KR100667039B1

KR100667039B1 - 다이옥신 노출 여부 진단용 마커 및 이를 이용하여 다이옥신 노출을 확인하는 방법

Info

Publication number: KR100667039B1
Application number: KR1020040084928A
Authority: KR
Inventors: 이상철; 고정헌; 인유정; 김지혜; 김진호; 강태혁
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2004-10-22
Filing date: 2004-10-22
Publication date: 2007-01-12
Also published as: KR20060035432A

Abstract

본 발명은 환경 호르몬의 일종인 테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, 이하 ‘TCDD’라 약칭함)에의 노출 여부 진단용 마커 단백질 및 이를 이용하여 다이옥신 노출을 확인하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 다이옥신에 노출시 당쇄가 증가하거나 감소하는 단백질을 찾아내어 동정하고 상기 단백질을 포함하는 진단용 마커를 제공하며 상기 마커에 포함된단백질의 당쇄변화를 이용하여 다이옥신에의 노출여부를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다이옥신에의 노출 여부 진단용 마커 및 이를 이용하여 다이옥신 에의 노출여부를 확인하는 방법은 다이옥신 독성 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

다이옥신, 글리코믹스, 당쇄 변화, TCDD

Description

다이옥신 노출 여부 진단용 마커 및 이를 이용하여 다이옥신 노출을 확인하는 방법{Marker for the diagnosis of exposure to dioxin and the diagnosis method using the same}

도 1은 N-연결형 당쇄와 각각에 특이적으로 결합하는 렉틴(lectin)을 나타내는 모식도이고,

도 2는 LCA(Lens culinaris agglutinin) 렉틴 친화성 크로마토그래피(lectin affinity chromatography)를 수행한 후, 2 차원 전기영동을 실시하여 질량 분석기로 분석하는 일련의 실험을 나타내는 모식도이고,

도 3은 DMSO를 처리한 대조군과 테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, 이하 ‘TCDD’라 약칭함)을 처리한 창(Chang) 세포주 내에서 당쇄의 발현이 증가하거나 감소하는 단백질을 찾아내기 위하여 실시한 2 차원 전기영동(pH 3-10 스트립) 사진이고,

도 4는 DMSO를 처리한 대조군과 TCDD를 처리한 창(Chang) 세포주 내에서 당쇄의 발현이 증가하거나 감소하는 단백질을 찾아내기 위하여 실시한 2차원 전기영동(pH 4-7 스트립) 사진이다.

본 발명은 환경 호르몬의 일종인 테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, 이하 ‘TCDD’라 약칭함)에의 노출 여부 진단용 마커 단백질 및 이를 이용하여 다이옥신 노출을 확인하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간의 간세포주인 창(Chang) 세포에 TCDD를 처리했을 때 당쇄가 증가하거나 감소하는 단백질을 동정하여 제조한 다이옥신에의 노출 여부 진단용 마커 및 이를 이용하여 다이옥신에의 노출을 확인하는 방법에 관한 것이다.

대표적인 환경 호르몬으로는 다이옥신, PCB, DDT, 유기염소 농약, 중금속, 플라스틱 가소제 등이 있는데, 이 중에서 다이옥신은 인류가 만들어낸 환경 호르몬 중 독성 및 위험성이 가장 강한 환경오염물질 또는 독성화합물로 여겨지고 있다. 보통 다이옥신(dioxin)이라 하면, 폴리클로리네이티드 디벤조파라다이옥신류(polychlorinaged dibenzo-p-dioxins, 이하 ‘PCDDs'로 약칭함)와 폴리클로리네이티드 디벤조퓨란류(polychlorinated dibenzofuran, 이하 ‘PCDFs’로 약칭함) 계열을 통칭하는데, 지금까지 PCDD는 약 75종, PCDF는 약 135종의 이성체(isomer)가 밝혀져 있다.

다이옥신은 화학적으로 분해 되지 않는 안정된 물질이며 먼지, 재, 토양 등과 같은 입자상의 물질 표면에 쉽게 흡착하고 한번 결합하면 쉽게 분리되지 않는 특성을 지녀, 환경오염을 증가시키고 동식물에 축적된다. 다이옥신은 도금, 제강 등과 같은 산업제조공정, 농약과 같은 화학물질 제조공정, 생활쓰레기 및 산업폐기물의 소각과정, 종이와 펄프공장의 염소표백 과정에서 발생하며 자동차 배기가스, 담배연기 중에 포함되어 있어 공기 중에 희석되거나 흙, 식물, 물 속으로 스며든다. 성인의 다이옥신 노출 경로는 고기, 생선, 우유, 지방 등과 같은 음식물 섭취가 주요인으로 전체의 95 % 이상을 차지하고 호흡이나 토양과의 접촉을 통해서도 노출된다. 수유기 아이들의 경우에는 모유 수유를 통해서도 다이옥신에 노출된다.

체내에 유입된 다이옥신 분자는 세포 조직 내에 존재하는 특이적인 수용체 부위(Aryl Hydrocarbon Receptor, AhR)에 결합하여 세포에 호르몬처럼 작용하거나, 다이옥신으로 인해 정상적으로 결합하여야 할 호르몬이나 체내 조절물질이 수용체에 결합하지 못하므로 세포 기능이 제대로 수행되지 못한다. 다이옥신이 인체에 축적되면 생식기능(자궁 출혈과 통증, 불임, 정자 감소)과 면역기능 이상을 가져오며, 간장 및 신장 파손, 피부의 염소좌창, 선천적인 기형아 출산(성기 이상, 무뇌아, 척추 이분증), 말초 및 중추신경 발달장애 등을 일으키는 것으로 알려져 있다.

다이옥신을 비롯한 독성물질에 대한 연구는 활발히 진행되어 왔으나, 최근에 이르도록 high-resolution gas chromatography/mass spectrometry(HRGC/HRMS)가 유일한 다이옥신 검출 방법이었다(C. Rappe et al. Envrion Sci Technol. 21:964, 1987). 그러나 지난 10년간 생명공학이 빠르게 발달함에 따라 생체 외 분석법(in vitro assay) 및 리간드 결합 분석법(ligand binding assay)이 개발되었고 현재까 지 EROD-bioassay, AHH bioassay, Enzyme immunoassay(EIA), CALUX assay, GRAB assay 등 다양한 방법이 개발되었다(P.A. Bechisch et al. Environment International. 27:413, 2001). 이러한 방법들은 대부분 다기능 산화제(mixed-function oxidase)라 불리는 CYP450 1A1 단백질을 주로 이용하고 있는데, CYP450 1A1은 다이옥신에 노출되었을 때 가장 먼저 발현되는 단백질로 다이옥신 노출 및 독성 검사에 적합한 물질이다. 그러나 다이옥신류 이외의 다른 독성물질에서도 발현이 보고되고 있어 다이옥신에 특이적이지 못하다는 단점이 있다.

한편, 단백질의 기능을 분석하기 위한 다양한 방법이 시도되어 왔는데 최근 들어 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization)와 같은 질량 분석기기가 발달함에 따라, 단백질 기능 분석 방법으로 프로테오믹스(proteomics)가 각광받고 있다. 그러나 프로테오믹스는 다이내믹하게 움직이는 생체에 대하여 정지된 한 시점만을 선택적으로 분석하므로 복잡한 신호 전달의 전사 후 변형(post-translational modification)을 분석하는데는 부적합하다. 이를 해결하기 위하여 렉틴(lectin)을 이용하는 방법이 있는데, 렉틴(lectin)은 단당 혹은 올리고당과 특이적으로 결합하는 탄수화물 결합 단백질을 일컫는 것으로 생체 내에서는 당지질이나 당단백질의 당쇄에 결합하는 경향이 있다. 프로테오믹스에 렉틴의 당쇄 결합을 이용한 분석을 접목시킨 것을 글리코믹스(glycomics)라 하며, 이는 번역 후나 변형 중에 있는 단백질의 당질화를 추적하는 것으로, 프로테오믹스의 분석상의 어려움을 극복한 한 단계 진전된 분석방법으로 여겨지고 있다.

단백질의 당질화를 이용한 질병 진단의 예로써 α-페토프로테인의 경우를 들 수 있다. 만성 간질환이 발생한 세포나 간암 조직 및 그 주변의 조직에서는 흔히 N-아세틸-β-글루코사미나이드-α1,6-푸코실트랜스퍼라제(N-acetyl-β-glucosaminide α1,6-fucosyltransferase, 이하 ‘α1,6-FucT’로 약칭함)가 발현되는데 이는 GDP-푸코오스(fucose)를 N-말단 당단백질에 붙이는 과정을 촉매하는 효소이다. 상기 α1,6-FucT에 의해 α-페토프로테인(α-fetoprotein)에 α1,6 푸코실레이션(α1,6 fucosylation)이 일어나 α1,6-푸코실레이티드 α-페토프로테인(1,6-fucosylated α-fetoprotein, 이하 ‘AFP’로 약함)이 생성되는데 이러한 AFP의 당쇄 변화를 관찰함으로써 초기 간암을 진단하는데 이용하고 있다(Naoyuki Taniguchi et al. Biochimica et Biophysica Acta, 1473: 9-20, 1998).

이에, 본 발명에서는 α-페토프로테인과 같이 TCDD에 노출된 간세포에서도 α1,6 푸코오스 당쇄가지가 첨가되거나 제거되는 단백질이 존재함을 확인하고 이를 다이옥신 검출 마커로 사용하는 방법을 연구하였다. 먼저 기존에 사용되던 프로테오믹스법에서 한 단계 나아간 글라이코믹스를 이용하여 다이옥신 노출시 당쇄변화를 일으키는 단백질을 동정하였다. 상기 방법을 이용하여 동정한 단백질은 세포의 표면에 있거나 분비되어 나오는 형태이므로, 혈액이나 소변 등의 체액의 진단을 통해서 TCDD에의 노출 여부의 진단을 가능하게 한다.

본 발명자들은 창(Chang) 세포주에 TCDD를 처리하여 당쇄 변화가 증가 및 감 소하는 단백질을 발견하고, 상기 단백질의 당쇄변화를 측정하여 TCDD 노출 여부를 진단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 다이옥신에 노출되었을 때 간세포에서 당쇄변화를 일으키는 단백질을 동정하고 이를 이용하여 다이옥신 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알파 1,6-푸코오스(α1,6-fucose) 당쇄가지가 변화하는 단백질을 포함하는 테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, 이하 ‘TCDD’라 약칭함)에의 노출 여부 진단용 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커에 포함된 단백질들의 당쇄 변화를 측정하여 TCDD에의 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachloro dibenzo-p-dioxin, 이하 ‘TCDD’라 약칭함)에의 노출 여부 진단용 마커를 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 다이옥신 마커로 사용될 수 있는 단백질을 찾아내기 위하여, 신체기관 중 독성물질이 축적되는 장소인 간(liver) 세포를 택 하여 단백질 동정 실험을 실시하였다.

구체적으로 인간의 간(liver) 세포인 창(Chang) 세포주에 TCDD를 처리한 실험군과 DMSO를 처리한 대조군의 무혈청 배지(serum free media) 를 준비하였다. 이를 α1,6-푸코오스 당쇄가지에 결합하는 렉틴의 일종인 LCA(Lens Culinaris agglutinin)로 패킹된 컬럼(column)에 로딩(loading)함으로써, TCDD 노출로 인하여 α1,6-푸코오스 당쇄가지에 변화가 일어난 단백질을 1차로 선별하였다. 상기 단백질 시료를 용출한 후, 드라이스트립(drystrip)에 로딩(loading)하여 일차원 전기영동(Isoelectrofocusing, IEF)을 실시하고 일차원 전기영동이 끝난 스트립에 다시 이차원 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하였다. 전기영동으로 얻어진 젤은 염색, 스캐닝 과정을 거쳐 젤 분석 전용 프로그램인 PDQuestTM으로 단백질 발현의 차이를 분석하였다.

본 발명자들은 이미지 분석 프로그램으로부터 발현 차이를 나타내는스팟(spot)을 찾아내고 이에 해당하는 단백질의 질량을 질량분석기(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-TOF MS)로 알아내었다. 이를 바탕으로 NCBI 데이터베이스에서 상기 펩타이드를 동정하였다(도 2 참조).

그 결과, TCDD를 처리하였을 때, 당쇄변화가 증가하거나 감소함을 보이는 단백질들은 다음과 같았다(도 3 및 도 4 참조).

먼저, 알파 1,6-푸코오스(α1,6-fucose) 당쇄가지가 증가하는 단백질로 약 50 kDa의 분자량 및 약 6.1의 pI를 갖는 ‘알데하이드 탈수소화효소(Aldehyde dehydrogenase)’, 약 38 kDa의 분자량 및 약 5.9의 pI를 갖는 ‘카뎁신 B(Cathepsin B)’, 약 25 kDa의 분자량 및 약 5.9의 pI를 갖는 ‘콜라겐 알파Ⅰ체인 전구체(Collagen alphaⅠchain precursor)’, 약 16 kDa의 분자량 및 약 9.4의 pI를 갖는 ‘라이소자임 A(Lysozyme A)’ 및 약 52 kDa의 분자량 및 약 5.35의 pI를 갖는 ‘FK-506 결합 단백질 4’를 동정하였다.

다음으로, 알파 1,6-푸코오스(α1,6-fucose) 당쇄가지가 감소하는 단백질로 약 57 kDa의 분자량 및 약 4.8의 pI를 갖는 ‘단백질 이황화 이성질체화 효소(Protien disulfide isomerase)’, 약 16 kDa의 분자량 및 약 9.4의 pI를 갖는 ‘라이소자임 C 전구체(Lysozyme C precursor)’, 약 14 kDa의 분자량 및 약 5.0의 pI를 갖는 ‘면역글로불린 헤비 체인(Immunoglobulin heavy chain) 단백질’을 동정하였다.

상기에서 밝혀낸 당쇄변화를 나타내는 당단백질들은 세포의 표면에 있거나 세포 외로 분비되어 나오기 때문에, 혈액이나 소변 등의 체액만으로도 상기 단백질의 당쇄변화를 확인하여 TCDD에의 노출 여부를 간편하게 진단할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 마커에 포함된 단백질들의 당쇄 변화를 측정하여 TCDD에의 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다. 즉, 정상세포와 비교하여 다이옥신에 노출된 세포에서 α1,6 푸코오스(fucose) 당쇄가지 변화를 나타내는 단백질의 당쇄가지 변화를 측정하는 것이다.

일반적으로 간암의 경우 α-페토프로테인(α-fetoprotein)에 α1,6 푸코오스(fucose)가 결합되는 당쇄 변화로 초기 간암을 진단하고 있는데, 본 발명에서는 다이옥신의 일종인 TCDD에 노출되었을때 α1,6 푸코오스 당쇄가지가 변화하는 단백질을 동정함으로써 단백질의 당쇄변화만으로 TCDD에의 노출 여부를 판별할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 시료준비(sample preparation)

본 발명자들은 인간의 간세포에 테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, 이하 ‘TCDD’라 약칭함)을 처리하여 전기영동을 실시하기 위한 시료를 준비하였다.

구체적으로 인간의 간세포인 창(Chang) 세포주에 50 nM의 TCDD를 72 시간 동안 처리한 실험군과 DMSO를 72 시간 동안 처리한 대조군의 무혈청 배지(serum free media) 1000 ml를 회수하고 이를 LCA(Lens Culinaris agglutinin) 수지(resin)로 패킹(packing)된 컬럼(column)(Sigma, #L-0511)에 로딩(loading)하였다. 다시 컬럼에 0.4 M 메틸-알파-D-만노피라노사이드(methyl α-D-manopyranoside)와 50 mM Tris-Cl를 가하여 수지에 붙어있는 당단백질들을 용출시켰다. Ultrafree-4 centrifugal filter device(Millipore사)를 이용하여 용출된 당단백질 중 10 kDa이하의 단백질은 제거하고 2 ㎖로 농축한 후 아세톤에 녹인 20% TCA를 첨가하고 -20℃에서 1시간동안 침전시켜 단백질을 회수하였다. 이로써 TCDD 처리 후, 당쇄 변화를 일으킨 단백질 시료를 확보하였다(도 2).

<실시예 2> 이차원 전기영동

<2-1> 일차원 전기영동

본 발명자들은 <실시예 1>에서 준비한 시료로 일차원 전기영동(Isoelectrofocusing, IEF)을 실시하였다. 구체적으로, <실시예 1>에서 침전시킨 단백질을 재수화(rehydration) 완충용액(7 M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 1% DTT, 0.5% IPG buffer)에 넣어 2 시간 동안 녹인 후 12000 rpm으로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 수거하였다. 16 시간 동안 드라이스트립(drystrip)을 수화시킨 뒤, 원심분리 후 수거한 상층액을 로딩(loading)하여 300V에서 1분, 3500V에서 1시간 30분, 3500V에서 13시간으로 Multiphor Ⅱ(Pharmacia Biotech사)로 일차원 전기영동을 수행하였다.

<2-1> 이차원 전기영동

본 발명자들은 일차원 전기영동이 끝난 스트립(strip)으로 이차원 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하였다. 구체적으로 실시예 <2-1>에서 제조한 스트립을 평형화 용액(6M Urea, 1.5 M Tris-Cl(pH 8.8), 30% Glycerol, 2% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, Bromophenol blue 약간) 5 ㎖에 넣어 15 분 동안 반응시킨 후, 11% 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤(14×15 ㎝) 위에 올려놓았다. HoferTM SE600(Pharmacia Biotech사)에 전기영동 완충액(24 mM Tris, 250 mM glycine, 0.1% SDS)을 넣고 1장 당 15 mA 1시간, 30 mA 5시간으로 총 6 시간 동안 2차원 전기영동을 실시하였다(도 2).

<2-3> 염색 및 이미지 분석(Image Analysis)

본 발명자들은 이차원 전기영동을 실시한 젤을 염색하고, 젤 분석 프로그램으로 젤 상의 스팟(spot)을 분석하였다.

구체적으로 젤을 유리판에서 분리한 뒤 3차 증류수로 15 분씩 3 번 세척하고, 염색제인 Bio-SafeTM coomassie(Bio-Rad사)를 넣어 교반하면서 12 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 젤은 다시 3차 증류수로 세척하고 스캐닝(scanning)한 후, 이차원 전기영동 젤 분석 전용 프로그램인 PDQuestTM(Bio-rad사)으로 단백질 차이를 분석하였다(도 3 및 도 4).

<실시예 3> 질량분석(Mass Analysis)

<3-1> 질량분석을 위한 시료준비

본 발명자들은 이미지 분석 프로그램으로부터 얻어진 스팟(spot)에 해당하는 단백질들을 동정하였다.

구체적으로 이차원 전기영동이 끝난 젤로부터 해당 스팟(spot)을 오려낸 뒤, 30% 메탄올을 처리한 후, 50% 아세토니트릴(acetonitrile)에 10 mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)가 포함된 용액 100 ㎕를 재차 처리하여 염색제를 완전히 제거하였다. 100% 아세토니트릴 100㎕로 젤을 탈수시킨 후 진공 원심분리기(Speed-vac)에서 남아있는 용액을 완전히 제거하였다. 트립신(trypsin) 10 ng/㎕를 탈수된 젤에 처리하고 37℃에서 16시간 반응시켜 젤 안의 단백질들을 펩타이드 상태로 잘랐다. 여기에 50 mM 암모늄 바이카보네이트 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 펩타이드 용액을 수거하고, 다시 젤에 50% 아세토니트릴과 5% 트리플로로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) 100 ㎕ 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 펩타이드 용액을 수거함으로써 젤로부터 펩타이드를 추출하였다. 추출한 펩타이드는 진공 원심분리기에 넣어 완전히 건조시켰다.

질량 분석을 하기 전 시료의 염을 제거하기 위하여, 미리 100% ACN으로 10 ㎕씩 3회, 50% ACN과 0.1% TFA 10 ㎕로 3회, 0.1% TFA로 3회 세척한 Zip-Tip(Millipore사)을 증류수 10 ㎕에 용해시킨 시료에 결합시켰다. 이를 0.1% TFA로 10 ㎕씩 3회 세척한 후 다시 50% ACN과 0.1% TFA 10 ㎕를 가하여 Zip-Tip으로부터 다시 펩타이드를 용출하고 이로써 펩타이드부터 염을 완전히 제거하였다. 이로써 질량분석을 위한 펩타이드 시료를 준비하였다.

<3-2> 질량분석

본 발명자들은 질량분석기(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-TOF MS)에 실시예 <3-1>에서 준비한 시료를 넣고 질량분석을 실시하였다.

구체적으로, 매트릭스(Matrix)로 사용되는 알파-시아노-4-하이드록시사이남 산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA)을 50% ACN, 0.1% TFA로 녹인 후 원심분리하여 상층액만 수거하였다. 매트릭스는 주로 자외선을 강하게 흡수하는 유기물질을 사용하는데, 시료분자 각각을 분리시키는 역할과 그것을 안정하게 연성이온화(soft ionization)시키는 역할을 한다. 매트릭스에 내부 보정(internal calibration)을 위한 표준 용액을 1/4000 정도로 희석시켜 그 중 1 ㎕를 시료에 넣고 녹인 후 상기 시료를 분석용 판에 떨어뜨려 시료가 완전히 말랐을 때 질량분석기에 판을 넣어 분석을 실시하였다. 질량분석기는 Voyager DE-STR Mass spectrometer(Applied Biosystems사)를 사용하였다. 질량분석기로 얻어진 펩타이드의 질량을 마스코트(MASCOT, http://www.matrixscience.com)에서 분석한 후 NCBI 데이터베이스에서 해당 펩타이드를 동정하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4와 같이 당쇄변화가 증가 또는 감소하는 단백질들이 동정되었다. 당쇄변화를 나타내는 단백질은 다음과 같다.

1. 알파,1,6-푸코오스(α1,6-fucose) 당쇄가지가 첨가되는 단백질

점	분자량(kDa/pI)	단백질
4	57/4.8	Protein disulfide isomerase
5,6	16/9.4	Lysozyme C precursor
9	14/5.0	Immunoglobulin heavy chain

2. 알파,1,6-푸코오스(α1,6-fucose) 당쇄가지가 감소하는 단백질

점	분자량(kDa/pI)	단백질
1	50/6.1	Aldehyde dehydrogenase
2,3	38/5.9	Cathepsin B
7	25/5.9	Collagen alpha 1(Ⅰ) chain precursor
8	16/9.4	Lysozyme A
10	52/5.35	FK-506 binding protein 4

상기에서 동정한 단백질의 당쇄변화를 측정하여 TCDD 노출 여부를 진단할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 단백질의 당쇄 변화를 이용하여 테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)에의 노출여부를 진단하는 방법 및 노출여부를 진단용 마커는 다이옥신에의 노출여부를 진단하기 위하여 사용될 뿐 아니라, 상기 마커에 포함된 단백질들을 기초로 제조된 단일클론항체는 면역반응을 이용한 단백질 칩 및 진단키트 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

‘알데하이드 탈수소화효소(Aldehyde dehydrogenase)’, ‘카뎁신 B(Cathepsin B)’, ‘콜라겐 알파Ⅰ체인 전구체(Collagen alphaⅠchain precursor)’, ‘라이소자임 A(Lysozyme A)’, ‘FK-506 결합 단백질 4’, ‘단백질 이황화 이성질체화 효소(Protien disulfide isomerase)’, ‘라이소자임 C 전구체(Lysozyme C precursor)’ 및 ‘면역글로불린 헤비 체인(Immunoglobulin heavy chain) 단백질’로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함하는 테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, 이하 ‘TCDD’라 약칭함)에의 노출 여부 진단용 마커.
삭제
제 1항의 진단용 마커에 포함되는 단백질의 당쇄 변화를 측정하여 테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)에의 노출 여부를 확인하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 단백질의 당쇄 변화 측정은

ⅰ) 인간을 제외한 테트라클로로다이벤조다이옥신(2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, ‘TCDD')에 노출된 검사대상체로부터 체액을 채취하여 시료를 준비하는 단계 ;

ⅱ) 상기 단계 ⅰ)의 시료를 LCA(Lens Culinaris Agglutinin) 수지(resin)로 패킹된 컬럼에 로딩하여 렉틴 친화성 크로마토그래피(Lectin affinity chromatography)를 수행하여 단백질 시료를 준비하는 단계 ;

ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 준비된 시료로 2차원 전기영동을 실시하는 단계 ;

ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 2차원 전기영동을 실시한 젤을 염색하고, 스캐닝하여 젤 상의 스팟(spot)을 확인하는 단계 ; 및

ⅴ) ‘알데히드 탈수소화효소(Aledhyde dehydrogenase)', ‘카뎁신 B(Cathepsin B)', ‘라이소자임 A(Lysozyme A)', ‘FK-506 결합단백질4’, ‘단백질 이황화 이성질체화 효소(Protein disulfide isomerase)', ‘라이소자임 C 전구체(Lysozyme C precursor)' 및 ‘면역글로불린 헤비 체인(Immunoglobulin heavy chain) 단백질’로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 단백질을 대상으로 단계 ⅲ) 및 ⅳ)와 동일한 과정으로 2차원 전기영동 및 젤 염색을 실시한 후 젤 상의 스팟을 확인하여 단백질 발현차이를 분석하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 테트라클로로다이벤조다이옥신(2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)에의 노출여부를 확인하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 당쇄 변화는 α 1,6 -푸코오스(fucose) 당쇄가지가 첨가되거나 감소되는 변화인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제