KR100674783B1 - Method of preparing cell for transplantation - Google Patents

Method of preparing cell for transplantation Download PDF

Info

Publication number
KR100674783B1
KR100674783B1 KR1020030088850A KR20030088850A KR100674783B1 KR 100674783 B1 KR100674783 B1 KR 100674783B1 KR 1020030088850 A KR1020030088850 A KR 1020030088850A KR 20030088850 A KR20030088850 A KR 20030088850A KR 100674783 B1 KR100674783 B1 KR 100674783B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bone marrow
cells
stem cells
marrow stem
myocardial
Prior art date
Application number
KR1020030088850A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20050055823A (en
Inventor
제프리 디. 크로센트
김택승
유희원
Original Assignee
(주)안트로젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)안트로젠 filed Critical (주)안트로젠
Priority to KR1020030088850A priority Critical patent/KR100674783B1/en
Priority to AU2004296369A priority patent/AU2004296369B2/en
Priority to PCT/KR2004/002983 priority patent/WO2005056779A1/en
Priority to JP2006543733A priority patent/JP4122365B2/en
Priority to CNB2004800365679A priority patent/CN100475956C/en
Publication of KR20050055823A publication Critical patent/KR20050055823A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR100674783B1 publication Critical patent/KR100674783B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

본 발명은 포유류 심근 조직으로 이식하기 위한 세포의 생산 방법에 관한 것으로, (a) 불멸화(immotalized)되지 않는 골수 줄기 세포를 공급하는 단계; (b) 상기 골수 줄기 세포를 골수 줄기 세포의 성격을 유지하는 상태에서 2 회 계대 배양하는 단계; (c) 상기 골수 줄기 세포를 심근 아세포로 분화시키도록 유도하는 심장 특이적 배지(cardiac specific media)에서 일정 기간 동안 배양하는 단계; 및 (d) 상기 세포의 80 내지 90%가 심근 아세포로 유도되었을 때 단계 (c)의 세포를 수집하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법에 따라 유도되는 심근 아세포는, 5-아자사이티딘과 같은 화학적 디메틸화 시약(demethylating agent)을 사용한 것보다 훨씬 임상적으로 적절하므로, 임상적으로 최적의 생착과 생존율을 나타내는 심근 세포로 유도된 골수 줄기 세포를 제공하여, 불충분한 심근 기능으로 인한 이상증으로 진단된 포유류(예, 인간)를 치료하는 데 이용할 수 있다.The present invention relates to a method for producing cells for transplantation into mammalian myocardial tissue, comprising the steps of: (a) supplying bone marrow stem cells that are not immortalized; (b) passaging the bone marrow stem cells two times while maintaining the nature of the bone marrow stem cells; (c) culturing for a period of time in cardiac specific media to induce the bone marrow stem cells to differentiate into cardiomyocytes; And (d) collecting the cells of step (c) when 80 to 90% of the cells are induced into cardiomyocytes. The cardiomyocytes induced in accordance with the method of the present invention comprise a 5-azacytidine, Much more clinically appropriate than using a chemical dimethylating agent, it provides myeloid stem cells derived from myocardial cells with clinically optimal engraftment and survival rates to diagnose abnormalities due to insufficient myocardial function. It can be used to treat a mammal (eg, a human).

골수 줄기 세포, 심근 아세포, 생물학적 성장인자, 변화 분화.Bone marrow stem cells, myocardial blasts, biological growth factors, change differentiation.

Description

세포 이식을 위한 세포의 생산 방법{METHOD OF PREPARING CELL FOR TRANSPLANTATION}Cell production method for cell transplantation {METHOD OF PREPARING CELL FOR TRANSPLANTATION}

도 1은 개에서 분리 배양한 골수 줄기 세포의 위상차 현미경 사진(100 배).1 is a phase contrast micrograph (100 times) of bone marrow stem cells isolated and cultured in a dog.

도 2는 개 골수 줄기 세포의 모양, 그리고 심장세포 특이적인 배지로 배양한 후 MEF2(A) 및 Desmin(B)의 발현을 본 현미경 사진이고, (C)은 MF-20의 음성 대조군 염색 사진(100 배).Figure 2 is a micrograph of the appearance of dog bone marrow stem cells, and expression of MEF2 (A) and Desmin (B) after incubation in a cardiac specific medium, (C) is a negative control staining of MF-20 ( 100 times).

도 3은 심장 특이적인 배지로 처리한 후 시간에 따른 MEF2 발현을 염색을 통하여 관찰한 현미경 사진으로(A∼F는 200 배, G∼N은 100 배), A와 D는 비 처리 세포이고, B와 E는 심장 특이적인 배지로 처리한 후 1일, C와 F는 2일, G와 K는 3일, H와 L은 6일, I와 M은 8일, J와 N은 8일 동안 처리한 BMSC를 토끼-IgG로 염색한 음성 대조군.Figure 3 is a microscopic photograph of the MEF2 expression over time after treatment with cardiac specific medium (A-F is 200 times, G-N is 100 times), A and D are untreated cells, B and E were treated with cardiac specific media for 1 day, C and F for 2 days, G and K for 3 days, H and L for 6 days, I and M for 8 days, and J and N for 8 days Negative control stained with rabbit-IgG treated BMSC.

도 4는 이식 15일 후 심근 경색 개의 심근층에서 이식된 골수 줄기 세포의 위치를 보여주는 일련의 현미경 사진으로(40 배), 붉은색 형광은 숙주의 심근 (myocardium)에 이식되어진 DiI-표지 골수 줄기 세포, 초록색 형광은 MF-20 항체로 염색된 심근 아세포, 그리고 파란색 형광은 DAPI로 표지된 핵을 나타낸 것.FIG. 4 is a series of micrographs (40x) showing the location of bone marrow stem cells transplanted in myocardial layer of myocardial infarction dog 15 days after transplantation, with red fluorescence diI-labeled bone marrow stem transplanted to host myocardium Cells, green fluorescence showing myocardial blast cells stained with MF-20 antibody, and blue fluorescence showing nuclei labeled with DAPI.

도 5는 이식 70일 후 심근 경색 개의 심근층에 이식된 골수 줄기 세포의 위치를 보여주는 현미경 사진으로(40 배), 붉은색 형광은 심근에 이식된 DiI-표지 골 수 줄기 세포, 초록색 형광은 MHC 항체에 반응한 심근 아세포, 그리고 파란색 형광은 DAPI로 표지된 핵을 나타낸 것.FIG. 5 is a micrograph showing the location of bone marrow stem cells transplanted into myocardial layer of myocardial infarction dog 70 days after transplantation (40x), red fluorescence is DiI-labeled bone marrow stem cells implanted in myocardium, green fluorescence is MHC Myocardial blasts and blue fluorescence in response to antibodies show nuclei labeled with DAPI.

도 6은 이식 70일 후 심근 경색 개의 심근에 에 이식된 골수 줄기 세포의 위치를 보여주는 현미경 사진으로(40 배), 붉은색 형광은 심장에 이식된 DiI-표지 골수 줄기 세포, 초록색 형광은 cTNI 항체에 반응한 심근 아세포를 나타낸 것.FIG. 6 is a micrograph showing the location of bone marrow stem cells transplanted into myocardial infarct dog myocardium 70 days after transplantation (40x), red fluorescence is DiI-labeled bone marrow stem cells implanted in heart, green fluorescence is cTNI antibody Myocardial blast cells in response to

도 7은 이식 96일 후 심근 경색 개의 심근에 이식된 골수 줄기 세포의 위치를 보여주는 현미경 사진으로(40 배), 붉은색 형광은 심장에 이식된 DiI-표지 골수 줄기 세포, 초록색 형광은 MF-20 항체에 반응한 심근 아세포를 나타낸 것.Figure 7 is a micrograph showing the location of bone marrow stem cells transplanted into myocardial infarct dog myocardium 96 days after transplantation (40x), with red fluorescence in the heart and DiI-labeled bone marrow stem cells implanted in the heart, green fluorescence in MF-20 Myocardial blast cells in response to antibodies.

도 8은 심근 경색 개의 심장 박동수의 변화를 유도된 골수 줄기 세포 이식 전(BL)과 이식 후(4주, 8주, 12주)에 비교한 그래프. 8 is a graph comparing changes in heart rate of myocardial infarction dogs before induced bone marrow stem cell transplantation (BL) and post transplantation (4 weeks, 8 weeks, 12 weeks).

도 9는 심근 경색 개의 심근에 유도된 골수 줄기 세포를 이식한 후 심장 기능의 개선을 나타내는 초음파 사진에서, 유도된 골수 줄기 세포 이식 전(BL)과 이식 후(4주, 8주, 12주)의 분획적 단축(fractional shortening)과 면적 단축(area shortening)의 변화량을 나타낸 그래프.9 is an ultrasound photograph showing the improvement of heart function after transplantation of bone marrow stem cells induced in myocardial infarction dog myocardium, before induced bone marrow stem cell transplantation (BL) and post transplantation (4 weeks, 8 weeks, 12 weeks). A graph showing the amount of change in fractional shortening and area shortening of.

도 10은 심근 경색 개의 심근에 유도된 골수 줄기 세포를 이식한 후 심장의 기능 개선을 보여주는 초음파 사진에서, 유도된 골수 줄기 세포 이식 전(BL)과 이식 후(4주, 8주, 12주) 심장 전벽의 두께 변화량을 나타낸 그래프.10 is an ultrasound photograph showing the improvement of the heart function after transplantation of bone marrow stem cells induced in myocardial infarction dog myocardium, before induced bone marrow stem cell transplantation (BL) and after transplantation (4 weeks, 8 weeks, 12 weeks) Graph showing the change in thickness of the anterior wall of the heart.

본 발명은 포유류 심근 조직으로 이식하기 위한 세포의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 인간을 포함하는 포유류의 골수 줄기 세포에 생물학적 성장인자를 처리하여 직접 심장 계통(cardiac lineage)으로 분화시키고, 분화된 골수 줄기 세포가 손상된 심근에서 가장 좋은 생착과 생존율을 나타내도록 하기 위해 주사하기 전 특정 기간 동안 in vitro에서 처리하고, 그리고 유도된 골수 줄기 세포를 심근경색이 있는 포유류의 심장에 이식하여 상태의 변화를 평가하는 방법에 관련된다.The present invention relates to a method for producing cells for transplantation into mammalian myocardial tissue, and more specifically, to differentiation into cardiac lineage by treating biological growth factors in mammalian bone marrow stem cells, including humans, Differentiated bone marrow stem cells are treated in vitro for a certain period of time prior to injection to ensure the best engraftment and survival in the damaged myocardium, and the induced bone marrow stem cells are transplanted into the heart of a mammal with myocardial infarction. It relates to how to assess change.

성체의 골수에서 얻어진 중간엽 줄기 세포는 지방 세포, 뼈 세포, 연골 세포, 간 세포, 그리고 심근 세포 등을 포함하여 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 전분화 능력을 가지고 있는 것으로 보여진다. 이와 같은 다양한 분화 능력 때문에 골수 줄기 세포는 세포 이식 치료법에 사용하기 좋은 후보 물질이 될 수 있다.Mesenchymal stem cells obtained from adult bone marrow have been shown to have the ability to differentiate into various cells, including adipocytes, bone cells, chondrocytes, liver cells, and cardiomyocytes. These differentiation abilities can make bone marrow stem cells a good candidate for use in cell transplantation therapies.

한편, 심근 경색은 전 세계적으로 사망을 일으키는 중요한 원인 중 하나로 알려져 있다. 성인 심장에서는 심근 아세포가 증식할 수 없기 때문에 심근 경색으로 인한 심근 세포의 죽음은 건강한 세포가 있던 자리에 상처를 남기게 된다.Myocardial infarction, meanwhile, is known as one of the leading causes of death worldwide. Because myocardial blasts cannot proliferate in the adult heart, myocardial cell death due to myocardial infarction leaves a scar in the place of the healthy cell.

최근 연구 결과에 의하면 골수 줄기 세포는 심장에 이식된 후 놀라운 유연성을 갖는 것으로 나타났다. 골수 줄기 세포가 심근에 이식되면 심근 아세포로 교차분화(transdifferentiation)되는 능력이 있으며, 이러한 능력이 골수 줄기 세포를 심근 재생 치료에 사용할 수 있도록 만든다. 그러나, 이같은 결과가 가능성이 있다고는 하지만, 경색 후 유의성 있는 기능 개선을 보일 만큼 골수 줄기 세포가 심근아세포로 전환되지는 않는다. 이에 따라, 골수 줄기 세포를 심근 세포로 분화시키 는 연구가 진행되고 있다.Recent studies have shown that bone marrow stem cells have incredible flexibility after being implanted in the heart. When bone marrow stem cells are transplanted into the myocardium, they have the ability to transdifferentiate into myoblasts, making them available for the treatment of myocardial regeneration. However, although this is a possibility, bone marrow stem cells are not converted to cardiomyocytes to show significant functional improvement after infarction. Accordingly, research is being conducted to differentiate bone marrow stem cells into cardiomyocytes.

골수 줄기 세포에 디메틸화 시약(demethylating agent)인 5-아자사이티딘(5-azacytidine)을 처리하는 것에 의해 골수 줄기 세포를 완전한 심근세포로 분화시킬 수 있음이 보고되었다. 5-아자사이티딘은 게놈 염기서열을 무작위로 디메틸화시켜 정상의 사일런트 유전자(silent genes)가 발현되게 하는 것으로, 골수 줄기 세포에 5-아자사이티딘을 처리하는 것에 의하여 많은 종류의 세포(예를 들어, 심근 세포(MyoD 양성), 뼈 세포(osteocalcin 양성), 지방 세포(PPAR- 양성), 그리고 심근 아세포(cardiac troponin I 양성))가 유도된다. 골수 줄기 세포는 5-아자사이티딘에 노출되면 c-abl과 인터류킨-6(interleukin-6)의 전사가 급속히 증가하고, 주된 기질 단백질인 콜라겐 I(collagen I)의 단백질 발현은 감소한다. 그러나 5-아자사이티딘과 같은 화학 약품인 디메틸화 시약은 인체 사용시 안전성이 입증되어 있지 않고, 한 가지 세포형인 심근 아세포로의 유의성 있는 분화를 보이지는 못한다.It has been reported that bone marrow stem cells can be differentiated into complete cardiomyocytes by treating 5-azacytidine, a dimethylating agent. 5-Azacytidine randomizes the genomic sequence to allow normal silent genes to be expressed. By treating 5-azacytidine on bone marrow stem cells, many types of cells (eg, For example, myocardial cells (MyoD positive), bone cells (osteocalcin positive), adipocytes (PPAR- positive), and myocardial blast cells (cardiac troponin I positive) are induced. Bone marrow stem cells rapidly increase the transcription of c-abl and interleukin-6 when exposed to 5-azacytidine and decrease the protein expression of collagen I, a major substrate protein. However, dimethylation reagents, such as chemicals such as 5-azacytidine, have not been proven safe for human use and do not show significant differentiation into one cell type, myocardial blast cells.

이상과 같은 문제점을 고려하여, 본 발명자들은 직접 분리된 골수 줄기 세포가 이식 전 특정 생물학적 요인들에 노출되면 숙주의 심근과 함께 심장 계통으로 교차분화되는 것이 촉진된다는 가정 하에서, 한 가지 세포형(예를 들어, 심근 아세포)으로 유도하는 적절한 생물학적 성장인자와 조건을 모색하고자 하였다. 그 결과, 골수 줄기 세포에 생물학적 성장인자를 처리하여 직접 심장 계통으로 분화시키는 특이한 방법과, 더 나아가 이와 같이 유도된 골수 줄기 세포가 손상된 심근에서 가장 좋은 생착과 생존율을 나타내도록 하기 위해 주사 전 특정 기간 동안 in vitro에서 처리하는 방법을 개발하였으며, 이러한 방법을 통하여 유도된 골수 줄기 세포를 심근 경색 개의 심근에 이식하여 심근 경색이 개선되는 것을 확인함으로써 본 발명에 이르게 되었다.In view of the above problems, the present inventors have assumed that a single cell type (eg, assuming that directly isolated bone marrow stem cells are exposed to certain biological factors prior to transplantation promotes cross-differentiation into the heart lineage with the host's myocardium). For example, we tried to find appropriate biological growth factors and conditions to induce myocardial blasts. As a result, a unique method of treating biological bone marrow stem cells to differentiate them directly into the cardiac lineage, and furthermore, to ensure that these induced bone marrow stem cells exhibit the best engraftment and survival rates in the damaged myocardium. During the development of the treatment method in vitro, the bone marrow stem cells derived through this method were transplanted into myocardial infarction dog myocardium, which leads to the present invention.

본 출원인에 의한 선출원인 국내출원 제10-2003-0004565호에서는 골수 줄기 세포로부터 심근 아세포를 고수율로 생산하는 방법에 대하여 기술하고 있는데, 본 발명에서는 보다 구체적이고 개량된 방법을 제시하고 있다.Korean Patent Application No. 10-2003-0004565, which is a prior application by the present applicant, describes a method for producing myoblasts from bone marrow stem cells in high yield, and the present invention provides a more specific and improved method.

본 발명의 목적은, 인간을 포함하는 포유류의 골수 줄기 세포를 생물학적 성장인자를 이용하여 심근 세포로 유도하고, 유도된 골수 줄기 세포가 손상된 심근에서 가장 좋은 생착과 생존율을 나타내도록 이식하기 전 특정 기간 동안 처리하는 방법을 개발함으로써, 심근 경색과 같은 불충분한 심근 기능으로 인한 이상증으로 진단된 포유류(예를 들어, 인간)에게 임상적으로 훨씬 적절하게 유도된 골수 줄기 세포를 제공하고자 하는 것이다.An object of the present invention is to induce a bone marrow stem cell of a mammal, including a human, into a myocardial cell by using a biological growth factor, and a specific period before transplanting the induced bone marrow stem cell to show the best engraftment and survival rate in the damaged myocardium By developing a method of treatment during the period, it is intended to provide clinically more appropriately derived bone marrow stem cells to mammals (eg, humans) diagnosed with abnormalities due to insufficient myocardial function such as myocardial infarction.

상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 포유류 심근 조직으로 이식하기 위한 세포의 생산 방법은 다음 단계를 포함한다:To achieve the above object, a method for producing a cell for transplantation into mammalian myocardial tissue of the present invention comprises the following steps:

(a) 불멸화(immotalized)되지 않는 골수 줄기 세포를 공급하는 단계;(a) supplying bone marrow stem cells that are not immotalized;

(b) 상기 골수 줄기 세포를 골수 줄기 세포의 성격을 유지하는 상태에서 2 회 계대 배양하는 단계;(b) passaging the bone marrow stem cells two times while maintaining the nature of the bone marrow stem cells;

(c) 상기 골수 줄기 세포를 심근 아세포로 분화시키도록 유도하는 심장 특이적 배지(cardiac specific media)에서 일정 기간 동안 배양하는 단계; 및 (c) culturing for a period of time in cardiac specific media to induce the bone marrow stem cells to differentiate into cardiomyocytes; And                     

(d) 상기 세포의 80 내지 90%가 심근 아세포로 유도되었을 때 단계 (c)의 세포를 수집하는 단계.(d) collecting the cells of step (c) when 80-90% of said cells are induced into cardiomyocytes.

여기에서, 상기 골수 줄기 세포는 이식 대상 포유류로부터 유래될 수 있으며, 상기 단계 (c)에서 배양은 1 시간 내지 21 일 동안이 바람직하고, 6 일 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하다.Here, the bone marrow stem cells may be derived from the mammal to be transplanted, the culture in step (c) is preferably for 1 hour to 21 days, more preferably for 6 days.

또한, 상기 심장 특이적 배지는 생물학적 성장인자인 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), BMP-2(Bone Morphogenic Protein-2) 및 IGF-I(Insulin-like Growth Factor-1)를 포함하는 배지로서, bFGF, BMP-2 및 IGF-1의 농도는 각각 1 내지 200 ng/㎖이고, 여기에 우혈청 2 내지 20%, L-아스코르브산-2-PO4 1 내지 1000 μM, LIF 5 내지 15 ng/㎖, 및 덱사메타손 1 내지 200 nM를 더욱 포함하는 배지인 것이 바람직하다.In addition, the cardiac specific medium is a medium containing a biological growth factor bFGF (basic Fibroblast Growth Factor), BMP-2 (Bone Morphogenic Protein-2) and IGF-I (Insulin-like Growth Factor-1), bFGF , Concentrations of BMP-2 and IGF-1 are 1 to 200 ng / ml, respectively, where 2 ~ 20% of bovine serum, 1 to 1000 μM of L-ascorbic acid-2-PO 4 , and 5 to 15 ng / ml of LIF. , And dexamethasone 1 to 200 nM.

여기에서, 배양된 골수 줄기 세포는 이식에 적합한 심근 아세포의 특징적 마커를 발현하는데, 특히 MEF2 단백질을 발현하고, MF-20는 발현하지 않는 단계의 세포를 수집하는 것이 바람직하다.Herein, the cultured bone marrow stem cells express characteristic markers of myocardial blast cells suitable for transplantation, in particular, it is preferable to collect cells in a stage expressing MEF2 protein and not expressing MF-20.

본 발명에 따른 포유류 심근 조직으로 이식하기 위한 세포의 생산 방법은, 골수 줄기 세포를 심장에 이식하기 전 심근계 세포로 유도하는 방법; 유도된 골수 줄기 세포를 손상된 심근에서 최적의 생착과 생존율을 나타내도록 특정 기간 동안 유도하는 방법; 그리고, 이와 같이 유도된 세포를 포유류의 심근 경색 모델에 이식하여 평가하는 방법으로 실시된다. A method for producing cells for transplantation into mammalian myocardial tissue according to the present invention includes a method for inducing bone marrow stem cells into cardiomyocyte cells before transplanting into the heart; Induced bone marrow stem cells for a specific period of time to exhibit optimal engraftment and survival in injured myocardium; The cells thus induced are then transplanted into a mammalian myocardial infarction model and evaluated.                     

먼저, 골수 줄기 세포를 심장에 이식하기 전 심근계 세포로 유도하는 방법은 다음 단계를 포함한다:First, the method of inducing bone marrow stem cells into myocardial cells prior to implantation into the heart includes the following steps:

(1) 불멸화(immortalized)되지 않는 골수 줄기 세포를 공급하는 단계;(1) supplying bone marrow stem cells that are not immortalized;

(2) 충분한 수의 세포를 얻기 위하여 상기 골수 줄기 세포를 계대 배양하는 단계;(2) passaging the bone marrow stem cells to obtain a sufficient number of cells;

(3) 배양된 상기 골수 줄기 세포를 생물학적 성장인자가 포함된 심장 특이적인 배지(cardiac specific media)에서 배양하여 심근 아세포로 유도하는 단계;(3) culturing the cultured bone marrow stem cells in cardiac specific media containing biological growth factors to induce cardiomyocytes;

(4) 단계 (3)의 세포의 유도 상태를 모니터링하는 단계; 및(4) monitoring the state of induction of the cells of step (3); And

(5) 상기 세포의 60-90%가 심근 아세포일 때 단계 (3)의 세포를 수집하는 단계.(5) collecting the cells of step (3) when 60-90% of the cells are cardiomyocytes.

또한, 유도된 골수 줄기 세포를 손상된 심근에서 최적의 생착과 생존율을 나타내도록 특정 기간 동안 유도하는 방법은 다음 단계를 포함한다:In addition, the method of inducing induced bone marrow stem cells for a specific period of time to achieve optimal engraftment and survival in injured myocardium comprises the following steps:

(1) 불멸화(immortalized)되지 않는 골수 줄기 세포를 공급하는 단계;(1) supplying bone marrow stem cells that are not immortalized;

(2) 충분한 수의 세포를 얻기 위하여 상기 골수 줄기 세포를 계대 배양하는 단계;(2) passaging the bone marrow stem cells to obtain a sufficient number of cells;

(3) 배양된 상기 골수 줄기 세포를 생물학적 성장인자가 포함된 심장 특이적인 배지(cardiac specific media)에서 1 시간 내지 21 일 동안 배양하여 심근 아세포로 유도하는 단계;(3) culturing the cultured bone marrow stem cells in cardiac specific media containing biological growth factors for 1 hour to 21 days to induce cardiomyocytes;

(4) 단계 (3)의 세포의 유도 상태를 특정 기간 별로 수집하여 모니터링하는 단계; 및 (4) collecting and monitoring the induction state of the cells of step (3) for a specific period of time; And                     

(5) 상기 세포의 80-90%가 심근 아세포일 때 단계 (3)의 세포를 수집하는 단계.(5) collecting the cells of step (3) when 80-90% of the cells are cardiomyocytes.

그리고, 이와 같이 유도된 세포를 포유류의 심근 경색 모델에 이식하여 평가하는 방법은 다음 단계를 포함한다:In addition, the method of transplanting and evaluating the cells thus induced in a mammalian myocardial infarction model includes the following steps:

(1) 심근 경색 포유류 모델을 만드는 단계;(1) creating a myocardial infarction mammalian model;

(2) 상기 포유류로부터 골수 줄기 세포를 분리하는 단계;(2) isolating bone marrow stem cells from the mammal;

(3) 충분한 수의 세포를 얻기 위하여 상기 골수 줄기 세포를 계대 배양하는 단계;(3) passaging the bone marrow stem cells to obtain a sufficient number of cells;

(4) 배양된 상기 골수 줄기 세포를 생물학적 성장인자가 포함된 심장 특이적인 배지(cardiac specific media)에서 6 일 동안 배양하는 단계;(4) culturing the cultured bone marrow stem cells in cardiac specific media containing biological growth factors for 6 days;

(5) 상기 세포의 80-90%가 심근 아세포로 유도되었을 때 단계 (4)의 세포를 표지하여 수집하는 단계; 및(5) labeling and collecting the cells of step (4) when 80-90% of the cells are induced into cardiomyocytes; And

(6) 상기 심근 아세포를 상기 포유류로 이식하는 단계.(6) transplanting the myocardial blast cells into the mammal.

본 발명에서는 인간을 포함하는 포유류의 골수 줄기 세포에 생물학적 성장인자를 처리하여 직접 심장 계통(cardiac lineage)으로 분화시키고, 분화된 골수 줄기 세포가 손상된 심근에서 가장 좋은 생착과 생존률을 나타내도록 하기 위해 주사하기 전 특정 기간 동안 in vitro에서 처리하고, 그리고 유도된 골수 줄기 세포를 심근경색이 있는 포유류의 심장에 이식하여 상태의 변화를 평가하였다. 이와 같은 방법을 통하여 유도된 심근 아세포는, 5-아자사이티딘과 같은 화학적 디메틸화 시약(demethylating agent)을 사용한 것보다 훨씬 임상적으로 적절한 것을 알 수 있 었다.In the present invention, the bone marrow stem cells of mammals including humans are treated with biological growth factors to directly differentiate into cardiac lineage, and the differentiated bone marrow stem cells are injected to give the best engraftment and survival rate in the damaged myocardium. Changes in status were performed in vitro for a specific period of time before and induced bone marrow stem cells were transplanted into the heart of a mammal with myocardial infarction. Myocardial blasts induced by this method were found to be more clinically appropriate than using a chemical dimethylating agent such as 5-azacytidine.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, this invention is demonstrated in detail.

본 발명에 따라, in vitro에서 포유류 심장 조직에 이식하기 위한 세포를 생산하는 단계에서는, 골수 줄기 세포를 심근계 세포로 유도하기 위하여 모든 과정에서 성장 인자의 조합을 사용할 수 있다. 특히 배아 발달 단계에서 심장 세포로 유도하는 데는 모든 생물학적 성장인자를 사용할 수 있다. 이러한 성장인자로는 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), BMP-2(Bone Morphogenic Protein 2), IGF-I(Insulin-like Growth Factor-1), TGF-β, Wnt-저해물질, 액티빈(activin), 레티노산(retinoic acic), Erb-2, 모든 FGF 성장인자 멤버, 모든 TGF 성장인자 멤버, 모든 IGF 성장인자 멤버 등을 포함하지만 이들만으로 제한되지는 않는다.According to the present invention, in the step of producing cells for transplantation into mammalian heart tissue in vitro, a combination of growth factors may be used in all processes to induce bone marrow stem cells into cardiomyocyte cells. In particular, all biological growth factors can be used to induce cardiac cells during embryonic development. These growth factors include basic fibroblast growth factor (bFGF), bone morphogenic protein 2 (BMP-2), insulin-like growth factor-1 (IGF-I), TGF-β, Wnt-inhibitors, and activin. , Retinoic acic, Erb-2, all FGF growth factor members, all TGF growth factor members, all IGF growth factor members, and the like.

이식되는 세포는 활발하게 증식하거나 충분히 분화할 수 있다. 골수 줄기 세포는 심장 특이적 마커를 이용하여 확인할 수 있는 심근 세포계로 특이하게 유도되어 사용될 수 있다. 이때 마커들은 Nkx2.5, GATA4, MEF2(myosin enhancing factor), 그리고 SRF(serum response factor) 등을 포함하지만 이들만으로 제한되지는 않는다. 심장 분화 마커의 발현으로 확인할 수 있는 분화된 심근 아세포도 사용 가능하다. 이 마커들은 MHC(myosin heavy chain), cTnI(cardiac troponin I), cTnT(cardiac troponin T), α-cardiac actin, α-actinin 그리고 MLC2(myosin light chain) 등을 포함하지만 이들만으로 제한되지는 않는다. 골수 줄기 세포는 서로 소통하는 심근 세포(cardiomyocytes)의 특징을 갖는 심근 세포로도 이용이 가능하다. 이런 세포의 표현형으로는 리듬감 있는 수축, 심장과 연관된 마커의 발현 으로 평가될 수 있다. 심장과 연관된 마커들의 확인은 검출 가능한 어떠한 방법, 예를 들어 리포터 유전자 발현(심장 특이적 프로모터(promoter)로 유도된 LacZ), RNA 발현(RT-PCR, Northern blot, RNase protection 방법), 또는 단백질 발현(면역 형광 염색법, western blot, flow cytometry) 등을 포함하지만 이들만으로 제한되는 것은 아니다.The cells to be transplanted can actively proliferate or fully differentiate. Bone marrow stem cells can be specifically induced and used in a cardiomyocyte system that can be identified using cardiac specific markers. The markers include, but are not limited to, Nkx2.5, GATA4, myosin enhancing factor (MEF2), and serum response factor (SRF). Differentiated cardiomyocytes, which can be identified by the expression of cardiac differentiation markers, can also be used. These markers include, but are not limited to, myosin heavy chain (MHC), cardiac troponin I (cTnI), cardiac troponin T (cTnT), α-cardiac actin, α-actinin and myosin light chain (MLC2). Bone marrow stem cells are also available as cardiomyocytes that are characterized by cardiomyocytes that communicate with each other. Phenotypes of these cells can be assessed by rhythmic contractions and the expression of markers associated with the heart. Identification of markers associated with the heart can be performed by any detectable method, such as reporter gene expression (LacZ induced by a heart specific promoter), RNA expression (RT-PCR, Northern blot, RNase protection method), or protein expression. (Immunofluorescence staining, western blot, flow cytometry) and the like, but are not limited thereto.

상기 방법을 이용하여 이식되는 세포는 심근 아세포 분화 과정 중 어떤 단계의 세포라도 사용할 수 있다.Cells transplanted using the method can be used at any stage of the myoblast differentiation process.

본 명세서에서 "골수 중간엽 줄기 세포 또는 골수 줄기 세포(BMSC)"는 CD45가 없는 골수 중간엽 유래 줄기 세포를 의미한다. 골수 중간엽 줄기 세포는 또한 골수 줄기 세포나 골수 유래 다잠재성 전구 세포라고도 불린다."Bone marrow mesenchymal stem cell or bone marrow stem cell (BMSC)" as used herein means a bone marrow mesenchymal derived stem cell lacking CD45. Bone marrow mesenchymal stem cells are also called bone marrow stem cells or bone marrow-derived multipotential progenitor cells.

"심장 세포(cardiac cell)"는 분화된 심장 세포(예를 들어, 심근 세포) 또는 심장 세포를 생성하거나 심장 세포로 분화되도록 결정된 세포(예를 들어, 심근 모세포 또는 심근 아세포)를 의미한다."Cardiac cell" refers to differentiated heart cells (eg, cardiomyocytes) or cells (eg, cardiomyocytes or cardiomyocytes) that have been determined to produce or differentiate into cardiac cells.

"심근 세포(cardiomyocyte)"는 심장에서 검출 가능한 양의 마커(예를 들어, 알파 미오신 heavy chain, cTnI, MLC2v, 알파 심장 액틴, in vivo에서 Cx43)를 발현하고, 수축하며, 증식은 하지 않는 근육 세포를 의미한다."Cardiomyocytes" are muscles that express, contract and do not proliferate detectable amounts of markers in the heart (eg, alpha myosin heavy chain, cTnI, MLC2v, alpha heart actin, Cx43 in vivo). It means a cell.

"심근 모세포(cardimyoblast)"는 심장에서 검출 가능한 양의 심장 마커를 발현하고, 수축하고, 증식하는 세포를 의미한다.By "cardimyoblast" is meant a cell that expresses, contracts, and proliferates a detectable amount of cardiac marker in the heart.

"심근 아세포(cardiomyogenic cell)"는 검출 가능한 양의 Csx/Nkx2.5 RNA 또는 단백질을 발현하고, 조직화된 육종 구조나 수축이 보이지 않고, 검출 가능한 양 의 미오신 heavy chain 단백질이 발현되지 않는 세포를 의미한다."Cardiomyogenic cell" means a cell that expresses a detectable amount of Csx / Nkx2.5 RNA or protein, shows no organized sarcoma structure or contraction, and does not express a detectable amount of myosin heavy chain protein. do.

"심장 특이적인(cardiac specific)"은 최종적으로 분화된 마커들이 발현되기 이전에 초기 심장 전사 인자들이 발현되는 심장 분화의 초기단계를 의미하며, "심장 특이적인 배지(cardiac specific media)"는 골수 줄기 세포를 심근 세포로 유도하는 bFGF, BMP-2 및 IGF-1을 함유하는 배지를 의미한다."Cardiac specific" refers to the early stages of cardiac differentiation in which early cardiac transcription factors are expressed before finally differentiated markers are expressed, and "cardiac specific media" is bone marrow stem A medium containing bFGF, BMP-2 and IGF-1, which induces cells into cardiomyocytes.

"교차분화(transdifferentiation)"는 적절한 외부 환경에 의하여 배엽기원이 다른 타종의 세포로 분화하는 것을 의미한다."Transdifferentiation" refers to the differentiation of germ cells into cells of another species by the appropriate external environment.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예만으로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 실시예에서는 개 골수에서 채취한 골수 줄기 세포를 이용하고 있지만 본 발명은 이에 한정되지 않고, 인간, 래트(rat), 마우스(mouse), 원숭이 등을 포함하는 모든 종류의 포유류 종에서 채취한 골수 줄기 세포에 유사하게 적용된다.Hereinafter, an Example demonstrates this invention in detail. However, the following examples are only examples of the present invention, and the scope of the present invention is not limited only to the following examples. In addition, although the bone marrow stem cells obtained from the dog bone marrow are used in the present embodiment, the present invention is not limited thereto, and is obtained from all kinds of mammalian species including humans, rats, mice, and monkeys. Similarly applies to bone marrow stem cells.

실시예 1: 생물학적 성장인자를 처리하여 골수 줄기 세포를 심근 아세포로 유도하는 방법Example 1 Method of Inducing Bone Marrow Stem Cells into Cardiomyocytes by Treating Biological Growth Factors

개 골수에서 채취(15∼20 ㎖)한 골수 줄기 세포는, 심근 경색 후 4주 이상이 되었을 때 장골 뼈로부터 헤파린에 적신 주사기를 사용하여 얻었다. 채취된 골수 줄기 세포는 2∼20% 우혈청, 1∼1,000 μM L-아스코르브산-2-PO4, 5∼15 ng/㎖ LIF (leukemia inhibitory factor), 그리고 1∼200 nM 덱사메타손(dexamethasone, 개 세포 배양에서는 인간 LIF를 사용하였다.)을 포함하는 배지로 배양하였다. 모든 배 양기와 슬라이드는 골수 줄기 세포를 넣기 전에 콜라겐(5 ng/㎖)으로 15분간 상온에서 코팅하였다. 이러한 in vitro 조건은 골수 줄기 세포의 자가 재생(self-renewing)성과 계대 배양에 의하여 성장인자와 같은 분화 물질에 반응성을 잃는 일이 없도록 하기 위하여 사용한다. 또한, 줄기 세포가 계대 배양에 의하여 중간엽 세포의 모양과 핵형(keryotype)을 유지하도록 하기 위하여 사용된다. 도 1은 개에서 분리 배양한 골수 줄기 세포의 위상차 현미경 사진(100 배)이다.Bone marrow stem cells harvested from dog bone marrow (15-20 mL) were obtained using a heparin-soaked syringe from iliac bone when more than 4 weeks after myocardial infarction. The harvested bone marrow stem cells were 2-20% bovine serum, 1-1000 μM L-ascorbic acid-2-PO 4 , 5-15 ng / ml leukemia inhibitory factor (LIF), and 1-200 nM dexamethasone (dog) In the cell culture, human LIF was used.). All incubators and slides were coated with collagen (5 ng / ml) at room temperature for 15 minutes before adding bone marrow stem cells. These in vitro conditions are used to ensure that the bone marrow stem cells are self-renewing and passivated so as not to lose reactivity to differentiation agents such as growth factors. Stem cells are also used to maintain the shape and karyotype of mesenchymal cells by subculture. 1 is a phase contrast micrograph (100 times) of bone marrow stem cells isolated and cultured in a dog.

두 번 계대 배양 후, 골수 줄기 세포를 4-웰 체임버 슬라이드에 접종하고 심근 분화 배지를 처리하였다. 이 배지는 DMEM에 2∼20% 우혈청, 1∼1000 μM L-아스코르브산-2-PO4, 5∼15 ng/㎖ LIF, 1∼200 nM 덱사메타손, 1∼200 ng/㎖ bFGF, 1∼200 ng/㎖ BMP2, 그리고 1∼200 ng/㎖ IGF-I을 포함하는 것이다. 이 배지 조성의 기본은 배아 발단 단계에서 심장 발생의 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 성장인자에서 유래하였다.After two passages, bone marrow stem cells were seeded in 4-well chamber slides and treated with myocardial differentiation medium. This medium was added to DMEM in 2-20% bovine serum, 1-1000 μM L-ascorbic acid-2-PO 4 , 5-15 ng / ml LIF, 1-200 nM dexamethasone, 1-200 ng / ml bFGF, 1- 200 ng / ml BMP2, and 1-200 ng / ml IGF-I. The basis of this medium composition was derived from growth factors known to play an important role in cardiac development during embryonic development.

성장인자를 이용하여 14일 동안 배양하면 50∼90% 정도의 골수 줄기 세포는 MEF2 단백질을 발현하였다. 도 2는 개 골수 줄기 세포의 모양, 그리고 심장세포 특이적인 배지로 배양한 후 MEF2(A) 및 Desmin(B)의 발현을 본 현미경 사진이고, (C)은 MF-20의 음성 대조군 염색 사진(100 배)이다. 부가적으로, Desmin의 발현도 확인하였다.When cultured for 14 days using growth factors, about 50-90% of myeloid stem cells expressed MEF2 protein. Figure 2 is a micrograph of the appearance of dog bone marrow stem cells, and expression of MEF2 (A) and Desmin (B) after incubation in a cardiac specific medium, (C) is a negative control staining of MF-20 ( 100 times). In addition, expression of Desmin was also confirmed.

이 세포들에서 MEF2 단백질을 발견할 수 있었으나, MF-20와의 면역반응에 의해 확인할 수 있는 심장 분화 마커의 발현은 볼 수 없었다. 즉, 이러한 세포들은 심장 특이적인(cardiac specific) 마커는 발현하나, 최종 분화(terminal differentiation) 마커는 발현하지 않음을 알 수 있다.The MEF2 protein was found in these cells, but no expression of cardiac differentiation markers was confirmed by the immune response with MF-20. That is, these cells express cardiac specific markers, but do not express terminal differentiation markers.

MEF2의 발현은 심장계 세포로 특이화된 마커로 사용되며, 발현된 단백질은 핵에 위치한다. MEF2 전사인자 계열은 배아 발달 단계에서 심장 분화의 유도보다 먼저 심장 전구체(cardiac progenitor)에서 발현된다. 이러한 유전자들은 배아 발달 중 심장 전구 중배엽 세포(early precardiac mesoderm)에서 발현된다. 또한 MEF2 단백질들은 완전한 심장 분화에 필요한 많은 구조 유전자의 발현에 중요하게 요구되는 전사인자이다.Expression of MEF2 is used as a marker that is specific for cardiac cells, and the expressed protein is located in the nucleus. The MEF2 family of transcription factors is expressed in the cardiac progenitor prior to the induction of cardiac differentiation during embryonic development. These genes are expressed in early precardiac mesoderm during embryonic development. MEF2 proteins are also important transcription factors for the expression of many structural genes required for complete heart differentiation.

MEF2 또는 미오신 heavy chain를 세포에서 볼 수 있도록 표지하는 방법은 다음과 같다: 배양된 세포는 4% 포름알데하이드로 20분간 냉장 고정하고, 그 후 0.2% Triton X-100을 함유한 PBS에서 15분간 처리하였다. PBS로 3번 세척한 후 블로팅 용액(blotting solution; 1% 우혈청 알부민과 0.2% Tween 20을 함유한 PBS)을 넣어 15분간 처리하였다. 시료에 다음의 항체: 항-MEF2(1:200, sc-10794, Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz), MF-20(1:100, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City, Iowa), 항-Desmin(1:100∼200, Sigma-Aldrich), 그리고 원한다면 동기준 표본(isotype) 항체(MEF2는 토끼, MF-20은 마우스 IgG2b, Desmin은 마우스 IgG1) 중 한 가지를 이용하여 모이스트 체임버(moist chamber) 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후 표본 슬라이드는 세척용액(0.5% Tween 20을 포함한 PBS)으로 3번 세척하고 2차 항원(MEF2에는 donkey 항-래빗 IgG, MF20과 Desmin은 donkey 항-마우스 IgG, 이상 Molecular Probe)을 첨가하여 제조사의 지시에 따라 반응시키고 3번 세척하였다. 표본 슬라이드를 형광현미경(Nikon TS 100)에서 관찰하였다.The method for labeling MEF2 or myosin heavy chains in the cells is as follows: Cultured cells are refrigerated with 4% formaldehyde for 20 minutes and then treated in PBS containing 0.2% Triton X-100 for 15 minutes. It was. After washing three times with PBS, a blotting solution (PBS containing 1% bovine serum albumin and 0.2% Tween 20) was added and treated for 15 minutes. The following antibodies in the sample: anti-MEF2 (1: 200, sc-10794, Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz), MF-20 (1: 100, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City, Iowa), anti Moist chamber using one of Desmin (1: 100-200, Sigma-Aldrich) and, if desired, isotype antibody (MEF2 is rabbit, MF-20 is mouse IgG2b, Desmin is mouse IgG1) chamber) at 4 ° C overnight. Sample slides were then washed three times with wash solution (PBS with 0.5% Tween 20) and secondary antigens (donkey anti-rabbit IgG for MEF2, donkey anti-mouse IgG for Desmin and Molecular Probe for Desmin) were added. Reaction and wash 3 times according to manufacturer's instructions. Sample slides were observed on a fluorescence microscope (Nikon TS 100).

실시예 2: 최적의 생착과 생존율을 나타내기 위해서 골수 줄기 세포를 심근 아세포로 특정 기간 동안 유도하는 방법Example 2 Method of Inducing Bone Marrow Stem Cells into Myocardial Glioma Cells for Specific Periods to Show Optimal Engraftment and Survival Rate

골수 줄기 세포는 이식 전 생물학적 성장 인자를 1 시간에서 21 일까지 다양한 시간 동안 심장 특이적인 배지(cardiac specific media)에서 처리할 수 있으며, 이 기간 동안 40∼90%의 세포가 핵 단백질인 MEF2를 발현한다. 심장 특이적인 배지 처리 기간의 차이에 의하여 심근 아세포로의 유도가 60∼90% 수준까지 증가될 수 있으며, 최적의 기간 동안 처리하면 80∼90%의 MEF2 단백질 발현 세포를 얻을 수 있다. 이식되는 골수 줄기 세포는 80∼90%가 MEF2 단백질을 발현하는 세포이며 따라서 경색 심장을 최적으로 재생한다.Bone marrow stem cells can process biological growth factors in cardiac specific media for various times from 1 to 21 days before transplantation, during which 40-90% of the cells express the nuclear protein MEF2. do. The induction into myocardial blast cells may be increased by 60-90% by the difference in the cardiac specific medium treatment period, and 80-90% of the MEF2 protein expressing cells can be obtained by treating for the optimal period. The transplanted bone marrow stem cells are 80-90% of the cells expressing MEF2 protein and thus optimally regenerate the infarct heart.

골수 줄기 세포를 개의 성체에서 분리하여 심장 특이적인 배지에서 6일간 배양하면 형광 현미경에서 볼 수 있는 핵에 존재하는 MEF2 단백질의 최적량을 보인다. 이 세포를 심근경색 개에 이식하면 세포는 심근에 생착하고 이식 후 96일까지 생존하는 것을 볼 수 있었다. 도 7은 이식 96일 후 심근 경색 개의 심근에 이식된 골수 줄기 세포의 위치를 보여주는 현미경 사진으로(40 배), 붉은색 형광은 심장에 이식된 DiI-표지 골수 줄기 세포, 초록색 형광은 MF-20 항체에 반응한 심근 아세포이다. In vivo 실험의 자세한 사항은 다음과 같다:Bone marrow stem cells were isolated from adult dogs and incubated for 6 days in cardiac-specific medium, showing the optimal amount of MEF2 protein present in the nucleus, as seen by fluorescence microscopy. When transplanted into myocardial infarction dogs, the cells lived in the myocardium and survived 96 days after transplantation. Figure 7 is a micrograph showing the location of bone marrow stem cells transplanted into myocardial infarct dog myocardium 96 days after transplantation (40x), with red fluorescence in the heart and DiI-labeled bone marrow stem cells implanted in the heart, green fluorescence in MF-20 Myocardial blast cells in response to antibodies. Details of the in vivo experiments are as follows:

유도의 최적 시간을 결정하기 위하여 개의 골수 줄기 세포를 2번의 계대 배양 후 콜라겐으로 코팅된 4-웰 체임버 슬라이드에 10,000 cells/chamber의 농도로 접종하였다. 24시간 후 세포를 PBS로 2번 세척하고 1 ㎖의 심장 특이적인 배지(cardiac specific media)를 첨가하였다. 하나의 슬라이드는 심장 특이적인 배지를 사용하지 않고 음성 대조군으로 사용하였다. 세포는 심장 특이적인 배지 처리 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 그리고 10일에 고정하여 MEF2 항체로 형광 염색하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 3은 심장 특이적인 배지로 처리한 후 시간에 따른 MEF2 발현을 염색을 통하여 관찰한 현미경 사진으로(A∼F는 200 배, G∼N은 100 배), A와 D는 비 처리 세포이고, B와 E는 심장 특이적인 배지로 처리한 후 1일, C와 F는 2일, G와 K는 3일, H와 L은 6일, I와 M은 8일, J와 N은 8일 동안 처리한 골수 줄기 세포를 토끼-IgG로 염색한 음성 대조군의 경우이다. 여기에서 보듯이, MEF2 염색의 상대적 강도를 실험해 본 결과 심장 특이적인 배지에서 6일간 처리한 것이 최고로 발현한다는 것을 밝혔다.To determine the optimal time for induction, two bone marrow stem cells were seeded at a concentration of 10,000 cells / chamber on collagen-coated four-well chamber slides after two passages. After 24 hours the cells were washed twice with PBS and 1 ml of cardiac specific media was added. One slide was used as a negative control without using cardiac specific medium. Cells were fixed at 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 and 10 days after cardiac specific media treatment, and stained with MEF2 antibody and observed by fluorescence microscopy. Figure 3 is a microscopic photograph of the MEF2 expression over time after treatment with cardiac specific medium (A-F is 200 times, G-N is 100 times), A and D are untreated cells, B and E were treated with cardiac specific media for 1 day, C and F for 2 days, G and K for 3 days, H and L for 6 days, I and M for 8 days, and J and N for 8 days This is the case of the negative control group stained with rabbit-IgG treated bone marrow stem cells. As shown here, experiments with relative intensities of MEF2 staining revealed that 6 days of treatment in cardiac-specific media provided the best expression.

이상과 같은 결과에 기초하여 심장 특이적 배지를 6일 동안 처리한 후 수집한 세포를 심근 경색 개 모델의 in vivo 실험에 사용하였다.Based on the above results, the cells collected after treating the cardiac specific medium for 6 days were used in the in vivo experiment of the myocardial infarction dog model.

실시예 3. 유도된 골수 줄기 세포의 이식 및 생착과 생존율 평가Example 3. Transplantation, Engraftment and Viability Assessment of Induced Bone Marrow Stem Cells

In vitro에서 심근 아세포 계통으로 유도된 골수 줄기 세포를 경색된 개의 심근에 이식하였다. 개 심근 경색은 왼쪽 관상 동맥을 영구적으로 폐색함으로써 만들어졌다. 경색은 골수 줄기 세포 이식 전 적어도 두 달 동안 안정화하였다. 이식에 따른 면역 거부반응을 방지하기 위하여 골수는 다음과 같이 각각 이식 수용체인 개로부터 분리하여 준비하였다:Bone marrow stem cells induced in myocardial blast lineage in vitro were transplanted into myocardial infarct dogs. Dog myocardial infarction was created by permanently occluding the left coronary artery. Infarctions stabilized for at least two months before bone marrow stem cell transplantation. To prevent immune rejection following transplantation, bone marrow was prepared separately from dogs, each of which were transplant recipients, as follows:

결찰 후 대략 4주 후에, 심장 초음파 조영술을 이용하여 심근 경색을 확인한 다음, 골수를 추출하기 위하여 장골 뼈에 구멍을 뚫었다. 골수는 즉시 헤파린과 혼합하고 냉동하여 드라이아이스 상태에서 세포 배양 시설로 이동하였으며, 여기에서 골수를 37 ℃에서 녹여 현탁시킨 후, DMEM 배지로 1회 세척하고 배양액(2∼20% 우혈청, 1∼1,000 μM L-아스코르브산-2-PO4, 5∼15 ng/㎖ LIF, 1∼200 nM 덱사메타손)이 담겨 있는 조직 배양 플라스크에 접종하여 배양하였다. 2회 계대 배양후, 골수 줄기 세포를 1∼200 ng/㎖ bFGF, 1∼200 ng/㎖ BMP2, 및 1∼200 ng/㎖ IGF-I를 함유하는 배지에서 6일간 배양하였다. 세포 수집 때, 이식 후 세포의 생존과 진행을 추적하기 위하여 붉은색 형광 표지체인 DiI로 세포를 표지하였으며, 대략 2 x 108개의 세포를 수집하여 심장의 경색 부위에 이식하였다.Approximately 4 weeks after ligation, myocardial infarction was confirmed using echocardiography, and then the iliac bone was punctured to extract bone marrow. The bone marrow was immediately mixed with heparin, frozen and transferred to a cell culture facility in a dry ice state, where the bone marrow was dissolved at 37 ° C. and suspended, washed once with DMEM medium and cultured (2-20% bovine serum, 1∼). Inoculated and cultured in a tissue culture flask containing 1,000 μM L-ascorbic acid-2-PO 4 , 5-15 ng / ml LIF, 1-200 nM dexamethasone). After two passages, bone marrow stem cells were cultured for 6 days in a medium containing 1-200 ng / ml bFGF, 1-200 ng / ml BMP2, and 1-200 ng / ml IGF-I. At the time of cell collection, cells were labeled with DiI, a red fluorescent label, to track the survival and progression of the cells after transplantation, and approximately 2 × 10 8 cells were collected and transplanted into the infarct region of the heart.

이식 후 골수 줄기 세포의 생존 여부는 사후 DiI를 형광 현미경을 통하여 측정하였다. 도 4는 이식 15일 후 심근 경색 개의 심근층에서 이식된 골수 줄기 세포의 위치를 보여주는 일련의 현미경 사진으로(40 배), 붉은색 형광은 숙주의 심근 (myocardium)에 이식되어진 DiI-표지 골수 줄기 세포, 초록색 형광은 MF-20 항체로 염색된 심근 아세포, 그리고 파란색 형광은 DAPI로 표지된 핵을 나타낸다. 여기에서 보면, 이식 15일 후에 심근층에서 DiI 양성인 큰 세포 집합체가 관찰되었는데, 이는 골수 줄기 세포가 장기간 생존해 있음을 의미한다. 특히, DiI로 표지된 줄기 세포는 MF-20 양성인 심근 세포를 포함하고 있는 심근층 내부 부위와 MF-20 양성인 심근 세포가 결여된 심근 경색 부위에서도 발견된 것을 알 수 있다.Survival of bone marrow stem cells after transplantation was measured by fluorescence microscopy after death. FIG. 4 is a series of micrographs (40x) showing the location of bone marrow stem cells transplanted in myocardial layer of myocardial infarction dog 15 days after transplantation, with red fluorescence diI-labeled bone marrow stem transplanted to host myocardium Cells, green fluorescence represent myocardial blast cells stained with MF-20 antibody, and blue fluorescence represents nuclei labeled with DAPI. Here, 15 days after transplantation, a large cell aggregate that was DiI positive was observed in the myocardial layer, indicating that bone marrow stem cells survive long term. In particular, it can be seen that the stem cells labeled with DiI were also found in the region of the myocardial layer containing MF-20 positive cardiomyocytes and in the region of myocardial infarction lacking MF-20 positive cardiomyocytes.

주입된 세포의 장기간 생존 능력을 알아보기 위하여 이식 70일과 96일 후에 개를 죽여 관찰하였다. 도 5는 이식 70일 후 심근 경색 개의 심근층에 이식된 골수 줄기 세포의 위치를 보여주는 현미경 사진으로(40 배), 붉은색 형광은 심근에 이식된 DiI-표지 골수 줄기 세포, 초록색 형광은 MHC 항체에 반응한 심근 아세포, 그리고 파란색 형광은 DAPI로 표지된 핵을 나타낸다. 도 6은 이식 70일 후 심근 경색 개의 심근에 에 이식된 골수 줄기 세포의 위치를 보여주는 현미경 사진으로(40 배), 붉은색 형광은 심장에 이식된 DiI-표지 골수 줄기 세포, 초록색 형광은 cTNI 항체에 반응한 심근 아세포를 나타낸다. 또한, 도 7은 이식 96일 후 심근 경색 개의 심근에 이식된 골수 줄기 세포의 위치를 보여주는 현미경 사진으로(40 배), 붉은색 형광은 심장에 이식된 DiI-표지 골수 줄기 세포, 초록색 형광은 MF-20 항체에 반응한 심근 아세포를 나타낸다. 이들 도 5 내지 7에서 보면, 모든 경우에 심장 경색 부위에서 DiI가 표지된 세포가 관찰되었다. 어떤 경우에는, DiI 형광이 MF-20을 포함한 심장 특이적 마커와 같은 위치에서 관찰되었다. 또한 심근 경색 부위의 경계 부위에서 DiI-양성인 줄기 세포는 심장 근육 특이적인 표지체인 MHCα/β와 TNI도 발현하였다.To examine the long-term viability of the injected cells, dogs were observed 70 and 96 days after transplantation. Figure 5 is a micrograph showing the location of bone marrow stem cells transplanted into myocardial layer of myocardial infarction dog 70 days after transplantation (40 times), red fluorescence is DiI-labeled bone marrow stem cells implanted in myocardium, green fluorescence is MHC antibody Myocardial blasts in response to, and blue fluorescence represent nuclei labeled with DAPI. FIG. 6 is a micrograph showing the location of bone marrow stem cells transplanted into myocardial infarct dog myocardium 70 days after transplantation (40x), red fluorescence is DiI-labeled bone marrow stem cells implanted in heart, green fluorescence is cTNI antibody It represents myocardial blast cells in response to. 7 is a micrograph showing the location of bone marrow stem cells transplanted to myocardial infarction dog myocardium 96 days after transplantation (40 times), where red fluorescence is DiI-labeled bone marrow stem cells transplanted into the heart and green fluorescence is MF Myocardial blast cells in response to -20 antibody are shown. In these FIGS. 5-7, DiI-labeled cells were observed in all cases of cardiac infarction. In some cases, DiI fluorescence was observed at the same location as cardiac specific markers including MF-20. DiI-positive stem cells also expressed cardiac muscle-specific markers MHCα / β and TNI at the border of myocardial infarction.

이러한 데이터들은 in vitro에서 상기 방법에 따라 처리되어 이식된 골수 줄기 세포는 숙주의 심근에 생존하고 생착하며 심장으로 분화되었음을 나타내는 표지체를 발현함을 입증하고 있다.These data demonstrate that bone marrow stem cells treated and transplanted according to the method in vitro express a marker indicating that the host myocardium has survived, engraftd and differentiated into the heart.

실시예 4. 심근 경색의 개선Example 4 Improvement of Myocardial Infarction

상기 개 심근 경색 모델은 심장 초음파 조영술를 이용하여 골수 줄기 세포 이식에 따른 회복 효과를 측정하기 위하여 사용되었다. 심장 초음파 조영술은 세포 이식 후 3.5, 4.5 및 5주에 실시하였으며, 이식 이전 심장 초음파 조영술 결과와 비교하였다.The canine myocardial infarction model was used to measure the recovery effect of bone marrow stem cell transplantation using echocardiography. Echocardiography was performed at 3.5, 4.5 and 5 weeks after cell transplantation and compared with pre-implantation echocardiography.

도 8은 심근 경색 개의 심장 박동수의 변화를 유도된 골수 줄기 세포 이식 전(BL)과 이식 후(4주, 8주, 12주)에 비교한 그래프이고, 도 9는 심근 경색 개의 심근에 유도된 골수 줄기 세포를 이식한 후 심장 기능의 개선을 나타내는 초음파 사진에서, 유도된 골수 줄기 세포 이식 전(BL)과 이식 후(4주, 8주, 12주)의 분획적 단축(fractional shortening)과 면적 단축(area shortening)의 변화량을 나타낸 그래프이다. 또한, 도 10은 심근 경색 개의 심근에 유도된 골수 줄기 세포를 이식한 후 심장의 기능 개선을 보여주는 초음파 사진에서, 유도된 골수 줄기 세포 이식 전(BL)과 이식 후(4주, 8주, 12주) 심장 전벽의 두께 변화량을 나타낸 그래프이다.FIG. 8 is a graph comparing the changes in heart rate of myocardial infarction dogs prior to induced bone marrow stem cell transplantation (BL) and post transplantation (4 weeks, 8 weeks, 12 weeks), and FIG. 9 is induced in myocardial infarction dog myocardium. Ultrasonographic images showing improvement of heart function after bone marrow stem cell transplantation, fractional shortening and area before induced bone marrow stem cell transplantation (BL) and post transplantation (4 weeks, 8 weeks, 12 weeks) It is a graph showing the amount of change in area shortening. In addition, Figure 10 is an ultrasound image showing the improvement of the heart function after transplantation of bone marrow stem cells induced in myocardial infarction dog myocardium, before induced bone marrow stem cell transplantation (BL) and post-transplantation (4 weeks, 8 weeks, 12 Note) This is a graph showing the thickness change of the anterior wall of the heart.

여기에서 보듯이, 각 동물에서 경색 부위의 수축력이 개선되어 심근층의 인접 부위와 조화를 이루게 된 것을 알 수 있다. 심장 초음파 결과는 실시예 3의 조직 면역 염색 결과를 확실하게 하며 배양된 골수 줄기 세포의 이식이 경색 이후의 심장 조직을 부분적으로 회복시킨다는 것을 입증하고 있다.As shown here, it can be seen that in each animal, the contractile force of the infarct area is improved to harmonize with adjacent areas of the myocardial layer. Echocardiographic results confirm the tissue immunostaining results of Example 3 and demonstrate that transplantation of cultured bone marrow stem cells partially restores heart tissue after infarction.

본 발명에 따라 유도되는 심근 아세포는 5-아자사이티딘과 같은 화학적 디메틸화 시약(demethylating agent)을 사용한 것보다 훨씬 임상적으로 적절하다. 본 발명에 따르면, 임상적으로 최적의 생착과 생존율을 나타내는 심근 세포로 유도된 골수 줄기 세포를 제공하여, 불충분한 심근 기능으로 인한 이상증으로 진단된 포유류(예, 인간)를 치료하는 데 이용할 수 있다.Myocardial blast cells derived in accordance with the present invention are much more clinically appropriate than using chemical demethylating agents such as 5-azacytidine. According to the present invention, bone marrow stem cells derived from myocardial cells exhibiting clinically optimal engraftment and survival rates can be provided and used to treat mammals (eg, humans) diagnosed with abnormalities due to insufficient myocardial function. .

Claims (9)

(a) 불멸화(immotalized)되지 않는 골수 줄기 세포를 공급하는 단계;(a) supplying bone marrow stem cells that are not immotalized; (b) 상기 골수 줄기 세포를 골수 줄기 세포의 성격을 유지하는 상태에서 2 회 계대 배양하는 단계;(b) passaging the bone marrow stem cells two times while maintaining the nature of the bone marrow stem cells; (c) 상기 골수 줄기 세포를 생물학적 성장인자인 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), BMP-2(Bone Morphogenic Protein-2) 및 IGF-I(Insulin-like Growth Factor-1)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및(c) culturing the bone marrow stem cells in a medium containing a biological growth factor, basic fibroblast growth factor (bFGF), bone morphogenic protein-2 (BMP-2), and insulin-like growth factor-1 (IGF-I). step; And (d) 상기 골수 줄기 세포의 80 내지 90%가 심근 아세포로 유도되었을 때 단계 (c)의 세포를 수집하는 단계를 포함하는,(d) collecting the cells of step (c) when 80-90% of said bone marrow stem cells are induced into cardiomyocytes, 포유류 심근 조직으로 이식하기 위한 세포의 생산 방법.Method of producing cells for transplantation into mammalian myocardial tissue. 제 1 항에 있어서, 상기 골수 줄기 세포가 이식 대상 포유류로부터 유래되는 방법.The method of claim 1, wherein said bone marrow stem cells are derived from a mammal to be transplanted. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 1 시간 내지 21 일 동안 배양하는 방법.The method of claim 1, wherein in step (c), the method is incubated for 1 hour to 21 days. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 6 일 동안 배양하는 방법.4. The method of claim 3, wherein the step (c) is incubated for 6 days. 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 bFGF, BMP-2 및 IGF-1의 농도는 각각 1 내지 200 ng/㎖이고, 여기에 우혈청 2 내지 20%, L-아스코르브산-2-PO4 1 내지 1000 μM, LIF 5 내지 15 ng/㎖, 및 덱사메타손 1 내지 200 nM를 더욱 포함하는 방법.The method of claim 1, wherein the concentration of bFGF, BMP-2 and IGF-1 is 1 to 200 ng / ㎖, respectively, the serum 2 to 20%, L- ascorbic acid-2-PO 4 1 to 1000 μM , LIF 5-15 ng / ml, and dexamethasone 1-200 nM. 제 1 항에 있어서, 단계 (c)의 세포를 수집하여 MEF2 단백질 및 MF-20의 발현을 모니터링하는 단계를 더욱 포함하는 방법.The method of claim 1, further comprising collecting the cells of step (c) to monitor expression of MEF2 protein and MF-20. 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 단계 (c)의 세포를 수집하여 MEF2 단백질 및 MF-20의 발현을 모니터링하여, MEF2 단백질은 발현하고 MF-20는 발현하지 않는 단계의 세포를 수집하는 방법.The method of claim 1 or 8, wherein the cells of step (c) are collected to monitor expression of MEF2 protein and MF-20 to collect cells of the step of expressing MEF2 protein but not MF-20. .
KR1020030088850A 2003-12-09 2003-12-09 Method of preparing cell for transplantation KR100674783B1 (en)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020030088850A KR100674783B1 (en) 2003-12-09 2003-12-09 Method of preparing cell for transplantation
AU2004296369A AU2004296369B2 (en) 2003-12-09 2004-11-18 Method of preparing cell for transplantation
PCT/KR2004/002983 WO2005056779A1 (en) 2003-12-09 2004-11-18 Method of preparing cell for transplantation
JP2006543733A JP4122365B2 (en) 2003-12-09 2004-11-18 Method for producing cells for transplantation
CNB2004800365679A CN100475956C (en) 2003-12-09 2004-11-18 Method of preparing cell for transplantation

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020030088850A KR100674783B1 (en) 2003-12-09 2003-12-09 Method of preparing cell for transplantation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20050055823A KR20050055823A (en) 2005-06-14
KR100674783B1 true KR100674783B1 (en) 2007-01-25

Family

ID=36660038

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020030088850A KR100674783B1 (en) 2003-12-09 2003-12-09 Method of preparing cell for transplantation

Country Status (5)

Country Link
JP (1) JP4122365B2 (en)
KR (1) KR100674783B1 (en)
CN (1) CN100475956C (en)
AU (1) AU2004296369B2 (en)
WO (1) WO2005056779A1 (en)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002084281A1 (en) 2001-04-13 2002-10-24 Anterogen Co., Ltd. Encapsulated cell indicator system
US7534607B1 (en) 2005-12-27 2009-05-19 Industrial Technology Research Institute Method of producing cardiomyocytes from mesenchymal stem cells
KR20070070445A (en) * 2005-12-29 2007-07-04 (주)안트로젠 Method of preparing cell for heart tissue regeneration
EP2139988A1 (en) 2007-03-15 2010-01-06 California Stem Cell, Inc. Cardiomyocytes and methods of producing and purifying cardiomyocytes
WO2010133686A1 (en) * 2009-05-20 2010-11-25 Cardio3 Biosciences S.A. Parmaceutical composition for the treatment of heart diseases.
CN106474456A (en) * 2016-10-18 2017-03-08 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 A kind of cell preparation and its preparation method and application

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1254952A4 (en) * 1999-12-28 2004-09-22 Kyowa Hakko Kogyo Kk Cells capable of differentiating into heart muscle cells
KR100864123B1 (en) * 2001-04-13 2008-10-16 (주)안트로젠 Methods for producing cells for transplantation

Also Published As

Publication number Publication date
JP4122365B2 (en) 2008-07-23
KR20050055823A (en) 2005-06-14
CN100475956C (en) 2009-04-08
WO2005056779A1 (en) 2005-06-23
AU2004296369A1 (en) 2005-06-23
JP2007513625A (en) 2007-05-31
AU2004296369B2 (en) 2008-05-01
CN1890365A (en) 2007-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4684108B2 (en) Method for inducing differentiation of cardiomyocytes from stem cells
Kadivar et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells
Bosnakovski et al. Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells
US20100166714A1 (en) Cardiovascular stem cells, methods for stem cell isolation, and uses thereof
US20190367883A1 (en) Regulating stem cells
CN105518125A (en) Methods and compositions for generating epicardium cells
Ishii et al. Endothelial cell lineages of the heart
Fukuda Progress in myocardial regeneration and cell transplantation
Van Laake et al. Cardiomyocytes derived from stem cells
KR100677054B1 (en) Method for isolating and culturing multipotent progenitor cells from umbilical cord blood and method for inducing differentiation thereof
KR100674783B1 (en) Method of preparing cell for transplantation
Sachinidis et al. Generation of cardiomyocytes from embryonic stem cells
KR100484550B1 (en) Method of preparing cell for transplantation
JP5174019B2 (en) Method for inducing differentiation into cardiomyocytes using G-CSF
KR20120006386A (en) Stem cell derived from first trimester placenta and cellular therapeutic agents comprising the same
CA2443984A1 (en) Encapsulated cell indicator system
CN112424340A (en) Method for isolating cardiomyocyte populations
BAGHBAN et al. Mesenchymal stem cells: In vitro differentiation among bone and cartilage cell lineages
TWI304840B (en) Method of preparing cell for transplantation
Filipczyk et al. Cardiovascular development: towards biomedical applicability: Regulation of cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells by extracellular signalling
KR20070070445A (en) Method of preparing cell for heart tissue regeneration
Wilschut et al. Approaches to isolate porcine skeletal muscle stem and progenitor cells
Mondal et al. Transcriptional Abundance of Myosin Light Chain 2 Gene in Cardiac Differentiated Canine Induced Pluripotent Stem Cells
Olmer et al. Induced pluripotent stem cells differentiate into functional cardiomyocytes
Misfeldt Endocardial cells are a distinct endothelial lineage derived from multipotent cardiovascular progenitors

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130110

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131121

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141230

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151224

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180117

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191230

Year of fee payment: 14