KR100697243B1 - Controllable recombinant protein expression vectors - Google Patents

Controllable recombinant protein expression vectors Download PDF

Info

Publication number
KR100697243B1
KR100697243B1 KR1020050056457A KR20050056457A KR100697243B1 KR 100697243 B1 KR100697243 B1 KR 100697243B1 KR 1020050056457 A KR1020050056457 A KR 1020050056457A KR 20050056457 A KR20050056457 A KR 20050056457A KR 100697243 B1 KR100697243 B1 KR 100697243B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
expression
promoter
protein
iron
expression vector
Prior art date
Application number
KR1020050056457A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20070000822A (en
Inventor
권오석
임재명
홍미주
조민호
강현아
오두병
김철호
이상기
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020050056457A priority Critical patent/KR100697243B1/en
Publication of KR20070000822A publication Critical patent/KR20070000822A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR100697243B1 publication Critical patent/KR100697243B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 단백질 발현 제어가 가능한 재조합 발현벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 철 이온에 의해 발현이 강력하게 억제되고 철 이온 흡착제 처리에 의해 탈억제되는 프로모터 또는 상기 프로모터와 이를 조절하는 유전자를 포함하고 있는 재조합 발현벡터를 제작하고 이를 이용하여 단백질 생산 시 배지 내 철 이온이나 철 이온 흡착제를 처리함으로써 재조합 단백질 발현 정도를 정교하고 고효율로 제어하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant expression vector capable of controlling protein expression, and more particularly includes a promoter or a gene that regulates the promoter or the promoter strongly inhibited expression by iron ions and de-suppressed by iron ion adsorbent treatment. The present invention relates to a method for precisely and efficiently controlling the degree of recombinant protein expression by producing a recombinant expression vector and treating the iron ions or iron ion adsorbents in the medium during protein production using the same.

단백질 발현 제어, 철 이온, 철 이온 흡착제, 프로모터 Protein expression control, iron ion, iron ion adsorbent, promoter

Description

단백질 발현 제어가 가능한 재조합 발현벡터{Controllable recombinant protein expression vectors}Controllable recombinant protein expression vectors

도 1은 철 이온에 의해 발현이 억제되며 철 이온 흡착제를 처리하면 발현억제로부터 벗어나는 대장균의 entC 유전자의 프로모터와 다중클로닝 부위, 앰피실린 항생제 내성 유전자를 포함하고 있는 대장균용 재조합 발현벡터 pOS2를 도식한 것(A)이며, 상기 벡터에 철 이온이 존재할 때 entC 유전자 프로모터의 발현을 억제하는 Fur(ferric uptake regulator) 전사조절 단백질을 코딩하는 fur 유전자를 서브클로닝한 대장균용 재조합 발현벡터 pOS3을 도식한 것(B)이다.1 is inhibiting the expression by the iron ions are schematic iron ion Processing an adsorbent promoter and the multiple of ent C gene of Escherichia coli causing a departure from the expression control cloning site, the recombinant expression for the E. coli, which contains an antibiotic resistance gene appeared Amphitheater vector pOS2 (A), a recombinant expression vector pOS3 for E. coli subcloned the fur gene encoding a fur (ferric uptake regulator) transcriptional regulator protein that inhibits expression of the ent C gene promoter when iron ions are present in the vector. It is one (B).

도 2는 대장균의 베타-갈락토시다아제 효소를 대장균에서 대량 발현하기 위하여 도 1의 pOS2와 pOS3에 각각 lacZ 유전자를 서브클로닝하여 제작한 발현벡터 pOS2-lacZ(A)와 pOS3-lacZ(B)를 도식한 것이다. FIG. 2 shows expression vectors pOS2-lacZ (A) and pOS3-lacZ (B) prepared by subcloning the lacZ gene in pOS2 and pOS3 of FIG. It is a schematic.

도 3은 베타-갈락토시다아제 효소 발현벡터 pOS2-lacZ와 pOS3-lacZ로 형질전환된 대장균을 LB(Bacto trypton 1%, NaCl 1%, Yeast extract 0.5%) 액체 배지에 배양하면서 배양 개시 3시간 후에 철 이온 흡착제인 다이피리딜(2,2'-dipyridyl)을 첨가하여 베타-갈락토시다아제의 발현을 유도하고 시간대별로 세포의 성장과 발현되는 베타-갈락토시다아제 효소 활성을 측정한 결과이다.3 is 3 hours from the start of the culture of E. coli transformed with beta-galactosidase enzyme expression vectors pOS2-lacZ and pOS3-lacZ incubated in LB (Bacto trypton 1%, NaCl 1%, Yeast extract 0.5%) liquid medium Subsequently, beta-galactosidase was induced by the addition of dipyridyl (2,2'-dipyridyl), an iron ion adsorbent, and cell growth and expression of beta-galactosidase enzymes were measured at different times. to be.

도 4는 베타-갈락토시다아제 효소 발현 벡터 pOS2-lacZ와 pOS3-lacZ로 형질전환된 대장균을 LB 액체 배지에 배양하면서 배양 개시 3시간 후에 철 이온 흡착제인 EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid)를 첨가하여 베타-갈락토시다아제의 발현을 유도하고 시간대별로 세포의 성장과 발현되는 베타-갈락토시다아제 효소 활성을 측정한 결과이다. Figure 4 is a beta-galactosidase enzyme expression vector pOS2-lacZ and pOS3-lacZ transformed E. coli incubated in LB liquid medium 3 hours after the start of the culture by adding iron ion adsorbent EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) beta It is a result of inducing the expression of galactosidase and measuring the growth and expression of beta-galactosidase enzyme activity over time.

도 5는 베타-갈락토시다아제 효소 발현 벡터 pOS2-lacZ와 pOS3-lacZ로 형질전환된 대장균을 LB 액체 배지에 배양하면서 배양 개시 3시간 후에 철 이온 흡착제인 EDTA를 첨가하여 베타-갈락토시다아제의 발현을 유도하고 시간대별로 시료를 취하여 8%의 SDS-PAGE로 전기영동한 후 쿠마지 블루(coomassie brilliant blue R-250)법으로 단백질을 염색하여 베타-갈락토시다아제 발현을 정성 분석한 결과이다.FIG. 5 shows beta-galactosidase by adding EDTA, an iron ion adsorbent, 3 hours after the start of culture, while E. coli transformed with beta-galactosidase enzyme expression vectors pOS2-lacZ and pOS3-lacZ were cultured in LB liquid medium. Induced expression and electrophoresis with 8% SDS-PAGE after sampled at each time period, and qualitative analysis of the beta-galactosidase expression by staining the protein by Coomassie blue (coomassie brilliant blue R-250) method to be.

도 6은 베타-갈락토시다아제 효소 발현 벡터 pOS2-lacZ와 pOS3-lacZ로 형질전환된 대장균을 황화철(Ⅱ)을 첨가한 LB 액체 배지에 배양하면서 배양 개시 3시간 후에 철 이온 흡착제인 EDTA를 첨가하여 베타-갈락토시다아제의 발현을 유도하고 시간대별로 세포의 성장과 발현되는 베타-갈락토시다아제 효소 활성을 측정한 결과이다. FIG. 6 shows that E. coli transformed with beta-galactosidase enzyme expression vectors pOS2-lacZ and pOS3-lacZ were incubated in an LB liquid medium containing iron (II) sulfide, and then EDTA, an iron ion adsorbent, was added 3 hours after the start of culture. By inducing the expression of beta-galactosidase and measuring the growth of cells and the beta-galactosidase enzyme activity expressed over time.

도 7은 베타-갈락토시다아제 효소 발현 벡터 pOS2-lacZ와 pOS3-lacZ로 형질전환된 대장균을 LB 배지, 철 이온이 첨가된 LB 액체 배지, 철분이 첨가된 LB 액체 배지에서 배양하고 3시간 후 철 이온 흡착제인 EDTA를 첨가했을 경우 조건 별로 배양개시 7시간 후의 베타-갈락토시다아제 효소활성을 측정하여 비교한 결과이다. FIG. 7 shows that E. coli transformed with beta-galactosidase enzyme expression vectors pOS2-lacZ and pOS3-lacZ were cultured in LB medium, LB liquid medium with iron ions, and LB liquid medium with iron. When EDTA, an iron ion adsorbent, was added, the beta-galactosidase enzyme activity was measured and compared 7 hours after the start of the culture for each condition.

본 발명은 단백질 발현 제어가 가능한 재조합 발현벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 철 이온에 의해 발현이 강력하게 억제되고 철 이온 흡착제 처리에 의해 탈억제되는 프로모터 또는 상기 프로모터와 이를 조절하는 유전자를 포함하고 있는 재조합 발현벡터를 제작하고 이를 사용하여 단백질 생산 시 배지 내 철 이온이나 철 이온 흡착제를 처리함으로써 재조합 단백질 발현 정도를 정교하고 고효율로 제어하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant expression vector capable of controlling protein expression, and more particularly includes a promoter or a gene that regulates the promoter or the promoter strongly inhibited expression by iron ions and de-suppressed by iron ion adsorbent treatment. The present invention relates to a method for precisely and efficiently controlling the degree of recombinant protein expression by preparing a recombinant expression vector and processing the iron ions or iron ion adsorbents in the medium during protein production using the same.

일반적으로 재조합 단백질을 과발현하기 위한 발현벡터 구축에 사용되는 프로모터들은 발현 효율이 매우 높고 발현 제어가 용이하다는 공통적인 특징을 갖고 있다. 따라서, 몇몇 프로모터들의 경우는 목적 단백질을 세포 총 단백질양의 50%까지 발현시킬 수도 있다. 또한, 프로모터의 발현을 정밀하게 제어함으로써 타겟 단백질의 연속적인 과발현으로 인해 야기될 수 있는 숙주의 불안정성과 발현 플라스미드의 돌연변이 유발 등과 같은 역효과를 효과적으로 회피할 수 있다. 대장균의 재조합 단백질 발현시스템에는 크게 Plac, Ptac, Ptrp, 그리고 세균성바이러스 유래의 프로모터들이 널리 사용되고 있다. In general, promoters used for constructing an expression vector for overexpressing a recombinant protein have a common feature of high expression efficiency and easy expression control. Thus, some promoters may express the protein of interest up to 50% of the total protein of the cell. In addition, precise control of the expression of the promoter can effectively avoid adverse effects such as host instability and mutagenesis of the expression plasmid, which may be caused by continuous overexpression of the target protein. Promoters derived from P lac, P tac, P trp, and bacterial viruses are widely used in E. coli recombinant protein expression systems.

Plac 프로모터 경우는 염색체 상에서는 억제 단백질(LacI)이 프로모터 상 세 곳의 오퍼레이터 부위(lacO)에 결합하여 발현을 억제 한다[Riggs et al., Journal of Molecular Biology, 34, 361(1968); Gilbert et al., Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America, 58, 2415(1967); Beckwith, Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology, 1439(1987)]. 그러나, 유당이나 이소프로필-베타-디-싸이오갈락토피라노사이드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)가 결합하게 되면 LacI가 오퍼레이터 부위로부터 분리되어 Plac 프로모터로부터의 발현이 개시되게 된다 [Majors, Nature, 256, 672(1975); Beckwith et al., Journal of Molecular Biology, 69, 155(1972)]. 현재 널리 사용되는 발현벡터는 일반적으로 하나의 lacO가 존재하고 활성인자 단백질(Catabolite activator protein, CAP) 비의존적인 lacUV5 프로모터를 사용하여 조절계가 단순화되어 있으며, 보통 IPTG를 이용하여 발현을 유도한다. 플라스미드를 안정성 있게 유지하기 위해 LacI 단백질을 균형 있게 합성할 수 있는 lacIq 혹은 lacIq1을 가지고 있는 발현 숙주를 사용한다 [Diaz-Collier et al., Journal of Cellular Biochemistry, 14, 34(1990), Stark, Gene, 51, 255(1987); Amann et al, Gene, 25, 167(1983)]. In the case of the P lac promoter, an inhibitory protein (LacI) binds to three operator sites ( lac O) on the chromosome to inhibit expression [Riggs et al., Journal of Molecular Biology, 34, 361 (1968); Gilbert et al., Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America, 58, 2415 (1967); Beckwith, Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology, 1439 (1987)]. However, when lactose or isopropyl-beta-di-thiogalactopyranoside (IPTG) binds, LacI is separated from the operator site to initiate expression from the P lac promoter [ Majors, Nature, 256, 672 (1975); Beckwith et al., Journal of Molecular Biology, 69, 155 (1972). Currently widely used expression vectors generally have a single lacO and activator protein (Catabolite activator protein, CAP) -independent lacUV5 promoter, which is simplified in regulation and usually induces expression using IPTG. An expression host with lacIq or lacIq1 capable of balanced synthesis of LacI protein is used to maintain the plasmid in a stable manner [Diaz-Collier et al., Journal of Cellular Biochemistry, 14, 34 (1990), Stark, Gene 51, 255 (1987); Amann et al, Gene, 25, 167 (1983).

Ptrp 프로모터의 경우는 트립토판이 존재할 경우 TrpR 단백질이 오퍼레이터 부위에 결합함으로써 발현이 조절 된다[Yanofsky et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology, 1453(1987)]. Ptrp를 이용하여 재조합 단백질을 발현하기 위해서는 trpR 돌연변이 숙주를 사용하며, 트립토판 생합성 유전자의 부분적 돌연변이나 트립토판 유사체인 인도릴-아크릴릭산(indolyl-3-acrylic acid, IAA) 처리를 통해 유발되는 트립토판 결핍 조건에 의해 발현을 유도한다[Yansura et al., Methods in Enzymology, 185, 54(1983); Nichols et al., Methods in Enzymology, 101, 155(1983)]. 그러나, 목적 단백질의 트립토판 함유량이 높거나 세포에 독성을 나타내는 단백질을 발현시킬 경우에는 문제점이 발견되기도 한다. In the trp promoter, expression is regulated by the presence of tryptophan by binding the TrpR protein to the operator site (Yanofsky et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology, 1453 (1987)). To express recombinant protein using P trp, the trp R mutant host is used, and tryptophan caused by partial mutation of tryptophan biosynthesis gene or treatment with indolyl-3-acrylic acid (IAA), a tryptophan analogue Expression is induced by a deficiency condition [Yansura et al., Methods in Enzymology, 185, 54 (1983); Nichols et al., Methods in Enzymology, 101, 155 (1983). However, a problem may be found when a protein having high tryptophan content or expressing a protein which is toxic to cells is expressed.

융합 프로모터인 Ptac과 Ptrc 프로모터는 Ptrp프로모터의 효율성과 lacUV5 프로모터의 조절기작을 갖도록 두 프로모터의 요소가 조합된 것들이다[Amann et al, Gene, 25, 167(1983); Amann et al., Gene, 69, 301(1988)]. Ptac는 -35 부위와 -10 부위의 간격이 16 염기쌍인 반면 Ptrc의 경우는 17개의 염기쌍으로 이루어져 있다. Ptac을 이용할 경우 lac 프로모터를 사용할 때에 비해 타겟 재조합 단백질의 발현양이 5배 이상 증가함을 관찰할 수 있다는 보고가 있다 [Beckwith, Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology, 1439(1987)].The fusion promoters, P tac and P trc promoters, combine elements of both promoters to have the efficiency of the P trp promoter and the regulatory mechanism of the lac UV5 promoter [Amann et al, Gene, 25, 167 (1983); Amann et al., Gene, 69, 301 (1988). P tac has 16 base pairs between -35 and -10 sites, while P trc has 17 base pairs. It has been reported that the use of P tac increases the expression level of the target recombinant protein by more than five times compared to using the lac promoter (Beckwith, Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology, 1439 (1987)).

대장균의 세균성바이러스 람다(λ)의 프로모터인 PL과 PR을 이용한 단백질 발현 시스템 역시 고효율 발현시스템으로 잘 알려져 있다[Eisen et al., Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America, 66, 855(1968)]. 이 시스템은 플라스미드 혹은 프로파지 상에서 발현되는 온도 민감성 억제 단백질인 cI857에 의해 조절된다[Roberts et al., Lysogenic induction, 1983(123)]. 즉, 30 ℃에서는 람다 프로모터에 cI857 단백질이 결합하여 전사를 억제하며, 42 ℃에서는 cI857 단백질이 불활성화되어 람다 프로모터 하에 있는 유전자의 발현을 유도한다. 그러나, 열 충격에 의한 단백질 분해효 소의 자연적인 과발현은 목적 단백질 발현에 영향을 줄 수 있기 때문에 이를 개량한 열충격 유전자 돌연변이 숙주를 사용하거나 pH에 의해 발현을 유도하는 시스템이 개발되기도 하였다[Poindxter et al., Gene, 97, 125]. 그리고 람다 프로모터 PL을 사용할 경우 단백질 발현이 Plac 보다 약 10배 가량 증가된다는 보고가 있다[Rosenberg et al., Methods in Enzymology, 101, 123(1983)]. Protein expression systems using P L and P R , promoters of the bacterial virus lambda (λ) of Escherichia coli, are also well known as highly efficient expression systems [Eisen et al., Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America, 66, 855 (1968). This system is regulated by cI857, a temperature sensitive inhibitory protein expressed on plasmids or propages (Roberts et al., Lysogenic induction, 1983 (123)). That is, at 30 ° C., the cI857 protein binds to the lambda promoter to inhibit transcription, and at 42 ° C., the cI857 protein is inactivated to induce the expression of the gene under the lambda promoter. However, since natural overexpression of proteolytic enzymes by heat shock may affect the expression of the target protein, a system has been developed that utilizes an improved heat shock gene mutant host or induces expression by pH [Poindxter et al. , Gene, 97, 125]. In addition, the use of lambda promoter P L has been reported to increase protein expression about 10-fold higher than Plac (Rosenberg et al., Methods in Enzymology, 101, 123 (1983)).

세균성바이러스 T7을 이용한 발현 시스템은 위에 설명한 프로모터들과는 달리 T7 리보핵산 중합효소가 필요하다. 이 T7 리보핵산 중합효소는 숙주의 프로모터를 인지하지 못하므로 완벽한 선택성을 갖고 있고, 대장균의 리보핵산 중합효소 보다 5배 정도 신속히 리보핵산을 합성하며, 목표 유전자의 발현은 억제인자의 필요 없이 완벽하게 유도될 수 있다는 장점이 있다. 보통 T7 리보핵산 중합효소 유전자는 lacI와 함께 숙주의 염색체 상에 삽입되어 있으며, lacUV5 프로모터의 통제 하에 있는 균주를 사용한다. Expression systems using bacterial virus T7 require T7 ribonucleic acid polymerase, unlike the promoters described above. This T7 ribonucleic acid polymerase has perfect selectivity because it does not recognize the host promoter, and it synthesizes ribonucleic acid about five times faster than Ribonucleic acid polymerase of E. coli, and the expression of the target gene is perfect without the need for inhibitory factor. There is an advantage that it can be derived. Usually the T7 ribonucleic acid polymerase gene is inserted on the host chromosome along with lac I and uses a strain under the control of the lac UV5 promoter.

한편, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 플라스미드에서 유래한 PG 프로모터가 있다[Yen, Journal of Bacteriology, 173, 5328(1991)]. PG 프로모터는 살리실산과 조절 유전자인 nahR에 의해 발현이 유도 및 조절 된다. 한편 인에 의해 조절되는 PphoA와 Pugp 프로모터가 알려지기도 했다[Craig et al., Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America, 88, 2500(1991); Su T-Z et al., Gene, 90, 129(1990)]. PphoA는 목적 단백질을 외부로 분비할 경우 사용하고, Pugp는 그 효율이 Ptac의 80%에 이른다고 보고 되었다. On the other hand, there is a P G promoter derived from the plasmid of Pseudomonas putida (Yen, Journal of Bacteriology, 173, 5328 (1991)). The P G promoter is induced and regulated by salicylic acid and the regulatory gene nah R. On the other hand, P pho A and Pugp promoters regulated by phosphorus have also been known [Craig et al., Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America, 88, 2500 (1991); Su TZ et al., Gene, 90, 129 (1990)]. P pho A is used to secrete the target protein to the outside, and P ugp has been reported to reach 80% of P tac.

대장균의 발현 시스템에서 일반적으로 사용되고 있는 상기 프로모터들은 그 효율이 비교적 높은 장점을 갖고 있으나, 발현을 위해 특정 숙주를 사용해야 하거나 발현의 정교한 제어가 어렵다는 단점이 있다. 특히, 발현숙주의 생육을 저해하는 효과가 있는 재조합 단백질을 생산하고자 할 때는 발현을 유도하는 시점까지는 목적단백질의 발현을 강력하게 제어해야 할 필요가 있으나 현재 이용되는 대부분의 프로모터는 이러한 조절이 어려운 문제점을 갖고 있다. 또한, 기존의 발현 시스템은 이소프로필티오갈락토사이드(isopropyl-thiogalactoside, IPTG)와 같이 매우 고가의 화합물을 발현 유도물질로 사용해야 하기 때문에 대량 생산공정에 적용하기에는 비경제적인 단점을 갖고 있다. The promoters generally used in the E. coli expression system have the advantage of relatively high efficiency, but has the disadvantage of using a specific host for expression or difficult control of expression. In particular, when producing a recombinant protein having an effect of inhibiting the growth of the expression host, it is necessary to strongly control the expression of the target protein until the induction of expression, but most of the promoters currently used are difficult to control this. Have In addition, the existing expression system has a disadvantage of being uneconomical to apply to a mass production process, because a very expensive compound such as isopropyl-thiogalactoside (IPTG) must be used as an expression inducer.

따라서, 강력한 효율을 지니며 필요에 따라 발현 정도를 정교하게 조절할 수 있고 특정 숙주 균주를 사용할 필요 없이 다양한 균주에서 손쉽게 사용할 수 있으며 무엇보다도 저가의 유도체를 사용하여 대량 생산 공정을 개발하는데도 경제적으로 적용될 수 있는 발현시스템의 개발이 요구된다.Therefore, it has powerful efficiency and can precisely control the expression level as needed, can be easily used in various strains without using a specific host strain, and above all, it can be economically applied even in developing a mass production process using low cost derivatives. Development of an expression system is required.

이에, 본 발명자들은 클로닝된 유전자의 발현을 효과적으로 조절하고 높은 효율로 발현을 유도할 수 있는 새로운 발현시스템을 구축하기 위하여 연구한 결과, 저가의 발현 억제제 및 발현 억제 제거제를 사용하여 용이하게 단백질 발현 정도를 조절할 수 있는 신규 재조합 발현벡터 및 이를 활용한 재조합 단백질 발현 정도를 고효율로 제어하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors have studied to establish a new expression system that can effectively regulate the expression of cloned genes and induce expression with high efficiency, and as a result, low-cost expression inhibitors and expression suppressors can be used to easily express protein. The present invention was completed by developing a novel recombinant expression vector capable of controlling and a method of controlling the expression level of recombinant protein using the same with high efficiency.

따라서, 본 발명은 저가의 발현 억제제 및 발현억제 제거제를 사용하여 용이하게 단백질 발현 정도를 조절할 수 있는 재조합 발현벡터 및 이를 이용하여 재조합 단백질 발현 정도를 고효율로 제어하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a recombinant expression vector capable of easily adjusting the expression level of a protein using a low-cost expression inhibitor and an expression inhibitor, and a method for efficiently controlling the expression level of the recombinant protein using the same.

본 발명은 철 이온 농도에 의해 조절받는 프로모터 또는 이 프로모터와 철 이온과 결합하여 프로모터의 발현을 억제하는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 그 특징으로 한다.The present invention is characterized by a recombinant expression vector comprising a promoter regulated by iron ion concentration or a gene encoding a protein that binds the promoter with iron ions to inhibit expression of the promoter.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 이용하여 배지 내 철 이온 농도를 조절하는 단백질 발현 정도의 제어방법을 또 다른 특징으로 한다.In another aspect, the present invention is characterized by a method for controlling the degree of protein expression to control the iron ion concentration in the medium using the recombinant expression vector.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.The present invention will be described in more detail as follows.

본 발명은 철 이온에 의해 발현이 강력하게 억제되고 철 이온 흡착제 처리에 의해 탈억제되는 프로모터 또는 상기 프로모터와 이를 조절하는 유전자를 포함하고 있는 재조합 발현벡터를 단백질을 생산 시 배지 내 철 이온이나 철 이온 흡착제를 처리함으로써 재조합 단백질 발현 정도를 정교하고 고효율로 제어하는 방법에 관한 것이다.The present invention provides a promoter that is strongly inhibited by iron ions and that is suppressed by iron ion adsorbent treatment, or a recombinant expression vector containing the promoter and a gene controlling the same. The present invention relates to a method for precisely and efficiently controlling the degree of recombinant protein expression by treating an adsorbent.

본 발명은 철 이온에 반응하는 프로모터 또는 이 프로모터와 철 이온과 결합하여 프로모터의 발현을 억제하는 Fur 단백질을 인코딩하는 fur 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터에 그 특징이 있으며, 상기 프로모터는 일반적으로 알려진 철 이온 농도와 Fur 단백질의 작용에 의해 조절되는 프로모터라면 모두 적용 가능하며, 구체적으로 entC, fepA, fhuA, fiu 유전자 등의 프로모터가 적합하다.The present invention is characterized by a recombinant expression vector comprising a promoter responsive to iron ions or a fur gene encoding the promoter and a Fur protein that binds the promoter and iron ions to inhibit the expression of the promoter, and the promoter is generally known as iron. As long as the promoter is regulated by the ion concentration and the action of the Fur protein, all of them are applicable. Specifically, promoters such as entC , fepA , fhuA , fiu genes are suitable.

특히, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 대장균의 entC 유전자 전체 또는 일부 DNA 단편을 포함하는 프로모터, 또는 상기 프로모터와 서열번호 2로 표시되는 대장균의 전사조절 단백질 Fur를 인코딩하는 fur 유전자 전체 또는 일부 DNA 단편을 포함하는 재조합 발현벡터를 포함하며, 이때 fur 유전자가 포함된 발현벡터의 경우 entC 프로모터를 사용하여 발현하고자 하는 목적단백질의 발현을 철분 흡착제를 처리하여 유도하기 전까지 보다 강력하게 억제할 수 있는 장점이 있다. 특정 재조합 단백질의 발현으로 숙주의 생육이 억제되는 경우 발현유도 전까지의 기저발현을 최소화함으로써 이러한 문제점을 극복할 수 있다.In particular, the present invention provides a promoter comprising all or part of the DNA fragment of the entC gene of E. coli, or SEQ ID NO: 1, or the entire or partial DNA of the fur gene encoding the promoter and the regulatory protein Fur of E. coli represented by SEQ ID NO: 2 Including a recombinant expression vector containing a fragment, in the case of the expression vector containing the fur gene advantage that can be more strongly inhibited the expression of the target protein to be expressed using the entC promoter until the iron adsorbent is treated There is this. When the growth of the host is inhibited by the expression of a specific recombinant protein can overcome this problem by minimizing the base expression before expression induction.

더욱 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 entC 유전자 프로모터를 포함하고 도 1-A의 개열지도로 나타내는 발현벡터 pOS2를 포함한다.More preferably, it comprises the expression vector pOS2 including the entC gene promoter represented by SEQ ID NO: 1 and represented by the cleavage map of Fig. 1-A.

더욱 바람직하게는 상기 발현벡터는 서열번호 1로 표시되는 entC 유전자 프로모터와 서열번호 2로 표시되는 fur 유전자를 포함하고 도 1-B의 개열지도로 나타내는 발현벡터 pOS3을 포함한다.More preferably, the expression vector includes an entC gene promoter represented by SEQ ID NO: 1 and a fur gene represented by SEQ ID NO: 2, and includes an expression vector pOS3 represented by a cleavage map of FIGS. 1-B.

대장균을 철 이온 결핍조건에서 배양하면 대장균은 외부의 철 이온을 흡착하여 세포 내로 유입하기 위하여 철 이온 흡착운반체 화합물인 엔테로켈린(enterochelin)을 생합성하는데 이에 필요한 일련의 효소를 코딩하는 오페론(enterochelin biosynthesis operon)의 entC 프로모터는 배지 내의 철 이온 농도에 민감하게 반응하여 발현이 조절된다[Kwon et al., Journal of Bacteriology, 178, 3252(1996), McHugh et al., Journal of Biological Chemistry, 278, 29478(2003)]. 그러나, 이러한 선행연구는 철 이온 농도에 의해 조절되는 유전자의 발현을 미생물 생리적인 측면에서 연구한 것들이며 이러한 성질을 재조합 단백질 발현계 구축에 응용한 예는 없다.When Escherichia coli is cultured under iron ion deprivation conditions, E. coli enters a cell of enzymes necessary for biosynthesis of enterochelin, an iron ion-adsorbing carrier compound, to adsorb external iron ions into cells. Ent C promoter is sensitively regulated in response to iron ion concentration in the medium (Kwon et al., Journal of Bacteriology, 178, 3252 (1996), McHugh et al., Journal of Biological Chemistry, 278, 29478). (2003). However, these previous studies have studied the expression of genes regulated by iron ion concentration in terms of microbial physiology, and there are no examples of applying these properties to the construction of recombinant protein expression systems.

본 발명에서는 이러한 entC 프로모터의 특성을 활용하여 구현예의 하나로서, 재조합 단백질 발현용 벡터를 제작하였다. 나아가 철 이온과 결합하여 entC와 같이 철 이온 존재여부에 따라 조절되는 프로모터에 부착함으로써 그 발현을 억제하는 Fur(ferric uptake regulation) 전사 조절 단백질을 코딩하는 fur 유전자를 서브클로닝한 벡터를 구축함으로써 보다 정교하게 발현을 조절할 수 있는 시스템을 구축하였다. In the present invention, as one of the embodiments utilizing the characteristics of the ent C promoter, a recombinant protein expression vector was produced. Furthermore, by constructing a vector subcloning the fur gene encoding a fur (ferric uptake regulation) transcriptional regulator protein that binds to iron ions and attaches to a promoter regulated according to the presence of iron ions such as ent C, thereby inhibiting its expression. A system was developed to control expression exquisitely.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 이용하여 배지 내 철 이온 농도를 조절하는 단백질 발현의 제어방법을 포함한다.In addition, the present invention includes a method of controlling protein expression to control the iron ion concentration in the medium by using the recombinant expression vector.

즉, 단백질 발현 억제제로 철 이온, 바람직하게는 황화철, 염화철 등과 발현 유도제로 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid), 다이피리딜(2,2'-dipyridyl) 등을 사용하여 단백질 생산 배지 내 철 이온 농도를 조절하여 단백질 발현 정도를 제어하는 방법을 포함한다. 본 발명에서는 하나의 구현예로 베타-갈락토시다아제 유전자 lacZ를 pOS3에 클로닝하여 사용하였다.That is, protein production medium using iron ions as the protein expression inhibitor, preferably iron sulfide, iron chloride and the like, and a chelating agent as the expression inducing agent, preferably EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid), dipyridyl (2,2'-dipyridyl), etc. It includes a method of controlling the degree of protein expression by adjusting the iron ion concentration. In one embodiment of the present invention, the beta-galactosidase gene lacZ was cloned into pOS3 and used.

상기 entC 프로모터를 이용한 발현 벡터들은 배지에 황화철과 같은 철 화합물을 첨가하여 철 이온의 양을 늘리면 Fur 단백질의 작용을 매개로 발현이 강력하게 억제되고 반면에 EDTA 또는 다이피리딜의 킬레이트제(chelate compound)를 첨가 하여 철 이온을 제거함으로써 Fur 단백질에 의한 전사 억제에서부터 완전하게 벗어나 높은 효율로 발현될 수 있다. Expression vectors using the ent C promoter are strongly inhibited by the addition of an iron compound, such as iron sulfide, to the medium to increase the amount of iron ions through the action of the Fur protein, whereas the chelate of EDTA or dipyridyl By removing iron ions by adding a compound, it can be expressed with high efficiency completely from the inhibition of transcription by Fur protein.

다시 말하면, 본 발명은 철 이온 흡착운반체 화합물인 엔테로켈린(enterochelin) 생합성효소들을 코딩하는 entCEBA 오페론의 프로모터와 철 이온과 결합하여 이 프로모터의 발현을 억제하는 전사조절 단백질인 Fur(ferric uptake regulation)를 코딩하는 fur 유전자를 대장균의 염색체 DNA로부터 PCR로 클로닝하여 다중클로닝 부위, 앰피실린 항생제 내성유전자, 복제신호서열 등과 조합하여 발현벡터를 제작하고 상기 발현벡터의 프로모터 하에 타겟 유전자를 클로닝하고 이 재조합 발현벡터를 형질전환시킨 대장균을 배양 배지에 철 이온을 첨가하여 타겟 단백질의 발현을 강력하게 억제하거나 철 이온 흡착제를 첨가함으로써 철 이온 매개 발현 억제에서 벗어나 목적 단백질을 강력하게 발현시키는 방법에 관한 것이다. In other words, the present invention is a fur (ferric uptake regulation), a transcriptional regulatory protein that binds to iron and ion promoters of the ent CEBA operon that encodes enterochelin biosynthesis, an iron ion adsorption carrier compound. the cloned fur gene encoding by PCR from the chromosome DNA of E. coli by the combination with the multi-cloning site, ampicillin antibiotic resistance gene, the replication signal sequence produced an expression vector and cloning a target gene under the promoter of the expression vector and the recombinant expression E. coli transformed with the vector relates to a method of strongly inhibiting the expression of a target protein by adding iron ions to the culture medium or strongly expressing a target protein by suppressing iron ion mediated expression by adding an iron ion adsorbent.

이하 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하겠는바, 다음 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명이 다음 실시예에 의해 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 실시예에서 타겟 단백질로 사용된 베타-갈락토시다아제(lacZ)는 단지 본 발명을 완성하기 위한 예이며, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. The following examples are only for explaining the present invention in more detail, and the present invention is not limited by the following examples in the technical field to which the present invention pertains. It will be self-evident for those of ordinary knowledge. In particular, beta-galactosidase ( lacZ ) used as a target protein in the examples is merely an example for completing the present invention, and the present invention is not limited thereto.

실시예 1 : 대장균의 Example 1 E. coli entCentC 프로모터를 포함하는 발현벡터 pOS2와 pOS3 제작 Expression vector pOS2 and pOS3 including a promoter

대장균 MC4100 균주의 염색체 DNA를 주형으로 프라이머쌍(서열번호 3, 4)을 사용하여 entC 프로모터를 포함하는 DNA 절편(서열번호 1)을 PCR로 증폭하였다. PCR 산물을 PvuII와 AatII로 절단한 후 약 0.4 kb의 DNA 단편을 확보하고, 플라스미드 pUC18을 동일한 효소로 절단하여 2.0 kb DNA 절편을 분리하여 T4 DNA 결합효소를 사용하여 상기 PCR 산물과 연결하여 약 2.7 kb의 플라스미드 pOS1을 확보하였다. 상기 pOS1에 다중클로닝부위(Multiple cloning sites)를 첨가하기 위하여 pEXT20 [Dykxhoorn et al. Gene 177:133, (1996)]을 제한효소 EcoRI과 ScaI으로 절단하여 약 0.6 kb의 DNA 절편을 확보하여 동일한 제한효소로 pOS1을 절단하여 분리한 2.2 kb DNA 절편과 T4 DNA 결합효소를 사용하여 연결하여 발현벡터 pOS2를 확보하였다[도 1-A]. DNA fragments containing the entC promoter (SEQ ID NO: 1) were amplified by PCR using primer pairs (SEQ ID NOs: 3, 4) as a template with chromosomal DNA of E. coli MC4100 strain. After digesting the PCR product with Pvu II and Aat II, DNA fragments of about 0.4 kb were obtained, plasmid pUC18 was digested with the same enzyme, 2.0 kb DNA fragments were isolated, and the T4 DNA binding enzyme was used to connect with the PCR product. About 2.7 kb of plasmid pOS1 was obtained. To add multiple cloning sites to the pOS1 pEXT20 [Dykxhoorn et al. Gene 177: 133, (1996)] was digested with restriction enzymes Eco RI and Sca I to obtain a DNA fragment of about 0.6 kb, and a 2.2 kb DNA fragment and a T4 DNA binding enzyme were isolated by cleaving pOS1 with the same restriction enzyme. By connecting to obtain an expression vector pOS2 [Fig. 1-A].

상기 발현벡터 pOS2에 entC 프로모터의 발현을 조절하는 Fur 단백질을 인코딩하는 fur 유전자(서열번호 2)를 추가하기 위하여 대장균 MC4100 균주의 염색체 DNA를 주형으로 프라이머쌍(서열번호 5, 6)으로 PCR 증폭하여 제한효소 PvuII와 AatII로 절단하여 약 600 bp의 DNA 절편을 확보하여 동일한 제한효소로 처리한 pOS2 벡터에 서브클로닝하여 약 3.1 kb의 발현벡터 pOS3을 제작하였다[도 1-B].PCR amplification of the chromosomal DNA of E. coli MC4100 strain with primer pairs (SEQ ID NOs: 5 and 6) to add a fur gene (SEQ ID NO: 2) encoding a Fur protein that regulates the expression of the entC promoter to the expression vector pOS2. A 600 bp DNA fragment was obtained by digestion with restriction enzymes Pvu II and Aat II and subcloned into a pOS2 vector treated with the same restriction enzyme to produce an expression vector pOS3 of about 3.1 kb [FIG. 1-B].

실시예 2: pOS2-lacZ와 pOS3-lacZ의 제조Example 2: Preparation of pOS2-lacZ and pOS3-lacZ

베타-갈락토시다아제를 인코딩하는 lacZ 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pRS415[Simon et al., Gene 53:85, (1987)]를 주형으로 특정 프라이머쌍(서열번호 7, 8)을 사용하여 PCR 증폭한 산물을 제한효소 EcoRI과 BamHI으로 절단하여 약 3.1 kb의 DNA 절편을 확보하여 동일한 제한효소로 절단한 발현 벡터 pOS2와 pOS3에 서브클로닝하여 각기 pOS2-lacZ[도 2-A]와 pOS3-lacZ[도 2-B] 벡터를 제작하였다. 이렇게 제조된 pOS2-lacZ와 pOS3-lacZ를 대장균 JM109 균주에 형질전환하여 발현되는 베타-갈락토시다아제 활성을 측정하였다. 한편, 대장균 JM109/pOS3-lacZ를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2005년 6월 10일에 기탁하여 기탁번호 KCTC 10816BP를 부여받았다. PCR amplification using plasmid pRS415 (Simon et al., Gene 53:85, (1987)) containing the lacZ gene encoding beta-galactosidase as a template using specific primer pairs (SEQ ID NOs: 7, 8) A product was digested with the restriction enzymes Eco RI and Bam HI to obtain a DNA fragment of about 3.1 kb and subcloned into expression vectors pOS2 and pOS3 digested with the same restriction enzymes, respectively, to display pOS2-lacZ [Fig. The lacZ [Fig. 2-B] vector was constructed. The pOS2-lacZ and pOS3-lacZ thus prepared were transformed into E. coli JM109 strain to measure the beta-galactosidase activity expressed. Meanwhile, E. coli JM109 / pOS3-lacZ was deposited with the Korea Biotechnology Research Institute Gene Bank on June 10, 2005 and was given accession number KCTC 10816BP.

실시예 3: Example 3: entent C 프로모터에 의한 베타-갈락토시다아제(lacZ)의 발현Expression of beta-galactosidase (lacZ) by the C promoter

대장균 JM109/pOS2-lacZ와 대장균 JM109/pOS3-lacZ를 5 ml의 LB 액체 배지에 접종하여 37 ℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 이 전배양액을 LB 배지에 1/100 부피로 접종하여 37 ℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양개시 3 시간 후 OD600≒0.5 ~ 1.0 사이에 철 이온 흡착제인 다이피리딜(100 ~ 500 μM)을 첨가하여 배양기 내 철 결핍조건을 유도한 후 베타-갈락토시다아제 발현 수준을 비교 분석한 결과 철분흡착제 처리 시 균주의 성장에는 영향이 없었으며 철분흡착제 처리 후 극적인 베타-갈락토시다아제 발현 증가를 확인할 수 있었다[도 3].E. coli JM109 / pOS2-lacZ and E. coli JM109 / pOS3-lacZ were inoculated in 5 ml of LB liquid medium and shaken at 37 ° C. at 200 rpm. This preculture was inoculated at 1/100 volume into LB medium and shaken at 37 rpm at 200 rpm. After 3 hours of incubation, the iron deficiency condition was induced by the addition of iron ion adsorbent, dipyridyl (100 ~ 500 μM) between OD 600 ≒ 0.5 ~ 1.0, and the beta-galactosidase expression levels were compared and analyzed. Results There was no effect on the growth of the strain during iron adsorbent treatment and dramatic beta-galactosidase expression increased after iron adsorbent treatment [FIG. 3].

상기 조건에서 사용한 다이피리딜 대신 일반적으로 사용하는 양이온 흡착제인 EDTA(100 ~ 500 μM)를 처리하였을 때의 베타-갈락토시다아제 발현 수준을 비교 분석하였는데 다이피리딜을 처리하였을 때와 동일한 결과를 얻었다[도 4]. 또한 EDTA를 첨가한 배양시료와 EDTA를 첨가하지 않은 배양시료를 시간별로 취하여 단백질 발현 수준을 8%의 에스디에스 폴리아클릴아마이드 겔전기영동(SDS-PAGE)을 통하여 분석한 결과 도 4에서 확인한 바와 같이 철분 흡착제 처리 후 급격한 베타-갈락토시다아제 발현 증가를 확인할 수 있었다[도 5]. The beta-galactosidase expression level of EDTA (100 to 500 μM), which is a commonly used cationic adsorbent instead of dipyridyl, was compared and analyzed. Obtained [Fig. 4]. In addition, the cultured samples without EDTA and the cultured samples without EDTA were taken over time, and the protein expression levels were analyzed by 8% SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), as shown in FIG. 4. Rapid beta-galactosidase expression was confirmed after iron adsorbent treatment [FIG. 5].

한편, 배지에 황산철(Ⅱ)(1 ~ 100 μM)을 추가로 첨가하여 철 이온 과다 조건을 조성하여 배양하다가 세포의 농도가 OD600≒ 0.5 ~ 1.0 사이에 도달하였을 때 EDTA(100 ~ 500 μM)를 첨가한 후의 베타-갈락토시다아제 발현정도를 비교하였다. 추가의 철분을 공급함으로써 흡착제 처리 이전의 기저 발현 정도를 현격하게 감소시킬 수 있었으며 상기에서 관찰한 바와 같이 철 이온 흡착제 처리에 의해 베타-갈락토시다아제의 발현을 강력하게 유도할 수 있었다[도 6]. 상기 형질전환 대장균 JM109/pOS2-lacZ와 대장균 JM109/pOS3-lacZ를 일반적인 복합배지인 LB 배지, 황화철이 첨가된 LB 배지, 황화철이 첨가된 LB 배지에 배양하면서 철 이온 흡착제를 처리했을 경우의 베타-갈락토시다아제 발현을 비교한 결과, 철 이온에 의한 발현 억제와 철 이온 흡착제에 의한 강력한 발현 유도를 확인할 수 있었다[도 7]. On the other hand, adding ferrous sulfate (II) (1 ~ 100 μM) to the medium to form a ferrous ion excess condition and incubated when the concentration of cells reached between OD 600 ≒ 0.5 ~ 1.0 EDTA (100 ~ 500 μM ) Beta-galactosidase expression levels were compared after the addition. By supplying additional iron, it was possible to significantly reduce the level of basal expression prior to adsorbent treatment and strongly induce the expression of beta-galactosidase by iron ion adsorbent treatment as observed above [FIG. 6. ]. Beta- when the transformed Escherichia coli JM109 / pOS2-lacZ and Escherichia coli JM109 / pOS3-lacZ were treated with an iron ion adsorbent while incubating in a general composite medium, LB medium, LB medium with iron sulfide, and LB medium with iron sulfide. As a result of comparing galactosidase expression, it was confirmed that the iron ions suppress the expression and the strong expression induced by the iron ion adsorbent [FIG. 7].

한편, entC 프로모터에 의한 베타-갈락토시다아제 발현을 조절하기 위한 철 이온 농도와 철 이온 흡착제 농도를 조사한 결과 LB 배지에 1 μM의 황화철을 첨가함으로써 강력하게 기저 발현을 억제할 수 있었고 발현 유도를 위해서 첨가해주는 철 이온 흡착제의 농도에 비례해서 발현이 증가함을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 entC 프로모터와 fur 전사조절 단백질 유전자로 구성된 발현시스템은 배지에 미량의 철 이온을 첨가하여 타겟 단백질의 발현을 차단하다가 첨가하는 철 이온 흡착 제 양에 따라 정교하게 발현 정도를 조절할 수 있는 발현시스템임이 입증되었다.On the other hand, the iron ion concentration and the iron ion adsorbent concentration for controlling beta-galactosidase expression by the ent C promoter were examined, and the basal expression was strongly inhibited by adding 1 μM of iron sulfide to the LB medium. It was confirmed that the expression increases in proportion to the concentration of the iron ion adsorbent added for. That is, the expression system consisting of the ent C promoter and fur transcription control protein genes can finely control the expression level according to the amount of iron ion adsorbent added while blocking the expression of the target protein by adding a small amount of iron ions to the medium. It has been proven to be an expression system.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 개발한 단백질 발현시스템은 저가의 발현 억제제 및 발현 유도제를 사용하여 타겟 단백질 발현을 정교하게 조절할 수 있는 시스템으로 재조합 단백질 대량 생산 공정에 경제적으로 사용될 수 있을 것이다. As described above, the protein expression system developed in the present invention can be economically used in a recombinant protein mass production process as a system capable of precisely controlling target protein expression using a low-cost expression inhibitor and an expression inducing agent.

서열목록 전자파일 첨부 Attach sequence list electronic file  

Claims (10)

삭제delete 철 이온 농도에 의해 조절받고 서열번호 1로 표시되는 대장균의 entC 유전자인 프로모터와, 철 이온과 결합하여 이 프로모터의 발현을 억제하는 단백질인 서열번호 2로 표시되는 대장균의 전사조절 단백질 Fur를 인코딩하는 fur 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.A promoter of the entC gene of Escherichia coli regulated by iron ion concentration and represented by SEQ ID NO: 1, and a transcriptional regulatory protein Fur of Escherichia coli represented by SEQ ID NO: 2, which binds to iron ions to inhibit expression of the promoter. A recombinant expression vector comprising a fur gene. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 2 항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 1-B의 개열지도로 나타내는 pOS3인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.The recombinant expression vector of claim 2, wherein the expression vector is pOS3 represented by a cleavage map of FIGS. 1-B. 삭제delete 제 6 항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 2-B의 개열지도로 나타내는 pOS3-lacZ[KCTC 10816BP]인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.The recombinant expression vector according to claim 6, wherein the expression vector is pOS3-lacZ [KCTC 10816BP] shown in the cleavage map of FIG. 2-B. 청구항 2, 6 및 8 중에서 선택된 어느 한 항으로부터 선택된 재조합 발현벡터를 이용하여 배지 내 철 이온 농도를 조절하는 것을 특징으로 하는 단백질 발현 정도의 제어방법.Claims 2, 6 and 8 using a recombinant expression vector selected from any one selected from the method of controlling the protein expression level, characterized in that the iron ion concentration in the medium is adjusted. 제 9 항에 있어서, 상기 철 이온 농도를 조절하기 위하여 킬레이트제 또는 철 화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.10. The method according to claim 9, wherein a chelating agent or an iron compound is used to adjust the iron ion concentration.
KR1020050056457A 2005-06-28 2005-06-28 Controllable recombinant protein expression vectors KR100697243B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050056457A KR100697243B1 (en) 2005-06-28 2005-06-28 Controllable recombinant protein expression vectors

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050056457A KR100697243B1 (en) 2005-06-28 2005-06-28 Controllable recombinant protein expression vectors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070000822A KR20070000822A (en) 2007-01-03
KR100697243B1 true KR100697243B1 (en) 2007-03-22

Family

ID=37868566

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050056457A KR100697243B1 (en) 2005-06-28 2005-06-28 Controllable recombinant protein expression vectors

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100697243B1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5342782A (en) 1992-02-24 1994-08-30 Washington University Tightly regulated expression system for eucaryotic cells
US6605450B1 (en) 2000-05-25 2003-08-12 Chiron Corporation Iron regulation of the PpSEC10 transcriptional regulatory region of Pichia pastoris and methods of use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5342782A (en) 1992-02-24 1994-08-30 Washington University Tightly regulated expression system for eucaryotic cells
US6605450B1 (en) 2000-05-25 2003-08-12 Chiron Corporation Iron regulation of the PpSEC10 transcriptional regulatory region of Pichia pastoris and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Mol. Biol., Vol.212:669-682 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20070000822A (en) 2007-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Changeux The feedback control mechanism of biosynthetic L-threonine deaminase by L-isoleucine
Mukaihara et al. Ralstonia solanacearum type III effector RipAY is a glutathione-degrading enzyme that is activated by plant cytosolic thioredoxins and suppresses plant immunity
Trovato et al. The plant oncogene rolD encodes a functional ornithine cyclodeaminase
Stojanowic et al. Physiological role of the F 420-non-reducing hydrogenase (Mvh) from Methanothermobacter marburgensis
Kasai et al. Characterization of the gallate dioxygenase gene: three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6
Gong et al. Deciphering the crucial roles of transcriptional regulator GadR on gamma-aminobutyric acid production and acid resistance in Lactobacillus brevis
Li et al. Cytochrome cd 1 nitrite reductase NirS is involved in anaerobic magnetite biomineralization in Magnetospirillum gryphiswaldense and requires NirN for proper d 1 heme assembly
Chen et al. DR2539 is a novel DtxR-like regulator of Mn/Fe ion homeostasis and antioxidant enzyme in Deinococcus radiodurans
Guo et al. Cloning and identification of a novel tyrosinase and its overexpression in Streptomyces kathirae SC-1 for enhancing melanin production
Nezhad et al. Discrimination between two rice metallothionein isoforms belonging to type 1 and type 4 in metal‐binding ability
Parwata et al. Heterologous ectoine production in Escherichia coli: optimization using response surface methodology
Navazo et al. Three independent signalling pathways repress motility in Pseudomonas fluorescens F113
Hashimoto et al. Nitrile pathway involving acyl-CoA synthetase: overall metabolic gene organization and purification and characterization of the enzyme
Luo et al. Pseudomurein endoisopeptidases PeiW and PeiP, two moderately related members of a novel family of proteases produced in Methanothermobacter strains
Acera et al. A cyanide-induced 3-cyanoalanine nitrilase in the cyanide-assimilating bacterium Pseudomonas pseudoalcaligenes strain CECT 5344
Jeong et al. PprM is necessary for up-regulation of katE1, encoding the major catalase of Deinococcus radiodurans, under unstressed culture conditions
Parthasarathy et al. The Arabidopsis thaliana gene annotated by the locus tag At3g08860 encodes alanine aminotransferase
Rzeznicka et al. Cloning and functional expression of a nitrile hydratase (NHase) from Rhodococcus equi TG328-2 in Escherichia coli, its purification and biochemical characterisation
Tsevelkhoroloo et al. LacI-family transcriptional regulator DagR acts as a repressor of the agarolytic pathway genes in Streptomyces coelicolor A3 (2)
Hao et al. ACC deaminase activity in avirulent Agrobacterium tumefaciens D3
Kato et al. Artificial control of transgene expression in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast using the lac regulation system from Escherichia coli
KR100697243B1 (en) Controllable recombinant protein expression vectors
Kulakova et al. Cloning of the phosphonoacetate hydrolase gene from Pseudomonas fluorescens 23F encoding a new type of carbon–phosphorus bond cleaving enzyme and its expression in Escherichia coli and Pseudomonas putida
Kim et al. Oxidative stress response of Deinococcus geothermalis via a cystine importer
Kushwaha et al. Gamma-glutamyl transpeptidase from two plant growth promoting rhizosphere fluorescent pseudomonads

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130305

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140314

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150312

Year of fee payment: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee