KR100679950B1 - Composition for cell?therapy of amyotrophic lateral sclerosis using mannitol and stem cell derived from umbilical cord blood - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제대혈 유래 줄기세포와 뇌혈관장벽(blood brain-barrier: BBB)을 통과할 수 있는 물질인 만니톨(mannitol)을 사용하여 정맥주사(intravenous injection) 및 경막내 주사(intrathecal injection) 함으로써, 근위축성측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS, 루게릭병) 환자를 치료하는 세포치료에 관한 것으로, 환자와 줄기세포의 조직적합성 유전자가 일치하는 것을 기본으로 하므로 면역거부 반응을 해결할 수 있으며, 다른 배아 줄기세포처럼 인체 내에 기형종(teratoma)나 기형암(terato carcinoma) 발생 가능성이 없다는 장점이 있어, 기존의 어떠한 외과적 또는 약물적 치료법이 없는 근위축성측삭경화증 환자들에게 실질적으로 임상의 개선을 보여주는 새로운 치료법으로서 환자들에게 새로운 희망을 안겨줄 것으로 기대된다.According to the present invention, intravenous injection and intrathecal injection using mannitol, a substance capable of passing through cord blood-derived stem cells and blood brain-barrier (BBB), Cell therapy for the treatment of patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), based on the matching of histocompatibility genes between the patient and stem cells, can solve the immune rejection response, and other embryonic stem cells As a result, there is no possibility of teratoma or terato carcinoma in the human body, which is a new treatment that shows substantial clinical improvement in patients with amyotrophic lateral sclerosis without any conventional surgical or drug treatment. It is expected to bring new hope to patients.
근위축성측삭경화증, 루게릭병, 만니톨, 제대혈, 줄기세포, 이식, 세포치료. Amyotrophic lateral sclerosis, Lou Gehrig's disease, mannitol, umbilical cord blood, stem cells, transplantation, cell therapy.
Description
도 1은 제대혈 유래 줄기세포의 세포 성상을 나타낸 것이다.Figure 1 shows the cell properties of umbilical cord blood-derived stem cells.
도 2는 제대혈 유래 줄기세포를 근육세포 배양액에서 배양한 후 근육세포 유전자의 발현을 보여주는 것이다.Figure 2 shows the expression of myocyte genes after culturing cord blood-derived stem cells in myocyte culture medium.
본 발명은 제대혈 유래 줄기세포와 뇌혈관장벽(blood brain-barrier: BBB)을 통과할 수 있는 물질인 만니톨(mannitol)을 사용하여 정맥주사(intravenous injection) 및 경막내 주사(intrathecal injection) 함으로써, 근위축성측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS, 루게릭병) 환자를 치료하기 위한 세포치료에 관한 것이다.According to the present invention, intravenous injection and intrathecal injection using mannitol, a substance capable of passing through cord blood-derived stem cells and blood brain-barrier (BBB), Cell therapy for treating patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS).
현대의학이 많은 발전을 이루었지만 장기 및 조직이 완전히 파괴된 경우에는 기존의 약물적인 요법이나 수술적인 요법으로는 그 근본적인 치료에 한계가 있는 것이 현실이다. 그 대안으로서 장기를 이식하는 방법이 있기는 하나 장기를 공여 받는 것도 현실적으로는 극히 어려우며, 장기 이식 차원에서도 해결할 수 없는 질병들이 존재한다. 그 대표적인 질병에 근위축성측삭경화증(ALS)이 있다. ALS는 운동신경세포가 점차 소실되어 근위축, 근력약화, 섬유속성연축 등을 초래하여 언어장애, 사지위약, 급격한 체중감소, 호흡장애 등으로 사망에 이르게 되는 질병으로, 이처럼 신경세포가 파괴되는 질병에 대해서는 아직까지도 그 치료가 불가능한 것이 사실이다.Modern medicine has made a lot of progress, but if the organs and tissues are completely destroyed, it is a reality that there is a limit to the fundamental treatment with conventional drug therapy or surgical therapy. As an alternative, there is a method of transplanting organs, but it is extremely difficult to donate organs, and there are diseases that cannot be solved at the level of organ transplantation. The representative disease is amyotrophic lateral sclerosis (ALS). ALS is a disease in which neuronal cells are destroyed due to gradual loss of motor neurons, muscle weakness, muscle weakness, and fibrotic spasm, resulting in death due to speech disorders, limb weakness, rapid weight loss, and respiratory distress. It is true that the treatment is still impossible.
ALS는 퇴행성 신경계 질환이며, 대뇌 및 척수와 같은 중추신경계의 운동 신경원이 선택적으로 파괴되기 때문에 운동 신경의 자극에 대해 근육들이 적절한 운동 기능을 나타내지 못해 "운동 신경원 질환"으로도 불리고, 1930년대 이 질병을 앓았던 운동선수 이름에 기원하여 "루게릭병(Lou Gehrig's disease)"으로도 불린다. 이 질환에서, 신체의 감각 신경, 자율 신경 등의 장애는 임상적으로 거의 나타나지 않고 있다. 즉, ALS 질환은 뇌의 신경 및 신체의 운동 근육 상태가 올바른 기능을 하고 있지 못한 질병이다.ALS is a degenerative neurological disorder, also called "motor neuron disease" because the muscles do not show adequate motor function to the stimulation of the motor nerves because the motor neurons in the central nervous system such as the cerebrum and spinal cord are selectively destroyed. It is also called "Lou Gehrig's disease", originating in the name of the athlete who suffered from the disease. In this disease, disorders such as sensory nerves and autonomic nerves of the body are rarely seen clinically. In other words, ALS is a disease in which the nerves of the brain and the motor muscles of the body do not function properly.
ALS에 관한 정확한 발병 원인은 아직까지 밝혀지지 않았지만, 현재까지 ALS 발병 가능성은 다음과 같이 예측할 수 있다: 첫째, 대뇌, 뇌간 척수 등과 같은 중추신경계의 생물학적 기능을 유지하는 데 필요한 신경아교세포(neuroglia)와 신경세포 사이의 신경 전달물질 중에서 흥분성 신경 전달물질인 글루타민산은 뇌에서 형성되어 신경을 통해 근육에 신호를 전달하는 분자로서 한 번 분비되면 신속히 제거되어야 하는데, 활성 산소가 글루타민산의 파괴를 차단함으로써 글루타민산이 오히려 과잉 증가되고 그로 인하여 운동 신경이 파괴되면서 ALS가 발생될 수 있다. 둘째, 운동 신경 세포막에 위치한 "전위 의존성 칼슘 통로"에 대한 항체가 형성되어 항원-항체 반응에 따른 일련의 생물학적 과정에 의해 운동신경세포가 파괴될 수 있다. 셋째, 운동선수들이 ALS 질환에 걸릴 위험도가 일반인보다 매우 높고, 그 발생 시기도 일반인보다 젊은 시기에 발생되고 있으며, 일부 지역에서 발생되고 있는 ALS 환자수가 다른 지역에 비해 훨씬 많을 만큼 환경 속의 특정 인자가 ALS 질환을 유도시키고 있다. 넷째, 운동 신경 세포의 원활한 기능을 유지하기 위해서는 신경 영양인자의 적절한 공급이 계속 필요한데, 신경을 성장시키거나 상처가 난 세포를 회복시키는 데 필요한 영양성분이 결핍됨으로써 운동 신경 세포가 파괴될 수 있다. 다섯째, 극소수의 환자는 부모로부터 ALS 질환을 유전 받고 있는 것이 확인됨으로써, 가족성 ALS 환자에서 SOD 효소의 유전자 돌연변이 현상을 분석했을 때, 약 60 개의 돌연변이가 보고되었고, 그 일부는 동물실험을 통하여 ALS 질환과 유사한 증상이 확인되어 ALS 질환의 발병기전에 관한 연구가 보다 활발히 진행되고 있다. 여섯째, 바이러스 감염과 같은 환경오염으로 인해 ALS의 발병이 유도될 수 있다.The exact cause of ALS has not yet been identified, but to date, the possibility of ALS can be predicted as follows: First, neuroglial cells (neuroglia), which are necessary for maintaining the biological functions of the central nervous system, such as the cerebrum and brainstem spinal cord, etc. Glutamic acid, an excitatory neurotransmitter among neurotransmitters between nerve cells, is a molecule that is formed in the brain and transmits signals to the muscles through the nerves. Once secreted, glutamic acid must be removed quickly, and free radicals block the destruction of glutamic acid. On the contrary, ALS can be generated as it is excessively increased and thereby the motor nerves are destroyed. Second, antibodies to the "potential-dependent calcium pathway" located in the motor neuron membranes can be formed, resulting in the destruction of motor neurons by a series of biological processes following an antigen-antibody response. Third, athletes are at higher risk of ALS disease than the general population, and the onset occurs at a younger age than the general population, and the number of ALS patients in some regions is much higher than that of other regions. It is inducing ALS disease. Fourth, proper supply of neurotrophic factors is necessary to maintain smooth function of motor neuron cells. Motor neuron cells may be destroyed by lack of nutrients necessary to grow nerves or restore damaged cells. Fifth, very few patients have inherited ALS disease from their parents. When analyzing gene mutations of SOD enzymes in familial ALS patients, about 60 mutations were reported, some of which were tested in animal studies. Similar symptoms have been identified, and studies on the pathogenesis of ALS disease are being actively conducted. Sixth, the development of ALS may be induced by environmental pollution such as viral infection.
이와 같이 여러 가지 원인으로 인해 발생된 ALS는 시간이 흐름에 따라 그 증상이 점점 뚜렷해지고 초기에 뇌간에 위치한 운동신경세포의 손상이 인접 부위로 확산되어 상하지 근력 약화, 근 위축, 근섬유속성 연축 등이 초래된다. 일반적으로 ALS는 발병 초기에 경부 척수에 위치하는 운동 신경 세포가 주로 손상되는 사지형(limb type)과 뇌간에 위치하는 운동 신경 세포가 주로 손상되는 구형(bulbar type)으로 구분되는데, 대뇌의 운동 신경 세포도 손상 받아 상부 운동 신경원 장애에 따른 임상징후를 나타내기 때문에, ALS에서 특징적으로 관찰되는 임상 양상을 상하지 근력 약화, 구마비, 호흡 장애, 상지 운동기능 장애, 하지 운동기능 장애 등으로 구분한다.As ALS is caused by various causes, the symptoms become more obvious as time passes, and damage to motor nerve cells located in the brain stem initially spreads to adjacent areas, resulting in muscle weakness, muscle atrophy, and muscle fibrillation. Caused. In general, ALS is classified into a limb type in which motor neurons located in the cervical spinal cord are primarily damaged and a bulbous type in which motor neurons located in the brain stem are mainly damaged. Since the cells are also damaged and show clinical signs according to upper motor neuron disorders, the clinical features characteristic of ALS are classified into upper extremity muscle weakness, numbness, respiratory disorders, upper extremity motor dysfunction, and lower extremity motor dysfunction.
블랙홀과 빅뱅 이론 등으로 유명한 물리학자 스티븐 호킹 박사는 40 년을 넘게 루게릭병을 앓다가 결국 전신마비가 된 상태이며, 한국에서도 많은 유명 인사들이 루게릭병을 앓고 있는 것이 현실임에도 불구하고 특별한 치료법이나 수술적인 요법이 전무한 실정이다. 또한, 이 질병은 젊은 연령대에서 발병한다는 점에서 육체적, 정신적으로 심한 고통을 주고 있다.Stephen Hawking, a physicist famous for black holes and the big bang theory, has been suffering from Lou Gehrig's disease for over 40 years and eventually became paralyzed, and despite the fact that many celebrities suffer from Lou Gehrig's disease in Korea, there are special treatments and surgery There is no conventional therapy. The disease also suffers physically and mentally from the young age.
더우기, 현재로서는 ALS 진단을 위한 특이적인 검사 방법도 전무한 상태이며, 환자가 운동 신경 세포의 손상을 보일 경우 ALS 질환을 의심하고 있다. 이처럼 의심이 되는 환자가 있으면 안구 운동 장애, 감각 장애, 방광 및 항문 장애, 또는 지능 장애 등과의 연관성 여부를 확인하고 있다.Moreover, at present, there are no specific test methods for diagnosing ALS, and if the patient shows damage to motor neurons, he suspects ALS disease. These suspected patients are checked for association with eye movement disorders, sensory disorders, bladder and anal disorders, or intellectual disabilities.
현재 ALS에 관한 연구가 조금씩 진전되어 운동 신경 세포의 글루타민산 과도 생산을 억제시킬 수 있는 약이 개발되어 병의 상태를 약간 지연시킬 수 있게 되었지만, 일단 파괴된 신경은 원래의 상태로 돌아오지 않기 때문에 ALS 환자의 증상이 개선되기는 현실적으로 불가능하다. 즉, 환자의 상태가 더 이상 나빠지지 않도록 시간적인 약간의 여유만을 제공해 주는 것이 전부이다.Current research on ALS has progressed little by little to develop drugs that can suppress glutamic acid overproduction of motor neurons, which can slightly delay the condition of the disease, but once the destroyed nerves do not return to their original state, ALS It is practically impossible to improve the patient's symptoms. In other words, the patient's condition is no longer worsened to provide only a little time to afford.
한편, 줄기세포(stem cell)란 아직 운명이 결정되지 않은 미숙한 세포로, 체내의 장기나 조직이 외부로부터 충격이나 손상을 받게 되면 스스로 그 손상부위를 찾아가 분화시키는 능력을 가진 세포를 말한다. 줄기세포는 그 공급원에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell), 성체 줄기세포(adult stem cell), 제대혈 줄기세 포(neonatal stem cell)로 나뉜다. 현재, 줄기세포를 골수에서 분리 및 배양하는 것은 쉬운 일이지만, 골수의 획득이 용이치 않고, 타인의 줄기세포를 이식할 경우 면역 거부 반응 문제를 해결하는 것이 현실적으로 어려운 것으로 알려져 있다. 이에 비해, 제대(탯줄)혈은 골수에 비해 획득이 용이할 뿐 아니라, 많은 제대혈 유닛(units)을 확보할 경우 환자의 조직적합성 유전자와 일치 또는 가장 유사한 제대혈 줄기세포를 사용할 수 있으므로 면역거부 반응을 해결할 수 있다는 장점이 있다.On the other hand, stem cells (i.e. stem cells) are immature cells whose fate has not yet been determined. When the organs or tissues in the body are shocked or damaged from the outside, they refer to cells that have the ability to differentiate themselves. Stem cells are divided into embryonic stem cells, adult stem cells, and neonatal stem cells, depending on their source. Currently, it is easy to isolate and culture stem cells from bone marrow, but it is not easy to obtain bone marrow, and it is known that it is practically difficult to solve the immune rejection reaction when transplanting stem cells of another person. In contrast, cord blood is not only easier to obtain than bone marrow, but if you have a lot of cord blood units, you can use a cord blood stem cell that matches or closely matches the histocompatibility gene of the patient. This has the advantage of being solved
현재 제대혈 유래 줄기세포를 사용한 인간 ALS 치료 사례는 전무한 상태이다. 다만 생쥐(mouse)와 같은 동물 모델에서 배양하지 않은 순수한 제대혈 세포를 사용한 실험만이 보고되어 있다(Norman Ende et al., Human umbilical cord blood dffect on sod mice. Life Sciences 67 (2000) 53-59). 또한, Zhuqing Qu-Petersen 등(Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. The Journal of cell biology. Vol.157, No 5, 2002)에 따르면 근 무력증(Duchenne muscular dystropy) 질환의 생쥐를 대상으로 새로 태어난 생쥐의 근육 줄기세포를 이식시켰을 때, 이 줄기세포가 근육세포 뿐만 아니라 신경세포로 전환되어진다는 것을 확인하였다. 그러나, 이처럼 줄기세포를 이용한 동물실험들을 통해서 ALS와 비슷한 유형의 질병 기작에 관해서 보고는 하였지만 엄밀하게 사람과 동물과의 구조적인 특성은 명백하게 차이가 나므로 아직까지 인간을 대상으로 한 ALS 환자에게 적용시키지 못한 것이 현실이다.Currently, there are no cases of human ALS treatment using cord blood stem cells. Only experiments using pure cord blood cells that have not been cultured in animal models such as mice have been reported (Norman Ende et al., Human umbilical cord blood dffect on sod mice.Life Sciences 67 (2000) 53-59). . In addition, according to Zhuqing Qu-Petersen et al. (Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration.The Journal of cell biology.Vol.157, No 5, 2002), Duchenne muscular dystropy disease When transplanted muscle stem cells of newly born mice to mice, it was confirmed that these stem cells are converted to neurons as well as muscle cells. However, although animal experiments using stem cells have reported a similar type of disease mechanism to ALS, the structural characteristics of humans and animals are clearly different, so they are not yet applied to human ALS patients. What is not true is reality.
제대혈 유래 줄기세포를 정맥 내(intravenous) 주사하였을 경우 뇌에까지 줄기세포가 도달한다는 것은 현실적으로 불가능하다. 이는, 뇌혈관장벽(Blood Brain- Barrier: BBB)이 존재하기 때문인데, 뇌혈관장벽은 혈관내피세포와 성상세포 간의 상호작용에 의해 뇌로 흐르는 혈류에서 물질의 이동을 제한하고 뇌신경망의 보호와 영양분 공급의 기능을 담당하고 있어 뇌의 항상성 유지에 필요한 필수적인 기능이다. 그렇기 때문에 아무리 제대혈 유래 줄기세포를 정맥 내에 주사하더라도 줄기세포가 손상된 뇌의 신경까지 도달한다는 것은 불가능하다는 것이 현 실정이다.Intravenous injection of umbilical cord blood-derived stem cells makes it impossible to reach them to the brain. This is due to the presence of the Blood Brain Barrier (BBB), which restricts the movement of substances in the blood flow to the brain by the interaction between vascular endothelial cells and astrocytes, and protects and nutrients of the neural network. It is responsible for the supply function, which is essential for maintaining brain homeostasis. Therefore, no matter how the umbilical cord blood-derived stem cells are injected intravenously, it is impossible to reach the nerves of the damaged brain.
본 발명의 목적은 제대혈 유래 줄기세포를 이용하여, 근본적인 치료법이 없음은 물론, 환자의 상태가 더 이상 나빠지지 않도록 약간의 시간을 제공하는 것이 전부인 근위축성측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS, 루게릭병)을 치료하기 위한 세포치료 방법을 제공하고자 하는 것이다.The purpose of the present invention is to use a stem cell derived from umbilical cord blood, and there is no fundamental treatment, but it is all about providing some time so that the patient's condition no longer worsens (Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS, Lou Gehrig's disease). It is to provide a cell therapy method for the treatment).
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는,In the present invention to achieve the above object,
출산 24 시간 이내의 순수 제대혈로, 1 유닛(unit) 당 부피가 45 ㎖ 이상인 제대혈에 항응고제를 가하고;Pure umbilical cord blood within 24 hours of birth, adding anticoagulant to umbilical cord blood with a volume of at least 45 ml per unit;
항응고제가 혼합된 제대혈을 αMEM(alpha-minimum essential medium) 배지로 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고; 그리고,Umbilical cord blood mixed with anticoagulant was diluted with alpha-minimum essential medium (αMEM) medium and centrifuged to harvest monocytes; And,
얻어진 단핵구를 Stem Cell Factor, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), IL-3(interleukin-3) 및 IL-6(interleukin-6)이 포함된 αMEM 배지에 부유 배양하여 얻어진 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는,The obtained monocytes include Stem Cell Factor, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), interleukin-3 (IL-3) and interleukin-6 (IL-6). Comprising umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells obtained by suspension culture in the prepared αMEM medium,
근위축성측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS, 루게릭병) 환자의 치료를 위해 환자의 정맥내 및 경막내에 이식하기 위한 조성물을 제공한다.Provided are compositions for implantation intravenously and intradural of a patient for the treatment of patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS, Lou Gehrig's disease).
또한, 본 발명에서는,In the present invention,
냉동 보관된 제대혈을 해동하여 αMEM(alpha-minimum essential medium) 배지로 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고;Thaw frozen cord blood, dilute with alpha-minimum essential medium and centrifuge to harvest monocytes;
얻어진 단핵구로부터 CD133 양성 세포를 분리하고; 그리고,CD133 positive cells were isolated from the obtained monocytes; And,
분리된 세포를 Stem Cell Factor, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), IL-3(interleukin-3) 및 IL-6(interleukin-6)이 포함된 αMEM 배지에 부유 배양하여 얻어진 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는;Stem Cell Factor, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), interleukin-3 (IL-3) and interleukin-6 (IL-6) Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells obtained by suspension culture in the contained αMEM medium;
근위축성측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS, 루게릭병) 환자의 치료를 위해 환자의 정맥내 및 경막내 이식하기 위한 조성물을 제공한다.Provided are compositions for intravenous and intradural transplantation of patients for the treatment of patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS, Lou Gehrig's Disease).
여기에서, 상기 조성물은 환자의 뇌혈관장벽(Blood Brain Barrier; BBB)를 개방시켜 상기 줄기세포를 뇌와 중추신경계에 효과적으로 전달하기 위한 만니톨을 정맥내 주사하고, 상기 줄기세포를 환자의 정맥내 및 경막내 이식하기 위한 조성물인 것이 바람직하다.Here, the composition is to open the Blood Brain Barrier (BBB) of the patient by intravenously injecting mannitol to effectively deliver the stem cells to the brain and the central nervous system, the stem cells intravenous and It is preferably a composition for intradural implantation.
또한, 본 발명에서는 환자의 뇌혈관장벽(Blood Brain Barrier; BBB)를 개방시켜 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 뇌와 중추신경계에 효과적으로 전달하기 위한 만니톨을 정맥내 주사하고, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 환자의 정맥내 및 경막내 이식하기 위한, 근위축성측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS, 루게 릭병) 환자의 치료용 키트를 제공한다.In addition, in the present invention, by opening the Blood Brain Barrier (BBB) of the patient, mannitol is injected intravenously for effectively delivering cord blood-derived mesenchymal stem cells to the brain and the central nervous system, and the cord blood-derived mesenchymal stem cells are injected. Provided are kits for the treatment of patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), for intravenous and intradural transplantation.
한편, 본 발명에 따른 근위축성측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS, 루게릭병) 환자의 치료 방법은,On the other hand, the treatment method of patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS, Lou Gehrig's disease) according to the present invention,
환자와 6 개 HLA 유전자가 일치하거나, 1 또는 2 개 불일치하는 제대혈을 선택하고;Selecting cord blood with 6 HLA genes or 1 or 2 discrepancies with the patient;
상기 선택된 제대혈로부터 줄기세포를 분리 및 배양하고;Isolating and culturing stem cells from said selected cord blood;
만니톨(mannitol)을 환자에게 정맥내 주사하고; 그리고,Mannitol is injected intravenously into the patient; And,
상기 배양된 줄기세포를 환자에게 정맥내 및 경막내 이식하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.And culturing the cultured stem cells into a patient intravenously and intradurally.
여기에서, 상기 줄기세포는 21 게이지 이상의 주사기를 사용하여 이식하는 것이 바람직하고, 23 게이지 주사기가 특히 바람직하다.Here, the stem cells are preferably implanted using a syringe of 21 gauge or more, and a 23 gauge syringe is particularly preferable.
본 발명에서는 현대의학으로 치료 불가능한 근위축성측삭경화증(ALS)을 치료하기 위하여 환자와 조직적합성 유전자가 일치하는 제대혈 유래 줄기세포를 이용하는데, 먼저 만니톨을 사용하여 환자의 뇌혈관장벽(BBB)을 개방한 후 환자의 정맥과 경막 내 줄기세포를 이식하는 새로운 세포치료 방법을 구축하였으며, 체외에서 제대혈 유래 줄기세포에 관한 새로운 배양조합을 사용하여 제대혈 유래 줄기세포의 근육세포(skeletal myogenic muscle)로의 분화를 유도 및 확인하였다.In the present invention, in order to treat ALS, which cannot be treated by modern medicine, umbilical cord blood-derived stem cells that match a patient and histocompatibility genes are used. First, mannitol is used to open a patient's cerebrovascular barrier (BBB). We then established a new cell therapy method for transplanting the patient's veins and intradural stem cells, and using a new culture combination for umbilical cord blood-derived stem cells to differentiate the cord blood-derived stem cells into skeletal myogenic muscle. Induced and confirmed.
즉, 본 발명에서는 제대혈 유래 줄기세포를 효과적으로 뇌에까지 전달시키기 위하여 만니톨(mannitol)을 먼저 사용하여 뇌혈관장벽을 개방시킨 후 제대혈 유래 줄기세포를 정맥 및 경막 내에 주사함으로써 신체 근육의 재생 및 뇌 신경계의 줄 기세포를 효과적으로 전달 및 치료하도록 하고 있다. 만니톨(mannitol)은 상두개골에서 압력을 축소시키는 혈관확장 신경약이며, 뇌혈관장벽을 형성하는 내피세포들을 대상으로 일시적이고 강력한 수축을 유도시킬 수 있기 때문에 알츠하이머(Alzheimer's disease)와 같은 뇌질환 환자의 약물을 환자에게 투여할 때 사용되는 약물이다. 그러나, 뇌질환에 관련되어 만니톨이 사용된 경우는 있었지만, 본 발명에서와 같이 ALS 환자를 위하여 제대혈 유래 줄기세포와 만니톨을 사용하여 질환을 치료하는 세포치료법은 전무하였다. 그리고, 본 발명에서 사용되는 제대혈 유래 줄기세포가 체외에서 신경세포로의 빠른 분화(Ju Ah Jeong et al., Rapid neural differentiation of human cord blood-derived mesenchymal stem cell. Neuroreport. Vol 15 No 2 6 August 2004)를 달성한 것은 이미 논문으로 확인한 바가 있다.That is, in the present invention, in order to effectively deliver the cord blood-derived stem cells to the brain, mannitol is first used to open the cerebrovascular barrier, and then the cord blood-derived stem cells are injected into the vein and the dura to regenerate the muscles of the body and the brain. Effectively delivering and treating stem cells. Mannitol is a vasodilator neuron that reduces pressure in the upper skull, and induces transient and powerful contractions in endothelial cells that form the cerebrovascular barrier, leading to the development of brain diseases such as Alzheimer's disease. A drug used when administering a drug to a patient. However, although mannitol has been used in connection with brain diseases, there has been no cell therapy for treating diseases using cord blood-derived stem cells and mannitol for ALS patients as in the present invention. In addition, the rapid differentiation of umbilical cord blood-derived stem cells used in the present invention into neurons in vitro (Ju Ah Jeong et al. , Rapid neural differentiation of human cord blood-derived mesenchymal stem cell. Neuroreport. Vol 15
뇌와 중추신경계의 질환으로 인하여 운동신경세포의 능력을 잃어 버린 ALS 환자에 대해서는 적극적인 치료법이 없을 뿐 아니라 이식도 불가능한 실정을 고려한다면, 본 발명에 따른 제대혈 유래 줄기세포와 만니톨을 이용한 ALS 환자의 세포치료법은 전 세계적으로 유례가 없는 귀중한 보고라 할 수 있다. 현재까지 전 세계적으로 줄기세포를 이용하여 ALS 환자를 치료한 경우는 전혀 없으며, 단지 분리하지 않은 제대혈세포(Umbilical Cord Blood Cell)만을 동물에 적용한 예가 있을 뿐이다.Considering the fact that there is no active treatment and transplantation is impossible for ALS patients whose motor nerve cells have lost their ability due to diseases of the brain and central nervous system, the cells of ALS patients using cord blood stem cells and mannitol according to the present invention Treatment is a valuable report that is unprecedented worldwide. To date, there have been no cases of treating ALS patients worldwide using stem cells, and only one example of applying undifferentiated cord blood cells to animals.
그리고, 본 발명에서는 제대혈 유래 줄기세포를 체외에서 새롭게 조합한 시약으로 처리하여 근육세포로의 분화를 확인하고 있다. 즉, 제대혈 유래 줄기세포는 체외에서 신경세포 뿐만 아니라 근육세포로도 분화하는 것을 확인함으로써, 제대혈 유래 줄기세포는 신경질환 뿐만 아니라 근육질환에도 효과가 있음을 간접적으로 증명하고 있다. 또한, 제대혈 유래 줄기세포가 다른 신경세포 뿐만 아니라 신경세포의 초기 단계인 글리아 세포(glia cell)로 분화되는 것에서도 확인할 수 있듯이, 제대혈 유래 줄기세포는 ALS에서 효과적으로 신경 및 근육을 재생할 수 있는 현존하는 유일한 방법이다.In the present invention, the cord blood-derived stem cells are treated with a newly combined reagent in vitro to confirm the differentiation into muscle cells. In other words, by confirming that cord blood-derived stem cells differentiate not only into nerve cells but also muscle cells in vitro, it is indirectly proving that cord blood-derived stem cells are effective not only for neurological diseases but also for muscular diseases. In addition, as can be seen from the differentiation of cord blood-derived stem cells into other neurons as well as glia cells, which are the early stages of neurons, cord blood-derived stem cells are presently capable of effectively regenerating nerves and muscles in ALS. Is the only way to do it.
본 발명의 방법에서, 제대혈 유래 줄기세포는 21 게이지 주사기 보다 가는 주사기를 사용하게 되면 줄기세포가 손상되거나 세포가 파괴될 수 있으므로 21 게이지 이상의 주사기를 사용하는 것이 중요하고, 23 게이지 이상의 주사기가 특히 바람직하다.In the method of the present invention, it is important to use a syringe of 21 gauge or more because cord blood-derived stem cells may use stems thinner than 21 gauge syringes because stem cells may be damaged or cells may be destroyed. Do.
본 발명에 따른 제대혈 유래 줄기세포와 디-만니톨을 이용한 근위축성측삭경화증 세포치료법은 환자와 줄기세포의 조직적합성 유전자가 일치하는 것을 기본으로 하므로, 미리 환자와 조직적합성 유전자가 일치하는 제대혈 줄기세포를 준비하여 면역거부 반응을 해결할 수 있다. 또한, 제대혈 줄기세포를 사용하기 전 디-만니톨을 사용하여 미리 뇌혈관장벽(BBB)을 개방해 놓은 상태이므로, 뇌와 중추신경계에 효과적으로 줄기세포를 전달할 수 있다. 이에 따라, 환자의 신경 및 근육을 재생하기 위한 세포 주입에 있어서 면역억제제를 상용하지 않아도 되므로, 환자의 치료 뿐만 아니라 향후 삶의 질을 향상시킨다는 점에 있어서도 큰 의의가 있다.Umbilical muscular atrophic sclerosis cell therapy using umbilical cord blood-derived stem cells and di-mannitol according to the present invention is based on the coincidence of histocompatibility genes of the patient and stem cells, and thus the cord blood stem cells of the patient and histocompatibility genes in advance Prepare to resolve the immune rejection reaction. In addition, since before using the umbilical cord blood stem cells using the di-mannitol, the brain blood vessel barrier (BBB) has been opened in advance, stem cells can be effectively delivered to the brain and the central nervous system. Accordingly, since there is no need to use an immunosuppressant in the injection of cells for regenerating the nerves and muscles of the patient, there is a significant significance in improving not only the treatment of the patient but also the quality of life in the future.
더우기, 제대혈 줄기세포는 다른 배아 줄기세포처럼 인체 내에 기형종(teratoma)나 기형암(terato carcinoma) 발생 가능성이 전혀 없기 때문에, 본 발명 에 따른 뇌와 중추신경계의 운동신경이 파괴된 환자의 세포치료는 근위축성측삭경화증 환자들에게 새로운 희망을 안겨줄 것으로 기대된다.Furthermore, since cord blood stem cells have no possibility of teratoma or terato carcinoma in the human body like other embryonic stem cells, cell therapy of patients with brain and central nervous system motor disruption according to the present invention is destroyed. Is expected to bring new hope to patients with amyotrophic lateral sclerosis.
이하, 실시예를 통하여 본 발명에 따른 제대혈 유래 줄기세포와 디-만니톨을 이용한 ALS 환자의 세포치료 방법을 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the cell treatment method of ALS patients using umbilical cord blood-derived stem cells and di-mannitol according to the present invention will be described in detail through Examples. However, these Examples are only illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
실시예 1: 제대혈의 선별Example 1 Screening of Umbilical Cord Blood
환자와의 6 개 조직 적합성 항원(HLA) 유전자 일치 여부 판정 후 환자와 HLA 유전자가 같거나 1∼2 개 불일치한 냉동 보관된 제대혈을 선별하였다.After determination of the six histocompatibility antigen (HLA) genes matched with the patient, the frozen stored cord blood with the same or one or two mismatched HLA genes were selected.
조직 적합성 항원은 자신의 세포가 아닌 외래의 세포가 체내로 주입 시 그 세포의 생착여부를 결정지어주는 중요한 것이다. 조직 적합성 항원은 총 6 가지 유전자를 검사하는데 모두 DNA에 기본을 두고 있으며, 6 가지 유전자는 class Ⅰ의 A, B, 그리고 class Ⅱ DR의 일치여부에 있다.Histocompatibility antigens are important for determining whether cells are engrafted by foreign cells, not their own cells. Histocompatibility antigens are based on DNA, which tests a total of six genes, and the six genes are in agreement with class I A, B, and class II DR.
실시예 2-1: 제대혈로부터 줄기세포의 분리 및 배양Example 2-1: Isolation and Culture of Stem Cells from Umbilical Cord Blood
제대혈에서 단핵구를 분리하기 위해, αMEM(alpha-minimum essential medium, Jeil Biotech Services, Korea)으로 제대혈을 2 배 용량으로 희석한 후 50 ㎖ 팔콘 튜브(falcon tube)에 옮겨 실온에서 10 분간 300xg로 원심분리하였다. 분리된 buffy coat 층을 수확하여 다시 2 배 용량의 αMEM으로 희석한 후 Ficoll-Hypaque에 중첩하고 실온에서 30 분간 300xg로 원심분리를 시행하였다.To separate monocytes from umbilical cord blood, dilute umbilical cord blood with αMEM (alpha-minimum essential medium, Jeil Biotech Services, Korea), and transfer to 50 ml falcon tubes and centrifuge at 300xg for 10 minutes at room temperature. It was. The separated buffy coat layer was harvested and diluted again with twice the capacity of αMEM, then superimposed on Ficoll-Hypaque, and centrifuged at 300xg for 30 minutes at room temperature.
혈액으로부터 단핵구를 분리하는 데는 Ficoll(슈크로스의 중합체)과 Hypaque (디트리조에이트 나트륨; sodium ditrizoate)의 중합체인 Ficoll-Hypaque가 주로 이용된다. Ficoll-Hypaque의 비중은 1.077 g/㎖로, 단핵구는 이보다 가벼우나 적혈구는 이보다 무겁기 때문에 비중차에 의한 분리가 가능하다. 즉, 혈액을 Ficoll-Hypaque 위에 올려서 원심분리하면 단핵구는 Ficoll-Hypaque 위에 모이게 된다.Ficoll-Hypaque, a polymer of Ficoll (a polymer of sucrose) and Hypaque (sodium ditrizoate), is mainly used to separate monocytes from blood. Ficoll-Hypaque specific gravity is 1.077 g / ㎖, monocytes are lighter than this, but red blood cells are heavier than this can be separated by specific gravity. In other words, when the blood is centrifuged on Ficoll-Hypaque, monocytes are collected on Ficoll-Hypaque.
이와 같은 밀도구배 원심분리 방법으로 얻어진 단핵구를 다시 첨가물이 섞이지 않은 세척용 αMEM에 넣어 10 분간 200xg로 원심분리한 후, 팔콘 튜브 바닥에 가라앉은 세포를 제외하고 αMEM을 버려 세척하였다. 한번 더 αMEM을 넣어 10 분간 200xg로 원심분리한 후 팔콘 튜브 바닥에 가라앉은 세포를 제외하고 αMEM을 버려 1 회 더 세척하였다.The monocytes obtained by such a density gradient centrifugation method were placed in the αMEM for washing with no additives, and centrifuged at 200 × g for 10 minutes, and the αMEM was discarded except for the cells that settled on the bottom of the Falcon tube. After another centrifugation at 200 × g for 10 minutes, αMEM was discarded and washed once more except for the cells that settled on the bottom of the Falcon tube.
다음에, 항생제(1000 U/㎖ 페니실린 G, 1000 ㎍/㎖ 황산 스트렙토마이신, Gibco-BRL)와 항진균제(0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B), 그리고 2 mM의 글루타민 (Glutamine, Sigma)이 포함된 αMEM 배지에 20% 우태혈청(FBS; fetal bovine serum, JRH, USA)과 함께 세포성장인자로서 Stem Cell Factor(50 ng/㎖), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; 10 ng/㎖), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor; 10 ng/㎖), IL-3(interleukin-3; 10 ng/㎖) 및 IL-6(interleukin-6; 10 ng/㎖)을 첨가하고, 세포수 1×106/㎠의 농도로 부유시켰다.Next, antibiotics (1000 U / ml penicillin G, 1000 μg / ml streptomycin sulfate, Gibco-BRL) and antifungal agents (0.25 μg / ml amphotericin B) and 2 mM glutamine (Sigma) were included. Stem Cell Factor (50 ng / ml) and GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; 10 ng / ml as cell growth factor with 20% fetal bovine serum (FBS; JRH, USA) in αMEM medium ), G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor (10 ng / ml), IL-3 (interleukin-3; 10 ng / ml) and IL-6 (interleukin-6; 10 ng / ml) It was suspended at a concentration of 1 × 10 6 /
5 일간 배양한 세포 군집에서 부유세포를 제거하고, 부착세포가 확보된 후에는 20% 우태혈청 및 항생제가 포함된 αMEM을 배양액으로 하여 2 일 간격으로 세척과정 없이 완전 교환하여 25 일간 배양하였다.After floating cells were removed from the cell populations cultured for 5 days, and after the adherent cells were secured, the cells were cultured for 25 days by completely replacing the cells with αMEM containing 20% fetal calf serum and antibiotics without washing at intervals of 2 days.
실시예 2-2: 냉동보관된 제대혈로부터 줄기세포의 분리 및 배양Example 2-2 Isolation and Culture of Stem Cells from Cryopreserved Cord Blood
영하 196 ℃에서 냉동 보관 중이던 제대혈을 37 ℃의 water bath에 넣어서 바로 해동하였다. 제대혈로부터 단핵구를 분리하기 위해, αMEM(alpha-minimum essential medium, Jeil Biotech Services, Korea)으로 제대혈을 2 배 용량으로 희석한 후 실온에서 10 분간 300xg로 원심분리하였다. 분리된 buffy coat 층을 수확하여 다시 2 배 용량의 αMEM으로 희석한 후 Ficoll-Hypaque에 중첩하고 실온에서 30 분간 300xg으로 원심분리를 시행하였다.Umbilical cord blood, which was stored frozen at minus 196 ° C, was thawed immediately in a 37 ° C water bath. In order to separate monocytes from umbilical cord blood, umbilical cord blood was diluted with a double dose with αMEM (alpha-minimum essential medium, Jeil Biotech Services, Korea) and centrifuged at 300xg for 10 minutes at room temperature. The separated buffy coat layer was harvested and diluted again with 2 times the volume of αMEM, then superimposed on Ficoll-Hypaque and centrifuged at 300xg for 30 minutes at room temperature.
혈액으로부터 단핵구를 분리하는 데는 Ficoll(슈크로스의 중합체)과 Hypaque (디트리조에이트 나트륨; sodium ditrizoate)의 중합체인 Ficoll-Hypaque가 주로 이용된다. Ficoll-Hypaque의 비중은 1.007 g/㎖로, 단핵구는 이보다 가벼우나 적혈구는 이보다 무겁기 때문에 비중차에 의한 분리가 가능하다. 즉, 혈액을 Ficoll-Hypaque 위에 올려서 원심분리하면 단핵구는 Ficoll-Hypaque 위에 모이게 된다.Ficoll-Hypaque, a polymer of Ficoll (a polymer of sucrose) and Hypaque (sodium ditrizoate), is mainly used to separate monocytes from blood. Ficoll-Hypaque has a specific gravity of 1.007 g / mL, and monocytes are lighter than this but erythrocytes are heavier than that, so they can be separated by specific gravity. In other words, when the blood is centrifuged on Ficoll-Hypaque, monocytes are collected on Ficoll-Hypaque.
이와 같은 밀도구배 원심분리 방법으로 얻어진 단핵구를 다시 첨가물이 섞이지 않은 세척용 αMEM으로 2 회 세척하였다.The monocytes obtained by this density gradient centrifugation method were washed twice with αMEM for washing without addition of additives.
얻어진 단핵구를 CD133 분리 키트(Isolation kit: Miltenyi Bioteck, Germany)로 양성(positive) 선택적 분리하였다. 분리 방법은 먼저, 얻어진 단핵구에 100 ㎕의 블로킹 시약(blocking reagent)을 첨가하여 비-특이적 결합을 제거하고, 이어서 100 ㎕의 CD133/Microbead를 잘 섞어서 전체 용적을 500 ㎕로 하여 4 ℃에서 30 분간 배양하였다. 10 배 용량의 PBS(D-phosphate buffered saline, JRH, USA)를 첨가하여 원심분리(300xg, 10 분)한 후, 튜브에 붙어있는 세포를 제외하고 PBS를 버린 다음 500 ㎕ PBS로 재현탁(resuspension)하였다. 이어서, 미리 컬럼을 3 ㎖ PBS 완충액으로 세척해 두고, 재현탁된 세포를 기계에 부착된 컬럼에 넣어 15 분 이상 머물게 한 다음 PBS로 4 회 헹구었다(rinsing). 다음에, 컬럼을 기계에서 떼내어 튜브에 두고 PBS를 적당히 넣어 플런저(plunger)로 플러쉬(flush)하여, 양성(positive) 세포들을 선택하였다.The obtained monocytes were positively isolated by CD133 isolation kit (Isolation kit: Miltenyi Bioteck, Germany). The separation method was first added 100 μl of blocking reagent to the obtained monocytes to remove non-specific binding, and then 100 μl of CD133 / Microbead was mixed well to make 500 μl of the total volume and 30 ° C. at 4 ° C. Incubate for minutes. After centrifugation (300xg, 10 minutes) by adding 10-fold PBS (D-phosphate buffered saline, JRH, USA), discard the PBS except the cells attached to the tube, and then resuspend with 500 μl PBS (resuspension). ) The column was then washed with 3 ml PBS buffer beforehand, and the resuspended cells were placed in a column attached to the machine for at least 15 minutes and then rinsed four times with PBS. Next, the column was removed from the machine, placed in a tube and flushed with a plunger with PBS appropriately selected to select positive cells.
선택된 세포들을, 항생제(1000 U/㎖ 페니실린 G, 1000 ㎍/㎖ 황산 스트렙토마이신, Gibco-BRL)와 항진균제(0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B), 그리고 2 mM의 글루타민(Glutamine, Sigma)이 포함된 αMEM 배지에 20% 우태혈청(FBS; fetal bovine serum, Jeil Biotech Services)과 함께 세포성장인자로서 Stem Cell Factor(50 ng/㎖), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; 10 ng/㎖), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor; 10 ng/㎖), IL-3(interleukin-3; 10 ng/㎖) 및 IL-6(interleukin-6; 10 ng/㎖)을 첨가하고, 세포수 1×106/㎠의 농도로 부유시켰다.Selected cells included antibiotics (1000 U / ml penicillin G, 1000 μg / ml streptomycin sulfate, Gibco-BRL), antifungal agents (0.25 μg / ml amphotericin B), and 2 mM glutamine (Sigma) Stem Cell Factor (50 ng / ml) and GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; 10 ng /) with 20% fetal bovine serum (FBS; fetal bovine serum, Jeil Biotech Services) Ml), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) (10 ng / ml), interleukin-3 (10 ng / ml) and IL-6 (interleukin-6; 10 ng / ml), The cells were suspended at a concentration of 1 × 10 6 /
5 일간 배양한 세포 군집에서 부유세포를 제거하고, 부착세포가 확보된 후에는 20% 우태혈청 및 항생제가 포함된 αMEM을 배양액으로 하여 2 일 간격으로 세척과정 없이 완전 교환하여 25 일간 배양하였다.After floating cells were removed from the cell populations cultured for 5 days, and after the adherent cells were secured, the cells were cultured for 25 days by completely replacing the cells with αMEM containing 20% fetal calf serum and antibiotics without washing at intervals of 2 days.
실시예 3: 제대혈 유래 줄기세포의 근육세포로의 분화 확인(in vitro)Example 3: Confirmation of Differentiation of Umbilical Cord Blood-derived Stem Cells into Muscle Cells (in vitro)
실시예 2에서 2 주 동안 배양한 줄기세포에 0.05% 트립신-EDTA를 가해 부착된 세포를 부유시킨 후 20% 저-포도당 DMEM(low-glucose DMEM)으로 1×106 cells/㎠ 로 재배양하였다. 이 세포를 2 일간 배양하고 배양액을 버린 후, low-glucose DMEM으로 부착된 세포들을 세척하였다. 세척 후 5% 말혈청(horse serum)이 포함된 0.1 μM 덱사메타손, 50 μM 하이드로코티손을 사용하여 6 주 동안 근육세포로 유도하였다.In Example 2, 0.05% trypsin-EDTA was added to the stem cells cultured for 2 weeks, and the attached cells were suspended. The cells were cultured at 1 × 10 6 cells /
계속해서, 6 주 동안 배양한 후 두 종류의 근육세포 표지인자, 즉 MyoD와 myogenin, 그리고 근육세포 특이 단백질인 fast-twitch myosin에 대한 단일항체를 이용하여 유세포분석기로 분석하였다.Subsequently, the cells were cultured for 6 weeks and analyzed by flow cytometry using single antibodies against two types of muscle cell markers, MyoD and myogenin, and fast-twitch myosin, a muscle cell-specific protein.
도 1은 제대혈 유래 줄기세포의 세포 성상을 나타낸 것으로 CD13 양성, CD29 양성, SH2 양성, ASMA 양성을 보여준다.Figure 1 shows the cell properties of umbilical cord blood-derived stem cells show CD13 positive, CD29 positive, SH2 positive, ASMA positive.
도 2는 제대혈 유래 줄기세포를 근육세포 배양액에서 배양한 후 근육세포 유전자의 발현을 보여주는 것이다. 여기에서 보면, 근육세포 표지인자인 초기 근육세포 발생에 관련되는 MyoD와 myogenin은 3일부터 발현되었다가 7 일 이후에 소멸되고, 근육세포 발생과정의 후반기에 나타나는 fast-twitch myosin은 6 주의 후반기에 나타나는 것을 확인할 수 있었다.Figure 2 shows the expression of myocyte genes after culturing cord blood-derived stem cells in myocyte culture medium. Here, the myoD and myogenin, which are involved in the early myocyte development of muscle cell markers, are expressed from 3 days and then disappear after 7 days, and the fast-twitch myosin, which appears later in the muscle cell development process, is expressed in late 6 weeks. It was confirmed that it appeared.
실시예 4: 제대혈 유래 줄기세포의 이식Example 4 Transplantation of Cord Blood-Derived Stem Cells
실시예 2에서 분리 배양된 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 환자에게 이식하기 전, 70% 디-만니톨(D-mannitol 15%, 0.15 g/㎖, 500 ㎖, 중외제약) 500 ㎖를 백(bag)을 통하여 정맥주사(intravenous injection) 하고, 뇌혈관장벽(BBB)이 개방되면, 줄기세포가 손상을 입히지 않게 하기 위하여 23 게이지 주사기를 이용하여 정 맥 및 경막 내에 제대혈 유래 줄기세포를 5×107 세포를 주입(administration)하였다.Before transplanting the isolated cultured cord blood-derived mesenchymal stem cells to the patient in Example 2, 500 ml of 70% di-mannitol (D-mannitol 15%, 0.15 g / ml, 500 ml, FTC) was bagged. Intravenous injection through the blood vessel barrier (BBB) is open, the stem cells derived from the vein and dura in the vein and dura using a 23 gauge syringe in order to prevent stem cells from damaging 5 × 10 7 cells Administration was injected.
임상시험예 1: 근위축성측삭경화증 세포 치료 결과Clinical Trial 1: Results of Amyotrophic Lateral Sclerosis Cell Treatment
(1) 환자: 김OO/48세/남(1) Patient: Kim OO / 48 years old / male
(2) 병명: 루게릭병(2) Disease name: Lou Gehrig's disease
(3) 줄기세포 시술전 환자의 상태: 루게릭병으로 인한 온몸의 마비증세가 있어 움직이지 못하고, 산소마스크를 통해 호흡을 하며, 언어소통이 불가능한 상태.(3) The condition of the patient before stem cell procedure: A state of paralysis due to Lou Gehrig's disease, unable to move, breathing through the oxygen mask, speech communication is impossible.
(4) 2004년 11월 9일 제대혈 유래 줄기세포 시술(4) Umbilical cord blood-derived stem cell procedure on 9 November 2004
① 11/18: 몸이 아픈 증상(손등, 허벅지, 발 등)은 계속되며 환자도 계속 주물러 달라고 요구함. 아픈 증상이 오히려 좋은 효과를 가져올 것 같다는 긍정적인 생각으로 기다림.① 11/18: Illness symptoms (back of hand, thighs, feet, etc.) continue and patients are asked to keep on rubbing. Wait with positive thoughts that sick symptoms may have a rather good effect.
② 11/25: 하체쪽에 힘이 들어가면서 옷을 입을 때 엉덩이를 들 정도가 가능하게 됨.② 11/25: It is possible to lift the hips while wearing clothes with the force on the lower body.
③ 11/27: 밤 12시 55분경. 아린 증상이 잠시 주춤하더니 손가락 발가락에 힘이 들어갈 수 있을 거라는 느낌을 받았다고 함. 실제로 조금씩 글쓰기가 가능했던 왼손 뿐만 아니라 오른손 손가락과 발가락이 움직여지며, 악수도 할 수 있는 손힘이 생김. 이빨이 보일 정도로 입도 벌어짐.③ 11/27: Around 12:55 at night. Arin's symptoms slowed down for a while, and she felt that she could get some strength on her toes. In fact, not only the left hand, which was able to write little by little, the fingers and toes of the right hand move, and the hand strength can be shaken. Mouth open to see teeth.
④ 11/30: 아린 증상 계속됨. 시술 이전 왼쪽 부분(팔, 다리)은 움직임이 어느 정도 가능했으나 오른쪽은 도움이 필요한 상태였다고 함. 그러나 25일 엉덩이를 들 수 있는 힘이 생긴 이후, 어제는 엉덩이를 오른쪽으로 돌릴 수 있었음.④ 11/30: Symptoms of Arin continue. Before the procedure, the left part (arm, leg) was able to move to some extent, but the right side needed help. However, after the strength to lift the hips on the 25th, yesterday was able to turn his hips to the right.
⑤ 12/1: 허리 쪽에 힘이 들어가서 엉덩이까지 들썩거릴 수 있기 때문에 항상 침대 시트 자국이 남았던 허리가 이제는 아무 자국이 없어질 정도임. 기도관 속에 가래가 많이 줄었음.⑤ 12/1: Because the force on the waist can cause the hips to shake, the waist, where the bed sheet marks have been left, is now gone. A lot of phlegm decreased in the airway.
⑥ 12/8: 계속적으로 운동을 하고 있으며 조금씩 호전되고 있음.⑥ 12/8: I continue to exercise and improve little by little.
⑦ 12/15: 예전에는 침을 못 삼켰는데, 월요일 밤부터 침을 삼킬 수 있었음.⑦ 12/15: I couldn't swallow my saliva before, but I could have swallowed it since Monday night.
⑧ 12/22: 10일 전부터 호흡기가 마이너스로 떨어져서 걱정만 하다가 오늘 기계수리 하는 분이 오셨는데 마이너스로 된다는 건 자신이 호흡할 수 있는 능력이 된다는 것을 의미한다고 함. 지금 까지는 -1∼-3 사이이며 -5 이상이 되면 하루에 30 분 정도 호흡기를 뗄 수 있으며, -10 이하일 경우엔 호흡기가 필요없다고 함. 조금씩 호흡기 떼는 연습을 시작하기로 함.⑧ 12/22: 10 days ago, the respirator fell negative and only worried about the machine. Today, a mechanical repairman came in. To be negative means that he is capable of breathing. Until now, it is between -1 and -3, and if it is above -5, the respirator can be stopped for about 30 minutes a day. I decided to start practicing my breathing little by little.
⑨ 2005/1/17: 저린 증상은 아직 있으나 호흡기를 떼는 연습을 계속하고 있으며 예전과는 다르게 호흡기를 떼고도 어느 정도 호흡이 가능하다고 함.⑨ 2005/1/17: There are symptoms of numbness, but he continues to practice removing the respiratory organs.
임상시험예 2: 근위축성측삭경화증 세포 치료 결과Clinical Trial 2: Result of Amyotrophic Lateral Sclerosis Cell Treatment
(1) 환자: 정OO/50세/남(1) Patient: OO / 50 years old / male
(2) 병명: 루게릭병(2) Disease name: Lou Gehrig's disease
(3) 줄기세포 시술전 환자의 상태: 산소마스크를 통해 호흡을 하고 있었으며 언어소통은 가능하나 사지를 사용하지 못하는 상태였음.(3) The condition of the patient before the stem cell procedure: The patient was breathing through an oxygen mask and spoken but could not use the limbs.
(4) 2004년 11월 9일 제대혈 유래 줄기세포 시술(4) Umbilical cord blood-derived stem cell procedure on 9 November 2004
① 11/16: 마비되어 움직이지 못했던 오른쪽 손을 힘겹게 배 위에 올려놓을 수 있다고 함.① 11/16: A paralyzed right hand that can't move can be put on your stomach.
② 11/17: 주사 맞은 후 아팠던 부분의 통증은 이제 안 느껴지며 저린 증상도 없음. 본인의 느낌상 다리의 마비증상으로 하반신을 움직이지 못했는데 현재 발목 쪽으로 힘이 가고 있음을 느낄 수 있다고 함. 부인이 보기에도 발 아래쪽으로 약간씩 미세하게 움직임을 볼 수 있음.② 11/17: 통증 Pain in the pain area after the injection is no longer felt and no symptoms. I felt that I could not move my lower body due to paralysis of my leg, but now I feel that my strength is moving toward my ankle. Even the wife can see a slight movement under the feet.
③ 11/19: 눈으로 보기엔 오른발 보다 왼발이 조금 더 움직임이 있으며, 예전에는 손에도 역시 힘이 들어가지 못했는데 지금은 미세하게나마 힘이 가는 걸 느낌. 기분 좋아함.③ 11/19: In my eyes, my left foot is a little bit more moving than my right foot, and in the past, my hands weren't able to enter, but now I feel fine. I feel good.
④ 11/26: 오른쪽 두 번째 손가락이 굽어 있었는데 약간 펴짐. 무릎을 세워서 누워 있는 자세가 편해 보호자의 도움으로 그 자세를 자주 취하는데, 예전에는 한쪽 다리가 쓰러져도 혼자의 힘으로 일으켜 세우지 못했었음. 어제는 쓰러진 한쪽 다리를 자신의 힘으로 세웠으며 보호자가 손가락으로 쓰려뜨려도 반동을 이용해 다시 제자리로 돌아올 수 있는 탄력이 생김.④ 11/26: Right second finger bent slightly. The position of lying on the knees is comfortable, so I often take the position with the help of a caregiver. In the past, I could not stand up with one's own strength even when one leg fell. Yesterday, he set up a broken leg with his own strength, and even if the guardian knocks it down with his finger, he can rebound back to his place.
⑤ 11/29: 누워있는 상태로 어깨가 들려져서 주먹 정도가 들어갈 정도가 됨. 계속적으로 모든 면에서 좋아지는 증상이 나타나고 있으며 환자 본인도 힘이 조금씩 더 들어가고 있다고 함. 현재 무릎을 세워 놓고 좌우로 운동을 하고 있음.⑤ 11/29: The shoulders are raised while lying down, and the fist is enough to enter. The symptoms continue to improve in every way, and the patient himself is getting a little bit stronger. He is currently exercising from side to side with his knees upright.
⑥ 11/30: 부인 말로는 몸에 살이 붙는 것 같은 느낌이라면서 체중을 한번 재어 보길 원함. 환자 본인의 말로 소변을 보고 싶을 때 많은 시간이 걸렸었는데 2∼3 일 전부터는 예전보다 쉽게 볼 수 있다고 함.⑥ 11/30: My wife feels like I'm getting flesh, but I want to weigh her once. It took a lot of time when I wanted to urinate in my own words, but it is easier to see from 2-3 days ago.
⑦ 12/1: 목하고 어깨 부분을 들썩거리는 운동을 20 번 정도 하고 있음. 무 릎을 세워 누운 자세로 다리를 좌우로(총 90도 각도) 벌렸다가 원 상태로 돌아왔다가 하는 운동을 14∼15 번 정도씩 하고 있음. 배까지 올라왔던 왼손은 가슴 윗부분까지 올릴 수 있으며, 마비가 더욱 심했던 오른쪽은 간신히 배까지 올라간다고 함.⑦ 12/1: Doing 20 neck and shoulder shakes. He is lying down on his knees with his legs spread from side to side (total angle of 90 degrees). The left hand, which has been raised up to the stomach, can be raised to the upper part of the chest, and the right side, which was more severe, is barely up to the stomach.
⑧ 12/3: 예전에는 베개 때문에 몰랐는데 환자가 목에 힘을 주고 머리를 3 ㎝ 정도 들 수 있다고 함. 하루에 2∼3 번 정도 운동을 하고 있음.⑧ 12/3: I wasn't aware of the pillows before, but the patient said he could lift his neck and lift his head about 3 cm. I exercise 2 or 3 times a day.
⑨ 12/8: 새벽 4 시경 화장실을 갔을 때 환자가 손에 약간 뭔가 느껴진다고 했으나 아침까지는 특별한 변화가 없음. 하지만 오전 11시쯤 마비가 심해서 움직이지 못했던 오른손에 힘이 들어가면서 힘겹지만 손바닥을 뒤집고 엎는 것이 가능했다고 함.⑨ 12/8: When I went to the bathroom around 4 am, the patient said that I felt something on his hand, but there was no change until morning. However, around 11 am, he was suffering from paralysis, and his right hand was unable to move, but it was difficult, but he could turn his palm upside down.
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따른 제대혈 유래 줄기세포와 만니톨을 이용한 근위축성측삭경화증 환자의 세포치료법은, 환자와 줄기세포의 조직적합성 유전자가 일치하는 것을 기본으로 하므로 면역거부 반응을 해결할 수 있으며, 다른 배아 줄기세포처럼 인체 내에 기형종(teratoma)나 기형암(terato carcinoma) 발생 가능성이 없는 등, 인체 내 부작용이 전혀 없다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 세포치료는 기존의 어떠한 외과적 또는 약물적 치료법이 없는 근위축성측삭경화증 환자들에게 실질적으로 임상의 개선을 보여주는 새로운 치료법으로서 환자들에게 새로운 희망을 안겨줄 것으로 기대된다.As described above, the cell therapy of patients with muscular dystrophy scleroderma using umbilical cord blood-derived stem cells and mannitol in accordance with the present invention can solve the immune rejection reaction because the histocompatibility genes of the patient and stem cells are based on the same. In addition, like other embryonic stem cells, there is no possibility of teratoma or terato carcinoma in the human body, and there is no side effect in the human body. Accordingly, the cell therapy according to the present invention is expected to bring new hope to patients as a new treatment showing substantial clinical improvement in patients with atrophic lateral sclerosis without any existing surgical or drug treatment.
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