHI과 SalI 제한효소로 절단한 pSTV28 벡터에 삽입하여 pSSN12Didi 벡터를 제조하였다. 얻어진 pSSN12Didi 벡터를 대장균 FS1576에 도입하여 형질전환된 대장균을 제조하였다. 본 대장균은 메발론산 경로 중 메발론산으로부터 IPP 및 DMAPP 합성에 관여하는 효소를 발현할 수 있어, 메발론산이 존재하는 배지하에서는 생육할 수 있다.
다음으로, 상기 pSSN12Didi 벡터로 형질전환된 대장균에 카나마이신 저항성 유전자 (aphII)를 상동 재조합법에 의해 삽입하여 내재적 비메발론산 경로를 불활성화시킨 변이주를 제조하였다. 대장균의 염색체를 주형으로 하고, 서열번호 22와 23의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 1.2 kb 크기의 ispC 유전자 DNA (Genbank accession No. AB013300)를 증폭하였다. 다음으로, 상기 증폭된 DNA를 EcoRV로 절단된 pBluescript SK(+) (Stratagen 사) 발현 벡터에 삽입하여 pBispC 벡터를 제조하였다. SalI으로 pUK4K (Pharmacia 사) 로 절단하여 카나마이신 유전자 저항성 단편을 얻고, 클레나우로 평활말단화하였다. 상기 카나미아신 유전자 저항성 단편을 NcoI으로 ispC 유전자 부위를 절단하고 클레나우로 평활말단화한 pBispC 벡터에 삽입하여 pBCK를 제조하였다. 상동재조합의 효율성을 높이기 위하여 pBCK를 BspH1 제한효소로 절단하여 선형화하고 상기의 pSSN12Didi 벡터로 형질전환된 대장균 FS1576에 전기천공으로 도입하였다. 유전자 ispC가 결손된 형질전환체를 찾기 위하여 50 ㎍/ml 카나미이신과 1 mM 메발론산이 함유된 LB 고체 배지와 50 ㎍/ml 카나미이신이 함유된 LB 고체 배지에 레플리카 방법으로 옮기고 50 ㎍/ml 카나미이신만이 함유된 LB 고체 배지에서는 생육하지 않고 50 ㎍/ml 카나미이신과 1 mM 메발론산이 함유된 LB 고체 배지에서만 생육하는 콜로니를 선택함으로써 ispC 결손주를 제조하였다.
상동 재조합 결과 얻어진 대장균은 메발론산이 첨가된 배지 및 메발론산이 첨가되지 않은 배지에서 배양하고, 메발론산이 첨가된 배지에서만 집락을 형성하는 균주를 내재적 비메발론산 경로가 불활성화된 대장균으로 선별하였다.
다음으로, 상기 내재적 비메발론산 경로가 불활성화된 대장균에 실시예 1에서 제작된 pDSNSA12DI 벡터를 도입한 다음, 100 ㎍/ml 암피실린이 첨가된 LB 액체 배지에서 계대배양하여 상기 대장균으로부터 pSSN12Didi 플라스미드가 상실되도록 하였다. 상기 계대배양은 37 ℃에서 12 시간 씩 5회에 걸쳐 수행되었다. 계대배양된 상기 대장균을 100 ㎍/ml 암피실린이 함유된 LB 고체 배지에 도말하고 37 ℃에서 24 시간 배양하였다. 상기 고체 배지에서 형성된 콜로니들을 100 ㎍/ml 암피실린이 함유된 LB 고체 배지와 50 ㎍/ml 클로람페니콜이 함유된 LB 고체 배지에 레플 리카 방법으로 옮기고 50 ㎍/ml 클로람페니콜이 함유된 LB 고체 배지에서는 생육하지 않고 100 ㎍/ml 암피실린이 함유된 LB 고체 배지에서만 생육하는 콜로니들을 선택하였다. 즉, pDSNSA12Didi만이 도입된, 내재적 비메발론산 경로가 불활성화되어 있고 외래 메발론산 경로가 도입되어 있는 대장균 (이하 "메발론산 대장균 ΔispC 균주" 또는 "MEC 균주"라고도 한다)을 제조하였다.
실시예 5 : 메발론산 대장균 ΔispC 균주를 이용한 메발론산 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 모두를 특이적으로 저해하는 저해제 물질의 탐색
본 실시예에서는 실시예 4에서 얻어진 메발론산 대장균 ΔispC 균주를 종래 각각 메발론산 경로 및 비메발론산 경로의 특이적 저해제로 알려진 심바스타틴과 포스미도마이신의 존재하에서 배양하여, 메발론산 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 모두를 특이적으로 저해하는 물질을 탐색할 수 있는지를 확인하였다.
먼저, 각각 심바스타틴 및 포스미도마이신이 첨가된 두 종류의 LB 아가 플레이트 (직경 9 cm 플레이트)를 제조하였다. 다음으로, 상기 각각의 LB 아가 플레이트에 실시예 4에서 얻어진 메발론산 대장균 ΔispC 균주와 공벡터만 도입된 대장균을 각각 도말하고 37 ℃에서 20 시간 동안 배양하였다. 배양 결과 얻어지는 플레이트로부터 대장균의 생육정도를 비교하였다. 도 2는 본 발명의 메발론산 대장균 ΔispC 균주를 포스미도마이신 (A) 또는 심바스타틴 (B)의 존재하에서 배양한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 포스미도마이신이 첨가된 플레이트에서는 메발론산 대장균 ΔispC 균주만이 생육하였고, 심바스타틴이 첨가된 플레이트에서는 메발론산 대장균 ΔispC 균주의 생육은 저해되었고, 공벡터만 도입된 대 장균 균주만이 생육하였다.
본 실시예의 결과, 본 발명의 메발론산 대장균 ΔispC 균주 및 공벡터만 도입된 대장균 균주를 이용하여 메발론산 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 모두를 특이적으로 저해제 물질을 탐색할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 메발론산 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 모두를 저해하는 물질을 탐색하는 방법에 의하면, 메발론산 또는 2-메틸에리스리톨-4-포스페이트와 같은 메발론산 또는 비메발론산 경로의 중간체를 배지 중에 투여하지 않으면서, 비메발론산 경로의 저해물질 뿐만 아니라 메발론산 경로 또는 둘 모두를 저해하는 물질을 동시에 탐색할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 비용이 적게 들며 효율적이다.
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Claims (14)

  1. 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 하나 내지 7개의 유전자가 불활성화되어 있는 숙주세포에 메발론산 경로를 갖는 세포의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입시킴으로써 얻어지는, 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 외래 메발론산 경로를 가지고 있고, 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있는 형질전환된 숙주세포 및 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포를 시험 물질의 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는, 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 둘 모두를 저해하는 물질을 탐색하는 방법으로서,
    상기 비메발론산 경로는 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG 및 ispH로 구성되는 유전자로 구성되고,
    상기 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA는 HMG-CoA 신타제, HMG-CoA 리덕타제, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제 및 메발로네이트 디포스페이트 디카르복실라제를 코딩하는 DNA인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균 (Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typimurium) 및 플라즈모디움 팔시파룸 (Plasmodium falsiparum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 메발론산 경로를 갖는 세포는 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae), 파라코커스 제악산티니파시엔스 (Paracoccus zeaxanthinifaciens) 및 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 DNA는 아세토아세틸-CoA 티올라제 또는 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제를 코딩하는 DNA를 더 포함하는 방법.
  7. 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 하나 내지 7개의 유전자가 불활성화되어 있는 숙주세포에 메발론산 경로를 갖는 세포의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입시킴으로써 얻어지는, 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 외래 메발론산 경로를 가지고 있고, 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있는 형질전환된 숙주세포 및 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포를 시험 물질의 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는, 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 둘 모두를 저해하는 물질을 탐색하는 방법으로서,
    상기 비메발론산 경로는 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG 및 ispH로 구성되는 유전자로 구성되고,
    상기 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA는 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)의 mvaS 및 mvaA (Genbank accession No. AF290099), mvaK1, mvaK2 및 mvaD (Genbank accession No. AF290098), 알칼리젠스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus) H16 유래의 phbA 유전자 (Genbank accession No. J04987) 및 대장균 (Escherichia coli) 유래의 idi 유전자 (Genbank accession No. AF119715)를 갖는 것인 방법.
  8. 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 하나 내지 7개의 유전자가 불활성화되어 있는 숙주세포에 메발론산 경로를 갖는 세포의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입시킴으로써 얻어지는, 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 외래 메발론산 경로를 가지고 있고, 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있는 형질전환된 숙주세포 및 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포를 시험 물질의 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는, 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 둘 모두를 저해하는 물질을 탐색하는 방법으로서,
    상기 비메발론산 경로는 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG 및 ispH로 구성되는 유전자로 구성되고,
    상기 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA는 파라코커스 제악산티니파시엔스 (Paracoccus zeaxanthinifaciens)의 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2, mvaD 및 idi 유전자들 (Genbank accession No. AJ431696)인 방법.
  9. 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 하나 내지 7개의 유전자가 불활성화되어 있는 숙주세포에 메발론산 경로를 갖는 세포의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입시킴으로써 얻어지는, 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 외래 메발론산 경로를 가지고 있고, 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있는 형질전환된 숙주세포 및 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포를 시험 물질의 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는, 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 둘 모두를 저해하는 물질을 탐색하는 방법으로서,
    상기 비메발론산 경로는 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG 및 ispH로 구성되는 유전자로 구성되고,
    상기 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 HMGS (Genbank accession No. X96617), HMG1 (Genbank accession No. M22002), ERG12 (Genbank accession No. X55875), ERG8 (Genbank accession No. M63648), ERG19 (Genbank accession No. X97557) 유전자 및 대장균 (Escherichia coli) 유래의 idi 유전자 (Genbank accession No. AF119715)를 갖는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 형질전환된 숙주세포의 생육은 저해하지만 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포의 생육은 저해하지 않는 시험 물질은 메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 후보 물질로 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 형질전환된 숙주세포의 생육은 저해하지 않지만 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포의 생육은 저해하는 시험 물질은 비메발론산 경로를 특이적으로 저해하는 후보 물질로 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 형질전환된 숙주세포 및 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포의 생육을 저해하는 시험 물질은 메발론산 경로 및 비메발론산 경로 모두를 저해하는 후보 물질로 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 비메발론산 경로의 유전자가 불활성화되어 있지 않은 숙주세포는 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 하나 내지 7개의 유전자가 불활성화되어 있는 숙주세포에 메발론산 경로를 갖는 세포의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입시키는데 사용되는 벡터에서 상기 DNA가 포함되어 있지 않은 공벡터가 도입된 것인 방법.
  14. 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 비메발론산 경로만을 가지고 있고, 상기 비메발론산 경로의 하나 이상의 유전자가 불활성화되어 있는 숙주세포에 메발론산 경로를 갖는 세포의 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입시킴으로써 얻어지는, 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)의 생합성 경로로서 외래 메발론산 경로를 가지고 있고, 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있는 형질전환된 숙주세포로서,
    상기 비메발론산 경로는 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG 및 ispH로 구성되는 유전자로 구성되고,
    상기 비메발론산 경로의 ispC (Genbank accession No. AB013300) 유전자가 불활성화되어 있는 대장균 (Escherichia coli)에, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)의 mvaS 및 mvaA가 포함된 젠뱅크 허가번호 AF290099의 염기서열을 갖는 DNA, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)의 mvaK1, mvaK2 및 mvaD가 포함된 젠뱅크 허가번호 AF290098의 염기서열을 갖는 DNA, 알칼리젠스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus) H16 유래의 phbA 유전자가 포함된 젠뱅크 허가번호 J04987의 염기서열을 갖는 DNA 및 대장균 (Escherichia coli) 유래의 idi 유전자가 포함된 젠뱅크 허가번호 AF119715의 염기서열을 갖는 DNA를 갖는 DNA; 파라코커스 제악산티니파시엔스 (Paracoccus zeaxanthinifaciens)의 mvaS, mvaA, mvaK1, mvaK2, mvaD 및 idi 유전자들 (Genbank accession No. AJ431696)를 갖는 DNA; 및 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 HMGS (Genbank accession No. X96617), HMG1 (Genbank accession No. M22002), ERG12 (Genbank accession No. X55875), ERG8 (Genbank accession No. M63648), ERG19 (Genbank accession No. X97557) 유전자 및 대장균 (Escherichia coli) 유래의 idi 유전자 (Genbank accession No. AF119715)를 갖는 DNA;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 메발론산 경로에 관여하는 모든 효소를 코딩하는 DNA를 도입하여 얻어지는 숙주세포.
KR1020040090123A 2004-11-06 2004-11-06 내재적 비메발론산 경로는 불활성화되어 있고, 외래메발론산 경로에 관련되는 모든 효소를 코딩하는 ｄｎａ로형질전환된 숙주세포를 이용한 메발론산 경로 및비메발론산 경로 중 어느 하나 또는 모두를 저해하는물질을 탐색하는 방법 KR100704776B1 (ko)

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