KR100651170B1 - Method for primary pure neuronal culture using methylthioadenosine - Google Patents
Method for primary pure neuronal culture using methylthioadenosine Download PDFInfo
- Publication number
- KR100651170B1 KR100651170B1 KR1020000043807A KR20000043807A KR100651170B1 KR 100651170 B1 KR100651170 B1 KR 100651170B1 KR 1020000043807 A KR1020000043807 A KR 1020000043807A KR 20000043807 A KR20000043807 A KR 20000043807A KR 100651170 B1 KR100651170 B1 KR 100651170B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- neurons
- methylcyanoadenosine
- cell culture
- nerve
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/80—Undefined extracts from animals
- C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Neurology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 메틸사이오아데노신의 분열하는 세포와 분열하지 않는 세포 중 분열하는 세포만 선택적으로 세포사멸을 유발시키는 특성을 이용하여 분열하지 않는 세포만을 선택적으로 배양하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 중추신경계 및 각종 말초신경계 신경세포에 적용하여, 일차 배양시 계속해서 분열하는 신경세포외에 다른 세포를 사멸시키고 순수한 신경세포만을 배양하기 위한 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for selectively culturing only non-dividing cells by using a characteristic of selectively dividing cells among the dividing cells and the non-dividing cells of methylthio adenosine, more specifically, Applied to the central nervous system and various peripheral nervous system neurons, the present invention relates to a method for culturing only pure neurons by killing other cells in addition to the neurons that divide continuously during primary culture.
또한, 본 발명은 메틸사이오아데노신의 항생제 활성을 이용하여 선택적 세포배양 뿐 아니라 배양액에 부가적인 항생제 투입 없이 세포배양을 함으로서 비용 절감의 효과를 얻을 수 있다.In addition, the present invention can obtain the effect of cost reduction by using the antibiotic activity of methylcyanoadenosine as well as selective cell culture and cell culture without additional antibiotics in the culture medium.
Description
도 1은 메틸사이오아데노신을 1 mM 농도로 48시간 처리한 후 신경세포의 광학현미경을 통한 형태학적 변화분석에 관한 사진. Figure 1 is a photograph of the morphological change analysis through the optical microscope of neurons after treatment with methylcyano adenosine at 1 mM concentration for 48 hours.
본 발명은 메틸사이오아데노신의 분열하는 세포와 분열하지 않는 세포 중 분열하는 세포만 선택적으로 세포사멸을 유발시키는 특성을 이용하여 분열하지 않는 세포만을 선택적으로 배양하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 중추신경계 및 각종 말초신경계 신경세포에 적용하여, 일차 배양시 계속해서 분열하는 신경세포 외에 다른 세포를 사멸시키고 순수한 신경세포만을 배양하기 위한 방법에 관한 것이다. 일반적으로 순수하게 신경세포만을 배양하기 위해서 보통 3가지의 방법이 사용되고 있다. 첫째가 원심분리기를 이용한 방법이고, 둘째는 형광 활성 세포 분별기(FACS)기법을 이용해서 원하는 신경세포를 얻는 방법이고, 셋째는 화합물 혹은 특별한 배지 구성물의 대체물을 배양액에 첨가하여 혼합된 세포들 중에 원하는 신경세포만을 남기고 나머지 세포들을 제거하는 방법이다. 이 중에서 세 번째 방법 이 가장 흔히 쉽게 쓰는 방법이다.The present invention relates to a method for selectively culturing only non-dividing cells by using a characteristic of selectively dividing cells among the dividing cells and the non-dividing cells of methylthio adenosine, more specifically, Applied to the central nervous system and various peripheral nervous system neurons, the present invention relates to a method for culturing only pure neurons by killing other cells in addition to the neurons that continue to divide during primary culture. In general, three methods are commonly used to cultivate pure neurons. The first is a method using a centrifuge, the second is a method of obtaining a desired neuron using a fluorescence activated cell fractionator (FACS) technique, and the third is adding a compound or a substitute of a special medium component to the culture medium. It is a way to remove the remaining cells leaving only the desired neurons. The third of these is the most commonly used method.
분화된 신경세포는 더 이상 성장하지 않는다. 하지만 신경세포와 혼합되어 있는 다른 세포들 예를 들어 신경아교세포인, 별아교세포, 슈반세포, 미세아교세포, 뇌실막세포, 희소돌기아교세포, 섬유모세포, 혈관내피세포들은 계속해서 세포 분열과정을 거친다. 따라서 배양액에 안티마이토틱스(antimitotics)을 첨가하게 되면 이들 세포들은 성장이 멈추게 되고 결국 세포사멸이 일어나게 된다. 대표적으로 사용되는 안티마이토틱스는 fluorodeoxyuridine(FUdR)와 cytosine arabinofuranoside (Ara-C)가 있다. 이 화합물들은 DNA합성을 방해함으로서 성장하려는 세포에 치명적 피해를 주게 된다. FUdR인 경우에는 DNA 뿐 아니라 RNA 합성을 방해함으로서 신경세포에 영향을 줄 수 있는 단점이 있는데 이를 보완하기 위해서 uridine과 혼합하여 사용하게 된다. 그런데 이런 알려진 안티마이토틱스는 일부 신경세포에서는 10-8 M의 아주 낮은 농도에서도 유해성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 보통 이런 경우는 이 신경세포들이 아직까지 분열하는 능력을 갖고 있기 때문이라고 판단되어진다. 따라서 이런 경우에는 신경세포를 순수하게 배양하기가 무척 어려운 문제점이 있다. Differentiated neurons no longer grow. However, other cells mixed with neurons, such as glial cells, astroglia, Schwann cells, microglia, ventricular cells, oligodendrocytes, fibroblasts, and vascular endothelial cells continue to undergo cell division. Therefore, when antimitotics are added to the cultures, these cells stop growing and eventually die. Representative antimytotics are fluorodeoxyuridine (FUdR) and cytosine arabinofuranoside (Ara-C). These compounds interfere with DNA synthesis, causing fatal damage to cells that are trying to grow. In the case of FUdR, there are disadvantages that can affect neurons by interfering with the synthesis of RNA as well as DNA. To supplement this, FUdR is used in combination with uridine. However, these known antimytotics are known to be harmful in some neurons even at very low concentrations of 10 -8 M. Usually this is because these neurons still have the ability to divide. Therefore, in this case, there is a very difficult problem to cultivate neural cells purely.
본 발명자들은 메틸사이오아데노신의 생리적 활성을 연구하던 중에 이 물질이 분열하는 세포의 세포 주기 중 마이토시스과정에 문제를 일으켜 세포 사멸을 유발함을 알고, 일차 순수 신경세포 배양에 응용하여 이 물질이 0.5 mM 이상의 농도에서 분열하는 비신경세포에 사멸을 일으키나 신경세포에는 전혀 영향을 주지 않는 다는 사실을 알아냄으로서 본 발명을 완성하였다. The inventors of the present invention, while studying the physiological activity of methylcyanoadenosine, know that this substance causes problems in the mitosis process in the cell cycle of dividing cells and causes cell death. The present invention has been completed by finding out that apoptosis occurs in non-neuronal cells that divide at a concentration of 0.5 mM or more, but does not affect neurons at all.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 신경세포만을 순수하게 배양하는 방법을 제공하는 것이다.The present invention solves the above problems, and the object of the present invention is to provide a method for purely culturing only nerve cells.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 메틸사이오아데노신을 이용한 신경세포배양방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for culturing nerve cells using methylthio adenosine.
본 발명의 신경세포는 중추신경계 또는 말초신경계에서 유래한 신경세포인 것이 바람직하고, 말초신경계의 일종인 안구조직의 시신경에서 유래한 신경세포인 것이 더욱 바람직하다. The nerve cell of the present invention is preferably a nerve cell derived from the central nervous system or the peripheral nervous system, and more preferably a nerve cell derived from the optic nerve of eye tissue, which is a kind of peripheral nervous system.
본 발명에 사용된 메틸사이오아데노신의 농도는 0.1 mM 이하에서는 성장하는 세포를 죽이지 못하며, 10 mM 이상은 배지 및 수용액에 잘 용해되지 않기 때문에, 0.1 ∼ 10 mM 범위가 바람직하다. Since the concentration of methylcyanoadenosine used in the present invention does not kill the growing cells at 0.1 mM or less, and 10 mM or more is poorly soluble in the medium and aqueous solution, the range of 0.1-10 mM is preferable.
하기식(1)의 구조를 갖는 메틸사이오아데노신(methylthioadenosine;이하 "MTA"라 함)은 생물체에서 생성됨은 아주 오래 전부터 알려져 왔다. 1912년에 Mandel과 Dunham에 의해서 최초로 MTA의 결정이 정제되었다(Mandel, J. A. and Dunham, E. K. (1912) J. Biol. Chem. 11, 85-88). 이 뉴클레오사이드는 원핵세포 와 진핵세포 생물체에서 모두 발견되었고, S-adenosylmethionine (SAM) 대사의 주 생성물의 하나임이 밝혀졌다. Methionine으로부터의 생합성과정은 1952년에 Schlenk에 의해 증명되었고( Smith, R. L. and Schlenk, F. (1952) Arch. Biochem. Biophys. 38, 159-162), 그 전에 Cantoni에 의해서 SAM이 MTA의 전구체임이 증명되었다(Cantoni, G. L. (1953) J. Biol. Chem. 204, 403-408). 수년동안 MTA는 단지 polyamine의 생합성 과정의 부산물로서만 간주되어 있었는데 근래와서 생화학자와 약리학자들이 MTA의 purine salvage 과정과 thiomethyl group 재순환에서의 역할을 설명하고 성장억제효과의 실험결과가 관찰됨으로서 이 MTA에 대한 관심이 증가되어 왔다(Williams-Ashman, H. G. and Canellakis, Z. N. (1979) Perspect. Biol. Med. 22, 421-453; Williams-Ashman, H. G., Seidenfeld, J. and Galletti, P. (1982) Biochem. Pharmacol. 31, 277-288). 더욱이, 여러 악성종양세포에서 MTA phosphorylase의 결핍이 관찰되어(Kamatani, N. and Carson, D. A. (1980) Cancer Res. 40, 4178-4182; Kamatani, N. Nelson-Rees, N. A. and Carton, D. A. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1219-1223) MTA대사와 악성종양 사이의 연관성이 있는지에 대한 가능성에 관심이 지속적으로 모아지고 있다.It has been known for a long time that methylthioadenosine (hereinafter referred to as "MTA") having a structure of the following formula (1) is produced in an organism. In 1912, the first MTA crystals were refined by Mandel and Dunham (Mandel, JA and Dunham, EK (1912) J. Biol. Chem. 11 , 85-88). This nucleoside was found in both prokaryotic and eukaryotic organisms and was found to be one of the main products of S-adenosylmethionine (SAM) metabolism. Biosynthesis from Methionine was demonstrated by Schlenk in 1952 (Smith, RL and Schlenk, F. (1952) Arch. Biochem. Biophys. 38 , 159-162), and previously by Cantoni that SAM was a precursor to MTA. Cantoni, GL (1953) J. Biol. Chem. 204 , 403-408. For many years, MTA has been regarded only as a byproduct of the polyamine biosynthesis process. In recent years, biochemists and pharmacologists have demonstrated the role of MTA in purine salvage and thiomethyl group recycling, and experimental results of growth inhibition have been observed. Interest has been increased (Williams-Ashman, HG and Canellakis, ZN (1979) Perspect. Biol. Med. 22 , 421-453; Williams-Ashman, HG, Seidenfeld, J. and Galletti, P. (1982) Biochem. Pharmacol. 31, 277-288) . Moreover, deficiency of MTA phosphorylase was observed in several malignant tumor cells (Kamatani, N. and Carson, DA (1980) Cancer Res. 40 , 4178-4182; Kamatani, N. Nelson-Rees, NA and Carton, DA (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 , 1219-1223) There is a continuing interest in the possibility of a link between MTA metabolism and malignancy.
(1) (One)
한편, 메틸사이오아데노신의 단백질의 수정과정인 메틸레이션을 방해함으로서, 분열하는 세포의 세포주기과정 중 마이토시스과정을 정지시켜 세포사멸을 일으킴으로서 분열하는 세포와 분열하지 않는 세포의 구별을 위한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 대표적으로 신경세포 배양에 사용했던 세포분열 방해용 화합물과는 다른 기전의 작용을 이용함으로서 새로운 효과를 제공한다.On the other hand, by interfering with the methylation process of the modification of the protein of methyl thio adenosine, by stopping the mitosis process in the cell cycle process of dividing cells to cause apoptosis to distinguish between cells that divide and do not divide Provide a method. Therefore, the present invention provides a new effect by utilizing the action of a mechanism different from the compound for inhibiting cell division, which is typically used for neuronal cell culture.
본 발명은 중추신경계 신경일차배양에서 배양액에 분열하는 세포만을 사멸시키는 메틸사이오아데노신을 첨가함으로서 순수하게 신경세포만을 배양할 수 있는 방법을 제공한다.The present invention provides a method capable of purely culturing only nerve cells by adding methylcyanoadenosine that kills only dividing cells in the culture medium in the central nervous system primary culture.
또한, 본 발명은 중추신경계 뿐 아니라 시신경세포와 같은 말초신경계 일차배양에서 배양액에 메틸사이오아데노신을 첨가함으로서 순수한 신경세포만을 배양할 수 있는 조건을 제공한다.In addition, the present invention provides a condition capable of culturing only pure neurons by adding methylcyanoadenosine to the culture medium in primary nervous system as well as in the peripheral nervous system such as optic nerve cells.
본 발명은 메틸사이오아데노신의 항생제 활성 효과 때문에 별도로 항생제를 배양액에 첨가해야하는 절차와 비용을 절감시키는 효과를 제공한다.The present invention provides the effect of reducing the cost and procedure of adding antibiotics to the culture separately due to the antibiotic activity effect of methylthio adenosine.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, this invention is demonstrated in detail.
암세포주인 U937 세포인 경우는 매우 잘 분열하고 일차 배양된 신경세포는 분열하지 않는다. 이 두 다른 세포에 각각 메틸사이오아데노신을 처리하여 이 화합물이 분열하는 세포에만 유해하다는 것을 보여 주고, 이 세포주에 메틸사이오아데노신을 농도별로 처리하여 세포를 사멸시킬 수 있는 양을 세포사멸 측정법을 이용하여 결정하였다. 또한, 메틸사이오아데노신이 박테리아의 성장을 억제시키는지 여부와 적정한 농도를 결정하였다. The cancer cell line, U937, divides very well and primary cultured neurons do not divide. Treating these two different cells with methylcyanoadenosine shows that this compound is harmful only to dividing cells, and then treated with methylcyanoadenosine by concentration in this cell line to determine the amount of apoptosis that can be killed. Determined using. In addition, it was determined whether methylthio adenosine inhibits the growth of bacteria and the appropriate concentration.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to non-limiting examples.
실시예 1Example 1
사람의 백혈병 임파구 세포인 U937세포(한국세포주은행 KCLB No. 21593)를 10% FBS을 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 세포배양은 37℃에서 5% CO2를 함유하는 배양기에서 수행하였다. 이렇게 준비된 세포에 0.01, 0.1, 0.5, 1 mM의 여러 농도의 메틸사이오아데노신을 4일 동안 처리하여 세포 성장과 생존율을 트립판 블루 세포내 흡수 거부반응을 이용하여 측정한 결과를 다음 표1에 나타냈다. U937 cells (Korea Cell Line Bank KCLB No. 21593), which are human leukemia lymphocytes, were cultured in RPMI1640 medium containing 10% FBS . Cell culture was performed in an incubator containing 5% CO 2 at 37 ° C. The prepared cells were treated with various concentrations of methylcyanoadenosine at 0.01, 0.1, 0.5, and 1 mM for 4 days, and the cell growth and survival rate were measured using Trypan Blue intracellular uptake rejection. Indicated.
[표 1]TABLE 1
분열하는 U937 세포주의 생존율에 미치는 메틸사이오아데노신의 영향Effect of Methylcyanoadenosine on Survival of Dividing U937 Cell Lines
실험결과 메틸사이오아데노신는 세포증식 억제 및 세포사멸을 유발시켰다. 메틸사이오아데노신 농도 0.01 mM까지는 U937세포의 증식에 어떠한 영향도 관찰되지 않았다. 그러나 메틸사이오아데노신의 농도가 0.1 mM인 경우 80%의 세포성장억제가 이루어졌다.Methylcyanoadenosine induced cell proliferation inhibition and cell death. No effect was observed on the proliferation of U937 cells up to 0.01 mM methylcyanoadenosine concentration. However, when the concentration of methylthio adenosine was 0.1 mM, cell growth inhibition of 80% was achieved.
세포 생존율은 메틸사이오아데노신 농도가 0.1 mM가지는 큰 영향을 주지 않았으나 농도가 0.5 mM에서 4일간 처리 후에는 생존율이 57%밖에 되지 않았다. 메틸사이오아데노신의 농도를 1 mM로 처리한 경우에서는 4일째 세포의 82%가 죽었다. 그러므로 메틸사이오아데노신가 분열하는 세포에서 사멸을 유발함을 알았으며 그 방식이 양에 의존함을 보이는 것으로 판단된다. The cell survival rate was not significantly affected by the concentration of methylcyanoadenosine at 0.1 mM, but the survival rate was only 57% after 4 days treatment at 0.5 mM. At 1 mM of methylcyanoadenosine, 82% of the cells died on day 4. Therefore, it was found that methylcyanoadenosine causes death in dividing cells, and the method seems to be dependent on the amount.
실시예 2Example 2
실시예1에서는 빠르게 분열하는 세포에 메틸사이오아데노신을 처리한 결과 메틸사이오아데노신 농도 0.5 mM에서부터 뚜렷한 세포사멸을 유도함을 보여 주었기 때문에 분열하지 않는 신경세포에서 실제로 메틸사이오아데노신이 세포 생존에 영향이 없음을 보여주기 위해 1 mM 농도의 메틸사이오아데노신을 일차 순수 신경세포에 처리하였다. 일차 순수 신경세포 배양은 임신 15일의 생쥐 배자를 이용하며, 수술현미경하에서 쥐 배자로부터 뇌를 적출한 후, 뇌막을 조심스럽게 제거하고 대뇌피질 부위를 해부하여 0.09% 트립신용액에 넣은 후 37℃ 배양기에 30분간 배양하였다. 한 배양용기에 3.5 대뇌반구의 밀도로 5% FBS를 준비한 후 세포 현탁액을 배양용기에 준비한다. 세포 배양 한지 24시간 후에 60%의 배지를 미리 준비해 놓은 GCM (glial conditioned medium)과 3 uM의 Ara-C용액으로 바꾼다. 배양 시작 10일 후에 실험에 사용하였다. 세포 생존율은 락테이트 탈수소효소(LDH) 활성법과 형태학적 분석법을 이용하여 관찰하였다. 그의 결과는 하기 표2와 도 1에 나타나 있다.In Example 1, the treatment of methylcyanoadenosine on rapidly dividing cells showed that induction of apoptosis from the concentration of methylcyanoadenosine at 0.5 mM, so methylthioadenosine actually affected cell survival in non-dividing neurons. Methylcyanoadenosine at 1 mM concentration was treated in primary neural cells to show this absence. Primary neural cell cultures were performed using mouse embryos at 15 days of gestation, and after brain extraction from mouse embryos under a surgical microscope, the brain membranes were carefully removed, the cerebral cortex was dissected and placed in 0.09% trypsin solution, followed by 37 ° C incubator. Incubated for 30 minutes. After preparing 5% FBS at a density of 3.5 cerebral hemispheres in one culture vessel, the cell suspension is prepared in the culture vessel. After 24 hours of cell culture, 60% of the medium is changed to a preconditioned GCM (glial conditioned medium) and 3 uM of Ara-C solution. Ten days after the start of the culture was used for the experiment. Cell viability was observed using lactate dehydrogenase (LDH) activity and morphological analysis. The results are shown in Table 2 below and in FIG. 1.
[표 2]TABLE 2
시간별로 정상대조군과 메틸사이오아데노신 농도 1 mM 처리한 신경세포에서의 세포사멸 비교분석Comparison of Apoptosis in Normal Control and Methylcyanoadenosine-treated Neurons by Time
실험결과 메틸사이오아데노신을 처리하지 않은 신경세포와 1 mM 농도로 처리 한 신경세포는 시간이 지나도 정상대조군과 비교하여 큰 생존율에 차이를 보이지 않았다. 따라서 이 농도로 메틸사이오아데노신을 처리하면 신경세포와 비신경세포를 충분히 선별하여 배양할 수 있을 것으로 판단된다.Experimental results showed that there was no difference in survival rate between the neurons without methylcyanodenosine treatment and those treated with 1 mM concentration compared to the normal control group over time. Therefore, the treatment of methylcyanoadenosine at this concentration is considered to be able to sufficiently select and culture neurons and non-neuronal cells.
또한, 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 메틸사이오아데노신을 처리하지 않은 정상대조군과 1 mM 농도로 48시간 처리한 신경세포의 현미경을 통한 조직학적 변화는 거의 관찰되지 않았다.In addition, as can be seen in Figure 1, the histological changes through the microscope of the normal control group not treated with methylthio adenosine and neurons treated at 1 mM concentration for 48 hours was hardly observed.
실시예 3Example 3
메틸사이오아데노신의 항균 효과 검증을 위해 디스크 확산법을 실시하였다.Disc diffusion was performed to verify the antibacterial effect of methylthio adenosine.
그람 양성 표준 균주로는 S.aureus ATCC 29231, S.pyogens ATCC 8668, 그람 음성 표준 균주로는 P.aeruginosa ATCC27853를 사용하였으며 증균용 배지에 키운 각각의 균주를 0.9% 생리식염수에 표준탁도액의 농도와 같도록 희석하였다. 농도를 맞춘 균 희석액에 15분이내로 멸균된 면봉을 충분히 적시어 표면이 마른 한천평판배지 위에 균액이 적셔진 면봉을 문질러 고루 접종하였다. 평판 뚜껑을 닫고 3~5분 동안 방치하여 표면의 습기가 흡수되도록 한다. 10mM 메틸사이오아데노신 100㎕를 Blank 디스크에 천천히 떨어뜨린 후 클린벤치 내에서 충분히 건조하여 메틸사이오아데노신 디스크를 제조하였다. 멸균된 핀셋를 이용하여 대조 항생제 디스크와 제조한 메틸사이오아데노신 디스크를 균이 골고루 접종된 한천 평판 위에 놓고 디스크 중앙을 가볍게 물러 한천 표면에 완전히 밀착시킨 후 디스크를 놓은 평판은 37℃에서 배양시켰다. 16~18시간 배양 후 눈금자 등을 이용하여 발육억제대 직경을 측정하여 기록하였다. 그의 결과는 하기 표3과 같다. A Gram-positive strains are S.aureus ATCC 29231, S.pyogens ATCC 8668, gram-negative strains as was used for P.aeruginosa ATCC27853 increase each of the strain of 0.9% saline to the concentration of the turbidity standard solution grown in medium gyunyong Dilute to The sterilized cotton swabs were sufficiently moistened within 15 minutes in the diluted bacterial dilution solution, and then inoculated evenly by rubbing a cotton swab moistened with the bacterial solution on a dry agar plate medium. Close the plate lid and let it stand for 3 to 5 minutes to let the surface absorb moisture. 100 μl of 10 mM methylthio adenosine was slowly dropped on a blank disk, and then dried sufficiently in a clean bench to prepare a methyl cyano adenosine disk. Using a sterilized tweezers, the control antibiotic disc and the prepared methylcyanodenosine disc were placed on the agar plate evenly inoculated with the bacteria, lightly backed off the center of the disc and completely adhered to the agar surface. After 16 to 18 hours of incubation, the diameter of the growth inhibition zone was measured using a ruler or the like. The results are shown in Table 3 below.
[표 3]TABLE 3
그람 양성균과 그람 음성균에 있어서의 메틸사이오아데노신 항균 효과 결과Methylcyanoadenosine antibacterial effect result in gram positive bacteria and gram negative bacteria
상기 표3에서 a는 Sensitive, b는 Resistance, c는 발육억제대 직경 (mm)를 나타낸다.In Table 3, a represents a Sensitive, b represents a Resistance, and c represents a growth inhibition zone diameter (mm).
실험 결과 메틸사이오아데노신이 그람 양성균과 그람 음성균에 대해 효과가 있다는 것을 확인하였다.Experimental results showed that methylcyanoadenosine was effective against gram positive and gram negative bacteria.
본 발명의 방법은 기존의 신경세포의 선택 배양에 사용했던 화합물과 다른 기전을 통해 이루어지고, 신경세포에 미치는 유해성도 적을 뿐 아니라 박테리아 오염을 방지해 주는 항생제 기능도 포함되어 있어 세포배양에 있어 비용절감의 효과가 있을 것이다.The method of the present invention is carried out through a different mechanism from the compound used for the selective culture of neurons, and has a low harmful effect on neurons and also includes an antibiotic function that prevents bacterial contamination. There will be savings.
Claims (6)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020000043807A KR100651170B1 (en) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | Method for primary pure neuronal culture using methylthioadenosine |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020000043807A KR100651170B1 (en) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | Method for primary pure neuronal culture using methylthioadenosine |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20020010037A KR20020010037A (en) | 2002-02-02 |
KR100651170B1 true KR100651170B1 (en) | 2006-11-30 |
Family
ID=19680621
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020000043807A KR100651170B1 (en) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | Method for primary pure neuronal culture using methylthioadenosine |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR100651170B1 (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61171423A (en) * | 1985-01-24 | 1986-08-02 | Advance Res & Dev Co Ltd | Drug for alleviating dental caries and periodontosis |
JPH05184356A (en) * | 1992-01-17 | 1993-07-27 | Fujitsu Ltd | Medium and culture method for nerve tissue of invertebrate |
KR20010069066A (en) * | 2000-01-12 | 2001-07-23 | 이종원 | Culturing Method Which Allows Growth of Animal Cells Under Hypoxic Condition |
-
2000
- 2000-07-28 KR KR1020000043807A patent/KR100651170B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61171423A (en) * | 1985-01-24 | 1986-08-02 | Advance Res & Dev Co Ltd | Drug for alleviating dental caries and periodontosis |
US4948783A (en) * | 1985-01-24 | 1990-08-14 | Kabushiki Kaisya Advance Kaihatsu Kenkyujo | Anticariogenic or antiperidontitic method |
JPH05184356A (en) * | 1992-01-17 | 1993-07-27 | Fujitsu Ltd | Medium and culture method for nerve tissue of invertebrate |
KR20010069066A (en) * | 2000-01-12 | 2001-07-23 | 이종원 | Culturing Method Which Allows Growth of Animal Cells Under Hypoxic Condition |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Exp Cell Res Vol.240(2):282-292 (1998) * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20020010037A (en) | 2002-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Trager et al. | Plasmodium falciparum: antimalarial activity in culture of sinefungin and other methylation inhibitors | |
Globus et al. | Effect of apical epidermal cap on mitotic cycle and cartilage differentiation in regeneration blastemata in the newt, Notophthalmus viridescens | |
Goldschmidt et al. | The effect of vancomycin powder on human dural fibroblast culture and its implications for dural repair during spine surgery: presented at the 2016 AANS/CNS joint section on disorders of the spine and peripheral nerves | |
JP2002518990A5 (en) | ||
CN108531448A (en) | A kind of human mesenchymal stem cell is at chondrocyte induction differential medium and preparation method | |
JP3573941B2 (en) | Composition having hyaluronidase inhibitory activity and cosmetic containing the composition | |
KR100651170B1 (en) | Method for primary pure neuronal culture using methylthioadenosine | |
CN101104845A (en) | Use of protocatechuic acid in accelerating nerve stem cell multiplication in vitro and inducement differentiation | |
Speit et al. | Characterization of sister chromatid exchange induction by hydrogen peroxide | |
Sharma et al. | Acrylamide cytotoxicity in chick ganglia cultures | |
RU2391399C2 (en) | Method of preparing skin cell matrix | |
Kress et al. | Sites of cytoplasmic ribonucleoprotein-filament assembly in relation to helical body formation in axenic trophozoites of Entamoeba histolytica | |
Bradley et al. | One step antibiotic disk method for obtaining axenic cultures of multicellular marine algae | |
Raghavan et al. | Inhibition of two‐dimensional growth and suppression of ribonucleic acid and protein synthesis in the gametophytes of the fern, Asplenium nidus, by chloramphenicol, puromycin and actinomycin D | |
Danielyan | Subcomponents of vitamine B complex regulate the growth and development of human brain derived cells | |
LEON et al. | Effect of Berenil on growth, mitochondrial DNA and respiration of Leishmania tarentolae promastigotes | |
Szweykowska et al. | The cell division response to cytokinins in isolated cell cultures of the protonema of Funaria hygrometrica and its comparison with the bud induction response | |
Serdar Öztürk et al. | The effects of gentamicin on the activities of glutathione peroxidase and superoxide dismutase enzymes and malondialdehyde levels in heart tissues of guinea pigs | |
White | The morphological effects of protein synthesis inhibition in Marsilea | |
Soldo | Cultivation of two strains of killer Paramecium aurelia in axenic medium. | |
CN107648253A (en) | A kind of basic element of cell division causes the application of human leukemia cell's apoptosis by nucleoside transporting body | |
Rama et al. | Effect of hyperthemia in combination with vitamin E and cyclic amp on neuroblastoma cells in culture | |
Kudrna et al. | Survival of apurinic SV40 DNA in the D-complementation group of xeroderma pigmentosum | |
Eguchi et al. | Simulation of Somatic Embryogenesis in Anise (Pimpinella anisum) Using Fish Protein Hydrolysates and Proline | |
Moradi et al. | Osteogenic differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells by phycocyanin and phycoerythrin pigments isolated from Spirulina platensis and Gracilaria gracilis algae |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
N231 | Notification of change of applicant | ||
A201 | Request for examination | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20121015 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131023 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141125 Year of fee payment: 9 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151123 Year of fee payment: 10 |
|
LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |