KR100634467B1 - 뇌혈관 질환의 진단 키트 - Google Patents

뇌혈관 질환의 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한국인의 혈액으로부터 분리된 DNA로부터 G 프로테인 β3 (GNB3) 유전자타입을 분석하여 GNB3 유전자의 268bp 영역에서의 T/T 타입의 존재 여부를 확인하여, 한국인의 뇌혈관 질환을 진단하는 키트로서, 1) 센스인 5’-TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC - 3’와 안티센스인 5’-GCA GCA GCC CAG GGC TGG C - 3’의 프라이머; 2) BseDI 제한 효소; 3) GNB3 를 전기 영동하기 위한 겔전기영동장치; 및 4) 상기 GNB3의 유전자형에 대한 특이적 염색을 위한 브롬화에티듐을 포함하는 것을 특징으로 하는 한국인의 뇌혈관 질환의 진단 키트에 관한 것이다. 상기와 같이 구성되는 본 발명의 뇌혈관 질환의 진단용 키트는 뇌혈관 질환 발병위험이 높은 유전자형을 용이하게 확인할 수 있다.
뇌졸증, 뇌질환, 유전자형, 진단키트

Description

뇌혈관 질환의 진단 키트{Diagnostic kit for the cerebrovascular disease }
도 1은 본 발명에 따라 처리된 개인의 말초신경에서 분리된 GNB3 다형성을 각 유전자형으로 분리한 아가로스 겔 판의 사진이고,
도 2는 본 발명에 따라 처리된 개인의 말초신경에서 분리된 GNB3 다형성의 다른 유전자형을 갖는 환자군의 LDL 콜레스테롤 농도를 나타낸 그래프이고,
도 3은 뇌출혈(ICH) 환자와 대조군에 있어 GNB3 유전자형의 출현빈도를 도시한 그래프이고,
도 4는 뇌경색(CI) 환자와 대조군에 있어 GNB3 유전자형의 출현빈도를 도시한 그래프이고,
도 5는 뇌졸증 환자와 대조군에 있어 GNB3 유전자형의 출현빈도를 도시한 그래프이다.
본 발명은 뇌혈관 질환의 진단 키트에 관한 것으로, 보다 자세하게는, 특정 유전자의 다형성(polymorphism)과 뇌혈관 질환의 연관성을 밝혀내고 이를 이용하여 뇌혈관 질환의 진단에 사용되는 키트에 관한 것이다.
뇌경색과 뇌출혈로 대표되는 뇌혈관 질환(腦血管 疾患)은 한의학의 중풍(中風)과 매우 유사한 질환이다. 이러한 중풍은 갑작스런 의식장애, 운동장애 및 언어장애 등의 증상이 나타나는 질병으로, 서양의학서는 뇌종양, 수막염, 뇌염 등 중추신경계질환들이 다수 포함되나 뇌졸증(stroke)이 대표적이라 할 수 있다(김영석, 臨床中風學, p.303-8, 317-29, 서원당, 서울, 1997.).
이렇게 한의학의 중풍과 매우 유사한 질환인 뇌졸증은 모든 선진국뿐 아니라 대부분의 개발도상국에서 사망과 장애의 중요한 원인 중 하나이며, 한국에서는 뇌졸증이 사망원인 중 1위를 차지하고 있다(Korea National Statistical Office, Cases & deaths of communicable diseases, 2000.). 뇌혈관 질환의 위험인자로는 나이, 성별, 민족, 유전 등의 교정이 불가능한 것과, 고혈압, 심방세동, 흡연, 고지혈증, 과음, 일과성 뇌허혈, 무증상의 경동맥협착증 등의 교정이 가능한 일차적 위험인자들이 있다(Gorelick, P. B. Stroke prevention: windows of opportunity and failed expectations? A discussion of modifiable cardiovascular risk factors and a prevention proposal. Neuroepidermiology 16(4):163-73, 1997 ; Straandgaard, S. Hypertention and Stroke. J Hypertens. 14(3):23-7, 1996.6,7). 그 밖의 위험인자로 당뇨병, 운동부족, 비만, 심혈관계 질환, 심근경색, 울혈성 심부전, 대동맥궁 죽상경화 등이 뇌졸증의 발생과 많은 관련이 있는 것으로 보고되었다(Sacco, R. L., Gan, R., Boden-Albala, B., Lin, I. F., Kargman, D. E., Hauser, W. A., Shea, S. and Paik, M. C. Leisure-time physical activity and ischemic stroke risk: the Northern Manhattan Stroke Study. Stroke 29(2):380-7, 1998 : Feigin, V. L., Wiebers, D. O., Nikitin, Y. P., O'Fallon, W. M. and Whisnant, J. P. Risk factors for ischemic stroke in a Russian community: a poppulation-based case-control study. Stroke 29(1):34-9, 1998.). 뇌졸증을 일으키는 많은 병태생리학적(病態生理學的) 기전 중 특히 고혈압과 비만은 중요한 위험인자로 볼 수 있다(Calle, E. E., Thun, M. J., Petrelli, J. M., Rodriguez, C. and Heath, C. W. Jr. Body-mass index and mortality in a prospective cohort of U.S. adults. N Engl J Med. 341(15):1097-105, 1999 ; Collins, R., Peto, R., MacMahon, S., Hebert, P., Fiebach, N. H., Eberlein, K. A., Godwin, J., Qizilbash, N., Taylor, J. O. and Hennekens, C. H. Blood pressure, stroke, and coronary heart disease, part 2: effects of short term reductions in blood pressure: overview of randomised drug trials in their epidemiological context. Lancet 335(8693):827-38, 1990 ; Bronner, L. L., Kanter, D. S. and Manson, J. E. Primary prevention of stroke. N Engl J Med. 333(21):1392-400, 1995.).
최근 서양의학에서 특정 유전자의 다형성과 뇌혈관 질환의 연관성에 대한 연구가 집중적으로 이루어지고 있으며, 이러한 연구의 결과로 G-프로테인 β서브유닛 (이하, "GNB3"라 칭함) 유전자의 C825T 알렐(allele)이 본태성 고혈압과 비만에 모두 관련한다는 연구가 각각 보고되어 있다.
그러나, 뇌졸증 발생의 위험률이 어떤 유전적 형질을 가진 자에게서 많이 발현될 수 있는 가에 대해서는 아무런 제안이나 추정도 없었다.
따라서, 본 발명의 목적은 뇌졸증과 같은 뇌질환의 발병 위험인자가 높은 유전자형을 밝혀 간단한 방법으로 한국인의 뇌질환 발병위험이 높은 환자를 진단할 수 있는 키트를 제공하기 위한 것이다.
특히, 본 발명의 다른 목적은 상기 특정 유전자의 다형성과 뇌혈관 질환의 연관성에 대한 연구에서 뇌질환을 일으키는 위험인자가 큰 유전자의 타입을 밝혀내어 이를 이용하여 한국인의 뇌혈관 질환의 진단에 사용되는 뇌혈관 질환 진단용 키트를 제공하기 위한 것이다.
삭제
이에 본 발명자 등은 크로모솜 12p13에 위치하여 G-프로테인의 베타 서브유닛(beta subunit)을 곳곳에서 발현시키며, 250번째의 염기종류에 따라 C/C 타입, T/C 타입, T/T 타입으로 구분되는 GNB3 유전자의 특정 타입이 뇌졸증의 발병과 연관되어 있다는 것을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 뇌혈관 질환의 진단에 사용되는 키트는 1) 센스인 5’-TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC - 3’와 안티센스인 5’-GCA GCA GCC CAG GGC TGG C - 3’의 프라이머; 2) BseDI 제한 효소; 3) GNB3 를 전기 영동하기 위한 겔전기영동장치; 및 4) 상기 GNB3의 유전자형에 대한 특이적 염색을 위한 브롬화에티듐을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구성에 따르면, 상기와 같이 구성되는 뇌혈관 질환의 진단에 사용되는 키트를 사용하여 상기 방법에 따라 분리된 DNA를 상기 키트에 전개하여 특정 타입인 T/T로 확인되면 뇌질환 발병위험이 높은 것으로 판단한다.
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이하에, 상기와 같이 구성되는 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
GNB3 유전자형의 측정은 다음과 같은 단계에 따른 방법에 의해 행하여 질 수 있다.
1) DNA 분리
DNA는 Debomoy등이 사용한 방법을 응용하여 말초정맥혈에서 분리하였다. 즉, 2 ㎖ 마이크로튜브에 1 ㎖의 정맥혈을 넣고 하기의 조성으로된 TKM1 완충액 1 ㎖, 25 ㎕ NP-40을 넣어 세포를 분리한다. TKM1 완충액으로 세정한 후 TKM2 완충액 160 ㎕, 10% SDS 10 ㎕를 넣고 55℃에서 10분간 배양한다. 60 ㎕의 6 M NaCl을 첨가하여 단백질을 침전시킨 후 상청액에 1 ㎖의 100% 에탄올로 DNA를 침전시킨다. 다시 70% 에탄올로 DNA를 세정하여 DNA를 얻어 Tris-EDTA 완충액에 보관하여 사용하였다.
* <TKM1> buffer의 조성:10 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM EDTA
* <TKM2> bufer의 조성:10 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.4 M NaCl, 2 mM EDTA
2) PCR 반응
분리된 DNA의 GNB3 유전자형은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 방법을 통하여 확인한다. 그 방법은 2㎕의 10 ×GeneAmp PCR 완충액(100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, pH 8.3) (PE Biosystem, Norwalk, USA), 2 ㎕의 25 mM MgCl2 용액, 1 ㎕의 5M 각 개시자(sense, 5’-TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC-3’; antisense, 5’-GCA GCA GCC CAG GGC TGG C-3’ (synthesized by Genotech co, Daejun, Korea)), 1 ㎕의 0.1 ㎍/㎕ genomic DNA, 0.5 ㎕의 10 mM dNTPs, 0.4 ㎕의 2.5 U/㎕ AmpliTaq DNA 중합효소(PE Biosystem, Norwalk, USA), 12.1 ㎕ 증류수를 모두 20 ㎕가 되게 하여 다음과 같은 조건에서 PCR하였다. 95℃에서 10분간 변성반응시킨 후 94℃ 1분, 60℃ 45초, 72℃ 1분의 반응을 35 주기(cycle) 실시하고 마지막으로 72℃에서 10분간 배양하였다. PCR은 프로그램가능한 온도 조절기(Programmable Thermal Controller; PTC-100, MJ Research Inc., Watertown, U.S.A.)에서 시행하였다.
표적(target) DNA의 충분한 증폭을 확인하기 위하여 PCR 반응액 중 5 ㎕를 2% 아가로스 겔로 전기영동하였다. 나머지 PCR 반응액은 제한효소인 0.1 U BseDI (Fermentas, Vilnius, Lithuania), 3.3 mM 트리스 아세테이트(Tris acetate), 1.0 mM 마그네슘 아세테이트, 6.6 mM 포타슘 아세테아이트, 0.01 ㎎/㎖ BSA를 이용하여 20㎕가 되게 혼합한 후, 60℃에서 3시간 배양하였다. 이렇게 제한효소 처리한 PCR 반응액은 트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 완충액에서 3% 아가로스 겔로 100 volt로 30분간 전기영동하고 브롬화에티듐(ethidium bromide)으로 스테이닝(staining)한 후 겔-독크 시스템(Gel-Doc system; Photodoc system, Bio-Rad co., USA)을 사용하여 유전자형을 구분하였다.
BseDI은 5-C ↓CNNGG-3 부위를 절단하며, T 알렐은 268 bp에서, C 알렐은 116 bp와 152 bp에서 밴드가 관찰되므로 268 bp만 관찰되면 T/T 타입(homozygote), 116 bp와 152 bp만 관찰되면 C/C 타입(homozygote), 268 bp, 116 bp, 152 bp가 모두 관찰되면 T/C 타입(heterozygote) 이다(도 1참고).
상기한 방법에 따라 구분된 유전자형에서, 뇌경색과 같은 뇌질환자에게서 정상인에 비해 GNB3 유전자의 T/T 타입이 통계적으로 유의하게 높은 수치가 관찰된 다.
상기한 바와 같이 GNB3 유전자는 크로모솜 12p13에 위치하여 G-프로테인의 베타 서브유닛을 곳곳에서 발현시키며, 250번째의 염기종류에 따라 C/C 타입, T/C 타입, T/T 타입으로 구분되는데, GNB3 유전자의 다형성이 뇌졸증과 같은 뇌질환의 발병과 연관되어 있다는 것은 T 알렐이 G-프로테인(주로 Gi protein) 의 활성자극을 증대시킨다는 사실에 바탕한다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 자세히 설명하지만 본 발명의 범위가 여기에 한정되는 것이 아님은 물론이다.
실시예
2000년도에 경희의료원에 입원한 361명의 환자들과 연구에 자발적으로 참여한 199명의 건강한 성인들을 대상으로 뇌혈관 질환의 일반적인 위험인자 (흡연과 음주여부, 고혈압, 당뇨, 허혈성 심장질환, total lipid levels, triglycerides levels, total cholesterol levels, HDL cholesterol levels, LDL cholesterol levels, prothrombine times)와 뇌졸증의 발병율 (뇌경색, 뇌출혈로 구분)이 GNB3 유전자의 다형성과 어떠한 연관성을 갖는가에 대해서 다음과 같이 조사했다.
1. 대상
(1) 환자군 : 2000년 3월 1일부터 2000년 12월 31일까지 경희의료원 한방병원 2내과 병동에 입원한 뇌경색과 뇌출혈 환자 361명을 대상으로 하였다. 뇌 MRI (magnetic resonance imaging)를 시행하여 뇌졸중의 종류에 따라 뇌경색과 뇌출혈의 2군으로 나누어 분석하였다.
(2) 대조군 : 2000년 제2회 한의학국제박람회를 방문한 관람객 중 유전자 검사를 희망하는 199명의 건강한 성인을 대상으로 하였다.
2. 임상기준의 설정
같은 종류의 분석은 모두 동일한 진단도구와 자동분석기를 사용하였으며, 임상검사는 모두 경희의료원에서 행하였다.
(1) 고혈압 : WHO-ISH 기준에 따라 수축기 혈압이 160 ㎜Hg 이상이며 이완기 혈압이 100 ㎜Hg 이상이거나, 혹은 혈압강하제를 복용하는 것을 기준으로 하였다.
(2) 당뇨병 : WHO 기준에 따라 금식시 글루코스 준위(glucose level)가 적어도 140 ㎎/㎗ 이상이거나, 식후 2시간 후, 혹은 75 g의 글루코스를 경구 투여한 후의 글루코스 준위가 적어도 200 ㎎/㎗ 이상인 경우를 기준으로 하였다.
(3) BMI (body mass index ): 체중 (㎏)과 신장 (㎝)의 비율에 의해 측정하였다.
(4) WH ratio (waist and hip circumference ratio): 제중(臍中) 높이의 지름과 둔부의 최대치로 측정하였다.
(5) 흡연습관 : 현재 흡연을 하는가, 하지 않는가로 구분하였다.
(6) 음주여부 : 자가설문지에 의해 음주자와 비음주자로 구분하였다.
(7) 심장질환 과거력 : 허혈성 심장질환이 있었다고 스스로 말한 경우와 임상의에 의해 뇌혈관질환을 제외한 허혈성 심장질환이 있었다고 보고된 경우로 하였다.
(8) 뇌혈관질환 과거력 : 임상의의 진단으로 확정된 뇌졸중이나 일과성 허혈 성 발작 (TIA)이 있었던 경우로 하였다.
3. 피시험자의 GNB3 유전자형의 측정
피시험자의 GNB3 유전자형은 상기 본 발명의 구성에 기술된 방법에 따라, 피험자의 DNA 분리를 분리하고 분리된 DNA의 GNB3 유전자형은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 방법을 통하여 확인하였다.
4. 통계처리
이 실험결과의 데이터는 연속변수의 일반적인 오차를 고려하여 빈도수와 백분율로 요약하였다. 환자군과 대조군 간의 위험인자의 비교는 키-스퀘어 테스트(chi-square test) 또는 원-웨이 아노바 테스트(one-way ANOVA test)를 사용하였다. 위험인자의 유의수준은 95%의 신뢰도로 양측검증을 하였다. 모든 데이터의 분석은 통계프로그램인 윈도우용 SPSS (ver 10.1, SPSS Inc., USA)를 사용하였으며, 유의수준은 p 값 < 0.05로 하였다.
5. 결과
1). 환자군 및 대조군의 일반적 특징
본 실험 대상은 361명의 환자군 (n=278, 뇌경색=CI group/n=83, 뇌출혈=ICH group)과 199명의 대조군으로 구성되어 있다.
총 361명의 환자군은 남자 206명 여자 155명으로 구성되어 있고, 평균연령은 56.00 ±7.76세였다. 환자군 중 뇌경색군은 총 278명으로 남자 159명, 여자 118명, 평균연령은 56.57 ±7.12세였다. 뇌출혈군은 총 83명이며 남자 47명, 여자 37명, 평균연령은 54.41 ±9.29세였다. 뇌경색군과 뇌출혈군, 대조군 사이에 나이와 성별 에 있어 특이할 만한 차이점은 없었다.
2). GNB3 유전자형에 따른 환자의 임상적 특징
GNB3 유전자형에 따른 환자의 임상적 유형은 다음과 같이 요약하였다. 다음 표 1에 나타난 바와 같이 평균연령과 성별은 유전자형에 관계없이 거의 동일하였다.
C/C 타입 T/C 타입 T/T 타입 유의성
N 68 189 104
성별(M/F) 39/29 102/87 65/39 없음
연령(연수) 57.2 ±8.1 56.0 ±7.2 55.6 ±8.1 없음
BMI 와 WH 비에서는 특이할 만한 차이점이 관찰되지 않았으며, 또한 흡연과 음주여부도 유전자형에 따른 차이점은 발견되지 않았다. 고혈압과 당뇨, 허혈성 심장질환의 발병률에서도 통계상 유의한 차이는 없었다. 그 외 상기한 기타 요인에 의해서도 통계적으로 유의한 차이는 없었다.
그러나, LDL 콜레스테롤 농도는 GNB3 유전자 T/T 타입이 다른 유전자형보다 통계적으로 유의하게 낮은 농도를 보였다.(도 2참고).
3). 환자군과 대조군의 GNB3 유전자형
환자군과 대조군(CI group, ICH group) 각각의 GNB3 유전자의 대립형질을 다음 표 2에 요약하였다.
T/T 타입은 대조군보다 환자군에서 더 높은 수치를 나타내고 있으며 (18.6% 대 28.7%), C/C type은 환자군보다 대조군에서 더 높게 나타나고 있다 (23.1% 대 18.8%).
유전자형 알렐
N C/C T/C T/T C 알렐 T 알렐
대조군 199 46(23.1%) 116(58.3%) 37(18.6%) 278(50.8%) 269(49.2%)
전체환자 362 68(18.8%) 189(52.2%) 104(28.7%) 446(48.1%) 482(51.9%)
CI 279 52(18.6%) 143(51.3%) 83(29.7%) 338(47.8%) 369(52.2%)
ICH 83 16(19.3%) 46(55.4%) 21(25.3%) 108(48.9%) 113(51.1%)
GNB3 유전자의 분석결과, 뇌경색과 뇌출혈의 유병율과 GNB3 유전자형의 연관성을 Table Ⅳ에 요약하였는데, GNB3 유전자의 T/T type이 C/C type에 비해 CI group에서 유의하게 높은 수치를 보였다.
도 3, 4, 5에서 볼 수 있는 바와 같이 GNB3 유전자의 T/T 타입이 뇌경색의 유병율과 통계적으로 유의한 연관성을 가지는 것으로 나타났다.
상기와 같이 환자군 중 뇌경색군은 대조군에 비해 GNB3 유전자의 T/T 타입이 통계적으로 유의하게 높은 수치가 관찰되었다. 이상과 같은 결과로 볼 때 한국인에 있어 GNB3 유전자의 T 알렐은 뇌혈관 질환 중 특히 뇌경색과 밀접한 연관성을 가진다는 것을 알 수 있다.
상기와 같이 구성되는 본 발명의 한국인의 뇌혈관 질환 발병위험이 높은 유전자형을 용이하게 확인할 수 있는 뇌혈관 질환 진단용 키트를 제공하는 유용한 발명이다.
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Claims (3)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 한국인의 혈액으로부터 분리된 DNA로부터 G 프로테인 β3 (GNB3) 유전자타입을 분석하여 GNB3 유전자의 268bp 영역에서의 T/T 타입의 존재 여부를 확인하여, 한국인의 뇌혈관 질환을 진단하는 키트로서,
    1) 센스인 5’-TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC - 3’와 안티센스인 5’-GCA GCA GCC CAG GGC TGG C - 3’의 프라이머;
    2) BseDI 제한 효소;
    3) GNB3 를 전기 영동하기 위한 겔전기영동장치; 및
    4) 상기 GNB3의 유전자형에 대한 특이적 염색을 위한 브롬화에티듐을 포함하는 것을 특징으로 하는 한국인의 뇌혈관 질환의 진단 키트.
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