KR100645995B1 - Bacillus sp.hm-6 for ripening cheongkukjang - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 본 발명에 따른 신규발효균 바실러스 에스피 HM-6이 주입된 청국장이 발효되는 동안 알파-아밀라제와 프로테아제의 활동, pH 및 총균수의 변화를 정리한 그래프.1 is a graph summarizing changes in activity, pH and total bacterial counts of alpha-amylase and protease during fermentation of Cheonggukjang injected with novel fermented Bacillus sp. HM-6 according to the present invention.
도 2는 본 발명에 따른 신규발효균 바실러스 에스피 HB-7이 주입된 청국장이 발효되는 동안 알파-아밀라제와 프로테아제의 활동, pH 및 총균수의 변화를 정리한 그래프. Figure 2 is a graph summarizing the changes in the activity, pH and total bacterial counts of alpha-amylase and protease during fermentation of Cheonggukjang injected with novel fermented bacterium Bacillus sp. HB-7 according to the present invention.
도 3은 본 발명에 따른 신규발효균 바실러스 에스피 HB-9이 주입된 청국장이 발효되는 동안 알파-아밀라제와 프로테아제의 활동, pH 및 총균수의 변화를 정리한 그래프.Figure 3 is a graph summarizing the changes in activity, pH and total bacterial counts of alpha-amylase and protease during fermentation of Cheonggukjang injected with novel fermented bacterium Bacillus sp. HB-9 according to the present invention.
도 4은 종래의 발효균이 주입된 청국장이 발효되는 동안 알파-아밀라제와 프로테아제의 활동, pH, 및 총균수의 변화를 정리한 그래프.Figure 4 is a graph summarizing changes in activity, pH, and total bacterial counts of alpha-amylase and protease during fermentation of the conventional fermented fungus Chungkukjang.
도 5는 본 발명에 따른 신규발효균 바실러스 에스피 HM-6이 주입된 청국장이 발효되는 동안의 사진.Figure 5 is a photograph of the fermentation of the new fermented Bacillus sp. HM-6 injection in accordance with the present invention.
도 6은 본 발명에 따른 신규발효균 바실러스 에스피 HM-6이 주입된 청국장이 발효되는 동안의 사진.Figure 6 is a photograph of the fermentation of the new fermented Bacillus sp. HM-6 injection in accordance with the present invention.
도 7은 본 발명에 따른 신규발효균 바실러스 에스피 HM-6이 주입된 청국장이 발효되는 동안의 사진.Figure 7 is a photograph of the fermentation of the new fermented Bacillus sp. HM-6 injection in accordance with the present invention.
도 8은 본 발명에 따른 신규발효균 바실러스 에스피 HM-6이 주입된 청국장이 발효되는 동안의 사진.Figure 8 is a photograph of the fermentation of the new fermented Bacillus sp. HM-6 injection in accordance with the present invention.
본 발명은 청국장 발효용 균주에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한국의 전통방식으로 제조된 청국장에서 분리되어 발효능이 우수한 신규한 발효균주 바실러스 에스피 HM-6에 관한 것이다. The present invention relates to a strain for fermenting Cheonggukjang, and more particularly, to a new fermented strain Bacillus sp. HM-6, which is isolated from Cheonggukjang prepared in the traditional manner of Korea and has excellent fermentation ability.
청국장은 한국의 전통발효법에 의해 생산되는 식품으로 영양이 풍부하여 널리 이용되며, 최근에는 청국장에 대한 연구가 활발히 진행되어 청국장이 혈액순환개선, 정장작용, 항산화, 항암, 면역증강, 비만조절, 혈압강하등의 효과가 있음이 보고되고 있다.Cheonggukjang is a food produced by traditional Korean fermentation. It is rich in nutrition and widely used. Recently, research on Cheonggukjang has been actively conducted, and Cheonggukjang has improved blood circulation, intestinal action, antioxidant activity, anti-cancer, immune enhancement, obesity control, and blood pressure. It is reported that there are effects such as descent.
그러나, 청국장은 우리 몸에 좋다는 인식에도 불구하고, 고유의 불취감으로 인해 젊은 세대나 비위가 좋지 않은 사람들에게는 외면되는 문제점이 있어 왔다. 이를 해소하기 위한 방법으로, 청국장에서 청국장 고유의 냄새를 제거하기 위한 다른 식품을 혼합하거나, 청국장의 발효방법등을 변경하는 등의 개선이 있어 왔으나, 이러한 개선으로는 청국장의 고유의 맛과 향기를 유지하면서도, 역한 냄새를 감소시키고, 갈변물질을 다량 함유하는 청국장을 제공하기에 본질적 한계가 있었다. However, despite the perception that Cheonggukjang is good for our bodies, there has been a problem that the young generation or the poor people are neglected due to its inherent odor. In order to solve this problem, there have been improvements such as mixing other foods to remove the unique smell of Cheonggukjang or changing fermentation method of Cheonggukjang. While maintaining, there was an inherent limitation to reducing adverse odors and providing Cheonggukjang containing large amounts of browning material.
한편, 한국특허공개공보 공개번호 제 특 2001-0075562호에는 식품발효를 위한 바실러스 서브틸리스균의 신규한 균주를 개시하고 있으나, 이는 콩류의 발효시 발생하는 자극적인 냄새에 영향을 미친다고 추정되는 이소-발데르산을 합성하지 않도록 변형된 균주이다. 따라서, 본원발명과 같이 천연에서 존재하면서도 그 효과면에서는 종래의 어떠한 균주보다 뛰어난 신규한 발효균에 대한 발견이 강력히 요청되고 있었다. On the other hand, Korean Patent Publication No. 2001-0075562 discloses a new strain of Bacillus subtilis bacteria for food fermentation, but iso is believed to affect the irritating odor generated during the fermentation of legumes It is a strain modified to not synthesize valderic acid. Therefore, there has been a strong demand for the discovery of novel fermentation bacteria that exist in nature as well as superior to any conventional strains in view of the present invention.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 제 1 목적은 효소활성이 높으며, 갈변물질을 많이 형성하고, 청국장의 맛, 향기를 우수하게 발효시키는 신규한 발효균을 제공하는 것이다. The present invention has been made to solve the above problems, the first object of the present invention is to provide a novel fermentation bacteria having high enzyme activity, forming a lot of browning material, excellent fermentation of taste and aroma of Cheonggukjang .
또한, 본 발명의 제 2 목적은 신규한 발효균으로 발효되어 맛, 향기가 우수하며 역겨운 냄새가 감소되며, 갈변물질을 다량 함유하는 청국장을 제공하는 것이다.In addition, the second object of the present invention is to ferment with a novel fermentation bacteria, excellent in taste, aroma, and disgusting smell is reduced, and to provide a cheongukjang containing a large amount of browning material.
본 발명에 따른 균주는 형태학적, 생리학적, 화학분류학적 특성을 관찰하여 분석한 결과 바실러스(Bacillus subtilis)로 동정되었다. 이하에서는 본 균주의 형태학적, 생리학적, 화학분류적 특성을 설명한다.The strain according to the present invention was identified as Bacillus subtilis by analyzing the morphological, physiological and chemical classification characteristics. Hereinafter, the morphological, physiological and chemical classification characteristics of the strain will be described.
(1) 형태학적 특성(1) morphological characteristics
본 균주는 긴 막대형의 그람 양성의 세균이다. This strain is a long rod gram positive bacteria.
(2) 생리학적 특성(2) physiological characteristics
본 균주는 인돌생산 음성, 메틸레드 음성, V-P 테스트 음성, 전분 가수분해 양성, 젤라틴 가수분해 양성, 카탈라제 생산 양성, 옥시다제 생산 음성, 시몬의 시트르산 이용 양성, 황화수소의 생성 음성, 리트머스·밀크 음성을 나타낸다.This strain contains indole production negative, methyl red negative, VP test negative, starch hydrolysis positive, gelatin hydrolysis positive, catalase production positive, oxidase production negative, Simon's citric acid use positive, hydrogen sulfide production negative, litmus milk negative Indicates.
(3) 화학분류적 특성(3) Chemical Classification
본 균주의 16S rRNA유전자 염기서열을 분석결과 바실러스 서브틸리스의 유전자의 염기서열과 일치하였다. The 16S rRNA gene sequence of the strain was consistent with that of the Bacillus subtilis gene.
상술한 바와 같은 특성을 가진 본 균주는 바실러스 에스피 HM-6(Bacillus sp.HM-6)로 명명되었으며, 2005년 4월 28일자로 농업생명공학연구원에 기탁되었다(수탁번호 KACC 91162P).This strain having the characteristics as described above was named Bacillus sp. HM-6 ( Bacillus sp. HM-6), and deposited on April 28, 2005 to the Institute of Agricultural Biotechnology (Accession Number KACC 91162P).
상술한 바와 같은 본 균주는 청국장을 발효시키는 데 있어서, 총균수, 갈변, 효소활성, 관능검사에서 종래에 알려진 균주보다 뛰어난 능력을 보였다. As described above, the present strains showed superior ability in fermenting Cheonggukjang, compared with conventionally known strains in total bacterial count, browning, enzyme activity, and sensory test.
이하에서는 본 발명에 따른 균주를 바실러스 서브틸리스에 속하는 다른 균주와 대비하여 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the strain according to the present invention will be described in more detail in comparison with other strains belonging to Bacillus subtilis.
[실시예 1] 균주의 분리 및 배양Example 1 Isolation and Culture of Strains
한국 충남지역에서 한국의 전통방법에 의해 제조된 청국장을 채취하여 원심분리용 튜브에 1 g의 청국장 시료와 5ml 생리식염수에 넣고 진탕배양기에 2시간 방치하였다. 배양기에서 꺼낸 튜브로부터 100 ㎕의 청국장 현탁액을 NA 평판배지에 도말하고 37℃에서 48 시간동안 배양하여 각각 HM-4, HM-5, HM-6, HB-7, HB-8, HB-9로 명명한 단일세균을 분리하였다. 이들 분리세균 가운데 관능실험을 통하여 우수한 평가를 받은 HM-6, HB-7, HB-9를 청국장 생산 균주으로 이용하기 위하여 특성조 사를 실시하였다. 이들 분리세균은 접종 균주로 사용하기 위하여, NB 배지에 접종하여 40℃에서 분당 160 회로 회전하는 진탕배양기에서 배양하였다. 또한, 비교를 위하여 상기 균주들과는 별도로 준비된 바실러스 서브틸리스로 동정되는 종래의 바실러스 나또 균(이하, 종래 나또균)의 특성도 같이 비교하였다.Cheonggukjang prepared by traditional Korean methods in Chungnam, Korea, was collected and placed in 1 g of Cheonggukjang samples and 5ml physiological saline in a centrifuge tube and left for 2 hours in a shaker incubator. 100 μl of Cheonggukjang suspension from the tube taken out of the incubator was plated on NA plate medium and incubated for 48 hours at 37 ° C. to HM-4, HM-5, HM-6, HB-7, HB-8 and HB-9, respectively. Named single bacteria were isolated. Among these isolates, HM-6, HB-7, and HB-9, which were excellently evaluated through sensory experiments, were used for the production of Cheonggukjang. These isolates were inoculated in NB medium to be used as inoculation strains and cultured in a shaker incubator rotated 160 times per minute at 40 ° C. In addition, for comparison, the characteristics of the conventional Bacillus natto bacteria (hereinafter, referred to as natto bacteria) identified as Bacillus subtilis prepared separately from the strains were also compared.
[실시예 2] 분리된 균주의 특성분석Example 2 Characterization of Isolated Strains
분리 균주를 LB 고체 평판 배지에 도말하여 단일 집락의 형태학적 관찰을 하였고, 그람 염색 후 위상차 현미경으로 세균의 형태학적 특성을 조사하였다. 분리 세균의 생리 화학적 특성을 조사하기 위하여 글루코스(glucose)이용여부, 메틸 레드-보게스 프로스카우어(methyl red-voges proskauer;MR-VP) 시험, 시트르산(citrate)과 녹말의 이용여부, 인돌(indole) 생성유무, 클링거 아이론 아가(Klingler iron agar;KIA) 시험, 젤라틴(gelatin) 이용여부, 우레아제(urease) 존재여부, 리트머스·밀크(lithmus milk)시험 등을 실시하였다. 탄소원으로 1% 글루코스가 포함된 액체배지에 분리된 세균을 접종한 후, 색의 변화를 관찰하였으며, 0.5% 글루코스가 포함된 MR-VP 배지에 분리 세균을 접종한 후 MR 배지에서는 pH 지시약인 메틸레드를 3방울 떨어뜨리고, VP 배지에는 α-나프톨(naphthol) 12방울과 40% KOH 6방울을 첨가 후 색깔 변화를 관찰하였다. 분리 세균의 시트르산 이용여부를 조사하기 위하여 시몬의 시트르산(Simmon's citrate) 고체 평판배지(Difco, Detroit, MI, USA)에 분리세균을 접종한 후, 배지의 색의 변화를 관찰하였고, 녹말의 분해여부를 알아보기 위하여 녹말 고체평판배지에 세균을 접종하고 그람 요오드 용액을 첨가하여 집락 주위에서 투명대 형성여부를 관찰하였다. 인돌 생성 시험은 1% 펩톤(peptone)이 포함된 트립톤(tryptone) 액체배지에 균주를 접종한 후, 20방울의 코박(Kovac) 시약을 첨가하여 시험관을 가볍게 흔들어 주면서 배지의 색 변화를 관찰하였다. H2S의 생성은 KIA (Difco, Detroit, MI, USA)에 균주를 접종한 후, 고체배지 표면의 색 변화를 관찰하였으며, 젤라틴(gelatin) 평판배지에 균주를 접종한 후, HgCl2를 첨가하여 집락 주위에 투명대 형성을 관찰하였고 우레아제(urease) 생성 여부는 색의 변화를 관찰하였다. 리트머스·밀크(Lithmus milk) 시험은 리트머스·밀크(Difco, Detroit, MI, USA)에 균주를 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후 펩톤화(peptonization)를 관찰하였다.The isolated strains were plated on LB solid plate medium for morphological observation of single colonies, and the morphological characteristics of bacteria were examined by phase contrast microscopy after gram staining. Use of glucose, methyl red-voges proskauer (MR-VP) test, use of citric acid and starch, indole to investigate the physiological and chemical properties of isolated bacteria ) Production, Klinger iron agar (KIA) test, gelatin (gelatin) availability, the presence of urease (lithmus milk) test was performed. After inoculation of isolated bacteria into a liquid medium containing 1% glucose as a carbon source, the change of color was observed, and after inoculating the isolated bacteria in MR-VP medium containing 0.5% glucose, the pH indicator methyl in the MR medium was observed. 3 drops of red were dropped, and 12 drops of α-naphthol and 6 drops of 40% KOH were added to the VP medium. In order to investigate the use of citric acid by the isolated bacteria, after inoculating the bacterial isolate on Simon's citrate solid plate medium (Difco, Detroit, MI, USA), the color of the medium was observed and the starch was degraded. In order to investigate the inoculation of bacteria into the starch solid plate medium and the addition of Gram iodine solution to observe the formation of a zona pellucida around the colony. Indole production test was inoculated with tryptone liquid medium containing 1% peptone, and then 20 drops of Kovac reagent were added to gently shake the test tube to observe the color change of the medium. . The production of H 2 S was inoculated with the strain to KIA (Difco, Detroit, MI, USA), the color change of the surface of the solid medium was observed, and after inoculating the strain on gelatin plate medium, HgCl 2 was added. The formation of the zona pellucida was observed around the colonies, and the change in color was observed for the production of urease. Lithmus milk (Lithmus milk) test was inoculated with the strain in litmus milk (Difco, Detroit, MI, USA) and incubated for 48 hours at 37 ℃ observed peptonization (peptonization).
표 1, 표 2, 표 3, 표 4는 각각 HM-6, HB-7, HB-9, 및 종래 나또균의 형태학 및 생리학적 특성을 정리한 표이다.Table 1, Table 2, Table 3, and Table 4 summarize the morphological and physiological characteristics of HM-6, HB-7, HB-9, and conventional natto bacteria, respectively.
또한, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8은 미국 바이오로그(BIOLOG)사의 시스템을 이용하여 각각 HM-6, HB-7, HB-9, 및 종래 나또균의 다양한 탄소원 이용여부를 확인하는 시험결과를 정리한 표이다.In addition, Table 5, Table 6, Table 7, Table 8 shows the use of various carbon sources of HM-6, HB-7, HB-9, and conventional natto bacteria, respectively, using a system of the US Biolog (BIOLOG) This table summarizes the test results.
[실시예 3] 총균수, pH변화 및 갈변물질측정Example 3 Measurement of Total Bacteria, pH Change and Browning Substance
발효중인 청국장으로부터 주기적으로 샘플을 채취하여 총균수와 pH의 변화를 측정하였다. 청국장 시료 1g을 생리식염수 5ml에 넣어 현탁시킨 후, 연속희석 방법으로 평판 도말하여 측정하였다. pH는 청국장 현탁액에 대하여 측정하였다. Samples were taken periodically from the fermented Cheonggukjang to measure changes in total bacterial counts and pH. 1g of Cheonggukjang samples were placed in 5 ml of saline solution and suspended, and then plated and measured by continuous dilution method. pH was measured for the Cheonggukjang suspension.
당 성분과 아미노산의 반응에 의해 생성되는 갈변물질의 농도를 결정하기 위해여 24시간 간격으로 갈변물질을 측정하였다. 청국장 10g을 증류수 50㎖에 2시간 동안 교반한 후, 4℃에서 16,600 ×g으로 원심분리하였다. 상등액을 0.8 ㎛ 막필터에 여과시켜 상등액을 각각 390 nm와 500 nm에서 흡광도를 측정하여 갈변도를 결정하였다.Browning materials were measured at 24 hour intervals to determine the concentration of browning materials produced by the reaction of sugar components and amino acids. 10 g of Cheonggukjang were stirred in 50 ml of distilled water for 2 hours, and then centrifuged at 16,600 × g at 4 ° C. The supernatant was filtered through a 0.8 μm membrane filter and the supernatant was measured for absorbance at 390 nm and 500 nm, respectively, to determine browning degree.
표 9는 HM-6을 청국장에 주입하여 96시간동안 매 24시간 마다 발효총균수(CFU/g), pH, 갈변물질에 있어서 변화를 나타낸 표이다.Table 9 shows the changes in total fermented bacterial counts (CFU / g), pH, and browning substances every 24 hours for 96 hours after injecting HM-6 into Cheonggukjang.
표 10은 HB-7을 청국장에 주입하여 96시간동안 매 24시간 마다 발효총균수(CFU/g), pH, 갈변에 있어서 변화를 나타낸 표이다.Table 10 is a table showing the change in the total fermentation bacteria count (CFU / g), pH, browning every 24 hours for 96 hours by injecting HB-7 into Cheonggukjang.
표 11은 HB-9를 청국장에 주입하여 96시간동안 매 24시간 마다 발효총균수(CFU/g), pH, 갈변물질에 있어서 변화를 나타낸 표이다.Table 11 shows the changes in total fermented bacterial counts (CFU / g), pH, and browning substances every 24 hours for 96 hours after injection of HB-9 into Cheonggukjang.
표 12는 종래 나또균을 청국장에 주입하여 96시간동안 매 24시간 마다 발효총균수(CFU/g), pH, 갈변물질에 있어서 변화를 나타낸 표이다.Table 12 is a table showing the change in the total fermentation bacteria count (CFU / g), pH, browning material every 24 hours for 96 hours to inject the conventional natto bacteria in Cheonggukjang.
표 8 내지 표 12에 따르면, 초기 접종시의 세균에서 총균수에 있어서 차이가 있었으나 시간이 경과하면서 커다란 차이는 없었다. 접종후 96시간 후 총균수면에서 HB-7이 가장 많았으며, 종래 나또균, HM-6, HB-9의 순으로 나타났다. 갈변현상에서는 HM-6에서 가장 높은 수치를 나타냈으며, 그 다음으로 HB-9과 HB-7 순이었고, 종래 나또균은 가장 낮았다. pH는 전체적으로 콩의 분해에 의한 질소화합물의 생성으로 pH는 8.57-8.59의 알칼리성을 나타내었다. According to Tables 8 to 12, there were differences in the total number of bacteria in the bacteria at the initial inoculation, but there was no significant difference over time. In 96 hours after inoculation, HB-7 was the highest in total bacterial sleep, followed by Nato bacteria, HM-6, and HB-9. The browning phenomenon was the highest in HM-6, followed by HB-9 and HB-7, and Nato bacteria was the lowest. The pH of the whole showed the alkalinity of 8.57-8.59 due to the generation of nitrogen compounds by the decomposition of soybean.
[실시예 4] 효소활성 측정 Example 4 Enzyme Activity Measurement
(1) 알파-아밀라제(α-Amylase) 활성 : 청국장에서 분리한 세균들의 알파-아밀라제의 활성을 측정하기 위하여 24시간 간격으로 효소활성을 측정하였다. 청국장 10g을 증류수 50㎖에 2시간 동안 교반한 후, 4℃ 13,000×rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 0.8㎛ 막필터(Advantec Inc, Plaeasanton, CA, USA) 에 여과한 후, 이 용액을 조효소로 사용하였다. 1% 가용성 전분(Sigma Co., St. Louis, Mo, USA) 용액에 조효소 100㎕와 증류수 900㎕를 혼합하여 첨가하고, 30℃에서 5분 동안 반응시켰다. 반응을 멈추기 위해 0.5M 아세트산 10㎖를 첨가하고, 1/300N 요오드 용액 1㎖와 멸균된 증류수 5 ㎖를 첨가하였다. 발색 정량은 분광광도계(V-550 UV/Vis Spectrophotometer, Jasco Co., Japan)을 사용하여 620nm에서 측정하였고, 가용성 전분용액을 표준품으로 사용하여 미리 작성한 검량선으로부터 잔존 가용성 전분의 양을 측정하였다. 대조군에 사용된 증류슈는 100℃에서 30분간 끊인 후 사용하였고, 아밀라제의 1 unit는 조효소 1㎖에 의해 40℃에서 30분 동안 1mg의 전분을 가수분해하는 효소의 양으로, 고유활성(specific activity)은 unit/g으로 정하였다.(1) Alpha-amylase activity: To measure the alpha-amylase activity of bacteria isolated from Cheonggukjang, enzyme activity was measured at 24 hour intervals. 10 g of Cheonggukjang were stirred in 50 ml of distilled water for 2 hours, and then centrifuged at 13,000 × rpm. The supernatant was filtered through a 0.8 μm membrane filter (Advantec Inc, Plaeasanton, Calif., USA), and this solution was used as coenzyme. 100 μl of coenzyme and 900 μl of distilled water were added to a 1% soluble starch (Sigma Co., St. Louis, Mo, USA) solution and reacted at 30 ° C. for 5 minutes. To stop the reaction, 10 ml of 0.5 M acetic acid was added, 1 ml of 1 / 300N iodine solution and 5 ml of sterilized distilled water were added. Color quantitation was measured at 620 nm using a spectrophotometer (V-550 UV / Vis Spectrophotometer, Jasco Co., Japan), and the amount of remaining soluble starch was measured from a calibration curve prepared in advance using a soluble starch solution as a standard. The distilled shoe used as a control group was used after cutting for 30 minutes at 100 ° C. One unit of amylase was an amount of enzyme that hydrolyzed 1 mg of starch at 40 ° C for 30 minutes by 1 ml of coenzyme. ) Was set to unit / g.
(2) 프로테아제(Protease) 활성 : 프로테아제 활성을 측정하기 위해서 기질로 밀크카세인 (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. 효소 반응은 밀크카세인(0.6%) 0.5㎖, McⅡvaine buffer 4.5㎖ (0.2M Na2HPO4 ·12H2O + 0.1M 시트르산 pH 6.0)를 반응온도인 40℃에서 10분간 수조(water bath)에서 방치한 후, 1㎖의 조효소 용액을 첨가하여 40℃에서 30분간 반응을 실시하였다. 반응액에 TCA 혼합물(0.1M 삼염화 아세트산(trichloroacetic acid), 0.2M 아세트산 나트륨(sodium acetate), 0.3M 아세트산) 5㎖을 첨가하여 반응을 정지 시켰다. 새로운 시험관에 1㎖의 반응액을 옮겨 담고, 0.5M Na2CO3 5㎖ 용액과 3배로 희석한 폴린 리전트-시오칼터스 페놀(Folin reagent -ciocalteus phenol) 1㎖을 더하고 30분간 40℃에서 방치 하였다. 이를 660 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 프로테아제 활성 1 unit은 반응시간 1분간 1㎍ 티로신(tyrosine)에 해당하는 펩티드를 생성하는 효소량으로 정의하였으며, 대조구는 30분 동안 수조에서 끓인 증류수로 하여 사용하였다. (2) Protease Activity: Milk casein (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) was used as a substrate to measure protease activity. Enzyme reaction was performed by leaving 0.5 ml of milk casein (0.6%) and 4.5 ml of McIIvaine buffer (0.2 M Na 2 HPO 4 · 12H 2 O + 0.1 M citric acid pH 6.0) in a water bath at a reaction temperature of 40 ° C. for 10 minutes. After that, 1 ml of coenzyme solution was added, and the reaction was carried out at 40 ° C for 30 minutes. 5 ml of TCA mixture (0.1 M trichloroacetic acid, 0.2 M sodium acetate, 0.3 M acetic acid) was added to the reaction solution to stop the reaction. Transfer 1 ml of the reaction solution to a new test tube, add 5 ml of 0.5 M Na 2 CO 3 solution and 1 ml of diluted 3 times Folin reagent-ciocalteus phenol and leave at 40 ° C. for 30 minutes. It was. The absorbance was measured at a wavelength of 660 nm. One unit of protease activity was defined as the amount of enzyme that produces a peptide corresponding to 1 μg tyrosine for 1 minute of reaction time, and the control was used as distilled water boiled in a water bath for 30 minutes.
(3) 리파제(Lipase)활성 : 리파제 활성 측정은 티트레이션법(titration method)에 의하여 올리브유(Sigma Co., St. Louis, MO, USA)를 기질로 하여 측정하였다. 효소 반응은 3 ml의 올리브유 혼합물[50%(v/v) 올리브유, 0.2%(w/v) 벤조산나트륨(sodium benzoate), 7.0%(w/v) 아라비아 고무(gum arabic)], 완충용액으로서 1ml의 0.2 M Tris-HCl (pH 8.0), 청국장 시료의 현탁액을 원심분리하여 얻은 상등액 1ml에 2.5ml의 증류수를 넣고 40℃의 수조에서 6시간 동안 반응 시킨 후, 3ml의 에탄올을 가하여 반응을 중지시켰다. 여기에 3~4 방울의 티모프탈레인(thymolphthalein)을 첨가한 뒤, 50mM NaOH로 적정하였다. 리파제 활성 단위는 시료에 소모된 NaOH 량에서 대조구에서 소모된 NaOH량을 뺀 값을 unit/g로 표시하였다.(3) Lipase activity : Lipase activity was measured by titration method using olive oil (Sigma Co., St. Louis, Mo., USA) as a substrate. The enzymatic reaction was carried out as a mixture of 3 ml of olive oil [50% (v / v) olive oil, 0.2% (w / v) sodium benzoate, 7.0% (w / v) gum arabic], buffer 1 ml of 0.2 M Tris-HCl (pH 8.0), 2.5 ml of distilled water was added to 1 ml of the supernatant obtained by centrifuging the suspension of the Cheonggukjang sample, and reacted in a 40 ° C. water bath for 6 hours. I was. After adding 3-4 drops of thymolphthalein, it was titrated with 50 mM NaOH. The lipase active unit was expressed as unit / g minus the NaOH consumed in the control from the NaOH consumed in the sample.
표 13은 HM-6이 주입된 청국장의 발효동안 알파-아밀라제, 프로테아제, 및 리파제의 효소활성 변화를 나타낸다. Table 13 shows the changes of enzyme activity of alpha-amylase, protease, and lipase during fermentation of Cheonggukjang injected with HM-6.
표 14는 HB-7이 주입된 청국장의 발효동안 알파-아밀라제, 프로테아제, 및 리파제의 효소활성 변화를 나타낸다. Table 14 shows the changes in enzyme activity of alpha-amylase, protease, and lipase during fermentation of Cheonggukjang injected with HB-7.
표 15는 HB-9가 주입된 청국장의 발효동안 알파-아밀라제, 프로테아제, 및 리파제의 효소활성 변화를 나타낸다.Table 15 shows the changes in enzyme activity of alpha-amylase, protease, and lipase during fermentation of Cheonggukjang injected with HB-9.
표 16은 종래 나또균이 주입된 청국장의 발효동안 알파-아밀라제, 프로테아제, 및 리파제의 효소활성을 나타낸다.Table 16 shows the enzymatic activity of alpha-amylase, protease, and lipase during fermentation of Cheonggukjang injected with conventional natto bacteria.
표 13 내지 표 16에 따르면, 효소활성은 알파-아밀라아제의 활성은 HM-6에서 가장 높았으며, 종래 나또균, HB-9, HB-7의 순서로 측정되었다. 프로테아제에서도 HM-6에서 가장 높은 활성을 나타내었고, 다음으로 HB-9, HB-7이었으며, 종래 나또균은 분리세균들의 활성보다 크게 낮은 것으로 밝혀졌다. 리파제의 활성에서도 분리세균들은 7 unit/g 으로 종래 나또균의 6.0 unit/g 보다 높았다. 알파-아밀라제의 활성은 주로 배양 72시간에서 최대 활성을 나타내었고, 프로테아제의 활성은 주로 96시간에서 최대 활성을 나타내었다. According to Tables 13 to 16, the enzyme activity of the alpha-amylase activity was the highest in HM-6, was measured in the order of conventional natto, HB-9, HB-7. Protease also showed the highest activity in HM-6, followed by HB-9 and HB-7, and the conventional natto bacteria were found to be significantly lower than the activity of the isolates. In the activity of lipase, the isolated bacteria were 7 unit / g, higher than 6.0 units / g of conventional natto bacteria. The activity of alpha-amylase was mainly maximal at 72 hours of culture, and the activity of protease was maximally at 96 hours.
추가적으로, 도 1 내지 도 4는 각각 상술한 실험예에 따라 HM-6, HB-7, HB-9, 종래 나또균이 주입된 청국장이 발효하는 동안 알파-아밀라제와 프로테아제의 활동, pH 및 총균수의 변화를 정리한 그래프이고, 도 5 내지 도 8은 HM-6, HB-7, HB-9, 종래 나또균이 주입된 청국장이 발효되는 모습을 보이는 사진이다. 도 5 내지 도 8에 따르면, 육안으로도 쉽게 종래의 나또균에 비해 HM-6등의 신규균주를 사용할 경우 발효가 잘 이루어짐을 확인할 수 있다.In addition, FIGS. 1 to 4 show the activity, pH and total bacterial count of alpha-amylase and protease during fermentation of HM-6, HB-7, HB-9, and conventional natto bacteria in accordance with the above-described experimental example. 5 to 8 are photographs showing a state in which HM-6, HB-7, HB-9, and Cheonggukjang injected with conventional natto bacteria are fermented. 5 to 8, it can be confirmed that the fermentation is well made when using new strains such as HM-6 compared to conventional natto bacteria easily with the naked eye.
[실시예 5] 청국장의 관능평가Example 5 Sensory Evaluation of Cheonggukjang
HM-6, HB-7, HB-9, 종래 나또균주를 이용하여 청국장을 제조한 후 관능검사 패널 20명을 대상으로 색, 맛, 향, 종합적인 기도호의 4개 검사항목에 대하여 5점 평점법(청국장으로서의 특성이 1 : 매우 나쁘다, 2: 비교적 나쁘다, 3 : 보통이다, 4: 비교적 좋다, 5 : 매우 좋다)으로 실시하였다. After manufacturing Cheonggukjang using HM-6, HB-7, HB-9, and conventional NATO strains, a score of 5 was given to 4 test items of color, taste, aroma, and total airway for 20 sensory test panel. It was implemented by the law (the characteristics as Cheonggukjang are 1: very bad, 2: relatively poor, 3: general, 4: relatively good, 5: very good).
관능평가 결과, 청국장의 색상은 HM-6의 선호도가 높았고 종래 나또균의 선호도가 낮았으나 각 시료간에 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 향기의 선호도 평가 결과, HM-6가 가장 높은 평점을 받았으며 각 시료간의 유의적인 차이가 인정되었다. 맛에 있어서도 역시 HM-6가 가장 높은 평점을 받았으며 HM-7>HB-9>종래 나또균 순의 선호도를 보였다. 종합적으로 보아 색, 향, 맛 그리고 전체적인 선호도의 모든 항목에서 HM-6가 가장 높은 평점을 받았고 종래의 나또균이 가장 낮았다. 따라서 청국장의 제조에 HM-6 균주를 접종균주로 하여 청국장을 발효시키는 것이 관능개선의 측면에서 효과적일 것으로 평가된다.As a result of sensory evaluation, the color of Cheonggukjang was high in preference of HM-6 and low in preference of natto bacteria, but there was no significant difference between samples. As a result of the affinity preference evaluation, HM-6 received the highest rating and significant difference between each sample was recognized. In terms of taste, HM-6 also received the highest rating, and HM-7> HB-9> Prior to NATO bacteria. Taken together, HM-6 received the highest ratings in all categories of color, aroma, taste, and overall preference, and the lowest in conventional natto bacteria. Therefore, fermenting Cheonggukjang with the HM-6 strain as the inoculation strain for the production of Cheonggukjang may be effective in terms of sensory improvement.
표 17은 상술한 각 균주별 관능평가결과를 정리한 표이다.Table 17 is a table summarizing the sensory evaluation results for each strain described above.
본 발명에 따른 신규한 발효균주 바실러스 에스피 HM-6은 청국장의 발효균으로서, 종래의 청국장 발효균이나 본 발명의 완성도중 발견한 다른 신규 발효균으로 청국장을 발효시키는 것보다, 갈변물질은 더 많고, 효소활성은 높으며, 색, 맛, 향기가 우수한 청국장을 만들어내는 효과가 있다. The new fermented strain Bacillus sp. HM-6 according to the present invention is a fermentation bacterium of Cheonggukjang, and it has more browning material and fermentation activity than fermenting Cheonggukjang with conventional Cheonggukjang fermentation bacteria or other new fermentation bacteria found during the completion of the present invention. Is high and has the effect of making Cheonggukjang excellent in color, taste and aroma.
전술한 발명에 대한 권리범위는 이하의 청구범위에서 정해지는 것으로써, 명세서 본문의 기재에 구속되지 않으며, 청구범위의 균등범위에 속하는 변형과 변경은 모두 본 발명의 범위에 속할 것이다. The scope of the above-described invention is defined in the following claims, and is not bound by the description in the text of the specification, all modifications and variations belonging to the equivalent scope of the claims will fall within the scope of the present invention.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050044635A KR100645995B1 (en) | 2005-05-26 | 2005-05-26 | Bacillus sp.hm-6 for ripening cheongkukjang |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050044635A KR100645995B1 (en) | 2005-05-26 | 2005-05-26 | Bacillus sp.hm-6 for ripening cheongkukjang |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR100645995B1 true KR100645995B1 (en) | 2006-11-14 |
Family
ID=37654623
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020050044635A KR100645995B1 (en) | 2005-05-26 | 2005-05-26 | Bacillus sp.hm-6 for ripening cheongkukjang |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100645995B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160097743A (en) | 2015-02-10 | 2016-08-18 | 김종덕 | Manufacturing method of cheonggukjang using the Bacillus subtilis strain SCM 685 having antimicrobial activity against pathogenic microorganism of soy sauce and degrading activity of biogenic amine and cheonggukjang manufactured by thereof |
-
2005
- 2005-05-26 KR KR1020050044635A patent/KR100645995B1/en not_active IP Right Cessation
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