KR100637901B1 - Isolation and culture method of mature adipocyte and preadipocyte - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 본 발명에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법의 제조 과정을 나타낸 공정도,1 is a process chart showing the manufacturing process of the isolated culture method of mature fat cells and fat precursor cells according to the present invention,
도 2는 본 발명의 제 1실시예에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법에 의해 인체의 안와에서 채취한 지방조직으로부터 분리 배양한 성숙지방세포를 나타낸 사진,Figure 2 is a photograph showing the mature fat cells separated and cultured from adipose tissue collected from the orbit of the human body by the method of separating and culturing the mature fat cells and fat precursor cells according to the first embodiment of the present invention,
도 3은 본 발명의 제 1실시예에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법에 의해 인체의 안와에서 채취한 지방조직으로부터 분리 배양한 지방전구세포를 나타낸 사진,Figure 3 is a photograph showing the fat precursor cells separated and cultured from the adipose tissue collected from the orbit of the human body by the method of separating and culturing mature fat cells and fat precursor cells according to the first embodiment of the present invention,
도 4는 본 발명의 제 2실시예에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법에 의해 인체로부터 지방흡입한 지방조직으로부터 분리 배양한 성숙지방세포를 나타낸 사진,4 is a photograph showing mature fat cells separated and cultured from adipose tissue adsorbed from the human body by the method of separating and culturing mature fat cells and fat precursor cells according to a second embodiment of the present invention.
도 5는 본 발명의 제 2실시예에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법에 의해 인체로부터 지방흡입한 지방조직으로부터 분리 배양한 지방전구세포를 나타낸 사진.5 is a photograph showing the fat precursor cells separated and cultured from adipose tissue adsorbed from the human body by the method of separating and culturing mature fat cells and fat precursor cells according to a second embodiment of the present invention.
본 발명은 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 지방조직을 처리하는 데 있어서 각 단계별 용액 조성물을 사용함으로 성숙지방세포와 지방전구세포를 최대한 활성화된 상태로 분리하고, 분리되어진 각각의 지방세포를 배양할 수 있도록 함으로써 높은 회수율을 갖도록 하는 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for isolating and culturing mature fat cells and fat precursor cells, and in detail, to separate mature fat cells and fat precursor cells in the most activated state by using a solution composition for each step in treating adipose tissue. The present invention relates to a method for isolating and culturing mature fat cells and fat progenitor cells to have a high recovery rate by allowing each of the separated fat cells to be cultured.
Chajchir A등에 따르면, 지방조직은 인체 중요 장기의 완충역할과 함께 체형유지에도 중요한 역할을 하며, 인체 어느 곳이나 풍부하게 존재하는 조직이어서 대부분 환자에서 공여부 윤곽의 변형 없이 조직을 쉽게 채취할 수 있기 때문에 수십 년 전부터 지방조직 이식을 임상에서 행해왔다. [참조 : Chajchir A, Benzaquen I. Fat-grafting injection for soft-tissue augumentation. Plast Reconstr Surg, 84 : 921-934, 1989, Ersek RA. Transplatation of purified autogenous fat : a 3-years follow-up is disappointing. Plast Reconstr Surg, 87 : 21-227, 1991]According to Chajchir A et al., Adipose tissue plays an important role in maintaining the body shape as well as buffering vital organs. Since most tissues are abundant anywhere in the body, tissues can be easily collected without altering the donor contour. Adipose tissue transplantation has been practiced for several decades. See: Chajchir A, Benzaquen I. Fat-grafting injection for soft-tissue augumentation. Plast Reconstr Surg , 84: 921-934, 1989, Ersek RA. Transplatation of purified autogenous fat: a 3-years follow-up is disappointing. Plast Reconstr Surg , 87: 21-227, 1991]
또한, Patrick CW에 의하면 초창기에는 지방조직을 한 덩어리로 하여 연부조직 결손부위를 채워주었으나 이식조직이 대부분 괴사되고 합병증들이 빈번하여 이후 작은 조각으로 나누어 이식함으로써 주위 혈류에 의한 조직 생존률을 높여왔다. [참조 : Patrick CW Jr, Chauvin PB, Robb GL. Tissue-engineered adipose tissue. 369-382, Houston, Elsevier Science, Ltd, 1998] In addition, according to Patrick CW, in the early stages, the adipose tissue was lumped to fill the soft tissue defects, but most of the grafts were necrotic and the complications were frequent. [Reference: Patrick CW Jr, Chauvin PB, Robb GL. Tissue-engineered adipose tissue. 369-382, Houston, Elsevier Science, Ltd, 1998]
그럼에도 불구하고 이식 수술 후 1년 이내 40~60% 이상의 부피가 줄어들어 수차례 다시 시술해야 하는 문제점을 가지고 있는데 이러한 현상은 이식된 지방조직 세포가 불충분한 혈류로 인한 허혈상태와 조직 채취 시에 물리적 손상에 의한 세포괴사 등이 원인으로 되어 있다. 괴사된 지방세포는 주위조직의 탐식 세포에 의해 제거되고 섬유화되어 처음 주입된 부피보다 현저히 감소된다.Nevertheless, there is a problem that the volume is reduced by more than 40 ~ 60% within one year after transplantation, and the procedure must be repeated several times. This phenomenon is caused by the ischemic state due to insufficient blood flow of transplanted adipose tissue and physical damage during tissue collection. This is caused by cell necrosis. Necrotic adipocytes are removed by the phagocytic cells of the surrounding tissue and fibrosis, which is significantly reduced than the volume initially injected.
또한, 현재는 이종 삽입물질로 많은 합성 및 천연 복합물질들이 연부조직 보강 및 충전 물질로 이미 상품화되어 사용되어지고 있으며, 이들은 주로 지방조직의 대체물질로 피하조직 결손 및 함몰 등에 충전물질로 사용되며 적은 양을 사용할 시 유용하게 사용될 수 있지만 이들 역시 기능적 보강 물질이기보다는 결손을 단순히 충전시키는 역할만을 가진다. 이들 물질들은 자가 조직이 아니므로 이물반응, 알레르기, 감염 등을 일으킬 수 있다. 실지로 결손된 조직을 대체하는 물질로는 동일한 조직으로 채워주는 것이 가장 이상적이며 기능성을 같이 가지는 것이 가장 적합할 것이다.In addition, many synthetic and natural composite materials are already commercialized and used as soft tissue reinforcement and filling materials as heterogeneous inserts, and they are mainly used as fillers for subcutaneous tissue defects and depression as a substitute for fatty tissue. While amounts may be useful, they also serve to simply fill in the deficiency rather than being functional reinforcing materials. These substances are not autologous and can cause foreign body reactions, allergies and infections. As a substitute for actually missing tissue, it is most ideal to fill it with the same tissue and have the same functionality.
성숙지방세포(mature adipocyte)의 경우에는 분리하기는 쉬우나 쉽게 증식 배양을 유도하지 못하며, 지방전구세포(preadipocyte)는 지방조직에서 효소처리에 의해 비교적 쉽게 분리하여 증식과 분화를 유도할 수 있다.Mature adipocytes are easy to isolate but do not induce proliferation cultures. Preadipocytes can be easily isolated from adipose tissue by enzymatic treatment to induce proliferation and differentiation.
그러나, 이것도 동물에서만 국한되어 있고, 사람의 지방조직의 경우에는 지방전구세포와 성숙지방세포를 분리함이 아직까지는 용이하지 않는 실정이다.However, this is also limited to animals only, and in the case of human adipose tissue, it is not yet easy to separate the fat precursor cells and the mature fat cells.
Melvin A에 의하면 지방조직으로부터 지방전구세포를 분리하는 방법론에 관하여는 많은 보고가 있으나, 지방전구세포만을 이용하여 모든 결손부위를 대체하는 데에는 한계가 있는 문제점이 있다. [참조 : Melvin A, Shiffman, MD and Sid Mirrafati, MD. Fat transfer techniques : the effect of harvest and transfer methods on adipocyte viability and review of the literature. The American Society for Dermatology Surgery, 27 : 819-826, 2001]According to Melvin A, there are many reports on the methodology for separating progenitor cells from adipose tissue, but there are limitations in replacing all defective areas using only progenitor cells. [Reference: Melvin A, Shiffman, MD and Sid Mirrafati, MD. Fat transfer techniques: the effect of harvest and transfer methods on adipocyte viability and review of the literature. The American Society for Dermatology Surgery, 27: 819-826, 2001]
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 지방조직을 처리하는 데 있어서 각 단계별 용액 조성물을 사용함으로 성숙지방세포와 지방전구세포를 최대한 활성화된 상태로 분리하고, 분리되어진 각각의 지방세포를 배양할 수 있도록 함으로써 높은 회수율을 갖도록 하는 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.The present invention is to solve the above problems, by using the solution composition for each step in the treatment of adipose tissue to separate mature fat cells and fat precursor cells in the most active state, and to separate each fat cells It is an object of the present invention to provide a method for isolating and culturing mature fat cells and fat progenitor cells to have high recovery rate by culturing them.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은,Features of the present invention for achieving the above object,
인체로부터 얻어진 지방 조직에 지방 조직 무게의 5~15배의 수세 용액인 0.01~1% BSA(Bovine Serum Albumin)이 첨가된 1X~10X PBS(Phosphate-Buffered Saline) 용액을 첨가하여 지방 조직을 세척하는 수세 단계(S100)와; 세척된 지방 조직에 효소처리 용액인 0.1~0.3% 콜라게나제(collagenase) 타입 Ⅱ 용액을 일정 부피비로 첨가한 후 일정 온도에서 일정 시간동안 교반하는 효소 처리 단계(S110)와; 효소 반응을 정지시키기 위하여 효소반응 정지 용액인 1~20%의 FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 DMEM(Dulbecco`s Minimum Essential Medium) 용액을 일정 부피비로 첨가하여 반응을 정지시키는 효소반응정지 단계(S120)와; 효소반응 정지된 지방 조직을 성숙지방세포와 지방전구세포로 분리하기 위하여 지방세포 배양 용 액을 첨가하여 일정 속도로 일정 시간동안 원심 분리시키는 원심 분리 단계(S130); 및 분리된 성숙지방세포와 지방전구세포를 각각 수집하여 배양시키는 배양 단계(S140)로 이루어지는 것을 특징으로 한다.Washing adipose tissue by adding 1X ~ 10X Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution containing 0.01-1% BSA (Bovine Serum Albumin), which is 5-15 times the weight of adipose tissue, to adipose tissue obtained from the human body Washing step (S100); An enzyme treatment step (S110) of adding 0.1-0.3% collagenase type II solution, which is an enzyme treatment solution, to the washed adipose tissue at a constant volume ratio and then stirring the mixture at a predetermined temperature for a predetermined time; In order to stop the enzyme reaction, the enzyme reaction stopping step of stopping the reaction by adding DMEM (Dulbecco`s Minimum Essential Medium) solution containing 1-20% of FBS (Fetal Bovine Serum), which is an enzyme stopping solution S120); A centrifugation step (S130) of adding adipose cell culture solution to centrifugation at a constant rate for a predetermined time in order to separate the enzyme-activated fat tissue into mature fat cells and fat precursor cells (S130); And a culture step (S140) of collecting and culturing the separated mature fat cells and the fat precursor cells, respectively.
여기에서, 상기 수세 단계는 상기 과정을 반복하여 적어도 3회 이상 지방 조직을 세척한다.Here, the washing step is repeated at least three times to wash the adipose tissue.
여기에서 또한, 상기 수세 용액인 0.01~1% BSA이 첨가된 1X~10X PBS 용액은, 정제수 900㎖에 KH2PO4 0.144~1.44g, NaCl 9.000~90.00g, Na2HPO4·7H2O 0.795~7.950g을 용해시켜 pH를 7.2~7.8로 맞춘 후 정제수로 최종부피가 1000㎖이 되게 한 다음 여과하고, 여과된 용액에 항생제 젠타마이신(gentamicin)을 최종농도가 100㎍/㎖이 되도록 첨가하여 1X PBS 용액을 제조하고, 400㎖ 1X PBS 용액에 0.05~5g BSA를 용해시켜 1X~10X PBS 용액으로 최종부피가 500㎖이 되게 한 후 여과하여 제조한다.Here also, the water washing solution of 0.01 ~ 1% BSA the 1X ~ 10X PBS was added, the purified water 900㎖ KH 2 PO 4 0.144 ~ 1.44g , NaCl 9.000 ~ 90.00g, Na 2 HPO 4 · 7H 2 O Dissolve 0.795 ~ 7.950g to adjust the pH to 7.2 ~ 7.8, make final volume 1000ml with purified water, and then filter, add antibiotic gentamicin (gentamicin) to final concentration of 100㎍ / ㎖ 1X PBS solution was prepared, and 0.05 ~ 5g BSA was dissolved in 400ml 1X PBS solution so that the final volume was 500ml with 1X ~ 10X PBS solution, followed by filtration.
여기에서 또, 상기 효소 처리 단계는 지방 조직의 부피와 효소처리 용액의 부피비는 1:4(v/v)의 비율이고, 36~38℃의 항온기에서 10~60분동안 교반시킨다.Here, in the enzyme treatment step, the ratio of the volume of the adipose tissue and the volume of the enzyme treatment solution is 1: 4 (v / v), and the mixture is stirred for 10 to 60 minutes in a thermostat at 36 to 38 ° C.
여기에서 또, 상기 효소처리 용액인 0.1~0.3% 콜라게나제 타입 Ⅱ 용액은 정제수 9㎖에 0.1~0.3g 콜라게나제 타입 Ⅱ를 용해시킨 후 정제수로 최종부피가 10㎖로 맞추고 여과하여 제조한다.Here, 0.1-0.3% collagenase type II solution, which is the enzyme treatment solution, is prepared by dissolving 0.1-0.3 g collagenase type II in 9 ml of purified water and then adjusting the final volume to 10 ml with purified water and filtering. .
여기에서 또, 상기 효소반응정지 단계는 상기 DMEM 용액을 1:1(v/v)의 부피비로 첨가하여 반응을 정지시킨다.Here, the step of stopping the enzyme reaction stops the reaction by adding the DMEM solution in a volume ratio of 1: 1 (v / v).
여기에서 또, 상기 효소반응 정지 용액인 1~20%의 FBS가 첨가된 DMEM 용액은 정제수 800㎖에 DMEM 파우더 8~11g, NaHNO3(Sodium Bicarbonate) 2000~2400㎎, HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N`-2-Ethane Sulfonic Acid) 2200~2400㎎을 용해시킨 후, DMEM 용액에 FBS 10~200㎖를 첨가하여 섞은 후 pH를 6.8~7.8로 맞추고, 정제수로 최종부피가 1000㎖가 되도록 한 후 여과하여 제조한다.Here, the DMEM solution containing 1-20% of FBS, the enzyme stopping solution, was added in 800 ml of purified water, 8-11 g of DMEM powder, 2000-2400 mg of NaHNO 3 (Sodium Bicarbonate), and HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine). -N`-2-Ethane Sulfonic Acid) After dissolving 2200 ~ 2400mg, add 10 ~ 200ml of FBS to DMEM solution, mix, adjust pH to 6.8 ~ 7.8, and make final volume 1000ml with purified water. After filtration it is prepared.
여기에서 또, 상기 원심 분리 단계는 효소반응 정지된 지방 조직을 1,000~5,000rpm에서 1~5분간 원심 분리한 후, 성숙지방세포를 수집하기 위하여 상층에서 세포층을 수집하고, 수집된 상층 세포층에 상기 지방세포 배양 용액을 1~5배 가량 부어 효소용액이 씻겨져 나가도록 부드럽게 흔든 다음 다시 1,000~5,000rpm에서 1~5분간 원심 분리한 다음 상층 세포층을 수집하는 제 1원심 분리 단계와; 상층 세포층을 분리하고 남은 용액을 다시 1,000~5,000rpm에서 5~10분간 원심 분리하고, 지방전구세포를 수집하기 위하여 하층에서 세포층을 수집하고, 수집된 하층 세포층에 상기 지방세포 배양 용액을 1~5배 가량 부어 효소용액이 씻겨져 나가도록 부드럽게 흔든 다음 다시 1,000~5,000rpm에서 5~10분간 원심 분리한 다음 하층 세포층을 수집하는 제 2원심 분리 단계로 이루어진다.Here, the centrifugation step is centrifuged for 1 to 5 minutes at 1,000 ~ 5,000rpm of the adipose tissue suspended enzyme reaction, and then collecting the cell layer from the upper layer to collect mature fat cells, the collected upper cell layer above A first centrifugation step of pouring the fat cell culture solution about 1 to 5 times, shaking gently to wash off the enzyme solution, and then centrifuging at 1,000 to 5,000 rpm for 1 to 5 minutes to collect the upper cell layer; The upper cell layer is separated and the remaining solution is centrifuged again at 1,000 to 5,000 rpm for 5 to 10 minutes, the cell layer is collected at the lower layer to collect the fat precursor cells, and the adipocyte culture solution is collected at the lower layer layer 1 to 5 Pour about twice and shake gently to wash off the enzyme solution, followed by centrifugation for 5 to 10 minutes at 1,000 ~ 5,000rpm, and then the second centrifugal separation step to collect the lower cell layer.
여기에서 또, 상기 지방세포 배양 용액은 정제수 800㎖에 DMEM 파우더 8~11g, NaHNO3 2000~2400㎎, HEPES 2200~2400㎎을 용해시킨 후, 용해시킨 용액의 pH를 6.8~7.8로 맞추고, 정제수로 최종부피가 1000㎖가 되도록 준비하고, 정제수 800㎖에 F-12 파우더 8~11g, NaHNO3 1000~1200㎎을 용해시킨 후, 용해시킨 용액의 pH를 6.8~7.8로 맞추고, 정제수로 최종부피가 1000㎖가 되도록 준비하며, 상기에서 각각 준비된 용액을 부피비 1:1(v/v)로 섞고, FBS 10~200㎖을 첨가하여 최종부피가 1000㎖가 되도록 한 후 여과하여 제조한다.Here, the adipocyte culture solution was dissolved in DMEM powder 8-11g, NaHNO 3 2000-2400mg, HEPES 2200-2400mg in 800ml purified water, the pH of the dissolved solution was adjusted to 6.8-7.8, purified water Prepare the final volume to 1000ml, dissolve 8-11g of F-12 powder and 1000-1200mg of NaHNO 3 in 800ml of purified water, adjust the pH of the dissolved solution to 6.8-7.8, and final volume with purified water. Prepare 1000 ml, and mix the solutions prepared above in a volume ratio of 1: 1 (v / v), add 10-200 ml of FBS to make the final volume 1000 ml, and then prepare by filtration.
여기에서 또, 상기 배양 단계는 원심 분리된 성숙지방세포를 성숙지방세포 탈지 용액을 혼합한 후 배양용기에 담아 배양용기를 5~8% CO2를 공급하는 36~38℃의 항온기에 넣고, 배양용기의 한쪽에 진동기를 걸어 5~20시간동안 탈지(defatting)를 시키고, 탈지가 완료되면 배양용기에 부착된 성숙지방세포를 제외하고 다시 새로운 성숙지방세포 탈지 용액으로 교환하면서 성숙지방세포를 배양하는 제 1배양 단계와; 원심 분리된 지방전구세포를 상기 지방세포 배양 용액에 혼합하여 배양하는 제 2배양 단계로 이루어진다.Here, in the culturing step, the mature adipocytes centrifuged are mixed with a defatted fat cell degreasing solution, put in a culture vessel, and placed in a culture vessel at a constant temperature of 36 to 38 ° C. to supply 5-8% CO 2 , and cultured. After degreasing for 5 to 20 hours by hanging a vibrator on one side of the container, culturing the mature fat cells while removing the mature fat cells attached to the culture vessel, replacing them with new mature fat cell degreasing solution once degreasing is completed. A first culture step; Centrifuged fat precursor cells are composed of a second culture step of culturing by mixing the adipocyte culture solution.
여기에서 또, 상기 성숙지방세포 탈지 용액은 정제수 800㎖에 DMEM 파우더 8~11g, NaHNO3 2000~2400㎎, HEPES 2200~2400㎎을 용해시킨 후, 용해시킨 용액의 pH를 6.8~7.8로 맞추고, 정제수로 최종부피가 1000㎖가 되도록 준비하고, 정제수 800㎖에 F-12 파우더 8~11g, NaHNO3 1000~1200㎎을 용해시킨 후, 용해시킨 용액의 pH를 6.8~7.8로 맞추고, 정제수로 최종부피가 1000㎖가 되도록 준비하며, 상기에서 각각 준비된 용액을 부피비 1:1(v/v)로 섞고, 에피네프린(epinephrine)을 1~100㎍/㎖, 덱사메타손(dexamethasone)을 10-5~10-7M, FBS 10~200㎖를 첨가하여 마지막 최종부피가 1000㎖가 되도록 한 후 여과하여 제조한다.Here, the mature fat cell degreasing solution was dissolved in DMEM powder 8-11g, NaHNO 3 2000-2400mg, HEPES 2200-2400mg in 800ml purified water, the pH of the dissolved solution was adjusted to 6.8-7.8, Prepare final volume to be 1000ml with purified water, dissolve 8-11g of F-12 powder and 1000-1200mg of NaHNO 3 in 800ml of purified water, adjust the pH of the dissolved solution to 6.8 ~ 7.8, and finally with purified water. preparation and bulky so that 1000㎖, each prepared solution in the volume ratio 1: mix a 1 (v / v), epinephrine (epinephrine) 1 ~ 100㎍ / ㎖ , dexamethasone (dexamethasone) 10 -5 ~ 10 - 7 M, 10-200 ml of FBS is added to make the final final volume of 1000 ml, followed by filtration.
이하, 본 발명에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법의 제 조 공정을 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, with reference to the accompanying drawings the manufacturing process of the isolated culture method of mature fat cells and fat precursor cells according to the present invention will be described in detail.
하기에서 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.In the following description of the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known function or configuration may unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, the detailed description thereof will be omitted. Terms to be described later are terms defined in consideration of functions in the present invention, and may be changed according to intentions or customs of users or operators. Therefore, the definition should be made based on the contents throughout the specification.
도 1은 본 발명에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법의 제조 과정을 나타낸 공정도이고, 도 2는 본 발명의 제 1실시예에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법에 의해 인체의 안와에서 채취한 지방조직으로부터 분리 배양한 성숙지방세포를 나타낸 사진이며, 도 3은 본 발명의 제 1실시예에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법에 의해 인체의 안와에서 채취한 지방조직으로부터 분리 배양한 지방전구세포를 나타낸 사진이고, 도 4는 본 발명의 제 2실시예에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법에 의해 인체로부터 지방흡입한 지방조직으로부터 분리 배양한 성숙지방세포를 나타낸 사진이며, 도 5는 본 발명의 제 2실시예에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법에 의해 인체로부터 지방흡입한 지방조직으로부터 분리 배양한 지방전구세포를 나타낸 사진이다.1 is a process chart showing the manufacturing process of the isolated culture method of mature fat cells and fat precursor cells according to the present invention, Figure 2 is a separate culture method of mature fat cells and fat precursor cells according to a first embodiment of the present invention It is a photograph showing the mature fat cells separated and cultured from the adipose tissue collected from the orbit of the human body, Figure 3 is in the orbit of the human body by the isolation culture method of mature fat cells and fat precursor cells according to the first embodiment of the present invention It is a photograph showing the fat precursor cells separated and cultured from the collected adipose tissue, Figure 4 is separated from the adipose tissue aspirated from the human body by the isolation culture method of mature fat cells and fat precursor cells according to a second embodiment of the present invention Photo shows the cultured mature fat cells, Figure 5 is a phosphorus by the method of separating and culturing mature fat cells and fat precursor cells according to a second embodiment of the present invention From a photograph showing the removed culture from liposuction fat tissue preadipocytes.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법은 먼저, 인체로부터 얻어진 지방 조직에 지방 조직 무게의 5~15배의 수세 용 액인 0.01~1% BSA(Bovine Serum Albumin)이 첨가된 1X~10X PBS(Phosphate-Buffered Saline) 용액을 첨가하여 지방 조직을 세척하고, 반복하여 적어도 3회 이상 지방 조직을 세척한다(S100).Referring to Figure 1, the method for separating and culturing mature fat cells and fat precursor cells according to the present invention, first, 0.01-1% BSA (Bovine Serum), which is a 5-15 times the amount of adipose tissue weight in adipose tissue obtained from the human body. Albumin) is added to the 1X ~ 10X Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution is added to wash the adipose tissue, and repeatedly washed at least three times the adipose tissue (S100).
그리고, 세척된 지방 조직에 효소처리 용액인 0.1~0.3% 콜라게나제(collagenase) 타입 Ⅱ 용액을 지방 조직의 부피와 효소처리 용액의 부피비를 1:4(v/v)의 비율로 혼합한 후 36~38℃의 항온기에서 10~60분동안 교반한다(S110).In addition, 0.1-0.3% collagenase type II solution, which is an enzyme treatment solution, was mixed with the adipose tissue in a ratio of 1: 4 (v / v) in the ratio of the volume of the adipose tissue and the volume of the enzyme treatment solution. Stir for 10 to 60 minutes in a thermostat of 36 ~ 38 ℃ (S110).
그런 다음, 효소 반응을 정지시키기 위하여 효소반응 정지 용액인 1~20%의 FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 DMEM(Dulbecco`s Minimum Essential Medium) 용액을 1:1(v/v)의 부피비로 첨가하여 반응을 정지시킨(S120).Then, to stop the enzymatic reaction, a Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM) solution containing 1-20% of FBS (Fetal Bovine Serum), an enzyme stopping solution, was added at a volume ratio of 1: 1 (v / v). The reaction was stopped by the addition (S120).
효소반응 정지된 지방 조직을 1,000~5,000rpm에서 1~5분간 원심 분리한 후(S131), 성숙지방세포를 수집하기 위하여 상층에서 세포층을 수집하고(S132), 수집된 상층 세포층에 상기 지방세포 배양 용액을 1~5배 가량 부어 효소용액이 씻겨져 나가도록 부드럽게 흔든 다음(S141), 다시 1,000~5,000rpm에서 1~5분간 원심 분리한 다음 상층 세포층을 수집한다.(S142)After centrifugation of enzyme-sustained adipose tissue at 1,000 to 5,000 rpm for 1 to 5 minutes (S131), the cell layer is collected from the upper layer to collect mature fat cells (S132), and the adipocyte culture is performed on the collected upper cell layer. Pour the solution about 1 to 5 times and shake gently to wash away the enzyme solution (S141), and then centrifuge for 1 to 5 minutes at 1,000 to 5,000 rpm and then collect the upper cell layer. (S142)
한편, 상층 세포층을 분리하고 남은 용액을 다시 1,000~5,000rpm에서 5~10분간 원심 분리하고(S133), 지방전구세포를 수집하기 위하여 하층에서 세포층을 수집하고(S143), 수집된 하층 세포층에 상기 지방세포 배양 용액을 1~5배 가량 부어 효소용액이 씻겨져 나가도록 부드럽게 흔든 다음(S143), 다시 1,000~5,000rpm에서 5~10분간 원심 분리한 다음 하층 세포층을 수집한다(S144).On the other hand, the upper cell layer is separated and the remaining solution is centrifuged again at 1,000 to 5,000 rpm for 5 to 10 minutes (S133), the cell layer is collected at the lower layer to collect the fat precursor cells (S143), and the collected lower layer is on the cell layer. Pour 1 ~ 5 times the adipocyte culture solution and gently shake to wash away the enzyme solution (S143), and then centrifuged at 1,000 ~ 5,000rpm for 5-10 minutes and then collect the lower layer (S144).
상기에서 원심 분리된 성숙지방세포를 성숙지방세포 탈지 용액을 혼합한 후 배양용기에 담아 배양용기를 5~8% CO2를 공급하는 36~38℃의 항온기에 넣고, 배양용기의 한쪽에 진동기를 걸어 5~20시간동안 탈지(defatting)를 시키고(S151), 탈지가 완료되면 배양용기에 부착된 성숙지방세포를 제외하고 다시 새로운 성숙지방세포 탈지 용액으로 교환하면서 성숙지방세포를 배양한다(S152).The mature fat cells centrifuged above were mixed with the mature fat cell degreasing solution, put in a culture vessel, and put the culture vessel in a thermostat at 36-38 ° C. that supplies 5-8% CO 2 , and vibrator on one side of the culture vessel. Defatting for 5 to 20 hours by walking (S151), and when degreasing is completed, the mature fat cells are cultured again while exchanging with new mature fat cell degreasing solution except for the mature fat cells attached to the culture vessel (S152). .
또한, 원심 분리된 지방전구세포를 상기 지방세포 배양 용액에 혼합하여 배양한다(S153).In addition, the centrifuged adipocytes are mixed with the adipocyte culture solution and cultured (S153).
그리고, 수세 용액인 0.01~1% BSA이 첨가된 1X~10X PBS 용액은 정제수 900㎖에 KH2PO4 0.144~1.44g, NaCl 9.000~90.00g, Na2HPO4·7H2O 0.795~7.950g을 용해시켜 pH를 7.2~7.8로 맞춘 후 정제수로 최종부피가 1000㎖이 되게 한 다음 여과하고, 여과된 용액에 항생제 젠타마이신(gentamicin)을 최종농도가 100㎍/㎖이 되도록 첨가하여 1X PBS 용액을 제조하고, 400㎖ 1X PBS 용액에 0.05~5g BSA를 용해시켜 1X~10X PBS 용액으로 최종부피가 500㎖이 되게 한 후 여과하여 제조한다.In addition, 1X ~ 10X PBS solution to which 0.01-1% BSA, which is a water washing solution, was added in 900 ml of purified water, 0.144-1.44g of KH 2 PO 4 , NaCl 9.000-90.00g, Na 2 HPO 4 · 7H 2 O 0.795 ~ 7.950g Dissolved to adjust the pH to 7.2-7.8, and the final volume to 1000ml with purified water, and then filtered, and the filtered solution was added to the final concentration of antibiotic gentamicin (gentamicin) to a final concentration of 100㎍ / ㎖ 1X PBS solution To prepare, prepare a final volume of 500ml by dissolving 0.05 ~ 5g BSA in 400ml 1X PBS solution to 1X ~ 10X PBS solution and then prepared by filtration.
여기에서 또, 상기 효소처리 용액인 0.1~0.3% 콜라게나제 타입 Ⅱ 용액은 정제수 9㎖에 0.1~0.3g 콜라게나제 타입 Ⅱ를 용해시킨 후 정제수로 최종부피가 10㎖로 맞추고 여과하여 제조한다.Here, 0.1-0.3% collagenase type II solution, which is the enzyme treatment solution, is prepared by dissolving 0.1-0.3 g collagenase type II in 9 ml of purified water and then adjusting the final volume to 10 ml with purified water and filtering. .
또한, 효소반응 정지 용액인 1~20%의 FBS가 첨가된 DMEM 용액은 정제수 800㎖에 DMEM 파우더 8~11g, NaHNO3(Sodium Bicarbonate) 2000~2400㎎, HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N`-2-Ethane Sulfonic Acid) 2200~2400㎎을 용해시킨 후, DMEM 용액에 FBS 10~200㎖를 첨가하여 섞은 후 pH를 6.8~7.8로 맞추고, 정제수로 최종부피가 1000㎖가 되도록 한 후 여과하여 제조한다. 여기에서, 바람직하게는 DMEM 파우더 9.6g, NaHNO3 2200㎎, HEPES 2383㎎이 첨가된다.In addition, DMEM solution containing 1 ~ 20% FBS, enzyme stopping solution, 8 ~ 11g DMEM powder, 2000 ~ 2400mg NaHNO 3 (Sodium Bicarbonate), HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N`) -2-Ethane Sulfonic Acid) After dissolving 2200 ~ 2400mg, add 10 ~ 200ml of FBS to DMEM solution, mix, adjust pH to 6.8 ~ 7.8, filter to final volume of 1000ml with purified water Manufacture. Here, 9.6 g of DMEM powder, 2200 mg of NaHNO 3 and 2383 mg of HEPES are preferably added.
또, 지방세포 배양 용액은 정제수 800㎖에 DMEM 파우더 8~11g, NaHNO3 2000~2400㎎, HEPES 2200~2400㎎을 용해시킨 후, 용해시킨 용액의 pH를 6.8~7.8로 맞추고, 정제수로 최종부피가 1000㎖가 되도록 준비하고, 정제수 800㎖에 F-12 파우더 8~11g, NaHNO3 1000~1200㎎을 용해시킨 후, 용해시킨 용액의 pH를 6.8~7.8로 맞추고, 정제수로 최종부피가 1000㎖가 되도록 준비하며, 상기에서 각각 준비된 용액을 부피비 1:1(v/v)로 섞고, FBS 10~200㎖을 첨가하여 최종부피가 1000㎖가 되도록 한 후 여과하여 제조한다. 여기에서, 바람직하게는 DMEM 파우더 9.6g, NaHNO3 2200㎎, HEPES 2383㎎이 첨가되고, F-12 파우더 9.6g, NaHNO3 1176㎎, FBS 100㎖가 첨가된다.In addition, in the adipocyte culture solution, dissolve 8-11 g of DMEM powder, 2000-2400 mg of NaHNO 3 , and 2200-2400 mg of HEPES in 800 ml of purified water, and adjust the pH of the dissolved solution to 6.8-7.8. Was prepared to make 1000 ml, and dissolved 8-12 g of F-12 powder and 1000-1200 mg of NaHNO 3 in 800 ml of purified water, and then adjusted the pH of the dissolved solution to 6.8-7.8, and the final volume was 1000 ml with purified water. Prepare to be prepared, and the solutions prepared above are mixed in a volume ratio of 1: 1 (v / v), and 10 to 200 ml of FBS is added so that the final volume is 1000 ml, followed by filtration. Here, 9.6 g of DMEM powder, 2200 mg of NaHNO 3 and 2383 mg of HEPES are preferably added, and 9.6 g of F-12 powder, 1176 mg of NaHNO 3 , and 100 ml of FBS are added.
한편, 성숙지방세포 탈지 용액은 정제수 800㎖에 DMEM 파우더 8~11g, NaHNO3 2000~2400㎎, HEPES 2200~2400㎎을 용해시킨 후, 용해시킨 용액의 pH를 6.8~7.8로 맞추고, 정제수로 최종부피가 1000㎖가 되도록 준비하고, 정제수 800㎖에 F-12 파우더 8~11g, NaHNO3 1000~1200㎎을 용해시킨 후, 용해시킨 용액의 pH를 6.8~7.8로 맞추고, 정제수로 최종부피가 1000㎖가 되도록 준비하며, 상기에서 각각 준비된 용액을 부피비 1:1(v/v)로 섞고, 에피네프린(epinephrine)을 1~100㎍/㎖, 덱사메타손 (dexamethasone)을 10-5~10-7M, FBS 10~200㎖를 첨가하여 마지막 최종부피가 1000㎖가 되도록 한 후 여과하여 제조한다. 여기에서, 바람직하게는 DMEM 파우더 9.6g, NaHNO3 2200㎎, HEPES 2383㎎이 첨가되고, F-12 파우더 9.6g, NaHNO3 1176㎎이 첨가된다.On the other hand, in mature fat cell degreasing solution, dissolve DMEM powder 8-11g, NaHNO 3 2000-2400mg, HEPES 2200-2400mg in 800ml purified water, adjust the pH of the dissolved solution to 6.8-7.8 Prepare the volume to 1000ml, dissolve 8-11g of F-12 powder and 1000-1200mg of NaHNO 3 in 800ml of purified water, adjust the pH of the dissolved solution to 6.8-7.8, and final volume 1000 with purified water. Prepare to ㎖, mix the solution prepared in each of the volume ratio 1: 1 (v / v), 1 ~ 100 ㎍ / ㎖ epinephrine (epinephrine), dexamethasone (dexamethasone) 10 -5 ~ 10 -7 M, 10 to 200 ml of FBS is added to make the final volume of 1000 ml, followed by filtration. Here, 9.6 g of DMEM powder, 2200 mg of NaHNO 3 and 2383 mg of HEPES are preferably added, and 9.6 g of F-12 powder and 1176 mg of NaHNO 3 are added.
이하, 본 발명의 실시 예들을 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시 예들은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예들에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. These examples are only intended to illustrate the invention, so the scope of the invention is not to be construed as limited by these embodiments.
《실시예 1-사람 안와 지방조직으로부터 지방세포 분리 및 배양》Example 1 Isolation and Culture of Adipocytes from Human Orbital Adipose Tissue
당일에 채취된 사람 안와, 즉 눈 지방조직으로부터 지방세포를 분리 배양하는 방법은 다음과 같다.The method of separating and culturing fat cells from human orbital, ie, eye adipose tissue collected on the day is as follows.
먼저, -20∼4℃ 냉장 상태로 이동되어져 온 눈 지방조직을 칭량하기 위해 50㎖ 원심 분리기 튜브(centrifuge tube)의 조직이 담겨져 있지 않은 용기의 무게를 측정하고, 조직이 담겨 있는 상태에서 용기의 전체 무게를 측정하여 그 뺀 값을 조직의 무게로 한다.First, in order to weigh the eye adipose tissue that has been moved to the refrigerated state at -20 to 4 ° C., the weight of the container containing no 50 ml centrifuge tube is weighed, Measure the total weight and subtract it from the weight of the tissue.
조직의 무게를 칭량한 후 수세 용액을 조직무게의 5~15배로 첨가하여 50㎖ 원심 분리기 튜브 뚜껑을 닫고 부드럽게 흔들어 조직을 씻어준다. 씻는 과정은 총 3번 반복한다. 씻은 조직에 1~10㎖의 수세 용액을 붓고, 페트리 접시(petri-dish) 상에서 작은 조각으로 세절(dissection)하여 다시 50㎖ 원심 분리기 튜브에 담는다.After weighing the tissue, add a flushing solution 5 to 15 times the tissue weight to close the 50 ml centrifuge tube lid and gently shake to wash the tissue. The washing process is repeated three times in total. Pour 1-10 mL of flushing solution into the washed tissue, cut it into small pieces on a petri-dish and place it back into a 50 mL centrifuge tube.
씻어서 세절한 지방조직에 효소처리 용액을 첨가하는데, 이 때 조직의 부피와 콜라게나제의 부피비는 1:4(v/v)의 비율이 되도록 한다. 효소 처리한 지방 조직이 든 50㎖ 원심 분리기 튜브는 37℃ 항온기에서 교반하는데, 교반 시간을 10~20분 동안 한다.Enzyme solution is added to the washed and cut adipose tissue. At this time, the volume ratio of the tissue to the collagenase is 1: 4 (v / v). A 50 ml centrifuge tube containing enzymatic adipose tissue is stirred in a 37 ° C. thermostat with agitation time of 10-20 minutes.
효소 처리가 끝난 후 효소 반응을 멈추기 위해 효소반응 정지 용액, 즉 배지를 1:1(v/v)의 부피비로 넣어 반응을 정지시킨다.In order to stop the enzyme reaction after the end of the enzyme treatment, stop the reaction by adding the enzyme reaction stop solution, that is, the medium in a volume ratio of 1: 1 (v / v).
50㎖ 원심 분리기 튜브에 담겨져 있는 세포들을 각각 성숙지방세포와 지방전구세포로 분리하기 위하여 1,000~5,000rpm에서 1~5분간 원심 분리를 한다. 이때, 상층에 수집된 세포층, 즉 성숙지방세포를 따로 15㎖ 원심 분리기 튜브에 담는다. 그리고, 수집되어 진 세포층에 지방세포 배양 용액을 1~5배 가량 부어 효소용액이 씻겨져 나가도록 부드럽게 흔들어 다시 1,000~5,000rpm에서 1~5분간 원심 분리하여 상층을 수집한다.In order to separate the cells contained in the 50ml centrifuge tube into mature adipocytes and adipocytes, centrifuge for 1 to 5 minutes at 1,000 to 5,000 rpm. At this time, the cell layer collected on the upper layer, that is, the mature adipocytes are separately placed in a 15 ml centrifuge tube. Then, the fat cell culture solution is poured 1-5 times in the collected cell layer, gently shaken to wash off the enzyme solution, and centrifuged at 1,000-5,000 rpm for 1-5 minutes to collect the upper layer.
상층이 분리되어진 50㎖ 원심 분리기 튜브에 있는 효소반응이 정지된 용액을 다시 한번 더 1,000~5,000rpm에서 5~10분간 원심 분리를 한다. 원심 분리가 끝난 후 50㎖ 원심 분리기 튜브의 하층에 수집된 세포층의 용액을 제거한 후 아래의 세포층에 1~5배 가량 지방조직 배양 용액을 부어 부드럽게 교반하여 남아있는 효소용액이 씻겨져 나가도록 하고 다시 1,000~5,000rpm에서 5~10분간 원심 분리를 하여 하층을 수집한다.Centrifuge the solution in which the enzymatic reaction was stopped in the 50 ml centrifuge tube from which the upper layer was separated once again at 1,000 to 5,000 rpm for 5 to 10 minutes. After the centrifugation, remove the solution of the collected cell layer in the lower layer of the 50 ml centrifuge tube and pour 1-5 times the adipose tissue culture solution into the lower cell layer and gently stir to wash the remaining enzyme solution. Collect the lower layer by centrifugation for 5-10 minutes at ˜5,000 rpm.
상층에서 분리되어진 성숙지방세포의 일부만을 취해 세포수를 측정한 다음 성숙지방세포 탈지 용액을 첨가하여 세포와 함께 골고루 섞어 지방세포 배양용기로 옮긴다.Take only a part of the mature fat cells separated from the upper layer, measure the cell number, add the mature fat cell degreasing solution, mix them evenly with the cells, and transfer to the adipocyte culture vessel.
그리고, 5~8% CO2를 공급하는 37℃의 항온기에서 지방세포 배양용기 한쪽 면에 진동기를 12시간 걸어 탈지(defatting)를 시키고, 탈지가 종료되면 부착된 세포를 제외하고는 새로운 성숙지방세포 탈지 용액으로 교환해주고, 3일에 한번 씩 성숙지방세포 탈지 용액을 교환하여 배양한다.Then, defatting the vibrator on one side of the adipocyte culture vessel for 12 hours in a 37 ° C thermostat supplying 5 to 8% CO 2 , and degreasing after completion of degreasing, new mature fat cells except the attached cells. Replace with degreasing solution, and incubate by replacing the mature fat cell degreasing solution every three days.
또한, 하층에서 분리되어진 지방전구세포의 일부만을 취해 세포수를 측정한 다음 지방세포 배양 용액, 즉 배지 10㎖에 골고루 섞어 총세포수에 따라 벤트 캡 플라스크(vent cap flask)를 선택하고 지방전구세포를 플라스크로 옮겨 배양한다.In addition, measure the cell number by taking only a part of the fat precursor cells separated from the lower layer, and then evenly mix the fat cell culture solution, that is, 10 ml of medium, select the vent cap flask according to the total cell number, Transfer to the flask and incubate.
상기와 같이 배양된 성숙지방세포와 지방전구세포는 도 2 및 도 3에 도시된 바와 같다.Mature fat cells and fat precursor cells cultured as described above are as shown in Figs.
《실시예 2-지방흡입한 지방조직으로부터 지방세포 분리 및 배양》Example 2 Isolation and Culture of Adipocytes from Adipose-Aspirated Adipose Tissue
당일에 채취된 사람으로부터 지방흡입(liposuction)한 지방조직의 지방세포를 분리 배양하는 방법은 다음과 같다.The method of separating and culturing fat cells of adipose tissue (liposuction) from a person collected on the day is as follows.
먼저, -20∼4℃냉장 상태로 이동되어져 온 지방흡입(liposuction)한 지방조직을 칭량하기 위해 50㎖ 원심 분리기 튜브의 조직이 담겨져 있지 않은 용기의 무게를 측정하고, 조직이 담겨 있는 상태에서 용기의 전체 무게를 측정하여 그 뺀 값을 조직의 무게로 한다.First, in order to weigh the liposuctioned adipose tissue that has been moved to the chilled state at -20 to 4 ° C., the weight of the container containing no tissue of the 50 ml centrifuge tube is measured, and the container in the state where the tissue is contained. Measure the total weight of and subtract that value as the weight of the tissue.
조직의 무게를 칭량한 후 수세 용액을 조직무게의 5~15배로 첨가한 후 50㎖ 원심 분리기 튜브 뚜껑을 닫고 부드럽게 흔들어 조직을 씻어준다. 수세 과정은 총 3번 반복한다.After weighing the tissue, add a flushing solution 5 to 15 times the tissue weight, and then close the 50 ml centrifuge tube lid and shake gently to wash the tissue. The washing process is repeated three times in total.
씻은 지방조직에 효소처리 용액을 첨가하는데, 이 때 조직의 부피와 콜라게나제의 부피비는 1:4(v/v)의 비율이 되도록 하여 효소처리 용액의 최종 농도가 0.23%가 되도록 한다. 효소 처리한 지방 조직이 든 50㎖ 원심 분리기 튜브는 37℃ 항온기에서 교반하는데, 교반 시간을 15~60분 동안 한다.The enzyme treatment solution is added to the washed adipose tissue. At this time, the volume ratio of the tissue to the collagenase is 1: 4 (v / v) so that the final concentration of the enzyme treatment solution is 0.23%. A 50 ml centrifuge tube containing enzymatic adipose tissue is stirred in a 37 ° C. thermostat, with agitation time of 15-60 minutes.
효소 처리가 끝난 후 효소 반응을 멈추기 위해 효소반응 정지 용액, 즉 배지를 1:1(v/v)의 부피비로 넣어 반응을 정지시킨다.In order to stop the enzyme reaction after the end of the enzyme treatment, stop the reaction by adding the enzyme reaction stop solution, that is, the medium in a volume ratio of 1: 1 (v / v).
50㎖ 원심 분리기 튜브에 담겨져 있는 세포들을 각각 성숙지방세포와 지방전구세포로 분리하기 위하여 1,000~5,000rpm에서 1~5분간 원심 분리를 한다. 이때, 상층에 수집된 세포층, 즉 성숙지방세포를 따로 15㎖ 원심 분리기 튜브에 담는다. 그리고, 수집된 세포층에 지방세포 배양 용액을 1~5배 가량 부어 효소용액이 씻겨져 나가도록 부드럽게 흔들어 다시 1,000~5,000rpm에서 1~5분간 원심 분리하여 상층을 수집한다.In order to separate the cells contained in the 50ml centrifuge tube into mature adipocytes and adipocytes, centrifuge for 1 to 5 minutes at 1,000 to 5,000 rpm. At this time, the cell layer collected on the upper layer, that is, the mature adipocytes are separately placed in a 15 ml centrifuge tube. Then, the fat cell culture solution is poured into the collected cell layer about 1 to 5 times, gently shaken to wash off the enzyme solution, and the upper layer is collected by centrifugation for 1 to 5 minutes at 1,000 to 5,000 rpm.
상층이 분리되어진 50㎖ 원심 분리기 튜브에 있는 효소반응이 정지된 용액을 다시 한번 더 1,000~5,000rpm에서 5~10분간 원심 분리를 한다. 원심 분리가 끝난 후 50㎖ 원심 분리기 튜브의 하층에 수집된 세포층의 용액을 제거한 후 아래의 세포층에 1~5배 가량 지방조직 배양 용액을 부어 부드럽게 교반하여 남아있는 효소용액이 씻겨져 나가도록 하고 다시 1,000~5,000rpm에서 5~10분간 원심 분리를 하여 하층을 수집한다.Centrifuge the solution in which the enzymatic reaction was stopped in the 50 ml centrifuge tube from which the upper layer was separated once again at 1,000 to 5,000 rpm for 5 to 10 minutes. After the centrifugation, remove the solution of the collected cell layer in the lower layer of the 50 ml centrifuge tube and pour 1-5 times the adipose tissue culture solution into the lower cell layer and gently stir to wash the remaining enzyme solution. Collect the lower layer by centrifugation for 5-10 minutes at ˜5,000 rpm.
상층에서 분리되어진 성숙지방세포의 일부만을 취해 세포수를 측정한 다음 성숙지방세포 탈지 용액을 첨가하여 세포와 함께 골고루 섞어 지방세포 배양용기로 옮긴다.Take only a part of the mature fat cells separated from the upper layer, measure the cell number, add the mature fat cell degreasing solution, mix them evenly with the cells, and transfer to the adipocyte culture vessel.
그리고, 5~8% CO2를 공급하는 37℃의 항온기에서 지방세포 배양용기 한쪽 면에 진동기를 12시간 걸어 탈지(defatting)를 시키고, 탈지가 종료되면 부착된 세포를 제외하고는 새로운 성숙지방세포 탈지 용액으로 교환해주고, 3일에 한번 씩 성숙지방세포 탈지 용액을 교환하여 배양한다.Then, defatting the vibrator on one side of the adipocyte culture vessel for 12 hours in a 37 ° C thermostat supplying 5 to 8% CO 2 , and degreasing after completion of degreasing, new mature fat cells except the attached cells. Replace with degreasing solution, and incubate by replacing the mature fat cell degreasing solution every three days.
또한, 하층에서 분리되어진 지방전구세포의 일부만을 취해 세포수를 측정한 다음 지방세포 배양 용액, 즉 배지 10㎖에 골고루 섞어 총세포수에 따라 벤트 캡 플라스크(vent cap flask)를 선택하고 지방전구세포를 플라스크로 옮겨 배양한다.In addition, measure the cell number by taking only a part of the fat precursor cells separated from the lower layer, and then evenly mix the fat cell culture solution, that is, 10 ml of medium, select the vent cap flask according to the total cell number, Transfer to the flask and incubate.
상기와 같이 배양된 성숙지방세포와 지방전구세포는 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같다.Mature fat cells and fat precursor cells cultured as above are shown in FIGS. 4 and 5.
상기와 같이 구성되는 본 발명인 성숙지방세포와 지방전구세포의 분리 배양 방법에 따르면, 각 과정에 맞는 용액을 선택하여 지방조직으로부터 성숙지방세포와 지방전구세포를 분리 배양하면 지방조직을 처리함에 따라 빠른 시간 내에 활성화된 지방세포들을 회수할 수 있을 뿐만 아니라, 그 동안 분리 배양이 어려웠던 성숙지방세포를 용이하게 분리 배양함으로 인해 새로운 지방세포 이식이 가능할 수 있다.According to the isolated culture method of the mature fat cells and fat precursor cells of the present invention configured as described above, by selecting a solution for each process and separating and culturing the mature fat cells and fat precursor cells from adipose tissue as fast as the adipose tissue is treated In addition to recovering the activated adipocytes in time, new adipocyte transplantation may be possible by easily isolating and culturing mature adipocytes, which had been difficult to isolate and culture.
본 발명은 다양하게 변형될 수 있고 여러 가지 형태를 취할 수 있으며 상기 발명의 상세한 설명에서는 그에 따른 특별한 실시 예에 대해서만 기술하였다. 하지만 본 발명은 상세한 설명에서 언급되는 특별한 형태로 한정되는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 오히려 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.As those skilled in the art would realize, the described embodiments may be modified in various ways, all without departing from the spirit or scope of the present invention. It is to be understood, however, that the present invention is not limited to the specific forms referred to in the description, but rather includes all modifications, equivalents, and substitutions within the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Should be.
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