KR100654967B1

KR100654967B1 - Dna 혼합물을 공초점 sers 방법으로 광학 검출하기 위한 마이크로 플루이딕 칩 및 이를 이용한 dna 혼합물의 고감도 광학 검출 방법

Info

Publication number: KR100654967B1
Application number: KR1020040095715A
Authority: KR
Inventors: 주재범
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2004-11-22
Filing date: 2004-11-22
Publication date: 2006-12-06
Also published as: KR20060056576A

Abstract

본 발명은 은 나노 입자에 DNA 혼합물을 흡착시켜 DNA를 광학 검출하는데 사용되는 마이크로 플루이딕 칩 및 이를 이용한 DNA 혼합물 광학 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 은 나노 콜로이드와 DNA 혼합물을 효율적으로 섞을 수 있는 마이크로 플루이딕 칩 및 이를 이용한 공초점 SERS의 광학 검출 방법으로 DNA 혼합물을 정량적으로 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

PDMS 고분자 물질을 반도체 공정을 이용하여 실리콘기판위에 패터닝한 다음, 악어 이빨 형태의 채널(channel)을 가지는 랩온어 칩을 제작한다. 제작된 랩칩의 미세 유로에 은 나노 입자 콜로이드와 두 개의 DNA 혼합물을 주입하여 은 나노 입자에 DNA 분자들을 흡착시킨 후 아르곤 이온 레이저를 주사하여 증폭된 시그널을 측정한다. 이때, 측정된 DNA 혼합물의 측정 한계는 10^-12M 정도로서, 저농도를 관측하는 것이 가능하다. 본 고감도 광산란 증폭 기술은 랩칩 내의 DNA와 단백질과 같은 바이오 시료의 고감도 측정에 널리 이용될 수 있다.

랩온어 칩, 마이크로 플루이딕 칩, 라만 분광법, SERS, PDMS, 공초점

Description

DNA 혼합물을 공초점 SERS 방법으로 광학 검출하기 위한 마이크로 플루이딕 칩 및 이를 이용한 DNA 혼합물의 고감도 광학 검출 방법{Microfluidic chip for highly sensitive signal detection of duplex DNA mixtures using confocal surface enhanced Raman Microspcopy and the detection method thereof}

도1a는 악어 이빨 모양의 마이크로믹서를 도식화한 도면.

도1b는 직사각형의 도관 안에서 삼각형 모양이 채널의 위와 아래 표면에 지그재그 방법으로 위치되어 있는 악어 이빨 모양의 마이크로믹서를 도식화한 도면.

도1c는 악어 이빨 모양의 삼각형 구조물을 위에서 본 평면도.

도1d는 악어 이빨 모양의 삼각형 구조물을 옆에서 본 측면도.

도2a는 두개의 시린지 펌프, 하나의 PDMS 마이크로플루이딕 채널 및 하나의 마이크로스테이지를 포함하는 공초점 형광 현미경의 실험적 셋업을 나타내는 사진.

도2b는 두개의 시린지 펌프, 하나의 PDMS 마이크로플루이딕 채널 및 하나의 마이크로스테이지를 포함하는 공초점 라만 현미경의 실험적 셋업을 나타내는 사진.

도3은 다양한 유속에서 측면의 합류흐름의 공초점 형광 이미지와, PDMS 채널에서 도1의 사각형 영역에 의해 표시된 위치에서 그 대응되는 강도 수준을 나타내는 사진 및 그래프(각 이미지의 정상에서의 숫자가 유속을 표시).

도4는 200μL/min의 유속에서 라만 스펙트럼을 나타낸 그래프로서 a는 PDMS의 SER 스펙트럼, b는 λ=514.5nm 레이저 여기에서 얻어진 TAMRA 표지 SPGY1 올리고뉴클레오타이드의 SER 스펙트럼, c는 PDMS 플루이딕 채널에서 TAMRA 표지 SPGY1 올리고뉴클레오타이드의 비공초점 방식 SER 스펙트럼, d는 PDMS 플루이딕 채널에서 TAMRA 표지 SPGY1 올리고뉴클레오타이드의 공초점 방식 SER 스펙트럼을 각각 나타낸 그래프.

도5는 200μL/min의 연속적인 유속의 PDMS 채널에서 a) 10^-10M Cy3-표지 SRY, b) 10^-10M TAMRA-표지 SPGY1, 및 c) 상기 물질의 1:1 혼합물의 공초점 SER 스펙트럼.

도6은 다양한 농도에서 측정된 Cy3표지 SRY 및 TAMRA-표지 SPGY1의 두개의 DNA 올리고머의 1:1 혼합물에 대한 공초점 SER 스펙트럼(유속은 200μL/mim).

도7 두개의 DNA 올리고머 혼합물의 다른 몰비율에서 공초점 SER 스펙트럼으로서, Cy3표지 SRY 및 TAMRA-표지 SPGY1의 몰비율은 각각 1:3(a), 1:2(b), 1:1(c), 2:1(d) 및 3:1(e)이고, 유속은 200μL/mim이며, 삽입된 그래프는 SRY/SPYG1의 몰비율에 따른 피크영역의 비율(I₁₄₆₉/I₁₆₅₀)을 나타낸 그래프.

랩-온-칩 기술은 최근 다양한 바이오 분석을 수행하기 위해 발전되어 왔다. 상기 기술은 기존의 기술에 비해 다음과 같은 장점이 있다. 즉, 최소한의 시료만이 요구되고 반응 시간이 짧으며 사용이 용이하고 생성물을 선택적으로 만들 수 있으며 부가 생성물의 생산이 적다. 그러나 미세 채널에서의 검출 부피가 매우 작으므로, 온칩 상태에서 바이오 분석을 하기 위해서는 매우 민감한 검출 방법이 요구된다.

DNA는 매우 낮은 농도로 존재하므로, DNA 분석시 더욱더 민감한 검출 기술이 요구된다. 일반적인 DNA 검출에는 PCR을 이용한 DNA 증폭 기술과 형광 검출기술이 널리 이용된다. 그러나, 상기 기술은 DNA는 형광을 발하지 않으므로 온-칩 검출을 위하여 형광 태그(tag)로 처리되어어야 하며, 복합 DNA 검출에서 넓은 형광 방출에 의해 발생하는 광표백(photobleaching)및 피크의 겹침(overlapping peaks) 현상과 같은 단점이 있다.

라만 분광법(raman spectroscopy)은 잘 알려진 분석 방법으로, 극미량의 단위에서 화합물의 생물학적, 구조적 성질을 규명할 수 있다는 장점이 있다. 비형광 시료의 검출 및 분석시 상기 기술을 이용할 수 있다. 이 때, 레이저 광에 의하여 들뜬 상태는 여기 에너지(the excitation energy)가 전자적 변화와 함께 공명상태에 있을 필요가 없기 때문에, 형광 시료와 비교해서 광분해 형상이 감소한다. 그러 나, 라만 산란(Raman scattering)은 형광 분자의 흡수 단면보다 약 10⁴ 배정도가 낮은 산란 단면을 가지는 극히 비능률적인 방법이다. 따라서, 생물학적 시료의 고감도를 얻기 위해, 산란 강도가 매우 증가 되어야 할 필요성이 있다.

은 나노 입자를 사용하는 표면 증강 라만 분광법(surface enhanced Raman spectroscopy, SERS)은 라만 분광법에 존재하던 문제점인 낮은 감도를 극복할 수 있는 가능성을 보여준다. SERS 기술을 이용하면, 검출 감도를 기존의 라만 분광법보다 10⁶ 내지 10¹⁰ 배 정도 향상시킬 수 있다. 결과적으로, SERS 감도는 형광의 감도를 능가할 수 있고, 미세한 라만 피크는 복합 DNA 검출을 가능하게 한다.

최근 Docherty 등(F. T. Docherty, P. B. Monaghan, R. Keir, D. Graham, W. E. Smith and J. M. Cooper, Chem. Commun., 2004, 118-119)은 마이크로 플루이딕 칩에 세가지 염색으로 표지한 DNA 올리고뉴클레오타이드의 SERS 검출을 보고한 바 있다. 또한, 상기 논문에서는 좁은 SERS 시그널이 하나의 칩에서 다성분의 DNA에 대한 동시 검출이 가능함을 보여줬다. 그러나 상기 논문에서, 마이크로플루이딕 채널에서 은 콜로이드들과 DNA 올리고뉴클레오타이드의 혼합물에 대한 SERS 시그널은 정지 상태에서 측정되었다. 그러나, 정지상태의 라만 측정은 변하기 쉬운 혼합시간, 변하기 쉬운 산란 현상, 국부적 가열 및 광해리라는 문제점들을 가지고 있다. 따라서, 유체 채널의 온-칩 라만 검출에 대해서는, 흐르는 상태에서 측정하는 것이 정지 상태에서 측정하는 것보다 위에서 지적한 문제점들을 해결할 수 있는 결과를 얻을 수 있다. 또한, 최적의 혼합 상태는 라만 시그널에 큰 영향을 미치므로 혼합 상태를 조절할 수 있는 채널 구조의 디자인과 유속의 조절이 정확한 광 검출을 위한 중요한 요소로 작용한다.

따라서, 본 발명자들은 DNA 올리고머와 은 콜로이드가 효율적으로 혼합되고 흐르는 상태에서 DNA를 검출하기 위한 악어 이빨 모양의 PDMS 마이크로플루이딕 채널을 디자인 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 DNA를 마이크로어레이에 고정시키지 않고 마이크로 플루이딕 채널 내에서 유체상으로 DNA 혼합물을 광학 검출하는 방법 및 이에 사용되는 마이크로 플루이딕 칩을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 은 나노 입자를 이용한 고감도 정량 분석이 가능한 DNA 혼합물의 고감도 광학 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DNA 혼합물 및 은 나노 콜로이드를 주입하는 두 개의 마이크로 시린지 펌프; 상기 펌프에 각 반응물질의 주입구가 연결되고 상기 두 물질의 유로(流路)가 합류하는 Y자 모양의 플라스틱 채널(channel);및 상기 물질의 흐름이 합류되는 채널 부분의 내부에 지그재그로 배열된 악어 이빨 모양의 삼각형 구조물을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 검출용 마이크로 플루이딕 칩을 제공한다.

상기 DNA 검출은 공초점 SER 스펙트럼을 이용하는 것이 바람직하고, 상기 DNA 혼합물 및 은 나노 콜로이드의 채널에서 유속은 100-200μl/min인 것이 바람직하다. 또한, 상기 플라스틱 채널은 PDMS 채널인 것이 바람직하다.

상기 DNA 혼합물은 서열이 다른 DNA를 두가지 이상 포함하는 것이 바람직하 고, 상기 서열이 다른 DNA는 각각 다른 염료로 표지되는 것이 바람직하다. 상기 은 나노 콜로이드의 입자 크기는 60-70nm인 것이 바람직하고, 상기 은 나노 콜로이드에 0.1M 스페르민를 첨가하되, 은 나노 콜로이드 100μl당 0.1M 스페르민 1μl를 첨가하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 DNA 혼합물 및 은 나노 콜로이드를 채널 내부로 주입하는 단계; 상기 두 반응 물질이 채널 내부에서 합류하여 혼합되는 단계;및 상기 반응 물질의 혼합물이 흐르는 상태에서 공초점 SER 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 혼합물의 광학 검출 방법을 제공한다.

상기 DNA 혼합물 및 은 나노 콜로이드의 채널에서 유속은 100-200μl/min이 바람직하고, 상기 플라스틱 채널은 PDMS 채널인 것이 바람직하다. 또한, 상기 DNA 혼합물은 서열이 다른 DNA를 두가지 이상 포함하는 것이 바람직하며, 상기 서열이 다른 DNA는 각각 다른 염료로 표지되는 것이 바람직하다. 상기 DNA 혼합물 중 한 DNA의 몰농도를 고정시키고 다른 DNA의 몰농도를 변화시키면서 DNA 광학 검출을 하는 경우, 상기 고정 농도의 DNA를 기준으로 변화 농도의 DNA를 정량적으로 검출할 수 있다.

상기 은 나노 콜로이드의 입자 크기는 60-70nm인 것이 바람직하고, 상기 은 나노 콜로이드에 0.1M 스페르민를 첨가하되, 은 나노 콜로이드 100μl당 0.1M 스페르민 1μl를 첨가하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따르면, 효율적으로 디자인된 혼합 채널과 유속의 적절한 상태 하에, 복합된 DNA 올리고머의 정량적인 SERS 검출을 흐르는 상태에서 수행할 수 있다.

본 발명에서는, SRY(sex determining Region Y gene)관련 DNA 시퀀스를 가진 두 올리고뉴클레오타이드를 선택하여 증명하였다. 이러한 유전자들은 성분화를 결정한다고 알려져 있다. DNA에서 SRY 시퀀스는 서든 블럿(southern blotting)과 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 일반적으로 증명되어왔다. 상기 올리고머들의 SERS 검출을 위해, TAMRA와 Cy3라는 라만 염료를 합성 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 부착하였다.

PDMS는 좋은 광학성질과 접착성을 가지므로, 마이크로플루이딕 채널의 디자인을 위해 매우 좋은 폴리머이다. 그러나, PDMS는 라만 활성 폴리머이므로 그 자체의 라만 산란 시그널을 가진다. 그러므로, PDMS 채널내에 존재하는 작은 부피의 (수 백 나노리터 정도) 생화학물질에 대한 라만 시그널을 얻기 위해서는, PDMS 채널의 자체 라만 시그널을 효율적으로 제거해야 한다. 공초점 기술이 이러한 문제점을 해결하기 위해 사용될 수 있다. 기존 라만 분광법에서는, 레이저의 초점-비초점 영역의 전 부분에 대한 산란 시그널이 모두 검출기에 검출된다. 반면, 공초점 마이크로 분광법(confocal micro-spectroscopy)에서는, 크기 조절이 가능한 슬릿(slit)을 초점 평면으로부터 산란되는 빛이외의 비초점 시그널을 차단하기 위해 현미경 대물렌즈의 후면 이미지 평면에 장착한다. 공초점 슬릿은 회절 한계 내에서 별개의 초점 부피로부터 유도된 시그널만을 모으기 위해 디자인 된 것이다. 그러므로, 공 초점 기술을 이용하면, 하나의 마이크로채널 미세 부피 내의 각 종류의 화학물질에 대한 산란 시그널만을 얻을 수 있고, 주변의 PDMS 물질로부터 유래하는 시그널로부터 분리될 수 있다.

랩-온-칩 기술과 복합된 공초점 SERS 검출 방법은 마이크로 어레이 칩에서 요구되는 고정화 과정이나 민감한 DNA 분석을 위한 증폭 과정을 요구하지 않는다. 이런 특징은 다른 바이오 분석에서 이러한 방법을 적용시킬 수 있게 한다.

좀 더 용이한 이해를 위하여, 이하에서는 구체적인 도면과 함께 설명한다.

도1a는 악어 이빨 모양의 PDMS채널과 합류하는 흐름의 혼합 과정을 도식적으로 보여준다. 은 콜로이드와 두개의 DNA 올리고머 혼합물(duplex DNA oligomer mixture)을 튜브로 연결된 마이크로시린지로부터 피펫 입구까지 채널 안으로 주입한다. DNA 혼합물과 은 콜로이드 용액의 유속은 마이크로시린지 펌프를 사용하여 정밀하게 제어한다. 공초점 SERS 시그널은, DNA 올리고머가 위와 아래의 악어 이빨 모양의 PDMS 채널을 통과하여 나노입자에 효율적으로 흡착된 후 측정한다. 상기 3차원 PDMS 채널은, 더욱 강한 이류(advection)가 합류 흐름에서 동시에 수직 및 수평의 분산에 의해 발전되기 때문에, 뱀 모양의 구불구불하거나 나선모양이 혼돈된 채널과 비교하여 높은 혼합 효율을 보여준다. 도1b에서 사각형 점선으로 표시된 부분은 공초점 레이저 스케닝 마이크로스코피에 의한 형광 이미지의 측정 영역이다.

도1c는 악어 이빨 모양의 삼각형 구조물을 위에서 본 평면도이고, 도1d는 악어 이빨 모양의 삼각형 구조물을 옆에서 본 측면도이다. 삼각형 두께가 혼합 효율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다양한 높이의 채널을 제작하여 실험을 하였는 데, 실험 결과 삼각형 구조물의 두께가 더 클수록 혼합 효율은 더 좋아졌다. 실험에서는 삼각형 구조물의 기저부 300um 및 높이 300um이고, 상기 직사각형 채널의 넓이 300um이며, 삼각형 구조물의 두께가 50, 100 및 150um로 변함에 따라 직사각형 채널의 높이도 100, 200 및 300um로 변하는 구조를 사용하였다.

도2는 마이크로플루이딕 채널에서 합류하는 흐름에 공초점 형광과 라만 측정에 대한 실험적 셋업(set-up)을 보여준다.

도3은 5종류의 다른 유속에서 측면 합류 흐름에 대한 공초점 형광 이미지를 보여주며 도1b에 사각형 점선으로 표시된 영역은 위 도3의 형광 측정부분을 나타낸다. 공초점 형광 측정을 위해, 0.05M의 레이저 등급 형광염료인 로다민 6G를 채널에서 합류하는 흐름의 하나를 형성하기 위해 증류수에 녹인다. 다른 흐름은 은 콜로이드를 포함한다. 상기 두 흐름을 튜브로 연결된 마이크로시린지로부터 피펫 입구까지 PDMS 채널안으로 주입한다.

유속은 KD Sicence 마이크로시린지 펌프를 사용하여 정밀하게 제어한다. 5 내지 10μl/min의 낮은 유속에서, 두가지 합류하는 액 즉, 은 콜로이드 및 형광염료는 완전히 혼합되지 않는다. 한편, 더 작은 구획안으로 합류하는 흐름의 분열(splitiing)은 유속이 100μl/min까지 증가될 때 매우 향상된다. 이와같이 혼합된 이류(advection)에 의해 혼합되는 액체의 부피는 유속의 증가에 따라 매우 향상된다. 200μl/min의 가장 빠른 유속에서, 들어가는 흐름은 많은 구획으로 분열된다. 이것은 혼란된 이류(advection)에 의해 휘저어진 부피는 유속의 증가에 따라 매우 증가된다. 결과적으로, 200μl/min의 유속은 라만 측정에 대한 광학(최적) 유속으 로 선택될 수 있다. 이러한 공초점 형광 이미지는 다른 유속에서 합류하는 흐름의 혼합 작용을 매우 잘 보여준다. 따라서, 본 발명에 따른 마이크로 플루이딕 칩을 이용하여 DNA 광학 분석을 할 경우, 반응물질의 유속은 5-200μl/min이 바람직하고(측정결과), 100-200μl/min이 더욱 바람직하고, 200μl/min이 가장 바람직하다. 상기 유속이 100μl/min 미만이면 두 반응물질이 완전히 혼합되지 않을 수 있고, 200μl/min을 초과하면 유체의 혼합 효율은 더 좋아지나 소비되는 시료의 양이 너무 많아지므로 비효과적이다.

라만 측정에서 공초점 기술의 필요를 확인하기 위해, PDMS 채널에서 두 혼합류의 라만 스펙트럼을 두가지 다른 형태로 측정한다. 즉, 비공초점 및 공초점의 형태로 측정한다. 도4는 PDMS 채널에서 은 콜로이드에 흡수된 Cy3-표지 SRY와 TAMRA-표지 SPGY1의 1:1 혼합물에 대한 SER 스펙트럼의 비교를 보여준다. 도4a에서와 같이, PDMS는 라만 활성 폴리머이므로 707, 688, 488cm^-1에서 자신의 라만 시그널을 가진다. 두개의 DNA 혼합물에 대한 주요 라만 시그널은 도4b에서와 같이 625 및 500cm^-1에서 측정되었다. PDMS 라만 시그널은 비공초점 방식 라만 스펙트럼에서 완전히 제거되지 못했다(도4c). 한편, 15μm 넓이의 공초점 핀홀이 초점이 맞지 않는 PDMS 산란 시그널을 제거하기 위해 사용되었을 때, PDMS 폴리머에 의한 라만 시그널은 공초점 방식 스펙트럼에서 제거되었다(도4d). 이것은 PDMS 폴리머 채널의 라만 시그널로부터 어떤 방해도 없이 화학물질의 종류에 대한 분광 정보를 얻는데 공초점 기술이 매우 중요하다는 것을 의미한다.

도5는 PDMS 채널에서 은 콜로이드에 흡수된 10^-10M Cy3-표지 SRY, 10^-10M TAMRA-표지 SPGY1 및 이들의 1:1 혼합물 각각의 공초점 SER 스펙트럼을 보여준다. 은 콜로이드 나노입자는 그 표면을 코팅하는 음전하 하이드록실아민 클로라이드 이온에 의해 안정화된다. 또한, 염료 표지 DNA 올리고뉴클레오타이드는 그것의 음전하 인산 기본구조 때문에 음전하를 가지고 있다. 그러므로, 분석물질과 은 나노입자 사이의 정전기적 반발로 인한 SERS 활성의 부족 때문에, PDMS 채널에서 염료 표지 올리고뉴클레오타이드의 어떤 SER 스펙트럼도 관찰될 수 없다. Faulds et al.(K. Faulds, W. E. Smith and D. Graham, Anal. Chem., 2004, 76, 412-417)은 이런 문제점을 해결하기 위해 폴리아민 스페르민 테트라하이드로클로라이드 (스페르민)를 사용하였다. 스페르민액은 DNA 기본구조와 상호작용하여 음전하를 중화시킨다. 따라서 스페르민액은 금속 표면에 올리고뉴클레오타이드가 흡착되는 것을 돕는다. 또한, 스페르민은 과량에서 라만 향상을 위한 응집제(aggregation agent)로도 활용된다. 염료 표지 DNA 올리고뉴클레오타이드에 스페르민액을 첨가한 후, SER 스펙트럼은 10^-10M의 낮은 농도에서 쉽게 얻어질 수 있다. Cy3 표지 SRY에 대한 특정 라만 피크는 1588, 1469, 1406, 1393 및 1270cm^-1에서 관찰되었다(도5a). 한편, TAMRA-표지 SPGY1에 대한 라만 피크는 1650, 1534, 1512, 1356 및 1217cm^-1에서 관찰되었다(도5b). 또한, 도5c는 PDMS 마이크로플루이딕 채널에서 두개의 염료 표지 올리고뉴클레오타이드의 1:1 혼합물의 SER 스페트럼을 보여준다. 상기 도5c에서와 같이, SRY 및 SPG1의 라만 피크는 그 혼합물에서도 명확히 관찰되었다. 이것은 다른 DNA 서열을 가지는 상기 두가지 염료 표지 올리고뉴클레오타이드가 공초점 SERS 기술을 사용하여 고감도로 검출될 수 있다는 사실을 보여준다.

공초점 SERS에 의해 관찰될 수 있는 검출한계(LOD)를 알아내기 위해, 농도 연구(concentration study)를 PDMS 채널에서 올리고머 혼합물에 대해 수행하였다. SERS의 정량적인 적용은 매우 어렵다고 알려져 있다. 왜냐하면, 응집정도, 금속 콜로이드의 입자 크기, 금속 표면에서 분자들의 비균일한 분포와 같은 실험적 상태를 제어하기 어렵기 때문이다. 결과적으로 보통의 샘플링 조건에서, SERS 실험으로부터 예상되는 정확성은 매우 부족하다. 그러나, 계속적인 흐름과 균일한 혼합 조건에 의해 상기 정확성은 매우 향상될 수 있다. 상기 조건은 본 발명에 따른 악어 이빨 모양의 랩-온-칩 기술을 사용하면 쉽게 달성될 수 있다.

도6은 200μm/min의 끊임없는 유속에서 콜로이드성 은에 흡수되는 1:1 DNA 올리고머 혼합물의 공초점 SER 스펙트럼을 보여준다. 상기 스펙트럼 자료에 따르면, 두개의 올리고머 혼합물의 LOD는 10^-11M로 측정된다.

도7은 마이크로플루이딕 채널에서 두개의 올리고뉴클레오타이드의 다른 몰비율에 대한 공초점 SER 스펙트럼을 보여준다. TAMRA 표지 SPGY1 5.0 x 10^-10M에 Cy3-표지 SRY를 1.6 x 10^-10 내지 1.5 x 10^-9M의 다양한 량을 첨가하여, SRY와 SPGY1의 몰비율이 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 및 3:1이 되도록 조절하였다. 1650cm^-1에서의 TAMRA 피크를 내부 표준으로 사용하고, 상기 다른 몰비율에 대한 조사는 1588, 1469, 및 1393cm^-1에서 Cy3 다양한 라만 피크로 하였다. 상기 라만 피크들의 강도는 Cy3-표지 SRY의 농도증가에 따라 증가하였다. 특히, 1469cm^-1에서 라만 피크는 SPGY1의 어떤 라만 피크와 겹치지 않으므로 SRY의 정량적 평가로 사용될 수 있다. 도7에 삽입된 그래프는 두개의 DNA 올리고뉴클레오타이드의 몰비율의 변화에 따른 피크영역의 비율(I₁₄₆₉/I₁₆₅₀)의 직선성을 보여준다. 이것은 마이크로플루이딕 채널에서 두개의 DNA 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 매우 민감한 정량적인 검출이 공초점 SERS 기술을 사용하므로서 가능하다는 것을 의미한다.

이하 구체적인 실험예를 들어 본 발명을 설명하나 본 발명이 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 악어 이빨 모양의 PDMS 채널 제작

마이크로플루이딕 채널은 위와 아랫 이빨의 패턴을 가진 두가지 PDMS 층을 쌓음으로써 제조된다. 이러한 층들은 주형으로부터 패턴 복제에 의해 생산된다. 위와 아랫 이빨의 패턴을 포함하는 두개의 에폭시 기반 광저항(two epoxy-based photoresist, EPON) 주형들은 통상적인 주형의 제조 방법에 따라 제조된다. 아래 주형에 PDMS 초기중합물(prepolymer)과 경화제(curing agent, Sylgard 184 silicone elastomer kit, Dow Corning, Midland, MI)를 10:1의 비율로 붓고, 80℃ 핫플레이트에서 2시간동안 경화하여 두께 1.0cm 의 두꺼운 층으로 아랫 패턴을 제조한다. 윗 이빨의 패턴을 가진 층은 PDMS 엘라스토머(elastomer)의 압축 마이크로몰딩(compress micro-moulding)으로 제조한다. PDMS 초기중합체를 주형에 부어서 투명 필름과 알루미늄 디스크와 함께 압축한다. 그리고 나서, 2시간동안 경화시킨다. 두께 200μm 의 얇은 윗층을 주형으로부터 분리한다. 위와 아랫 층을 결합시키기 위해, 두층의 표면을 산소플라즈마(oxygen plasma)에 활성화시키고, 정렬시킨다. 두층 사이에 계면 활성제로서 메탄올을 사용한다. 마지막으로 커버 글래스를 윗층에 쌓아 올린다.

[실시예 2] DNA 혼합물의 검출

a) 염색 표지 올리고뉴클레오타이드의 제조

두가지 다른 타입의 SRY 올리고뉴클레오타이드는 바이오니아(Bioneer, 대전)에서 구입하였고, HPLC로 정제하여 사용하였다. 각각의 시료에 대해, 라만 염료인 Cy3 와 TAMRA 를 5'-말단에 붙였다. SRY와 SPGY1 올리고뉴클레오타이드의 시퀀스는 각각 (Cy3) 5'-GGT CGA TAC TTA TAA TC GGG-3'과 (TAMRA) 5'-ACA ATT TTG ATA GRC TGA ACA CAA GC-3'이다. SERS 측정을 위한 표준 DNA액은 3차 증류수로 염료 표지 올리고뉴클레오타이드를 10^-9M 까지 희석하여 제조한다.

b) 은 콜로이드 제조

은 콜로이드는 Leopold와 Lendl(N. Leopold and B. Lendl, J. Phys. Chem. B, 2003, 107, 5723-5727)가 최근 보고한 방식으로 제조하였다. 질산은을 하이드록실아민 하이드로클로라이드로 환원시켰다. 하이드록실아민 하이드로클로라이드로 환원된 은 콜로이드의 장점은 상온에서 빠르게 제조되고 SERS에 바로 적용 가능하다는 것이다. 처음에, 3.0 x 10^-2M의 하이드록실아민 하이드로클로라이드 5mL를 3차 증류수 84mL에 녹이고, 1.7 x 10^-3M의 수산화나트륨(sodium hydroxide) 1mL를 첨가하여 pH를 알칼리로 유지했다. 그리고 난 후, 1.0 x 10^-3M 질산은 액 10mL를 상기 액을 계속 저으면서 상기 액에 한방울씩 떨어뜨렸다. 상기 혼합된 액을 20분동안 더 계속 저어줬다. UV/Vis 스펙트로스코피(spectroscopy)와 TEM을 상기 생산된 콜로이드의 입자 크기를 측정하기 위해 사용하였다. 입자 크기의 평균은 60 내지 70nm 로 결정되었다. 0.1M 스페르민(spermine) 1μL를 은 콜로이드 용액 100μl 에 첨가하였다. 폴리아민 스페르민 테트라하이드로클로라이드를 DNA 올리고뉴클레오타이드의 음전하를 띤 인산 기본구조(negatively charged phosphate backbone) 을 중화시키기 위한 작용제로 사용하였다. 결과적으로, 올리고뉴클레오타이드는 은 나노입자에 효율적으로 흡착되었다.

c) 공초점 표면 증강 라만 측정(confocal surface Raman measurments)

라만 측정은 레니쇼 2000 라만 마이크로스코프 시스템(Renishaw 2000 Raman microscope system)을 사용하여 수행되었다. λ=514.5nm 에서 조절되는 스펙트라 피직 아르곤 이온 레이져(Spectra Physics argon ion laser)는 약 20mW의 레이져 파워를 가진 여기 소스(excitation source)로서 사용되었다. 레일리 라인(Rayleigh line)은 수집경로(collection path)에 있는 홀로그래픽 노치 필터(holographic notch filter)에 의해 수집된 라만 산란으로부터 제거되었다. 라만 산란은 1 cm^-1의 분광 해상력(spectral resolution)으로 CCD 카메라(charge-coupled device camera)를 사용함으로써 검출되었다. 부가적인 CCD 카메라를 광학 이미지를 얻기위하여 광학 현미경(optical microscope)에 설치하였다. 두개의 슬릿 공초점 배열(two-slit confocal arrangement)은 초점에 맞춰지지 않은 레이져빔으로부터의 백그라운드 라만 산란(background raman scattering)을 줄이기 위해 사용되었다. 레이져빔이 Z 방향에서 정상과 바닥 사이의 구역과 같은 마이크로 채널의 중앙에 초점되어졌지만, 마이크로 채널의 화학물질들의 작은 부피로부터 나오는 라만 시그널은 주변 PDMS 물질로부터 기인한 시그널로부터 완전히 분리될 수 없었다(도4c). 이 문제를 해결하기 위해, 모든 라만 스펙트럼을 공초점 형태에서 측정하였다. 라만 시스템에서, 핀홀(pinhole)의 역할은 CCD 검출기에서 입구 슬릿과 픽셀의 공조로 대체되었다. 첫번째 공초점 슬릿을 15μm 넓이로 배치하였다. 그리고 나서, 시그널은 스펙트로미터 슬릿에 수직 배열된 허상의 두번째 슬릿을 만들면서 CCD 검출기에 단지 두개의 픽셀 줄(pixel rows)로부터 수집되었다. 각 스펙트럼은 30초동안 모아졌다. 공초점 기술을 사용하여, PDMS의 어떤 초점을 빗나간 영역에 기인한 백그라운드 스트레이 라이트(background stray light)는 효율적으로 제거되었다(도4d). 실험은 PDMS 마이크로플루이딕 채널에서 비형광의 합류하는 흐름에 의한 혼합의 평가에 대한 민감한 검출 수단으로서 공초점 SERS의 가능성을 조사하기 위해 수행되었다.

[실시예 3] 형광 로다민 6G이 녹아있는 물과 비형광 은 콜로이드가 합류하는 흐름의 혼합 과정 실험

공초점 형광 이미지 측정은 He-Ne 레이져를 가지는 Leica TCS SL 공초점 형광 현미경을 사용하여 수행되었다. 형광 로다민 6G(fluorescent Rhodamine 6G)이 녹아있는 물과 비형광 은 콜로이드가 합류하는 흐름의 혼합 과정을 보이기 위해 마이크로 시린지 펌프를 사용하여 5-200μl/min의 유속으로 Y 모양의 입구에 적용하 였다. 합류하는 혼합류(confluent mixing stream)는, 10배율의 워터-이머젼 대물렌즈(10x water-immersion objective lens)를 사용하여 광학축에 수직으로 위치한 x-y 평면에 2차원 공초점 형광 이미지를 사용하여 분석되었다. 측면 해상력은 1μm로 측정되었다. 로다민 6G의 레이져 여기는 λ=543nm에서 일어났고, 방사된 형광 빛은 λ=590 과 620nm 사이에서 검출되었다. 이미지 크기는 512 x 512 픽셀이었고, 각 픽셀은 0.49μm 였다. 또한, 채널을 가로지르는 흐름의 형광 강도 수준은 합류하는 혼합류의 혼합 작용을 체크하기 위해 측정되었다. 200μl/min의 유속에서 라만 측정에 대한 광학(최적) 유속으로 선택될 수 있었다(도3).

이상 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 DNA 혼합물 광학 검출은 매우 고감도의 검출 및 정량적 검출이 가능하고, 유체상에서 검출할 수 있다.

본 발명에서는 공초점 SERS 기술과 복합된 랩-온-칩 기술이 두개의 염료 표지 DNA 올리고뉴클레오타이드의 분석에 적용된다. 본 발명에 의한 방법은 마이크로 어레이에서와 같은 고정화 과정을 필요로 하지 않는다. 왜냐하면, DNA 시그널은 마이크로플루이딕 채널에서 흐르는 상태 하에 검출될 수 있기 때문이다.

또한, 본 발명에 의한 방법은 기존의 라만 스펙트로스코피에서의 낮은 감도라는 문제점을 은 나노입자에 염료 표지 올리고뉴클레오타이드의 흡착 과정과 SERS 기술을 사용함으로써 증폭 과정을 필요로 하지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 검출 방법은 형광 뿐만 아니라 비형광 시료에도 적용될 수 있다. 랩-온-칩 기술과 복합된 상기 공초점 SERS 검출은 다른 매우 민감한 바이오-분석 뿐만 아니라 마이크로 환경의 분석에도 적용할 수 있다.

Claims

DNA 혼합물 및 은 나노 콜로이드를 주입하는 두 개의 마이크로 시린지 펌프; 상기 펌프에 각 반응물질의 주입구가 연결되고 상기 두 물질의 유로가 합류하는 Y자 모양의 PDMS 플라스틱 채널(channel); 및 상기 물질의 흐름이 합류되는 채널의 상면에는 삼각기둥형상으로 돌출된 상부돌출구조물이 각각 이격된 공간으로 복수개 형성되며, 상기 상부돌출구조물의 이격된 공간으로 돌출되고 채널의 하면에 형성된 삼각기둥형상의 복수개 하부돌출구조물로 구성되는 삼각기둥 구조물을 포함하며, 공초점 SER 스펙트럼을 이용하여 DNA를 검출하는 것을 특징으로 하는 DNA 검출용 마이크로 플루이딕 칩.
삭제
제1항에 있어서, 상기 DNA 혼합물 및 은 나노 콜로이드의 채널에서 유속은 100-200μl/min인 것을 특징으로 하는 DNA 검출용 마이크로 플루이딕 칩.
삭제
제1항에 있어서, 상기 DNA 혼합물은 서열이 다른 DNA를 두가지 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 검출용 마이크로 플루이딕 칩.
제5항에 있어서, 상기 DNA 혼합물은 각각 다른 염료로 표지되는 것을 특징으로 하는 DNA 검출용 마이크로 플루이딕 칩.
제1항에 있어서, 상기 은 나노 콜로이드의 입자 크기는 60-70nm인 것을 특징으로 하는 DNA 검출용 마이크로 플루이딕 칩.
제1항에 있어서, 상기 은 나노 콜로이드에 0.1M 스페르민를 첨가하되, 은 나노 콜로이드 100μl당 0.1M 스페르민 1μl를 첨가하는 것을 특징으로 하는 DNA 검출용 마이크로 플루이딕 칩.
DNA 혼합물 및 은 나노 콜로이드를 채널 내부로 주입하는 단계; 상기 두 반응 물질이 PDMS 채널 내부에서 합류하여 혼합되는 단계; 및 상기 반응 물질의 혼합물이 흐르는 상태에서 공초점 SER 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항의 DNA 검출용 마이크로 플루이딕 칩을 이용한 DNA 혼합물의 광학 검출 방법.
제9항에 있어서, 상기 DNA 혼합물 및 은 나노 콜로이드의 채널에서 유속은 100-200μl/min인 것을 특징으로 하는 DNA 혼합물의 광학 검출 방법.
삭제
제9항에 있어서, 상기 DNA 혼합물은 서열이 다른 DNA를 두가지 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 혼합물의 광학 검출 방법.
제12항에 있어서, 상기 DNA 혼합물은 각각 다른 염료로 표지되는 것을 특징으로 하는 DNA 혼합물의 광학 검출 방법.
제12항에 있어서, 상기 DNA 혼합물 중 한 DNA의 몰농도를 고정시키고 다른 DNA의 몰농도를 변화시키면서 DNA 광학 검출을 하는 경우, 상기 고정 농도의 DNA를 기준으로 변화 농도의 DNA를 정량적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 DNA 혼합물의 광학 검출 방법.
제9항에 있어서, 상기 은 나노 콜로이드의 입자 크기는 60-70nm인 것을 특징으로 하는 DNA 혼합물의 광학 검출 방법.
제9항에 있어서, 상기 은 나노 콜로이드에 0.1M 스페르민를 첨가하되, 은 나노 콜로이드 100μl당 0.1M 스페르민 1μl를 첨가하는 것을 특징으로 하는 DNA 혼합물의 광학 검출 방법.