KR100635453B1 - Anti-telomerase siRNA vector for gene therapy of cancer or differentiation of stem cells - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 발생 및 줄기 세포 분화와 관련있는 텔로머라제 효소 활성을 RNAi 기술을 이용하여 조절 가능한 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터 및 이를 이용한 유전자 치료제에 관한 것이다.The present invention relates to telomerase inhibitory siRNA expression vectors and gene therapeutics using the same which modulate telomerase enzyme activity associated with tumor development and stem cell differentiation using RNAi technology.

구체적으로, 본 발명은 90 % 이상 종양 및 줄기세포에서 그 활성이 보고되는 텔로머라제의 활성 억제가 가능한 유전자 치료 벡터와 그의 응용방법에 관한 것으로서, 본 발명의 플라스미드 벡터는 다양한 종양 치료 및 줄기세포 분화조절에 유용하게 사용될 수 있다.Specifically, the present invention relates to a gene therapy vector capable of inhibiting the activity of telomerase, whose activity is reported in more than 90% tumors and stem cells, and a method of applying the same. It can be usefully used for differentiation control.

Description

텔로머라제 억제 ｓｉＲＮＡ 발현 벡터 및 이를 이용한 유전자 치료제{Anti-telomerase siRNA vector for gene therapy of cancer or differentiation of stem cells}Telomerase inhibitory siRNA expression vector and anti-telomerase siRNA vector for gene therapy of cancer or differentiation of stem cells

도 1a 및 도 1b은 본 발명의 siRNA 시퀀스 및 헤어핀 이차구조를 나타낸 그림이다. 각 변이종(Nagative control)은 3개의 점변이(소문자)를 갖는다.1a and 1b is a diagram showing the siRNA sequence and hairpin secondary structure of the present invention. Each variant control has three point mutations (lower case).

도 1c 및 도 1d는 본 발명에 사용된 pU6shX 벡터 및 이로부터 제조된 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터의 지도이다.1C and 1D are maps of pU6shX vectors used in the present invention and telomerase inhibitory siRNA expression vectors prepared therefrom.

도 2는 각 실험 세포주의 텔로머라제 활성도를 나타낸 그림이다. 텔로머라제 활성 측정은 텔로미어 반복 중합 방법 (telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay)을 약 2,000개의 세포를 이용하여 실시하였다. 최소 3번의 실험을 반복하였고 바는 SD를 나타낸다.2 is a diagram showing the telomerase activity of each experimental cell line. The telomerase activity measurement was performed using a telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay using about 2,000 cells. At least three experiments were repeated and bars represent SD.

도 3은 siRNA에 의한 텔로머라제 억제효과를 나타낸 그림으로 억제 정도는 변이종에 의한 텔로머라제 활성도를 100으로 가정했을 때의 %이다. 최소 3번의 실험을 반복하였고 바는 SD를 나타낸다.3 is a diagram showing the inhibitory effect of telomerase by siRNA, the degree of inhibition is% when assuming telomerase activity by the variant species is 100. At least three experiments were repeated and bars represent SD.

본 발명은 RNAi 기술에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 종양 발생 및 줄기세포 유지에 중요한 역할을 하는 텔로머라제 활성의 억제가 가능한 siRNA를 생산하는 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터 및 이를 이용한 유전자 치료제에 관한 것이다.The present invention relates to RNAi technology, and more particularly, to a telomerase inhibitory siRNA expression vector producing a siRNA capable of inhibiting telomerase activity which plays an important role in tumor development and stem cell maintenance, and a gene therapy agent using the same. .

줄기 세포를 이용한 의료 연구는 기존의 의학적 한계를 뛰어넘는 새로운 형태의 의학으로 21 세기 의학기술에서 중요한 위치를 차지하리라 본다. 줄기 세포란 분화(differentiation)되지 않은 세포로써, 증식(proliferation)되고 분화되어 어떤 특정 조직(tissue)이나 기관(organ)을 형성할 수 있는 능력을 가진 세포를 말한다. 줄기 세포를 크게 구별하면 성인 골수(adult bone marrow)에서 얻는 간엽 줄기 세포 (mesenchymal stem cell MSC) 와 같은 성인 줄기 세포 (adult stem cell)와 배자 (embryo) 와 태아 (fetus) 에서 얻는 배자, 태아 줄기 세포 (embryonic & fetal stem cell) 로 대별된다. 현재까지의 연구 결과에 따르면 성인 줄기 세포에서 연골 (cartilage), 지방 (fat), 근육 (muscle), 조혈 (hematopoietic) 그리고 신경 세포인 성상 세포 (astrocyte) 를 얻을 수 있다.Medical research using stem cells is a new type of medicine that goes beyond existing medical limitations and will hold an important place in 21st century medical technology. Stem cells are cells that are not differentiated and that have the ability to proliferate and differentiate to form certain tissues or organs. The main distinction between stem cells is adult stem cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs) from adult bone marrow, and embryonic and fetal stems from embryos and fetuses. It is roughly divided into cells (embryonic & fetal stem cells). To date, research has shown that adult stem cells can produce cartilage, fat, muscle, hematopoietic and neuronal astrocytes (astrocytes).

유전자 치료 (gene therapy) 는 유전병과 암 등 각종 유전자 이상으로 유발되는 질병 치료를 위해 치료 유전자를 체내에 주입하는 방법으로 각종 치료 유전자에 의해 각종 질환의 치료 효과를 기대 할 수 있다. 유전자 치료의 가장 중요한 요건은 목적 유전자의 목표 세포에의 성공적 전달에 있고 이를 위해 리포좀 (liposome) 등의 운반체를 사용하여 유전자를 주입하거나, 아데노바이러스나 레트로 바이러스 등에 유전자를 실어 세포에 전달하게 되는데, 이 두 방법 모두 세포에의 전달 효율이 떨어지며 암세포와 정상세포를 모두 공격함으로써 환자에게 불필요 한 면역 반응을 유도해 생명을 잃기도 하므로 암세포 등 목적 세포에 특이적으로 작용하면서 동시에 그 발현 효율이 높은 새로운 유전자 전달 체계가 필요하다. 새로운 유전자 치료의 개발에 있어서 악성 종양의 말기나 종양 절제 후 항암제 치료 또는 방사선 치료에 저항성을 보이는 경우 현재로서는 다른 치료 대안이 거의 없는 실정이고 항암제 사용으로 인한 부작용으로 환자가 입을 고통을 생각한다면 부작용이 거의 없고 효과가 확실한 유전자 치료의 개발이 더욱 절실한 이유로 전 세계적으로 유전자 치료에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으나 현재까지는 뚜렷한 치료 효과를 보이는 제품은 없는 실정이다. 그러나 항암제 개발에 드는 천문학적 비용을 고려한다면 상대적으로 저 비용이며, 과학적 이론이 뒷받침되면서 항암 효과도 예측이 가능한 유전자 치료가 충분한 경제적 경쟁력을 갖는다고 생각된다. 아울러 유전자 치료가 실제 사용될 가까운 장래에는 각 유전자 치료제 당 적어도 연간 10억 불 이상의 순 이익을 창출 할 것으로 예견되는 바 선진국과의 기술 격차가 크지 않은 현 시점이 유전자 치료 연구 투자에 최적기라 생각된다. 유전자 치료제의 개발은 사회, 경제적인 측면에서 계산할 수 없는 국가 경쟁력 제고에 보탬이 될 것으로 사료된다.Gene therapy is a method of injecting therapeutic genes into the body for the treatment of diseases caused by various genetic abnormalities such as genetic diseases and cancer, and can be expected to treat various diseases by various therapeutic genes. The most important requirement for gene therapy is the successful delivery of the target gene to the target cell, and for this purpose, the gene is injected using a carrier such as a liposome, or the gene is loaded into an adenovirus or a retrovirus and delivered to the cell. Both of these methods are less effective in delivering to cells, and by attacking both cancer cells and normal cells, they induce unnecessary immune responses to patients and lose their lives. Gene delivery systems are needed. In the development of new gene therapies, resistance to chemotherapy or radiation therapy at the end of malignant tumors or after tumor resection is currently lacking in alternative treatments. Although research on gene therapy has been actively conducted worldwide because there is little need to develop gene therapy that has little effect and certainty, there is no product showing a clear therapeutic effect until now. However, considering the astronomical cost of developing anticancer drugs, it is relatively low cost, and supported by scientific theory, gene therapy, which can predict anticancer effects, seems to have sufficient economic competitiveness. In the near future, where gene therapy will be used in practice, it is expected to generate net profit of at least $ 1 billion per year for each gene therapy product. The development of gene therapy products is expected to help raise national competitiveness that cannot be calculated from the social and economic aspects.

텔로미어 (telomere)는 진핵 생물의 염색체 말단에 존재하는 특이 구조로 짧은 DNA 조각 (척추 동물의 경우 TTAGGG)이 100 kb 이상 반복되는 형태를 띠고 있다. 이들은 단백질과 결합된 형태로 여러 가지 기능을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 텔로머라제 는 1) 염색체 끝 사이의 재결합, 융합 (interchromosomal fusion), 붕괴를 막아 염색체를 보호하고 2) 체세포 또는 생식 세포 분열 시 염색 체 이동을 도우며 3) 직선을 이루는 진핵 세포 염색체에서 자연적으로 일어나는 말단복제 문제 (end-replication problem)을 막는 역할을 한다. 즉, 복제의 끝 무렵 지체가닥 (lagging strand) DNA 합성 시 제거되는 RNA 시발체 (primer) 부분을 DNA 복제 효소가 합성 할 수 없어 그 부위는 영구히 사라지는데 텔로미어 가 있음으로 해서 손상되지 않고 보존된다는 설명이다. 생식 세포에서는 텔로머라제라는 효소가 존재해 TTAGGG 반복 부위를 염색체 끝에 계속 합성하는데 비해 체세포에서는 이러한 텔로머라제 활성이 없어서 매 세포주기 마다 텔로미어가 짧아져 결국은 사멸하게 된다 (David et al., 1997). 4) 텔로머라제 는 리보단백질(riboprotein)로 텔로머라제 자체의 RNA 부위를 주형으로 해서 기존의 텔로미어의 3' 끝에 텔로미어를 연결시키는 역할을 한다. 즉, 텔로머라제는 염색체의 복제 및 보호에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되며, 특히 세포의 불멸화에 중요한 역할을 하는 것으로생각되며 대략 80-95 %의 암세포에서 텔로머라제 활성이 관찰된다 (Feng et al., 1997) 따라서 텔로머라제 활성의 억제를 항암 치료에 이용하고자 하는 연구가 전세계적으로 활발히 진행 중이다. 즉, Bisoffi (Bisoffi et al., 1998) 등에 의하면 악성신경교종 (malignant glioma MG) 세포에 hTR (human telomoerase RNA component)에 대한 안티센스 벡터를 세포 감염 시키자 MG 세포의 많은 부분이 세포 사멸하거나 분화를 일으켰으며, 시스플라틴 (cisplatin) 등의 항암제에 대해 더 민감하게 반응했다. 이 외에도 레트로바이러스의 역전사 효소 저해제를 암세포에 처리하자 텔로머라제 활성의 저해 및 세포 사멸 효과를 보았으며 hTR에 대한 여러 펩타이드 핵산 및 안티센스 소중합체 처리 시에도 같은 효과를 보았다 (Bhaswati et al., 1998, A.I.Glukhov et al., 1998). 텔로머라제 활성과 세포내의 다른 여러 종양 억제 유전자 (tumor suppressor gene) 이나 발암 유전자 (oncogenes) 사이의 관계는 아직까지 명확하게 밝혀진 것이 없으나 최근 논문에 의하면 c-myc의 발현을 저해시키자 텔로머라제 활성도 감소하였고 정상 p53이 텔로미어 길이를 줄여 세포 사멸을 유도한다는 사실이 밝혀진 상태이다 (Kohtaro et al., 1997).Telomere is a specific structure at the chromosomal end of eukaryotes that repeats short DNA fragments (TTAGGG in vertebrates) over 100 kb. These have been reported to exhibit a variety of functions in the form of protein binding. Telomerase protects the chromosome by 1) preventing recombination, interchromosomal fusion, and disruption between chromosomal ends, 2) helping chromosomal migration during somatic or germ cell division, and 3) occurring naturally in straight eukaryotic chromosomes. It acts to prevent end-replication problems. In other words, the DNA primer cannot be synthesized by the RNA primer, which is removed at the end of replication by lagging strand DNA synthesis, and the site disappears permanently. . In germ cells, there is an enzyme called telomerase, which continuously synthesizes the TTAGGG repeat site at the end of the chromosome, whereas somatic cells lack this telomerase activity, resulting in shortening of telomeres in each cell cycle and eventually death (David et al., 1997). ). 4) Telomerase is a riboprotein, which is a template of the RNA region of telomerase itself, and serves to connect telomeres to the 3 'end of existing telomeres. That is, telomerase is thought to play an important role in the replication and protection of chromosomes, in particular it is thought to play an important role in the immortalization of cells and telomerase activity is observed in approximately 80-95% of cancer cells (Feng et al. al., 1997) Therefore, there is an active research worldwide to use the inhibition of telomerase activity in anti-cancer treatment. In other words, According to Bisoffi (Bisoffi et al., 1998), when a cell was infected with an antisense vector against human telomoerase RNA component (hTR) in malignant glioma MG cells, many of the MG cells caused cell death or differentiation. It responded more sensitively to anticancer drugs such as cisplatin. In addition, treatment of retrovirus reverse transcriptase inhibitors to cancer cells resulted in inhibition of telomerase activity and apoptosis, and the same effect in the treatment of various peptide nucleic acids and antisense oligomers against hTR (Bhaswati et al., 1998). , AIGlukhov et al., 1998). The relationship between telomerase activity and other tumor suppressor genes or oncogenes in the cell has not been elucidated yet, but recent papers have suggested that telomerase activity is inhibited by inhibiting c-myc expression. It has been found that normal p53 reduces telomere length and induces cell death (Kohtaro et al., 1997).

2002년 과학잡지 "Science"는 small RNA를 'molecule of the year'에 선정하였으며, 2003년 12월에는 과학 전 분야를 대상으로 10대 중요 과학적 성과를 발표하였는데 그 중에 RNAi (RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 siRNA(small interfering RNA) 기술이 선정되었다. 이러한 사실은 현재 small RNA 연구분야 및 이를 이용한 RNAi 기술의 중요성과 연구자들 사이의 관심을 단적으로 보여 주고 있다. 이 기술은 아직은 초기단계에 불과하지만 세포 유전학 연구에 혁명적인 변화를 가져올 것으로 생각되며 일부 과학자들은 이 기술이 polymerase chain reaction (PCR)에 버금가는 기술이 될 수도 있을 것으로 평가하고 있다. 지금까지는 한 유전자의 형질발현을 중단시킨 세포를 만들기 위해서는 6개월에서 1년에 걸친 실험이 필요하지만 siRNA를 이용한 RNAi 기술로는 일주일에 수 십 개의 유전자를 제어할 수도 있다. 지난 10 여년간 많은 연구자와 제약회사 연구진은 anti-sense oligonucleotide 또는 antisense RNA 발현에 의해 유전자의 기능 규명 및 새로운 drug의 개발을 위해 각고의 노력으로 경주해 왔으나 이러한 anti-sense technique의 사용은 많은 경우 대조군으로 sense strand를 사용한 실험에서도 target gene의 발현 억제 현상이 관찰되어 그 원인 규명을 위한 관심이 지속되고 있었고 이러한 노력의 일환으로 Dr. Fire 그룹은antisense RNA와 sense RNA를 각각 RNA polymerase를 이용해 시험관 속에서 합성한후, 아주 소량이긴 하지만 비특이적으로 반대 방향의 RNA가 합성되어 dsRNA가 생성된다는 사실을 관찰했을 뿐 아니라, 전기영동으로 정제한 antisense RNA 및 senseRNA는 유전자 발현을 효율적으로 억제하지 못하는 반면, 흥미롭게도 분리하지 않은 시험재료에서 생성된 dsRNA가 매우 효율적으로 유전자 발현을 억제한다는 사실을 밝혀내었다 (Fire et al., 1998). 이 보고에서 Dr. Fire 그룹은 특정 유전자의 염기 서열에 해당하는 double strand RNA(dsRNA)를 선충 Caenorhabditis elegans의 체내에 넣으면, 그에 대응하는 mRNA가 특이적으로 분해되어 유전자의 기능을 상실하며 또한 투여하는dsRNA는 분해될 mRNA에 비하여 극히 소량이어도 가능하다라는 실험 결과 (RNA interference, RNAi)를 관찰하였으며, 이러한 RNAi 현상의 염기서열 특이성과 기존의 gene knock-out 방법보다 간단하고 신속한 유전자 발현 억제 유도 기능으로 인하여 급속하게 전파되어 선충을 이용한reverse genetics 연구에 활발히 사용되게 되었으며 RNAi는 선충에만 적용되는 것이 아니고, 전 생물계에 응용될 수 있다는 사실이 보고되었다. 즉, RNAi는 21-25 nt의 small-size RNA에 의해 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA가 선택적으로 분해되거나translation이 억제되는 현상으로 siRNA에 의한 mRNA분해와 miRNA에 의한 번역 억제는 사실상 동일한 조절 경로에 속한다고 볼 수 있다. 따라서 이러한 RNAi 기술을 이용하여 텔로머라제의 활성을 억제함으로써 종양의 사멸을 유도 할 수 있을 것으로 기대된다.In 2002, Science Magazine selected small RNA as the 'molecule of the year', and in December 2003, published 10 major scientific achievements in all fields of science, among them inducing RNAi (RNA interference) phenomenon. SiRNA (small interfering RNA) technology has been selected. This fact shows the importance of the small RNA research field and RNAi technology using it and the interest among researchers. The technology is still in its infancy, but it is expected to revolutionize cytogenetic research, and some scientists believe it may be comparable to polymerase chain reaction (PCR). Until now, it took six months to a year to make a cell that stopped expression of a gene, but siRNA-based RNAi technology can control dozens of genes a week. Over the last decade, many researchers and pharmaceutical researchers have been striving to identify genes and develop new drugs by expressing anti-sense oligonucleotides or antisense RNA, but the use of these anti-sense techniques is often used as a control. In the experiment using the sense strand, the phenomenon of suppressing the expression of the target gene was observed, and the interest for the cause was continued. The Fire group synthesized antisense RNA and sense RNA in vitro using RNA polymerase, and observed that very small but non-specifically reversed RNA was synthesized to produce dsRNA. While antisense RNA and senseRNA did not efficiently inhibit gene expression, it was interestingly found that dsRNA produced from unseparated test material inhibits gene expression very efficiently (Fire et al., 1998). In this report, The Fire group puts double stranded RNA (dsRNA) corresponding to the nucleotide sequence of a specific gene into the body of the nematode Caenorhabditis elegans, and the corresponding mRNA is specifically degraded to lose the function of the gene. Compared to the result of experiments (RNA interference, RNAi), it was observed that even a small amount is possible, and it was spread rapidly due to the sequence specificity of such RNAi phenomenon and simple and rapid gene expression inhibition induction function than the existing gene knock-out method. Nematodes have been actively used in research on reverse genetics, and it has been reported that RNAi is not only applied to nematodes but can be applied to the whole biological system. In other words, RNAi is a phenomenon in which mRNA having complementary sequences is selectively degraded or translation is inhibited by 21-25 nt small-size RNA, and mRNA degradation by siRNA and translation inhibition by miRNA are substantially in the same regulatory pathway. It can belong. Therefore, it is expected that the RNAi technology can be used to induce tumor death by inhibiting telomerase activity.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 RNAi 기술을 이용한 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터를 제공하는 데 있다. Therefore, the main object of the present invention is to provide a telomerase inhibitory siRNA expression vector using RNAi technology.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a host cell transformed with the telomerase inhibitory siRNA expression vector of the present invention.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 발현 벡터로 부터 발현된 텔로머라제 억제 siRNA를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention to provide a telomerase inhibitory siRNA expressed from the expression vector of the present invention.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터 또는 siRNA의 항암 또는 줄기세포의 분화조절용 유전자 치료제로서의 용도를 제공하는 데 있다.Still another object of the present invention is to provide a telomerase-inhibiting siRNA expression vector or siRNA of the present invention as a gene therapy agent for controlling anti-cancer or differentiation of stem cells.

본 발명은 텔로머라제 활성을 발현 siRNA를 이용하여 억제시켜 종양 특이적 항암 효과나 줄기 세포의 분화를 조절하는 것에 관한 것이다. 텔로머라제는 크게 RNA 주형 부위 (hTR)와 역전사 효소의 활성을 갖는 hTERT 부위로 이루어진다. 현재까지의 연구 결과로는 텔로머라제의 RNA 주형 부위 (hTR) 를 억제 시켰을 때 가장 큰 효과를 본 것으로 보고되고 있다. 또한 Kondo 등에 의하면 텔로머라제 mRNA를 MFOLD 프로그램을 사용해 분석한 결과 가장 개방된 부위 (75~96 레지듀)를 합성 올리고머로 억제 시킬 경우 암세포의 사멸 유도 효과를 본 것으로 보고하고 있다 (Kondo et al., 1998). 따라서 본 발명에서는 siRNA 발현 벡터에 텔로머라제 개방 hTR 부위에 대한 siRNA 발현 시퀀스를 삽입하여, 여기서 전사된 siRNA에 의한 텔로머라제 활성을 억제시키는 벡터를 제공한다. 또한 최적의 siRNA 텔로머라제 목적 부위를 찾기 위해 www.invivogen.com, www.oligoengine.com, www.genescript.com, www.wistar.com, www.ambion.com 등 인터넷상의 siRNA 합성 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 선택 기준은 Tuschl 등이 제시한 기준, 즉, 50% 이하의 GC contents를 갖을 것, 제어 단백질의 결합부위를 피하기 위해 적어도 첫 codon으로부터 50~100 nt 아래 부위일 것, 최소의 2차 구조를 갖을 것, 적어도 3 염기의 반복이 없을 것, 엑손-인트론 경계부위가 아닐 것, 다른 부위와 유사성을 갖지 않을 것 등이다 (Elbashir et al., 2002). 이들 기준에 의하면 telomerase template RNA 의143~163 부위가 siRNA에 가장 적당한 부위로 선정되었다. BLASTN 서치 결과 이 부위는 인간 게놈에서 hTR 부위를 제외하고 어떤 부위와도 유사성을 보이지 않아 siRNA 에 가장 이상적인 부위임을 알 수 있다.The present invention relates to the inhibition of telomerase activity using expression siRNAs to regulate tumor specific anticancer effects or stem cell differentiation. Telomerase consists largely of the hTERT site with the activity of the RNA template site (hTR) and reverse transcriptase. To date, research has been reported to have the greatest effect when inhibiting the RNA template region (hTR) of telomerase. Also, according to Kondo et al., The analysis of telomerase mRNA using the MFOLD program showed the effect of killing cancer cells when the most open sites (75-96 residues) were inhibited with synthetic oligomers (Kondo et al. , 1998). Accordingly, the present invention inserts an siRNA expression sequence for a telomerase open hTR site into an siRNA expression vector, thereby providing a vector that inhibits telomerase activity by the transcribed siRNA. In addition, siRNA synthesis software, such as www.invivogen.com, www.oligoengine.com, www.genescript.com, www.wistar.com, www.ambion.com, can be used to find the optimal siRNA telomerase target site. Analyzed. The selection criteria should be those suggested by Tuschl et al., Ie less than 50% GC contents, at least 50-100 nt below the first codon to avoid binding sites of control proteins, with minimal secondary structure. No repeats of at least 3 bases, no exon-intron boundaries, no similarity to other sites (Elbashir et al., 2002). According to these criteria, 143-163 sites of telomerase template RNA were selected as the most suitable sites for siRNA. BLASTN search results show that this site is the most ideal site for siRNA because it shows no similarity to any site except the hTR site in the human genome.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 siRNA의 발현을 개시할 수 있는 프로모터, 텔로머라제 주형 hTR의 유전자 단편, 및 폴리 아데닌화 신호를 전사방향으로 연결되어 포함하는 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a telomerase inhibitory siRNA expression comprising a promoter capable of initiating the expression of siRNA, a gene fragment of telomerase template hTR, and a polyadenylation signal linked in the transcriptional direction. Provide a vector.

본 발명의 발현 벡터에 있어서, 상기 프로모터는 siRNA의 발현을 개시할 수 있는 어떤 프로모터도 가능하나, 짧은 RNA transcript를 전사하는 RNA polymerase III (pol III) promoter중에서 선택하는 것이 좋으며, 대부분의 siRNA의 센스 사슬(sense strand)의 5' 말단은 G 또는 C로 끝나므로 G 또는 C의 전사를 효율적으로 개시할 수 있는 프로모터를 선택하는 것이 좋다. 바람직하게는, 본 발명의 프로모터는 U6 프로모터(GenBank # X07425), H1 프로모터(GenBank # NM_005319), 또는 CMV 프로모터(GenBank # AB085641)인 것을 특징으로 한다. In the expression vector of the present invention, the promoter may be any promoter capable of initiating the expression of siRNA, but it is preferable to select among RNA polymerase III (pol III) promoters that transcrib short RNA transcript, and most siRNA senses Since the 5 'end of the sense strand ends with G or C, it is better to select a promoter capable of efficiently initiating G or C transcription. Preferably, the promoter of the present invention is characterized in that the U6 promoter (GenBank # X07425), H1 promoter (GenBank # NM_005319), or CMV promoter (GenBank # AB085641).

본 발명의 발현 벡터에 있어서, 상기 텔로머라제 주형 hTR의 유전자 단편은 텔로머라제 주형 hTR(GenBank # NR_001566)의 75~96nt에 해당하는 표적서열을 가질 수 있으나, 바람직하게는 텔로머라제 주형 hTR의 143~163 nt에 해당하는 서열번호 5의 염기서열과 이와 3-10 염기의 루프(loop) 영역으로 연결된 서열번호 5에 역상보적인(reverse complementary) 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 상기 텔로머라제 주형 hTR의 유전자 단편은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.In the expression vector of the present invention, the gene fragment of the telomerase template hTR may have a target sequence corresponding to 75 ~ 96nt of the telomerase template hTR (GenBank # NR_001566), but preferably the telomerase template hTR And a reverse complementary base sequence of SEQ ID NO: 5 corresponding to 143 to 163 nt of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 5 connected to a loop region of 3-10 bases. Preferably, the gene fragment of the telomerase template hTR is characterized in that it comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명의 발현 벡터에 있어서, 상기 루프(loop) 영역은 표적서열의 센스서열과 안티센스서열을 고리로 연결하여 전사된 siRNA가 헤어핀(hairpin)구조를 형성하도록 한다. 이러한 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스서열과 안티센스서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3-10 정도의 염기를 가지고 있으면 족하다. 종래에 siRNA의 루프 영역으로 많이 사용되어온 예들은 다음과 같다: AUG (Sui et al., (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. US A 99(8): 5515-5520), CCC (Paul et al., (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology 20 : 505-508), UUCG (Lee et al., (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnology 20 : 500-505), CCACC (Paul et al., (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology 20 : 505-508), CTCGAG, AAGCUU (Editors of Nature Cell Biology (2003) Whither RNAi, Nat Cell Biol. 5:489-490), CCACACC (Paul et al., (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology 20 : 505-508), UUCAAGAGA (Yu et al., (2002) RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9) : 6047-6052), 및 TTGATATCCG(www.genscript.com의 default spacer).In the expression vector of the present invention, the loop region connects the sense sequence and the antisense sequence of the target sequence by a ring so that the transcribed siRNA forms a hairpin structure. This loop region has no special meaning in the sequence, and it only needs to have 3-10 bases in order to connect the sense sequence and the antisense sequence at appropriate intervals. Examples that have been widely used as loop regions of siRNAs are as follows: AUG (Sui et al., (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc. Natl. Acad. Sci. US A 99 (8): 5515-5520), CCC (Paul et al., (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells.Nature Biotechnology 20: 505-508), UUCG (Lee et al., (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.Nature Biotechnology 20: 500-505), CCACC (Paul et al., (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells.Nature Biotechnology 20: 505 -508), CTCGAG, AAGCUU (Editors of Nature Cell Biology (2003) Whither RNAi, Nat Cell Biol. 5: 489-490), CCACACC (Paul et al., (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology 20: 505-508), UUCAAGAGA (Yu et al., (2002) RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.Proc.Nat Acad. Sci. USA 99 (9): 6047-6052), and TTGATATCCG (default spacer at www.genscript.com).

본 발명의 발현 벡터에 있어서, 벡터는 본 발명의 표적 서열을 siRNA로 발현할 수 있는 종래 알려진 어떤 siRNA 발현 벡터도 사용할 수 있다. 예컨대,Promega 제품으로 GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System(Cat.#'s C8750, C8760, C8770, C8780, C8790), siLentGene™ U6 Cassette RNA Interference System (Cat.# C7800), T7 RiboMAX™ Express RNAi System (Cat.# P1700), siSTRIKE™ U6 Hairpin Cloning Systems (Cat.#'s C7890, C7900, C7910, C7920) 및 siLentGene™ -2 U6 Hairpin Cloning Systems (Cat.#'s C7860, C8060, C8070, C8080) 등을 사용할 수 있으며, Genscript 제품으로 pRNA-U6.1 (Cat.#'s SD1201, SD1202, SD1207), pRNATin-H1.2 (Cat.#'s SD1223, 1224) 및 pRNA-H1.1/Adeno (Cat.# SD12009) 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명은 상기 텔로머라제 주형 hTR의 유전자 단편이 U6 프로모터와 폴리 아데닌화 신호사이의 다클로닝부위에 삽입되어 제조되는 것을 특징으로 하는 도 1c의 개열지도를 갖는 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터 pUsh143를 제 공한다.In the expression vector of the present invention, the vector may use any conventionally known siRNA expression vector capable of expressing the target sequence of the present invention as siRNA. For example, Promega products include the GeneClip ™ U1 Hairpin Cloning System (Cat. # 'S C8750 , C8760 , C8770 , C8780 , C8790 ), the siLentGene ™ U6 Cassette RNA Interference System (Cat. # C7800 ), and the T7 RiboMAX ™ Express RNAi System (Cat . # P1700 ), siSTRIKE ™ U6 Hairpin Cloning Systems (Cat. # 'S C7890 , C7900 , C7910 , C7920 ) and siLentGene ™ -2 U6 Hairpin Cloning Systems (Cat. #' S C7860 , C8060 , C8070 , C8080 ) GenRNA products available include pRNA-U6.1 (Cat. # 'S SD1201, SD1202, SD1207), pRNATin-H1.2 (Cat. #' S SD1223, 1224), and pRNA-H1.1 / Adeno (Cat # SD12009). Preferably, the present invention is a telomerase inhibitory siRNA having a cleavage map of FIG. 1C, wherein the gene fragment of the telomerase template hTR is inserted into the polycloning region between the U6 promoter and the poly adenization signal. Expression vector pUsh143 is provided.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a host cell transformed with the telomerase inhibitory siRNA expression vector of the present invention.

본 발명의 숙주세포는 예컨대 CaCl2 나 electroporation 법과 같은 종래 알려진 형질전환방법에 의해 본 발명의 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터가 주입되어 발현될 수 있는 어떤 숙주세포도 가능하나, 바람직하게는 본 발명의 siRNA 발현 벡터 pUsh143로 형질전환된 대장균 균주(수탁번호: KCCM 10605) 를 특징으로 한다.The host cell of the present invention may be any host cell which can be expressed by injecting the telomerase inhibitory siRNA expression vector of the present invention by a conventionally known transformation method such as CaCl 2 or electroporation, but preferably E. coli strain (Accession No .: KCCM 10605) transformed with siRNA expression vector pUsh143.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 텔로머라제 주형 hTR의 143-163 nt에 해당하는 서열번호 5의 RNA 염기서열을 포함하는 텔로머라제 억제 siRNA를 제공한다.To achieve another object of the present invention, the present invention provides a telomerase inhibitory siRNA comprising an RNA sequence of SEQ ID NO: 5 corresponding to 143-163 nt of the telomerase template hTR of the present invention.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 5의 RNA 염기서열과 이와 3-10 염기의 루프(loop) 영역으로 연결된 서열번호 5에 역상보적인(reverse complementary) RNA 염기서열을 포함하는 헤어핀구조의 텔로머라제 억제 siRNA를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention includes an RNA base sequence of SEQ ID NO: 5 and a reverse complementary RNA base sequence of SEQ ID NO: 5 linked to a loop region of 3-10 bases thereto. To provide a telomerase inhibitory siRNA of the hairpin structure.

본 발명의 상기 헤어핀 구조 텔로머라제 억제 siRNA는 세포내에서 다이서(dicer)에 의해 절단되어 단일가닥의 siRNA가 되어 표적 mRNA를 분해하는 활성을 나타낸다.The hairpin structure telomerase inhibitory siRNA of the present invention is cleaved by a dicer in a cell to become a single-stranded siRNA, and exhibits the activity of degrading target mRNA.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터 또는 이로부터 발현된 텔로머라제 억제 siRNA를 유효성분 으로 함유하는 항암 유전자 치료제를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides an anticancer gene therapeutic agent containing the telomerase inhibitory siRNA expression vector of the present invention or a telomerase inhibitory siRNA expressed therefrom as an active ingredient.

본 발명의 텔로머라제 억제 siRNA에 의해 텔로머라제 활성이 억제되면 항암 효과를 나타낼 수 있다는 것은 Kondo 등 (1998, 2000)에 안티센스 텔로머라제를 처리하면 malignant glioma cell 이나 prostate cancer cell의 사멸이 유도된다고 기술된 점에 의해 뒷받침된다.Inhibition of telomerase activity by the telomerase inhibitory siRNA of the present invention may have an anticancer effect. Treatment of antisense telomerase by Kondo et al. (1998, 2000) induces the death of malignant glioma cells or prostate cancer cells. It is supported by what is stated.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터 또는 이로부터 발현된 텔로머라제 억제 siRNA를 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 분화조절용 유전자 치료제를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a gene therapy agent for controlling the differentiation of stem cells containing the telomerase inhibitory siRNA expression vector of the present invention or a telomerase inhibitory siRNA expressed therefrom as an active ingredient. .

본 발명의 텔로머라제 억제 siRNA에 의해 텔로머라제 활성이 억제되면 줄기세포의 분화 조절 효과를 나타낼 수 있다는 것은 Chang 등 (1997)에 배아줄기세포와 조혈모세포에서 텔로머라제의 활성을 조절시 "differentiation therapy"가 가능하다고 기술된 점에 의해 뒷받침된다.Inhibition of telomerase activity by the telomerase inhibitory siRNA of the present invention may have an effect of regulating the differentiation of stem cells in Chang et al. (1997), when controlling telomerase activity in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. is supported by what is described as possible.

본 발명의 유전자요법 치료제는 본 발명의 유효성분인 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터 또는 이로부터 발현된 텔로머라제 억제 siRNA 외에 생물제제에 통상 사용되는 안정화제 및 담체, 보조 활성성분 등을 더 포함할 수 있으며, 세포외(ex-vivo) 주사제 형태로 인체에 투여될 수 있다. 이 때 환자에게 투여될 siRNA 발현벡터 또는 siRNA의 적정 수는 환자의 중한 상태에 따라 다르나 바람직하게는 1X109~1X1012 pfu 정도이다.In addition to the telomerase inhibitory siRNA expression vector or the telomerase inhibitory siRNA expressed therefrom, the gene therapy therapeutic agent of the present invention may further include stabilizers and carriers commonly used in biologics, auxiliary active ingredients, and the like. It may be administered to the human body in the form of ex-vivo injections. At this time, the appropriate number of siRNA expression vector or siRNA to be administered to the patient depends on the patient's severe condition, but is preferably about 1 × 10 9 to 1 × 10 12 pfu.

본 발명은 항암 유전자 요법 및 줄기 세포 분화 조절에 사용될 수 있는 상기 플라스미드 벡터를 제조하는 데 필요한 siRNA 합성 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 상기 siRNA 발현 벡터를 만들기 위해 두 시발체 (서열번호 1, 서열 번호 2 및 서열번호 3, 서열번호 4)를 상보적으로 합성했으며 두 시발체 끝에는 제한 효소 자리를 넣어 클로닝을 용이하게 하였다.The present invention provides a method of siRNA synthesis necessary to prepare the plasmid vector that can be used for anticancer gene therapy and stem cell differentiation control. Specifically, the present invention synthesized two primers (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4) to make the siRNA expression vector, and put the restriction enzyme sites at the ends of the two primers to facilitate cloning. It was.

본 발명에서 개발된 플라스미드 벡터를 pU6sh75, pU6sh143 으로 명명하고 이들 중 텔로머라제 활성 억제 효과가 우수한 pU6sh143 플라스미드를 갖는 대장균군을 2004년 11월 04일에 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존센터(KCCM)에 기탁하였다 (수탁번호 : KCCM 10605).The plasmid vectors developed in the present invention are named pU6sh75 and pU6sh143, and among them, the Escherichia coli group having the pU6sh143 plasmid having an excellent inhibitory effect on telomerase activity, the Korean Microbial Conservation Center (KCCM), an international depository institution under the Budapest Treaty on November 04, 2004 (Accession number: KCCM 10605).

본 발명은 siRNA 발현하는 텔로머라제 활성 억제 벡터를 제공한다. 본 발명의 아데노바이러스를 제조하기 위하여, 아데노바이러스의 게놈 DNA에서 E1 유전자 부위를 제거하고 그 자리에 안티센스 텔로머라제 DNA를 포함하는 발현 카세트를 대신 삽입함으로써 안티센스 텔로머라제를 생산할 수 있는 발현 벡터를 제조한다. 이를 위한 벡터의 디자인을 위해 짧은 RNA transcript를 전사하는 RNA polymerase III (pol III) promoter중 U6 promoter를 사용하였다. U6 promoter로부터 siRNA target sequence의 sense 및 anti-sense sequence가 4 nt loop를 사이에 두고 위치하며 발현되어 small hairpin 구조의 RNA (shRNA)가 합성되게 된다. 이렇게 합성된shRNA는 세포 내에 존재하는siRNA processing enzyme (Dicer or Rnase III)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 target gene의 silencing을 유도하게 된다. The present invention provides telomerase activity inhibition vectors that express siRNA. In order to prepare the adenovirus of the present invention, an expression vector capable of producing antisense telomerase by removing the E1 gene region from the genomic DNA of the adenovirus and inserting an expression cassette containing antisense telomerase DNA in its place. Manufacture. For the design of the vector, we used U6 promoter among RNA polymerase III (pol III) promoters that transcrib short RNA transcripts. From the U6 promoter, the sense and anti-sense sequences of siRNA target sequences are located with 4 nt loops in between to express small hairpin RNA (shRNA). The synthesized shRNA is converted into siRNA having the correct structure by siRNA processing enzyme (Dicer or Rnase III) present in the cell, thereby inducing silencing of the target gene.

구체적으로 본 발명은 U6 promoter, 다클로닝 부위(multiple cloning site) 및 polyA 신호로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 siRNA 발현 벡터 pU6shX (벡터 코어에이사 제품, 한국)를 이용한다. SiRNA 발현부위는 각각 두 시발체 (서열번호 1, 2 와 서열 번호 3,4)를 합성 후 상보 결합시켜 발현 벡터 pU6shX의 다클로닝 부위의 EcoRI과 XbaI 제한효소 부위에 삽입하고 siRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터 pU6sh75, pU6sh143를 제조한다 (도 1 참조).Specifically, the present invention uses siRNA expression vector pU6shX (Vector Core Inc., Korea) comprising an expression cassette consisting of a U6 promoter, a multiple cloning site and a polyA signal. SiRNA expression sites are expressed by synthesizing two primers (SEQ ID NO: 1, 2 and SEQ ID NO: 3,4) and then complementarily inserting them into the EcoRI and XbaI restriction enzyme sites of the polyclonal region of the expression vector pU6shX and expressing siRNA. The vectors pU6sh75, pU6sh143 are prepared (see FIG. 1).

상기 siRNA 발현벡터가 텔로머라제 활성을 억제하는지 알아보기 위하여 텔로미어 반복 중합 연쇄 반응 (telomeric repeat amplification protocol TRAP)으로 측정하여 텔로머라제 활성억제 효과를 확인한다 (도 3 참조). In order to determine whether the siRNA expression vector inhibits telomerase activity, the effect of telomerase activity inhibition is confirmed by measuring by telomere repeat amplification protocol TRAP (see FIG. 3).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예 1: siRNA 발현 벡터의 제조Example 1: Preparation of siRNA Expression Vectors

본 발명은 siRNA 발현 벡터를 제조하기 위하여, U6 promoter, 다클로닝 부위 및 polyA 신호로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 pU6shX (도 1c, VCA-shPlasmid small hairpin RNA expression vector; 벡터코어에이사 , 한국)를 이용하였다.The present invention provides an expression vector pU6shX comprising an expression cassette consisting of a U6 promoter, a polyclonalization site, and a polyA signal to prepare an siRNA expression vector (FIG. 1C, VCA-sh Plasmid small hairpin RNA expression vector; ) Was used.

본 발명의 siRNA를 세포 내에서 생산할 수 있는 siRNA 발현 벡터를 제조하기 위하여, 합성한 올리고머의 양 끝에 제한 효소인 EcoRI과 XbaI 자리를 갖는 2 쌍의 시발체를 제조하였고 (서열번호1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4) 이를 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA 버퍼에서 90 ℃ 10 분, 55 ℃ 4시간 방치하여 상보 결합시키고(도 1a) 이를 상기 발현 벡터 pU6shX(도 1c)의 다클로닝 부위에 존 재하는 EcoRI/ XbaI 제한효소 부위에 삽입하였다. 그 결과, siRNA 발현 벡터 pU6sh75, pU6sh143을 제조하였다 (도 1d 참조). 이 발현벡터에서 U6에 의해 전사되면 도 1b의 헤어핀 구조의 siRNA가 발현된다.In order to prepare siRNA expression vectors capable of producing siRNA of the present invention, two pairs of primers having restriction enzymes EcoRI and XbaI sites at both ends of the synthesized oligomer were prepared (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) it was complementarily bound to 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA buffer at 90 ° C. for 10 minutes and 55 ° C. for 4 hours (FIG. 1A), and this expression vector pU6shX (FIG. 1C). It was inserted into the EcoRI / XbaI restriction enzyme site present in the polycloning site of. As a result, siRNA expression vectors pU6sh75 and pU6sh143 were prepared (see FIG. 1D). When transcribed by U6 in this expression vector, siRNA of the hairpin structure of FIG. 1B is expressed.

실시예 2: 각종 세포주의 배양Example 2: Culture of Various Cell Lines

본 발명의 siRNA 발현 벡터가 암 세포 및 줄기 세포에 작용하여 텔로머라제 억제 시키는지 조사하기 위하여, 자궁 경부암 세포주인 HeLa (한국 세포주 은행 KCLB # 10002), 인간 배아줄기 세포인 SNU-3 embryonic stem cells (ESC) (서울대 문신용 교수), 정상 사람 간엽 줄기 세포 (MSC) (미국 바이오 휘테커 사 (Bio-whittaker, USA))를 사용하였다. 간엽 줄기세포는 간엽 줄기 세포 성장 배지 (MSCGM)을 사용하여 37℃ 5% CO2 의 조건에서 배양하였다. 대조군으로는 텔로머라제 활성을 갖지 않는 인간 정상 피부 피브로브라스트 세포인 Wi-38(한국 세포주 은행 KCLB # 10075)를 사용하였다. 자궁경부암 세포주 HeLa와 대조군인 인간 정상피부 피브로브라스트 세포인Wi-38등은 10% 소태아 혈청을 포함하는 배지 RPMI1640 에서 배양하여 사용하였다.To investigate whether the siRNA expression vector of the present invention acts on cancer cells and stem cells to inhibit telomerase, HeLa (cervical cancer cell line KCLB # 10002), SNU-3 embryonic stem cells, human embryonic stem cells (ESC) (Professor of Tattoo, Seoul National University), normal human mesenchymal stem cells (MSC) (Bio-whittaker, USA) were used. Mesenchymal stem cells were cultured at 37 ° C. 5% CO 2 using mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM). As a control group, Wi-38 (Korean Cell Line Bank KCLB # 10075), which is a human normal skin fibroblast cell having no telomerase activity, was used. Cervical cancer cell line HeLa and control human normal skin fibroblast cells Wi-38 and the like were cultured in a medium RPMI1640 containing 10% fetal bovine serum.

실시예 3: 텔로머라제 활성 억제 효과Example 3: Effect of Inhibiting Telomerase Activity

실험 세포주의 텔로머라제 활성 정도를 알아보기 위해 2,000개의 세포들을 이용하여 TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA Kit (로쉬사, 독일)을 사용하여 텔로미어 반복 중합 방법 (telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay) 으로 측정하였다(Kim et al., 1994). 배양한 세포를 lysis시켜 TS oligonucleotide를 extract와 같이 넣어주면 TS oligonucleotide에 TTAGGG 의 반복된 염기를 연장시키게 되는데 여기에 CX primer를 넣어 주고 thermocycler를 이용하면 여러개의 크기로 증폭이 된는데 이것을 TRAP(telomeric repeat amplification protocol) assay라고 하며 이 product를 ELISA quantitative incorporation assay와 polyacrylamide gel 전기영동을 통해 telomerase activity를 측정하였다. 그 결과 정상 세포를 제외한 나머지 세포주에서 모두 강력한 텔로머라제 활성도를 측정할수있었고 자궁경부암 세포주인 HeLa의 텔로머라제 활성도가 가장 높았다 (도 2 참조).In order to determine the degree of telomerase activity of the experimental cell line, 2,000 cells were measured using a TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA Kit (Roche, Germany) using a telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay ( Kim et al., 1994). After lysing the cultured cells and adding TS oligonucleotide with extract, the repeated base of TTAGGG is extended to TS oligonucleotide. CX primer is added here and amplified to several sizes using thermocycler. This is TRAP (telomeric repeat) Telomerase activity was measured by ELISA quantitative incorporation assay and polyacrylamide gel electrophoresis. As a result, strong telomerase activity was measured in all cell lines except normal cells, and telomerase activity of HeLa, the cervical cancer cell line, was the highest (see FIG. 2).

다음은 완성된 siRNA 발현 플라스미드에 의한 텔로머라제 활성 억제 효과를 조사하기 위하여 35-mm에 105 세포를 배양하여 2 ㎍ 의 siRNA expressing plasmids(실시예 1) 와 0.5 ㎍ 의 pSV-beta-galactosidase control plasmid vector (Promega, USA)를 사용하여 5 시간동안 37℃에서 배양하였다. 트랜스팩션 시약으로는 FuGENETM6 (Roche, Germany)을 가용하였다. 그 후 3 ml 성장 배지를 첨가하여 16시간 더 배양 한 후 48 시간 후 2,000 개의 세포를 이용하여 텔로머라제 활성도를 측정하였다 (도 3 참조). pU6sh75에 의한 HeLa, MSC, ES의 텔로머라제 억제 효과는 각각 21%, 32%, 37% 이였고, pU6sh143은 33%, 43%, 46% 여서 pU6sh143의 텔로머라제 억제 효과가 더 뛰어났다.Next, in order to investigate the inhibitory effect of telomerase activity by the finished siRNA expression plasmid, 10 5 cells were cultured at 35-mm and 2 μg of siRNA expressing plasmids (Example 1) and 0.5 μg of pSV-beta-galactosidase control The cells were incubated at 37 ° C. for 5 hours using a plasmid vector (Promega, USA). FuGENETM6 (Roche, Germany) was used as a transfection reagent. Thereafter, 3 ml growth medium was added thereto, followed by further incubation for 16 hours, and then telomerase activity was measured using 2,000 cells after 48 hours (see FIG. 3). The telomerase inhibitory effects of HeLa, MSC, and ES by pU6sh75 were 21%, 32%, and 37%, respectively, and pU6sh143 was 33%, 43%, and 46%, respectively.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 siRNA 발현 벡터는 암세포 및 줄기 세포 의 텔로머라제 활성의 조절이 가능하고 이로써 암세포를 사멸시키거나 성장을 억제시키거나 줄기세포의 분화조절에 이용이 가능하다. 또한 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터에 의한 부작용이 없고 인체 게놈 중 유사 부위가 존재하지 않아 텔로머라제 특이적 활성 억제가 가능하다. 본 발명의 siRNA 발현 벡터는 기존의 안티센스 올리고머나 바이러스 벡터에 비해 독성이나 부작용이 적은 반면 기존의 안티센스 올리고머보다 월등하게 우수한 효과를 내는 것으로 생각되어 항암 유전자 요법이나 줄기세포 분화 조절에 사용하는 경우 매우 우수한 안전성 및 효과를 나타내게 된다.As described above, the siRNA expression vector of the present invention can regulate the telomerase activity of cancer cells and stem cells, thereby killing cancer cells, inhibiting growth, or controlling the differentiation of stem cells. In addition, the expression vector has no side effects caused by the viral vector and there is no similar site in the human genome, thereby enabling the inhibition of telomerase specific activity. The siRNA expression vector of the present invention is less toxic or side effects than conventional antisense oligomers or viral vectors, but it is thought to have a superior effect compared to the existing antisense oligomers and is very excellent when used for anticancer gene therapy or stem cell differentiation control. Safety and effectiveness.

[참고문헌][references]

A.I.Glukhov, O.V. Zimnik and S.E. Severin. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells in vitro by antisense oligonucleotides. Bioche. and BioPhy. Res. Comm. 248, 368-371 (1998)AIGlukhov, OV Zimnik and SE Severin. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells in vitro by antisense oligonucleotides. Bioche. and BioPhy. Res. Comm . 248, 368-371 (1998)

Bhaswati P. and Nitai. P. Detection of telomerase activity in Chinese hamster V79 cells and its inhibition by 7-deaza-deoxy guanosine triphosphate and (TTAGGG)4 in vitro. Bioche. and BioPhy. Res. Comm. 251, 620-624 (1998)Bhaswati P. and Nitai. P. Detection of telomerase activity in Chinese hamster V79 cells and its inhibition by 7-deaza-deoxy guanosine triphosphate and (TTAGGG) 4 in vitro. Bioche. and BioPhy. Res. Comm . 251, 620-624 (1998)

Bisoffi, A.E.Chakerian, M.M.Fore. Inhibition of human telomerase by a retrovirus expressing telomeric antisense RNA. European J. of Cancer vol.14 pp1242-1249 (1998)Bisoffi, AEChakerian, MMFore. Inhibition of human telomerase by a retrovirus expressing telomeric antisense RNA. European J. of Cancer vol. 14 pp1242-1249 (1998)

Cheng, A.J., Liao, S.K., Chow, S.E., Chen, J.K., Wang, T.C., Differential inhibition of telomerase activity during induction of differentiation in hematopoietic, melanoma, and glioma cells in culture. Biochem Biophys Res Commun., 237, 438-444 (1997). Cheng, AJ, Liao, SK, Chow, SE, Chen, JK, Wang, TC, Differential inhibition of telomerase activity during induction of differentiation in hematopoietic, melanoma, and glioma cells in culture. Biochem Biophys Res Commun., 237, 438-444 (1997).

David Wynfold and David Kipling Telomerase. Cancer and the knockout mouse. Nature vol.389 pp.551-552 (1997)David Wynfold and David Kipling Telomerase. Cancer and the knockout mouse. Nature vol. 389 pp. 551-552 (1997)

Elbashir SM, Harborth J, Weber K, Tuschl T. Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs. Methods. 2002 26:199-213.Elbashir SM, Harborth J, Weber K, Tuschl T. Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs. Methods. 2002 26: 199-213.

Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391,806-811. (1998) Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391,806-811. (1998)

Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PLC, Coviello GM, Wright WE, Weinric SL, Shay JW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266: 2011-2015 (1994).Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PLC, Coviello GM, Wright WE, Weinric SL, Shay JW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266: 2011-2015 (1994).

Kohtaro Fujimoto and Morinobu Takahashi. Telomerase activity in human leukemic cell lines is inhibited by antisense pentadecadeoxynucleotides targeted against c-myc mRNA. Bioche. and BioPhy. Res. Comm.241, 775-781 (1997)Kohtaro Fujimoto and Morinobu Takahashi. Telomerase activity in human leukemic cell lines is inhibited by antisense pentadecadeoxynucleotides targeted against c-myc mRNA. Bioche. and BioPhy. Res. Comm. 241, 775-781 (1997)

Kondo S, Kondo Y, Li G, Silverman RH, Cowell JK.Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA. Oncogene.16:3323-3330 (1998). Kondo S, Kondo Y, Li G, Silverman RH, Cowell JK. Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA. Oncogene. 16: 3323-3330 (1998).

Kondo, Y., Koga, S., Komata, T., and Kondo, S., Treatment of prostate cancer in vitro and in vivo with 2-5A-anti-telomerase RNA component. Oncogene, 19, 2205-2211 (2000).Kondo, Y., Koga, S., Komata, T., and Kondo, S., Treatment of prostate cancer in vitro and in vivo with 2-5A-anti-telomerase RNA component. Oncogene, 19, 2205-2211 (2000).

Lee CT, Wu S, Gabrilovich D, Chen H, Nadaf-Rahrov S, Ciernik IF, Carbone DP. Antitumor effects of an adenovirus expressing antisense insulin-like growth factor I receptor on human lung cancer cell lines. Cancer Res. 1996;56: 3038-41.Lee CT, Wu S, Gabrilovich D, Chen H, Nadaf-Rahrov S, Ciernik IF, Carbone DP. Antitumor effects of an adenovirus expressing antisense insulin-like growth factor I receptor on human lung cancer cell lines. Cancer Res. 1996; 56: 3038-41.

Peng-Sheng Zheng, Tsuyoshi Iwasaka et al. Telomerase activity in gynecologic tumors. Gynecologic oncology 64, 171-175 (1997)Peng-Sheng Zheng, Tsuyoshi Iwasaka et al. Telomerase activity in gynecologic tumors. Gynecologic oncology 64, 171-175 (1997)

Scanlon KJ, Ohta Y, Ishida H, Kijima H, Ohkawa T, Kaminski A, Tsai J, Horng G, Kashani-Sabet M. Oligonucleotide-mediated modulation of mammalian gene expression. FASEB J.9:1288-1296 (1995)Scanlon KJ, Ohta Y, Ishida H, Kijima H, Ohkawa T, Kaminski A, Tsai J, Horng G, Kashani-Sabet M. Oligonucleotide-mediated modulation of mammalian gene expression. FASEB J. 9: 1288-1296 (1995)

Steiner MS, Anthony CT, Lu Y, Holt JT. Antisense c-myc retroviral vector suppresses established human prostate cancer. Hum Gene Ther. 1998;9: 747-755.Steiner MS, Anthony CT, Lu Y, Holt JT. Antisense c-myc retroviral vector suppresses established human prostate cancer. Hum Gene Ther. 1998; 9: 747-755.

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Claims (11)

siRNA의 발현을 개시할 수 있는 프로모터, 텔로머라제 주형 hTR의 143~163 nt에 해당하는 서열번호 5의 염기서열과 이와 3-10 염기의 루프(loop) 영역으로 연결된 서열번호 5에 역상보적인(reverse complementary) 염기서열을 갖는 텔로머라제 주형 hTR의유전자 단편, 및 폴리 아데닌화 신호를 전사방향으로 연결되어 포함하는 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터.A promoter capable of initiating the expression of siRNA, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 corresponding to 143-163 nt of the telomerase template hTR, and a complementary sequence of SEQ ID NO: 5 linked to a loop region of 3-10 bases (Treat complementary) A telomerase inhibitory siRNA expression vector comprising a nucleotide sequence of a telomerase template hTR having a nucleotide sequence, and a poly adenization signal connected in a transcription direction. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터, 또는 CMV 프로모터인 것을 특징으로 하는 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터.The telomerase inhibitory siRNA expression vector of claim 1, wherein the promoter is a U6 promoter, an H1 promoter, or a CMV promoter. 삭제delete 제 1항에 있어서, 상기 텔로머라제 주형 hTR의 유전자 단편은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터.The telomerase inhibitory siRNA expression vector according to claim 1, wherein the gene fragment of the telomerase template hTR comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. 제 4항에 있어서, 상기 텔로머라제 주형 hTR의 유전자 단편이 U6 프로모터와 폴리 아데닌화 신호사이의 다클로닝부위에 삽입되어 제조되는 것을 특징으로 하는 도 1d의 개열지도를 갖는 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터 pUsh143.5. The telomerase inhibitory siRNA expression having a cleavage map of FIG. 1D, wherein the gene fragment of the telomerase template hTR is inserted into the polyclonal region between the U6 promoter and the poly adenization signal. Vector pUsh143. 제 1항, 제 2항, 제 4항 또는 제 5항중 어느 한 항의 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.A host cell transformed with the telomerase inhibitory siRNA expression vector of any one of claims 1, 2, 4 or 5. 제 6항에 있어서, 제 5항의 siRNA 발현 벡터 pUsh143로 형질전환된 대장균 균주(수탁번호: KCCM-10605).The E. coli strain transformed with the siRNA expression vector pUsh143 of claim 5 (Accession No .: KCCM-10605). 텔로머라제 주형 hTR의 143-163 nt에 해당하는 서열번호 5의 RNA 염기서열을 포함하는 텔로머라제 억제 siRNA.A telomerase inhibiting siRNA comprising the RNA sequence of SEQ ID NO: 5 corresponding to 143-163 nt of the telomerase template hTR. 서열번호 5의 RNA 염기서열과 이와 3-10 염기의 루프(loop) 영역으로 연결된 서열번호 5에 역상보적인(reverse complementary) RNA 염기서열을 포함하는 헤어핀구조의 텔로머라제 억제 siRNA.A telomerase inhibitory siRNA having a hairpin structure comprising an RNA nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and a reverse complementary RNA base sequence of SEQ ID NO: 5 linked to a loop region of 3-10 bases thereto. 제 1항, 제 2항, 제 4항 또는 제 5항중 어느 한 항의 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터 또는 이로부터 발현된 텔로머라제 억제 siRNA를 유효성분으로 함유하는 항암 유전자 치료제.An anticancer gene therapeutic agent comprising the telomerase inhibitory siRNA expression vector of any one of claims 1, 2, 4 or 5 or a telomerase inhibitory siRNA expressed therefrom as an active ingredient. 제 1항, 제 2항, 제 4항 또는 제 5항중 어느 한 항의 텔로머라제 억제 siRNA 발현 벡터 또는 이로부터 발현된 텔로머라제 억제 siRNA를 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 분화조절용 유전자 치료제.The gene therapy agent for controlling the differentiation of stem cells containing the telomerase inhibitory siRNA expression vector of any one of claims 1, 2, 4 or 5 or a telomerase inhibitory siRNA expressed therefrom as an active ingredient.
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