KR100679923B1 - 돼지의 해면골을 취하여 무기물화함으로써 골이식용 해면골의 기초 본블록을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골이식용 해면골을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 이식용 해면골을 제조하는 방법에 있어서, 돼지의 해면골을 취하여 무기물화 함으로써 기초 구조재를 제작함에 있어, 생체 적용에 필요한 해면골을 적소·적기에 제조·공급할 수 있게 하는 이식용 해면골의 기초 구조재로서의 본블록을 제공할 수 있도록 하였다.

Description

돼지의 해면골을 취하여 무기물화함으로써 골이식용 해면골의 기초 본블록을 제조하는 방법{Method for providing basic bone block for transplanting using trabecular bone of pig}

본 발명은 골이식용 해면골을 제조에 이용하기 위한 기초 본블록을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 돼지 등의 동물 뼈를 이용하고, 면역학적 문제를 해결하면서, 필요한 적용대상자들에게 보다 적합한 해면골을 적기에 제조 공급할 수 있도록 하는 기초 구성물로서의 본블록을 제공하는 기법에 관한 것이다.

특히, 이종간 이식의 경우에 발생하는 면역학적 문제를 해결하면서, 적용 대상에 따라 사용자가 원하는 크기와 형태의 해면골을 동물 뼈를 이용하여, 조기에 제작 공급함으로써 궁극적으로는 생체 내에서의 신속하고도 정규화된 뼈의 재생을 유도하는 기법에 관한 것이다.

일반적으로, 골다공증은, 골의 화학적 조성에는 변화가 없이, 즉 유기적인 골 기질과 골 무기질의 비율은 변화 없이, 골절 한계치(fracture threshold) 이하로 골량이 감소되어 물리적인 강도가 떨어져 경미한 충격에도 골절을 일으킬 수 있는 상태(질환)를 말한다. 다시 말해서, 골의 질은 정상이나 양적으로 감소된 상태를 의미한다.

또한, 골감소증이란 유골(osteoid) 형성의 속도가 정상적인 골흡수 속도에 미치지 못하여 골량이 감소된 상태를 일컫는 것으로 원인에 관계없이 정상 이하로 골량이 감소된 상태를 지칭한다.

이러한 골 질환은 원상태로 재생될 수는 없으며 예방이 중요하다. 골소실에 의해 골다공증이 발생하면 골소실을 억제하여 더 이상의 골량 감소를 막는 방법은 있으나 골형성을 촉진시켜 골량을 증가시키는 효과적인 방법은 거의 없다. 설사, 골량을 증가시키는 치료법이 있더라도 심한 골다공증을 보이는 해면골 또는 지주골(cancellous or trabecular bone)의 많은 부위에서는 미세 골절이 일어나 서로의 연결 부위가 절단되기도 한다. 따라서 이미 이러한 변화가 나타난 후 치료를 하면 골량은 증가할 수 있으나 절단 부위는 다시 연결되지 않아 골의 구조와 골의 물리적 강도는 회복되지 않는다. 즉 현재까지의 치료로는 정상적인 골 구조를 회복시키지 못하는 것이다.

이와 같이 골절의 위험에는 골량의 양적인 감소뿐 아니라 골의 질적인 변화도 문제가 된다. 따라서 골다공증이 심해진 후에는 치료될 수 없다.

현재, 이러한 골의 질병 또는 골 종양을 포함한 골 질환에 의해 부러지거나 파손되어 해당 부위의 골 제거가 불가결할 경우에는, 인공적으로 만든 골이나, 혹은 적용대상자 신체의 일부분에서 골을 채취하여 이식하게 된다. 그러나 척추 및 기타 정형외과적 수술 등의 경우에는 수술시 적용대상자의 자가장골을 채취하여 이식하게 되는데 이러한 경우에는 임상적으로 많은 문제들, 예를 들어 이식골 채취 부위의 동통, 채취시 시간이 길어지는 문제, 채취 부위의 감염문제, 적용대상자의 입원 기간이 길어지는 문제 등이 나타날 뿐만 아니라 적용대상자의 심리적 부담감이 커지는 등 많은 문제점이 있다.

더욱이, 인공적으로 만든 세라믹(ceramic) 등의 구조재(construct) 자체, 혹은 체외에서 세포를 파종(seeding)하여 일정기간 배양한 후 이식하는 방법도 최근에 많이 연구, 사용되는 경향이 있으나 아직까지 조직의 배양과 이식 후의 장기적 관찰로서는 만족스러운 결과를 얻지 못하고 있는 실정이다.

따라서, 본 발명은 상술한 문제점을 감안하여 이루어진 것으로서, 본 발명의 목적은, 적용대상자가 필요로 하는 크기와 형태의 해면골을 면역학 문제를 해결하면서 보다 신속하게 제조할 수 있도록 함으로써, 적용대상자에게 필요한 뼈를 적기에 공급할 수 있도록 하기 위한 새로운 조직 배양 및 재생 기법을 이용하여 처리하기에 용이한 기초 구조재로서의 해면골용 본블록을 제공함에 있다.

이와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 의한 골이식용 해면골을 제조하는 방법은, 이식용 해면골을 제조하는 방법에 있어서, 돼지의 해면골을 취하여 무기물화 함으로써 기초 구성물로서의 해면골용 본블록을 제공함에 있다.

이러한 기법을 제공함으로써, 장기나 뼈를 이종 이식하는 경우에 발생되는 면역문제를 해결할 수 있고, 보다 신속한 조직 배양이 가능해지게 되어, 골 이식이 필요한 적용 대상자들에게 보다 적합하고 안전한 해면골을 적소·적기에 제조·공급할 수 있도록 하였다.

또한, 본 발명에 따른, 돼지의 해면골을 무기물화(Mineralization)하여 기초 본블록을 제작하는 주된 처리공정으로서,

도살한지 12시간 내의 동물 해면골을 얻어 영하 70도의 냉동고에서 급속 냉동시킨 후 24시간 내에 원하는 크기로 다이아몬드 톱(Diamond Saw)을 이용하여 가공하는 제1단계;

상기 해면골을 3차 증류수에 담가서 2시간 동안 교반 시키면서 가열하여 골수(fatty bone marrow)를 제거하는 제2단계;

30% 과산화수소에 넣어 2시간 정도 교반과 동시에 가열하면서 남은 골수를 완전히 제거하는 제3단계;

3차 증류수로 세척한 다음, 순도 99.9%의 알코올에 담그는 제4단계;

그 후 대기 중에서 24시간이상 건조시켜 잔여 수분을 완전히 제거하는 제5단계;

열처리로서, 직경 8-10cm의 튜브 형태의 전기 가열기를 이용하고, 전기 가열로는 해면골을 튜브에 넣은 후 상온에서 시작하여 분당 섭씨 10도 씩 증가시켜 섭씨 1300도 까지 승온한 후 유지하는 제6단계;

섭씨 1300도에 이르게 되면 2시간정도 유지하는 제7단계; 및

2시간 경과 후 전원을 끄고 상온이 될 때까지 기다리고, 전기로가 완전히 상온으로 돌아오면 튜브에서 해면골을 꺼내는 제8단계를 포함한다.

또, 이를 적용하는 하나의 응용예로서 제시할 수 있는, 적용대상자의 골수로부터 추출된 중배엽기간세포(MSC; mesenchymal stem cell)의 증폭 및 골아세포(osteoblast)로의 분화를 유도하는 제2 처리공정으로서,

적용대상자의 골수로부터 추출한 중배엽 기간세포(mesenchymal stem cell)를 계대배양하여 20-100배 증폭시키는 제1소단계;

배지는 DMEM-low glucose 및 10% 우태혈청을 사용하며, 항생제를 첨가하고, 배양시 일주일에 한번 박테리아 배양을 실시하여 감염 여부를 판단하는 제2소단계를 포함하고, 계대배양시 배양액은 3일에 한 번씩 교체한다.

또한, 후속하는 하나의 응용예로서, 후술하는 소단계들에 기재된 바와 같이, 공지의 생물반응장치(Bioreactor, 본문에서는 바이오 리액터라고만 통칭함) 내에서 배양액 교체, 성장인자(growth factors)의 투여 및 기계적 자극에 의한 초기 조직이 형성되는 제3 처리공정은,

증폭된 중배엽 기간세포(Mesenchymal Stem Cell)를 스핀 플라스크(Spinner Flask)에, 처리된 동물의 해면골(뼈)과 함께 넣어 파종(seeding)시키는 제1소단계;

처음 30분 정도 분당 30회 정도 회전시키면서 플라스크(flask) 전체를 요동시키면서 파종(seeding)을 유도하는 제2소단계;

그 후 0.2내지 0.4 기압으로 0.1내지 0.3 Hz를 유지하면서, 즉 약 1초간 가압 후 2초간 휴식하면서 하루에 1분간 3회를 2주일 동안 반복하고, 성장인자(Growth factor) TGF-beta와 prednisolone를 이용하여 중배엽 기간세포(MSC)에서 골아세포(osteoblast)를 유도하되, 하루에 한 번씩 배양액을 교체하는 제3소단계;

바이오 리액터( Bioreactor)에서 재생을 유도하여 상기 2주일의 기간 중 마지막 3일동안 TGF-beta1, BMP(Bone Mophogencic Protein), BFGF(Basic Fibroblast Growth Factor)를 동시에 사용하여 시너지 효과를 극대화시키는 제4소단계;

2주일 후 재생된 뼈가 담겨있는 스핀플라스크(Spinner flask) 용기를 수술실에 곧 바로 제공하는 제5소단계; 및

스핀 플라스크(Spinner Flask)를 수술실에서 개봉하여 원하는 크기로 다시 멸균상태에서 잘라서 이식하는 제6소단계를 포함하고, 상기 제1, 2 및 3소단계에서는 멸균된 상황에서 5%의 이산화탄소를 이용한다.

이하, 본 발명의 일실시예에 관하여 상세하게 설명한다.

본 발명은 돼지의 해면골을 취하여 무기물화 함으로써 기초 구조재로서의 본블록(bone block)을 제작하는 주된 처리공정으로 이루어진다.

[주공정]

주된 공정은, 돼지의 해면골을 무기물화(Mineralization)화하여, 기초 구조재를 제작하는 것인데 자세한 과정은 다음과 같다.

1단계) 도살한지 12시간 내의 동물 해면골을 얻어 영하 70도의 냉동고에서 급속 냉동시킨 후 24시간 내에 원하는 크기로 다이아몬드 톱(Diamond Saw)을 이용하여 가공한다.

2단계) 시편을 3차 증류수에 담가서 2시간 동안 교반 시키면서 가열하여 골수(fatty bone marrow)를 제거한다.

3단계) 30% 과산화수소에 넣어 2시간 정도 교반과 동시에 가열하면서 남은 골수를 완전히 제거한다.

4단계) 3차 증류수로 세척한 다음, 순도 99.9%의 알코올에 담근다.

5단계) 그 후 대기 중에서 24시간이상 건조시켜 잔여 수분을 완전히 제거한다.

6단계) 열처리는 직경 8-10cm의 튜브 형태의 전기 가열기를 이용한다. 전기 가열로는 시편을 튜브에 넣은 후 상온에서 시작하여 분당 섭씨 10도 씩 증가시켜 섭씨 1300도 까지 승온한 후 유지한다. 이때 생분해를 야기 시키는 베타 티시피(beta-TCP)를 유지할 것인가의 여부에 따라 두 가지로 나누어 승온 시킨다. 즉 튜브의 양쪽을 막는 실리콘 마개를 열고 1300도까지 가열하면 beta-TCP가 존재하지 않지만, 만약 마개를 막고 진행하면 beta-TCP가 남게 된다.

7단계) 섭씨 1300도에 이르게 되면 2시간정도 유지한다.

8단계) 2시간 경과 후 전원을 끄고 상온이 될 때까지 기다린다. 전기로가 완전히 상온으로 돌아오면 튜브에서 시편을 꺼낸다.

[제2 처리]

또한, 상기 주된 처리공정으로부터 무기물화되어 마련된 본블록은, 적용대상자의 골수로부터 추출된 중배엽 기간세포(MSC; mesenchymal stem cell)의 증폭 및 골아세포(osteoblast)로의 분화를 유도하는 제2 처리공정과, 바이오 리액터 내에서 용액의 교체, 성장인자의 투여 및 기계적 자극을 통해 초기 조직이 형성되도록 하여 재생된 뼈가 곧바로 수술실에 제공될 수 있도록 하는 후속의 제3 처리공정을 거칠 수 있다.

1) 적용대상자의 골수로부터 추출한 중배엽 기간세포(mesenchymal stem cell)를 계대배양하여 20-100배 증폭시킨다.

2) 계대배양시 배양액은 3일에 한 번씩 교체한다.

3) 배지는 DMEM-low glucose 및 10% 우태혈청을 사용하며, 항생제를 첨가한다. 그리고 배양시 일주일에 한번 박테리아 배양을 실시하여 감염 여부를 판단한다.

[제3 처리]

상기 제3 처리공정은, 바이오 리액터(Bioreactor) 내에서 용액 교체, 성장인자(growth factors)의 투여 및 기계적 자극에 의한 초기 조직의 형성과정이다.

1) 증폭된 중배엽 기간세포(Mesenchymal Stem Cell)를 스핀 플라스크(Spinner Flask)에 처리된 동물의 뼈와 함께 넣어 파종(seeding)시킨다.

2) 처음 30분 정도 분당 30회 정도 회전시키면서 플라스크(flask) 전체를 요동시키면서 파종(seeding)을 유도한다.

3) 그 후 0.2내지 0.4 기압으로 0.1내지 0.3 Hz를 유지하면서, 즉 약 1초간 가압 후 2초간 휴식하면서 하루에 1분간 3회를 2주일 동안 반복한다.

4) 이상의 모든 것은 멸균된 상황에서 5%의 이산화탄소를 이용한다.

5) 하루에 한 번씩 용액을 교체한다.

6) 성장인자(Growth factor) TGF-beta와 prednisolone를 이용하여 중배엽 기간세포(MSC)에서 골아세포(osteoblast)를 유도한다.

7)바이오 리액터( Bioreactor)에서 재생을 유도하여 마지막 3일째부터 TGF-beta1, BMP(Bone Mophogencic Protein), BFGF(Basic Fibroblast Growth Factor)를 동시에 사용하여 시너지 효과를 극대화시킨다.

8) 2주일 후 재생된 뼈가 담겨있는 스핀플라스크(Spinner flask) 용기를 수술실에 곧바로 제공한다

9) 스핀 플라스크(Spinner Flask)를 수술실에서 개봉하여 원하는 크기로 다시 멸균상태에서 잘라서 이식한다.

이와 같은 공법에 따라, 돼지의 척추, 대퇴골 또는 경골에서 채취한 해면골을 열·화학적 처리 및 적용대상자 자신의 중배엽 기간세포를 파종한 후, 바이오 리액터에서 생화학적 성장인자 및 기계적 자극을 통한 조기 조직 배양을 이루어, 인체의 원하는 부위에 이식하는 새로운 기법을 창출할 수 있게 된다.

상기한 새로운 기법으로 인해, 1) 탈염된(Demineralized)뼈가 아닌 무기물화된(mineralized) 동물의 해면골을 이용하는 기술과,

2) 생분해를 야기 시키는 TCP-beta의 존재 여부를 필요에 따라 결정하는 열처리 기술과,

3) 열처리 및 화학적 처리의 방법에 따라 직경 10내지 20마이크로미터정도로 기공크기(pore size)를 조절하는 기술과,

4) 적용대상자의 골수에서 채취된 중배엽 기간세포(MSC; Mesenchymal Stem Cell)의 증폭 기법과,

5) 바이오 리액터(Bioreactor)를 이용하여 MSC가 파종(seeding)된 동물의 해면골에 성장인자(growth factors) 및 기계적 자극(mechanical stimuli)을 적정수준으로 가하여 이식 전 초기 조직을 시험관 내(in-vitro)에서 일정 수준 이상으로 형 성하는 기술을 선택적으로 이룰 수 있게 된다.

따라서, 이종간 이식의 경우에 발생하는 면역학적 문제를 해결함과 더불어, 적용대상자의 필요에 따라 사용자가 원하는 크기와 형태의 해면골을 동물의 뼈를 이용하여 조기에 제작 공급함으로써, 적용대상자에게 이식 시, 생체 내에서의 조속한 뼈의 재생을 도모할 수 있게 되는 것이다.

다시 말해서, 본원의 본블록을 이용하여 뼈를 이종 이식하는 경우에 발생되는 면역문제를 해결할 수 있고, 현재의 신속한 조직 배양 기술을 접목하여, 필요한 적용대상자들에게 보다 적합하고 안전한 해면골을 적기에 제조 공급할 수 있게 되는 것이다.

앞에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의한 해면골 제조방법에 의하면, 첫째, 필요한 적용대상자들에게 보다 적합하고 안전한 해면골을 적기에 제조 공급하는 데 일조할 수 있는 기초구조재로서의 본블록을 제공할 수 있다는 매우 뛰어난 효과가 있는 것이다.

Claims (4)

1. 돼지의 해면골을 취하여 무기물화 함으로써 골이식용 해면골의 기초 본블록을 제조하는 방법에 있어서,

   도살한지 12시간 내의 돼지 해면골을 얻어 영하 70도의 냉동고에서 급속 냉동시킨 후 24시간 내에 원하는 크기로 다이아몬드 톱(Diamond Saw)을 이용하여 가공하는 제1단계;

   상기 해면골을 3차 증류수에 담가서 2시간 동안 교반 시키면서 가열하여 골수(fatty bone marrow)를 제거하는 제2단계;

   30% 과산화수소에 넣어 2시간 정도 교반과 동시에 가열하면서 남은 골수를 완전히 제거하는 제3단계;

   3차 증류수로 세척한 다음, 순도 99.9%의 알코올에 담그는 제4단계;

   그 후 대기 중에서 24시간이상 건조시켜 잔여 수분을 완전히 제거하는 제5단계;

   열처리로서, 직경 8-10cm의 튜브 형태의 전기 가열기를 이용하고, 전기 가열로는 해면골을 튜브에 넣은 후 상온에서 시작하여 분당 섭씨 10도 씩 증가시켜 섭씨 1300도 까지 승온한 후 유지하는 제6단계;

   섭씨 1300도에 이르게 되면 2시간정도 유지하는 제7단계; 및

   2시간 경과 후 전원을 끄고 상온이 될 때까지 기다리고, 전기로가 완전히 상온으로 돌아오면 튜브에서 해면골을 꺼내는 제8단계를 포함하고,

   상기 제6단계에서, 베타 티시피(beta-TCP)를 유지시키고자 할 때에는 튜브의 양쪽을 막는 실리콘 마개를 닫고 가열하고, 베타 티시피를 없애고자 할 때에는 실리콘 마개를 열고 가열하는 것을 특징으로 하는 골이식용 해면골의 기초 본블록을 제조하는 방법.
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