KR100701923B1 - 항- ｂ림프종 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마세포주 - Google Patents

항- ｂ림프종 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마세포주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-B림프종 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 B-림프종에 특이적으로 결합하여 B-림프종의 활성을 저해시키는 단일클론항체와 이의 중쇄 가변영역(VH) 및 이를 코드하는 DNA, 경쇄 가변영역(VL) 및 이를 코드하는 DNA 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 항-B림프종 단일클론항체는 B-림프종에서 과량 발현되는 단백질 HLA class II DR을 항원으로 인식하여, 이에 특이적으로 결합하여 B-림프종의 활성을 저해시켜 B-림프종 세포의 성장을 억제시키는 효과가 있다.
B-림프종, B-lymphoma, 단일클론항체, 하이브리도마 세포주

Description

항- Ｂ림프종 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주{MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST B-LYMPHOMA AND HYBRIDOMA CELL LINE PRODUCING THE SAME}
도 1은 선별된 클론 D56에 대해서 B-lymphoma 세포주인 Daudi 세포주와 Raji 세포주 및 유방암 세포주인 SK-BR-3에 대한 ELISA 결과이고,
도 2는 클론 D56의 세포분석기를 통한 B-lymphoma 세포주에 대한 결합을 확인한 결과이고,
도 3은 B-lymphoma 세포주인 Raji와 Daudi 세포주에 대한 성장저해능을 확인한 결과이고,
도 4는 클론 D56의 정제된 항원에 대한 western blotting 결과이다
본 발명은 항- B림프종(B-lymphoma) 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 B-림프종의 표면에서 과량 발현되 는 단백질 HLA class II DR을 항원으로 인식, 이에 특이적으로 결합하여 B-림프종의 활성을 저해시키는 단일클론항체와 이의 중쇄 가변영역(VH) 및 이를 코드하는 DNA, 경쇄 가변영역(VL) 및 이를 코드하는 DNA 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.
림프종(lymphoma)은 림프 조직에 생기는 원발성 악성종양으로서, 악성림프종은 백혈구 속의 림프구가 암화한 악성종양으로서 림프절이 붓거나 종괴가 생기게 된다. 백혈병 중에도 림프성 백혈병이라고 하는 림프구가 암화한 악성종양이 있지만, 악성세포가 증가하는 장소가 주로 혈액과 골수(뼈 속에 있는 혈액을 만드는 공장과 같은 것)라는 점이 악성림프종과 차이가 있다.
림프구는 인체 면역계에 있어 매우 중요한 요소로서, 흉선, 비장 및 골수(성인)에서 생성되며, 인간(성인) 순환계에 존재하는 백혈구 세포 전체의 약 30%를 차지한다. 림프구는 주로 T 세포 및 B 세포로 구성되면, T 세포는 세포 매개 면역을 담당하고 B 세포는 항체 생성(체액면역)을 담당한다.
B 세포는 그 표면상에 각각 다른 항체를 발현한다. 따라서 하나의 B 세포는 하나의 항원에 특이적인 항체를 발현하고, 다른 B 세포는 다른 항원에 특이적인 항체를 발현한다. 따라서, B 세포는 상당히 다양하고, 이러한 다양성은 면역계에 있어 중요하다. 인간의 각 B 세포는 다수의 항체 분자(즉, 약 107 ~ 108 )를 생성할 수 있다. 외래 항원이 중성화되면 이러한 항체 생성은 거의 일반적으로 중단되거나 실질적으로 감소된다. 그러나, 경우에 따라서는, 특정 B 세포 증식이 감소되지 않 고 계속되는데, 이러한 증식으로 인해 B 림프종으로 불리는 암이 발생할 수 있다.
우리나라에서 악성 림프종은 소아 연령에서 세번째로 많은 종양이다. 악성 림프종은 생물학적 특성의 차이에 의해 호지킨 림프종(Hodgkin Lymphoma, HL)과 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin Lymphoma, NHL)으로 대별된다. 두 질환은 같은 림프조직에서 발병되나, 임상증상, 경과, 병태생리, 치료방법 등이 완전히 차이가 난다. 특히 비호지킨 림프종에서는 아형(subtype)에 따라 다른 점이 많다.
서양과 비교해 볼 때 전체적인 발생빈도는 비슷하나, 악성 림프종 중에서 비교적 치료효과가 양호한 호지킨 림프종이 차지하는 비율이 10~20%로, 서구의 35~45%에 비해 낮은 비율을 보이고 있어 치료에 난점이 많다.
악성 림프종에 대한 치료는 그 종류 및 병기 등에 따라 방사선치료, 화학요법, 항원항체요법, 이들의 병행요법, 조혈간세포이식요법(골수이식요법을 포함함) 등 다양한 방법이 사용되고 있다.
호지킨 림프종의 경우, 병소가 림프선 조직에 국한되어 있을 경우 발생한 림프조직이나 주위 조직에 대한 방사선 치료만으로도 완치율이 매우 높으나, 비호지킨 림프종은 처음부터 전신적인 증상과 각종 실질 장기를 침범해서 발생하므로 국소적인 치료만으로는 완치율이 높지 않기 때문에, 반드시 최근 발전된 여러 약제를 병용하는 intensive combination chemothrapy가 기본 치료방법이다.
림프종의 분포가 국소적일 때는, 방사선요법이 효율적일 수 있으나, 광범위한 경우 조사범위가 크기때문에 골수장해 등 심한 부작용이 나타나기도 한다. 골수장해는 방사선요법 때문에 혈액 생산에 문제가 생겨 일어난다. 이 때문에 백혈구가 감소하여 쉽게 감염을 일으키게 되거나, 혈소판의 감소에 의해 출혈이 잘 일어나게 되기도 한다. 두경부에 대한 방사선조사에서는 구내염이나 타액선의 장해, 미각장해가 나타날 수 있다. 화학요법과 병용한 경우 부작용이 더 심하게 나타날 수 있으며, 2차적인 백혈병 등 악성종양이 발생할 가능성이 높아진다고 보고되고 있다.
화학요법은 항암제를 내복하거나 정맥 또는 근육에 주사하는 방법으로 투여한다. 림프종의 종류, 병기 등에 따라 다양한 항암제가 개발되어 있다. 호지킨 림프종의 경우 제일 많이 사용하는 방법으로는 MOPP(nitrogen mustard, vincristine, procarbazine, prednisone)요법이나, 이 밖에 ABVD(adriamycin, bleomycin, vinblastine, dacarbazine)요법이 사용될 수 있으며, 비호지킨 림프종의 경우 대표적으로는 vincristine, cyclophosphamide, prednisone, methotrexate, adriamycin 등이 있으며, 이 밖에도 etoposide, bleomycin, L-asparaginase, cytosine arabinoside 등도 사용되고 있다.
종래 방사선요법이 방사선을 조사한 곳에 대해서만 효과가 있는 국소요법인 것에 반해, 화학요법은 항암제가 혈류를 타고 전신으로 퍼져 종양세포를 죽일 수 있으므로 전신요법이라고 불리기도 한다. 하지만, 화학요법은 전신요법이기 때문에 몸의 모든 장기에서 항암제로 인한 후유증이 나타날 가능성이 높다. 사용하는 항암제의 종류에 따라 다르지만 대다수의 항암제에 공통되는 제일의 부작용은 골수독성(백혈구감소, 혈소판감소, 빈혈)이다. 백혈구가 감소하면 감염되기 쉬워지며 때로는 고열에 시달리기도 한다. 그런 경우에는 항생물질을 투여해야 한다. 혈소판이 감소하면 출혈이 잘 일어나게 된다. 그 밖의 주된 부작용은 구역질, 구토, 식욕저 하, 말초신경장해(손발이 저리는 증상), 변비 또는 설사, 간장과 신장 장해, 탈모, 심장과 폐 장해 등이 있다.
상술한 바와 같이, B 세포 악성종양을 치료하기 위한 전통적인 방법은 독성 부작용으로 인해 그 이용이 제한되어 왔다.
이에 대한 새로운 치료방법으로, B 세포의 표면에 발현되는 단백질을 항원으로 인식, 이에 반응하는 단일클론항체에 대한 연구가 계속적으로 이루어지고 있다.
단일클론항체의 이용은 이러한 제제들이 종양 부위에 선택적으로 운반되어 이를 표지 또는 표적하기 때문에, 정상조직에서의 독성이 적다. 따라서, 림프계의 종양치료에 가장 높은 효과를 보이고 있다.
이들 B 세포 악성종양에서 B 세포의 표면에 발현되는 단백질로는 B 세포에서 CD19, CD20, CD21, CD22 및 CD23 등이 있으며, 이들을 항원으로 인식, 이에 대한 단일클론항체에 대한 개발이 연구되고 있다.
이미 미국의 Biogen Idec사에서는 종양이 된 B 세포에서 증가하는 세포표면 단백질인 CD20을 표적으로 하는 단일클론항체를 의약품으로 개발하여 리툭시마브(Rituximab)란 이름으로 판매하고 있다.
CD20 항원은 비호지킨림프종(NHL) 환자의 B 세포에 80% 이상 존재한다. 리툭시마브(Rituximab)는 미국 FDA에서 1997년 암 치료제로는 최초로 승인을 받은 단일클론항체로 CD20 항원을 표적으로 한 생쥐 항체로 Fc부분을 사람의 항체로 대체하여(생쥐의 경쇄 및 중쇄 가변영역 및 인간의 감마 I 중쇄 및 카파 경쇄 불면 영역) 사람의 보체 및 표적세포와의 반응은 더 잘되게 하고 부작용인 면역학적 반응은 줄 인 것이다. 초기의 연구로 34명의 재발한 저등급 여포형 림프종에서 단독으로 사용시 반응률 50%, 진행시까지의 시간 중앙값 10.2개월이 보고되었다. 대규모 3상 연구에서는 166명의 환자에게 표준용량의 맙테라를 투여하여 완전 반응 6%를 포함하여 전체 반응률이 48%였고, 반응한 환자의 진행시까지의 시간 중앙값은 13.2개월이었다. 이 연구를 바탕으로 1997년 리툭시마브(Rituximab)가 재발 또는 불응성인 저등급(low grade) 비호지킨 림프종의 치료제로 FDA의 승인을 받게 되었다. 이러한 단인클론항체에 방사성 동위원소를 붙여서 치료효과를 더욱 높인 약제들이 계속해서 개발되고 있으며, 또한, CD19, CD20, CD21, CD22 및 CD23 등과 아울러 B-림프종의 세포표면에 과량 발현되는 HLA class II DR antigen도 악성 B 세포의 치료 표적이 될 수 있고, 이에 대한 연구 개발도 다각적으로 이루어질 필요가 있다.
본 발명의 목적은 B-림프종의 세포표면에 과량 발현되는 단백질 HLA class II DR 을 항원으로 인식, 이에 특이적으로 결합하여 B-림프종의 활성 및 성장을 억제시키는 항- B림프종 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 B-림프종에 특이적으로 결합하여 B-림프종의 활성을 저해하는 서열정보 1의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 (VH) 및 서열정보 2의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항- B림프종 단일클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체 중쇄 가변영역(VH)을 코드하는 서열정보 3의 염기서열 및 경쇄 가변영역(VL)을 코드하는 서열정보 4의 염기서열을 포함하는 항- B림프종 단일클론항체 DNA를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 D56(기탁번호 KCLRF-BP-00128)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이브리도마 세포주 D56(기탁번호 KCLRF-BP-00128)으로부터 생산되는 항- B림프종 단일클론항체 D56을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열정보 3 및 서열정보 4의 염기서열 정보에서 발현되는 재조합 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항- B림프종 단일클론항체를 포함하는 B-림프종 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자는 B-lymphoma 세포주인 Daudi(human burkitt lymphoma, EBV-positive suspension cell)를 마우스의 복강에 주사한 다음 3주 후에 같은 암세포를 복강내에 부스터(booster)주사하여 마우스를 면역시킨 후 상기면역화된 마우스의 비장세포를 골수종(myeloma) 세포(SP2/0)와 혼합하고 풀리에틸렌클리콜(분자량 1,500; Roche)을 넣어 반응시킨 후 배양하여 하이브리도마 세포주를 제조하는 단계; 제조한 하이브리도마 세포주 중에서 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 선별하고, 이 세포주가 단일클론이 되도록 제한 희석(limiting dilution)하여 B-lymphoma에 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계; 선별한 하이브리도마 세포주를 이용하여 마우스로부터 단일클론항체를 대량생산 및 정제하는 단계; 유세포분석기를 통해서 B-lymphoma 세포주에서 반응성을 확인하는 단계; B-lymphoma 세포주인 Daudi 와 Raji의 성장저해를 확인하는 단계; 성장저해능이 있는 B-lymphoma 단일클론항체의 항원을 결정하는 단계; 성장저해능이 있는 단일클론항체에 대한 DNA 염기서열을 확인하는 단계를 통하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 본 실시예는 바람직한 일 실시예일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다.
실시예 1 : B- lymphoma 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 구축
B-lymphoma 세포주인 Daudi 세포주를 인산완충액과 잘 혼합하여 4주된 Balb/c 마우스의 복강에 주사하였다. 3주후에 Daudi 세포주를 마우스의 복강에 부스터(booster)주사하였다. 세포융합실험 4일전에 Daudi 세포주를 인산완충액과 잘 혼합하여 마우스의 복강에 주사하였다. 면역된 마우스의 비장(spleen)를 적출하여 비장세포를 분리하였다. 분리된 비장세포와 골수종 세포(myeloma cell, SP2/0)를 각각 2회 DMEM 배지로 씻어준 다음 비장세포와 골수종 세포의 세포수를 각각 세어서 비장세포와 골수종세포가 5:1이 되도록 섞어준 다음 1회 씻어 준다. 폴리에틸렌 글라이콜을 1ml 넣어서 섞어준 다음 DMEM배지를 첨가한 후 원심분리를 하여 침전된 세포를 분리배지(HAT 배지)에 현탁시키고 96웰(well) 마이크로 타이터 플레이트에 0.2ml씩 깔은 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
실시예 2: 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별
상기 실시예 1에서 제조한 하이브리도마 세포군 중에서 B-lymphoma에 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주의 선별과정은 ELISA 법을 이용하여 B-lymphoma에 결합하는 항체를 다음과 같이 측정함으로써 이루어졌다. 먼저, Daudi 세포막 추출액을 10㎍/ml 포스페이트 버퍼 식염수(PBS)로 희석시키고, 이 희석된 Daudi 세포막 추출액 100㎕를 96웰 플레이트(Nunc Immuno Module, Maxisorp, 덴마크)에 분주하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 1% 우혈청 알부민(BSA) PBS 300㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 한 다음, 하이브리도마 배양액 100㎕를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. PBST로 두번째 세척을 한 다음, 1% BSA-PBS 중의 희석된 염소 항-마우스 IgG(Fab 특이적)-퍼옥시다제 접합체(Sigma사, 미국)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 한 번 더 세척한 다음, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린)-6-술폰산(ABTS) 용액(KPL사, 미국) 100㎕를 첨가하고 405nm에서 흡광도(O.D.)를 측정하여 1개의 클론을 선별하여 D56이라 명명하였고, 단일클론항체 D56을 생산하는 하이브리도마 세포주 D56을 2006년 1월 23일자로 한국세포주연구재단(KCLRF, Korean Cell Line Research Foundation)에 기탁하였다(Identification reference: Daudi-56-2B7).(기탁번호 KCLRF-BP-00128)
도 1은 선별된 클론 D56에 대해서 B-lymphoma 세포주인 Daudi 세포주와 Raji(human burkitt lymphoma, EBNA positive suspension B cell) 세포주 및 유방암 세포주인 SK-BR-3에 대한 ELISA 결과이다.
상기 도 1에 보이는 바와 같이 B-lymphoma 세포주인 Daudi 세포주와 Raji 세포주에 대하여 강한 결합력을 보임을 알 수 있다.
실시예 3 : 단일클론항체의 생산 및 정제
상기 실시예 2에서 얻은 계속적으로 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주로부터 단일클론항체를 생산하기 위하여 마우스(Balb/c)에 0.5ml의 2,6,10,14-테트라메실펜타데케인(pristane, Sigma사)를 복강내로 주사하였다.1주일 후에 각각의 하이브리도마세포주를 마우스 1마리당 5 x 106 씩 주사하고 복강이 부풀어 오른 마우스에서 복수액을 채취하였다. 이 복수액을 -20℃에서 얼린 다음 얼지 않은 부분은 제거해준다. 복수액을 다시 녹인 후 암모늄설페이트((NH4)2SO4)로 침전 시킨 다음 원심분리하여 침전물을 인산완충액으로 녹인다. 그 다음 항체 정제용 결합완충액 (Pierce사, 미국)과 1:1로 섞어 준 후 protein A-agarose gel이 충전된 column을 사용하여 정제하였다.
실시예 4: 세포분석기를 이용하여 B- lymphoma 에 대한 결합성 확인
실시예 2에서 B-lymphoma에 대한 반응성이 확인된 단일클론항체 D56에 대해서 B-lymphoma에 대한 결합성을 확인하기 위하여 B-lymphoma 세포주인 Daudi 세포주와 Raji 세포주 각각을 1% 우혈청알부민(BSA) PBS로 씻어 주었다. 얼음속에서 단일클론항체 10ug과 B-lymphoma 세포주를 반응시킨 다음 1% BSA-PBS로 2회 씻어 주었다. 염소 항-마우스 (Fab 특이적) FITC 접합체를 넣고 얼음에서 40분간 반응시킨 다음 1% BSA-PBS로 2회 씻어 주었다. 1% BSA-PBS 1mL로 현탁한 다음 유세포분석기로 분석을 하였다.
도 2는 클론 D56의 세포분석기를 통한 B-lymphoma 세포주에 대한 결합을 확인한 결과이다.
상기 도 2에 보이는 바와 같이 단일클론항체 D56은 Daudi 와 Raji 세포에 반응성이 우수함을 확인하였다.
실시 예 5: B-lymphoma 세포주에 대한 성장저해 실험
실시예 4에서 B-lymphoma 세포주에 결합하는 단일클론항체 D56에 대한 B-lymphoma 세포의 성장저해 실험을 확인하기 위하여 12웰 마이크로 플레이트(Nunc)에 2 x 105 세포수가 되도록 Raji 와 Daudi 세포를 깔아 준 다음 D56 단일클론항체를 처리하였다.
도 3은 B-lymphoma 세포주인 Raji와 Daudi 세포주에 대한 성장저해능을 확인 한 결과이다.
상기 도 3에 보이는 바와 같이, 매일 세포수에 변화를 측정한 결과 단일클론항체 D56이 항파상풍 단일클론항체인 TT-2에 비해서 Raji와 Daudi 세포주에 대한 성장저해능이 탁월함을 확인하였다.
실시 예 6 : 단일클론항체 D56 의 항원 동정
실시예 3에서 정제한 단일클론항체 D56과 CNBr activated sepharose (Amersham Pharmacia 사)를 반응시켜 affinity resin을 제조한 다음 Daudi 추출물에서 resin에 결합하는 항원을 분리하여 먼저 western blotting으로 단일클론항체 D56이 분리된 항원에 결합함을 확인하였고(도 4), Maldi-TOF 으로 분리된 항원을 동정하였다. 동정결과 HLA class II DR antigen으로 밝혀졌다.
도 4는 단일클론항체 D56의 정제된 항원에 대한 western blotting 결과이다.
실시예 7: B- lymphoma 세포주에 대한 성장저해능이 확인된 단일클론항체 D56 의 DNA염기서열결정
실시예 5에서 B-lymphoma 세포주에 대한 성장저해능이 확인된 단일클론항체 D56에 대한 DNA 염기서열결정을 위하여 하이브리도마를 1x108 정도로 DMEM 배지에서 배양하여 Trizol(Life Technologies사)을 사용하여 설명서에 따라 RNA를 분리하였다. cDNA 합성, 항체의 VH 및 VL DNA의 증폭과 같은 항체 유전자의 클로닝과 관련된 제반 사항은 Mouse ScFv and Expression Module(Amersham Pharmacia 사)을 사용하여 제시된 방법에 따라 시행하였으며 클로닝된 항체유전자는 pGEM-T 벡터(Promega사, 미국)에 삽입한 후 염기서열을 확인하였다. 보다 자세한 과정은 다음과 같다.
1. RNA의 분리
하이브리도마 세포 5～10x106당 trizol 1ml을 넣고 피펫으로 세포를 잘 풀어준 후, 실온(15℃～30℃)에서 5분 동안 기다렸다. 다음으로, Trizol 1ml당 클로로포름 200㎕를 넣어 잘 섞고, 뚜껑을 닫고 손으로 15초동안 세게 흔들어준 후 실온에서 3분 동안 기다렸다. 그 후, 2～8℃에서 15분 동안 15,000rpm으로 원심분리 하고, 상층액만 새 튜브에 옮겼다. Trizol 1ml당 이소프로필 알콜 500㎕를 넣고 잘 섞어 준 다음, 실온에서 10분 동안 기다렸다. 그 후, 2～8℃에서 10분 동안 15,000rpm으로 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. Trizol 1ml당 75% 에탄올 1ml을 넣고 2℃～8℃에서 5분 동안 15,000rpm으로 원심분리하고, 에탄올은 따라 버리고 RNA 펠렛은 잠깐 말렸다. 증류수를 150㎕ 넣고 RNA를 잘 녹인 후, 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 그 후, -20℃에서 보관하였다. 분리한 RNA의 양은 모두 1.0～2.5 ㎍/㎕이었다.
2. cDNA의 합성 및 증폭
상기에서 얻어진 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 먼저, mRNA를 65℃에서 10분 동안 반응시킨 후 즉시 얼음에서 식혔다. mRNA 10㎕, 증류수 10㎕, 제1가닥 혼합물 (first-strand mix) 11㎕, DTT 1㎕를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 여기에서, 상기 제1가닥 혼합물은 Mouse ScFv and Expression Module(Amersham Pharmacia 사) 내에 포함되어 있는 것으로, 쥐 역전사 효소(murine reverse transcriptase), 랜덤 헥사데옥시리보뉴클레오티드(random hexadeoxyribonucleotides: pd(N)6), RNase/DNase가 없는 BSA, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 등을 포함하고 있다.
다음으로, 얻어진 cDNA를 이용하여 PCR을 하였다. 2개의 PCR 튜브를 준비하여 하나의 튜브에는, PCR 키트, cDNA 33㎕, 경쇄 프라이머 혼합물(light primer mix) 2㎕, 증류수 15㎕를 넣었고, 다른 하나의 튜브에는 PCR 키트, cDNA 33㎕, 중쇄 프라이머 혼합물(heavy primer mix) 2㎕, 증류수 15㎕를 넣고 PCR 기계에서 반응을 시켰다. PCR 반응은 95℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 1분, 56℃에서 2분, 72℃에서 2분으로 40회 반응시킨 후, 마지막으로 72℃에서 15분 동안 반응시킴으로써 이루어졌다. 상기 경쇄 프라이머 혼합물은 경쇄의 10개 가변영역에 해당하는 프라이머의 혼합물을 말하며, 5′프라이머 및 3′프라이머를 포함하고 있다. 상기 중쇄 프라이머 혼합물은 중쇄의 가변영역에 해당하는 프라이머의 혼합물로서, 5′프라이머 및 3′프라이머 각각으로 존재하며 반응 시에 이를 함께 혼합하여 사용하였다. 상기 혼합물들은 그 자체가 Mouse ScFv and Expression Module(Amersham Pharmacia 사)에 제공된다.
이와 같이 얻어진 PCR 산물 DNA를 1.2% 아가로즈 겔에서 전기영동을 하여 확인하였고, QIAquick PCR purification kit(Qiagen, Valencia, CA, 미국)를 사용하 여 분리 정제하였다.
3. 재조합 벡터의 제조
상기에서 얻어진 항체 VH 및 VL DNA 와 pGEM-T vector를 T4 DNA 라이게이즈(Promega 사)를 사용하여 재조합 벡터를 제조하였다. 이렇게 제조된 재조합 벡터를 E.coli 세포에 형질전환 시킨 다음 X-Gal 과 IPTG가 포함된 LB 플레이트에 도말하였다. 37℃에서 밤새 배양한 다음 하얀색 콜로니를 선별하여 LB 배지에서 배양한 후 Qiagen plasmid mini kit (Qiagen, Valencia, CA, 미국)를 이용하여 재조합 플라스미드를 분리하였다. 이렇게 얻어진 재조합 플라스미드 DNA를 염기서열 결정에 사용하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 B-림프종 단일클론항체는 다양한 종류의 종양 또는 암에서 과잉 발현되는 B-림프종를 항원으로 인식, 특이적으로 결합하여 B-림프종의 활성을 저해시켜 종양 세포의 성장을 억제시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 각종 종양 및 암의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. B-림프종에 특이적으로 결합하여 B-림프종의 활성을 저해하는 서열정보 1의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역(VH) 및 서열정보 2의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항- B림프종 단일클론항체.
  2. 제1항의 중쇄 가변영역(VH)을 코드하는 서열정보 3의 염기서열 및 제1항의 경쇄 가변영역(VL)을 코드하는 서열정보 4의 염기서열을 포함하는 항- B림프종 단일클론항체 DNA.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 하이브리도마 세포주 D56(기탁번호 KCLRF-BP-00128)로부터 생산되는 항- B림프종 단일클론항체 D56.
  4. 제1항의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 D56(기탁번호 KCLRF-BP-00128).
  5. 제2항의 서열정보 3 및 서열정보 4의 염기서열 정보에서 발현된 재조합 항체.
  6. 제1항의 항- B림프종 단일클론항체를 포함하는 악성 B림프종 치료제.
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