KR100634466B1

KR100634466B1 - 비만발생위험도 진단키트

Info

Publication number: KR100634466B1
Application number: KR1020030059642A
Authority: KR
Inventors: 신민규; 신현대; 홍무창; 배현수; 최현; 이상호; 강문규
Original assignee: 퓨리메드 주식회사
Priority date: 2003-08-27
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2006-10-16
Also published as: KR20050023170A

Abstract

본 발명은 한국인의 혈액으로부터 분리된 DNA로부터 G 프로테인 β3 (GNB3) 유전자타입을 분석하여 GNB3 유전자의 268bp 영역만에서의 T/T 타입과 268bp, 152bp, 116bp 영역 모두에서 관찰되는 T/C 타입의 존재 여부를 확인하여, 한국인의 비만발생 위험도를 진단하는 키트로서, 1) 센스인 5’-TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC - 3’와 안티센스인 5’-GCA GCA GCC AGG GCT GGC - 3’의 프라이머; 2) BseDI 제한 효소; 3) GNB3 를 전기 영동하기 위한 겔전기영동장치; 및 4) 상기 GNB3의 유전자형에 대한 특이적 염색을 위한 브롬화에티듐을 포함하는 것을 특징으로 하는 한국인의 비만발생 위험도를 진단하는 키트를 특징으로 한다.

이에 의하여 비만을 일으키기 쉬운 유전자형을 용이하게 확인할 수 있는 진단용 키트를 제공하는 유용한 발명이다.

비만, 유전자형, 진단키트

Description

비만발생위험도 진단키트{Diagnostic kit for the risk degree of adipogenic occurance }

도 1은 본 발명에 따라 처리된 개인의 말초신경에서 분리된 GNB3 다형성을 각 유전자형으로 분리한 아가로스 겔 판의 사진이고,

도 2는 비만군과 대조군에 있어 GNB3 유전자형의 출현빈도를 도시한 그래프이고,

도 3은 비만군 환자와 대조군에 있어 GNB3 알렐의 출현빈도를 도시한 그래프이다.

본 발명은 비만발생위험도 진단키트에 관한 것으로, 보다 자세하게는, 유전자의 다형성(polymorphism)과 비만의 연관성을 밝힘으로 비만발생위험도를 진단하는 키트에 관한 것이다.

통상 비만의 원인은 환경적 요소와 유전적 요소로 양분할 수 있으며 이 두 요소는 상호간에 영향을 주고 받는다. 환경적 요인으로는 에너지의 축적을 일으킬 수 있는 신체활동량의 감소와 식생활의 이상, 스트레스 등이 있으며, 유전적 요인으로는 지방대사 및 에너지의 소모와 관련된 유전자의 이상이 대부분으로 추정되고 있다. 특히, 비만의 유전적 요인에 대한 장기간의 연구에 의하면, 비만의 결정에 유전적 요인이 40∼70%를 차지하는 것으로 보고 되었다.

최근 특정질환의 유전적 소인에 관한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 심혈관계질환, 2형 당뇨병, 악성 신생물, 알쯔하이머 질환 등의 난치성 질환 뿐 만 아니라 비만과 관련된 유전자 다형성의 특성을 규명하려는 연구가 구미와 일본을 위시한 선진국에서 상당부분 진행되어 왔다. 지금까지 수십 종에 달하는 유전자가 비만과 관련되어 있을 것으로 추정되어 연구가 진행되어 왔으나, 확정적인 유전자는 규명되지 않고 있다. 다만, 외국의 연구에서는 β2-아드레네르직 리셉터(adrenergic receptor), β3-아드레네르직 리셉터, G 프로테인 β3, 도파민 D2 리셉터(Dopamine D2 receptor), 렙틴(Leptin) 리셉터 등의 유전자의 다형성이 비만과 관련성이 높은 것으로 보고 되었으며, 이러한 유전자의 다형성은 인종이나 종족마다 다양하게 발현되므로 각 종족별로 관련된 유전자에 대한 연구가 필수적으로 선행되어야 한다.

비만에 대한 한국인의 유전자 다형성에 대한 연구는 외국에 비해 미미한 상태이며, β2-아드레네르직 리셉터, β3-아드레네르직 리셉터, 렙틴 리셉터, 퍼옥시좀 증식자 활성화 리셉터 감마 2(Peroxisome proliferator activated receptor gamma 2) 유전자 다형성 정도가 보고되었다.

따라서 본 발명자 등은 한국인 비만자의 유전적 소인을 확인하기 위하여 기존 연구에서 비만과 관련성이 높은 것으로 보고된 β2 및 β3-아드레네르직 리셉터와, 한국인에 대해서는 보고된 바 없는 G 프로테인 β3, 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin converting enzyme)와, 비만에 동반되는 심혈관계 질환과 관련성이 높은 것으로 알려져 있으나 비만과의 관련성에 관하여는 보고된 바 없는 메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제(Methylenetetrahydrofolate reductase) 등 5종의 유전자를 선택하여 각 유전자의 다형성 정도와 비만관련 지표들과의 상관성을 알아보아 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 특정 유전자의 다형성과 비만과의 연관성으로 부터 비만을 일으키기 쉬운 유전자의 타입을 밝혀냄으로서 이를 이용하여 비만발생 위험에 노출된 유전자형을 용이하게 감식할 수 있는 키트를 제공하기 위한 것이다.

특히, 본 발명의 목적은 특정 유전자의 다형성과 비만의 발생과의 연관성에 대한 연구를 통해 비만을 일으키기 쉬운 유전자의 타입을 밝혀내어 이를 통해 이러한 유전자를 가진 사람에 있어 특히 식습관 등에 있어 보통 사람보다 특히 유의하게 하여 이의 조절로 비만이 발생하지 않도록 미연에 예방할 수 있는 자료를 제공하기 위한 것이다.

이에 본 발명자 등은 크로모솜 12p13에 위치하여 G-프로테인의 베타 서브유닛(beta subunit)을 곳곳에서 발현시키며, 250번째의 염기종류에 따라 C/C 타입, T/C 타입, T/T 타입으로 구분되는 GNB3 유전자의 특정 타입이 비만발생위험도가 큰 것을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

삭제

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 한국인의 혈액으로부터 분리된 DNA로부터 G 프로테인 β3 (GNB3) 유전자타입을 분석하여 GNB3 유전자의 268bp 영역만에서의 T/T 타입과 268bp, 152bp, 116bp 영역 모두에서 관찰되는 T/C 타입의 존재 여부를 확인하여, 한국인의 비만발생 위험도를 진단하는 키트로서, 1) 센스인 5’-TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC - 3’와 안티센스인 5’-GCA GCA GCC AGG GCT GGC - 3’의 프라이머; 2) BseDI 제한 효소; 3) GNB3 를 전기 영동하기 위한 겔전기영동장치; 및 4) 상기 GNB3의 유전자형에 대한 특이적 염색을 위한 브롬화에티듐을 포함하는 것을 특징으로 하는 한국인의 비만발생 위험도를 진단하는 키트를 특징으로 한다.
이하에, 상기와 같이 구성되는 본 발명을 보다 자세히 설명한다.

삭제

GNB3 유전자형의 측정은 다음과 같은 단계에 따른 방법에 의해 행하여 질 수 있다.

1) DNA 분리

DNA는 Lahiri 등이 사용한 방법을 응용하여 말초정맥혈에서 분리하였다. 즉, 2 ㎖ 마이크로튜브에 1 ㎖의 정맥혈을 넣고 하기의 조성으로된 TKM1 완충액 1 ㎖, 25 ㎕ NP-40을 넣어 세포를 용해한 후, TKM1 완충액으로 세정한 후 TKM2 완충액 160 ㎕, 10% SDS 10 ㎕를 넣고 55℃ 에서 10분간 배양한다. 6 M NaCl을 첨가하여 단백질을 침전시킨 후 100% 에탄올로 DNA를 침전시킨다. 다시 70% 에탄올로 DNA를 세정하여 DNA를 추출하고 Tris-EDTA 완충액에 보관하여 사용하였다.

* <TKM1> 완층액의 조성:10 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 2 mM EDTA

* <TKM2> 완충액의 조성:10 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0.4M NaCl, 2mM EDTA

2) 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 과정

G 프로테인 β3(이하, "GNB3"이라 약칭함) 유전자의 PCR 과정은 다음과 같다. 즉, 추출한 DNA 30ng에 각각 0.5 M의 센스(sense), 안티센스(antisense) 개시자(primer)(서울, 대전, 제노텍, sense: 5'-TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC-3', antisense: 5'-GCA GCA GCC AGG GCT GGC-3')와 0.5U의 AmpliTaq gold DNA 중합효소(Applied Biosystems, USA), 각각의 0.25mM dNTPs, 2.5mM MgCl₂, 10 X PCR 반응 완충액(supplied with AmpliTaq gold DNA polymerase)를 혼합, 최종 부피를 20㎕로 하여 다음과 같은 조건에서 PCR하였다. 즉, 94℃에서 10분간 변성한 후 94 60초, 60 45초, 72 60초의 반응을 35 주기(cycle)로 실시하고 마지막으로 72℃에서 10분간 배양하였다. PCR 반응액은 트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 완충액에서 2% 아가로스 겔로 100 volt, 30분간 전기영동하여 브롬화에티듐(ethidium bromide)으로 스테이닝(staining)한 후 겔-독크 시스템(Gel-Doc system; Photodoc system, Bio-Rad, USA)을 통해 증폭된 밴드를 확인하고, 다시 1U BseDI 제한효소(MBI, Fermentas, Lithuania)로 처리하여 60℃에서 9시간 배양한 후, TAE 완충액에서 3% 아가로스 겔로 100 volt, 30분간 전기영동, 브롬화에티듐으로 스테이닝한 후 겔-독크 시스템을 이용하여 타입을 구분하였다.

상기와 같이 본 발명에서 사용한 개시자로 PCR 반응 후 BseDI 제한효소로 처리하면 T 알렐(allele)은 268bp에서, C 알렐(allele)은 152bp, 116bp에서 관찰되므로 268bp의 밴드만 관찰되면 T/T 타입(homozygote), 152bp, 116bp의 두 밴드만 관 찰되면 C/C 타입(homozygote), 268bp, 152bp, 116bp 밴드가 모두 관찰되면 T/C 타입(heterozygote)이다(도 1참고).

상기한 방법에 따라 구분된 유전자형에서, T/T 타입 또는 T/C 타입의 유전자형을 갖는 사람이 특히 쉽게 비만을 일으킨다.

상기한 바와 같이 GNB3 유전자는 크로모솜 12p13에 위치하여 G-프로테인의 베타 서브유닛을 곳곳에서 발현시키며, 250번째의 염기종류에 따라 C/C 타입, T/C 타입, T/T 타입으로 구분되는데, GNB3 유전자의 T/T 타입 또는 T/C 타입의 유전자형이 특히 한국 사람에 있어 비만을 쉽게 일으키는 것이 확인되며, GNB3 유전자 이러한 특징을 이용하여 쉽게 비만에 걸릴 수 있는 사람을 용이하게 진단할 수 있는 키트를 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 자세히 설명하지만 본 발명의 범위가 여기에 한정되는 것이 아님은 물론이다.

실시예

1. 연구대상

비만군으로는 2000년 9월 1일부터 2002년 3월 31일까지 경희대학교 한의과대학 부속한방병원 재활의학과 비만클리닉에 내원한 한국인 여성 중, 설문지나 문진상 당뇨병이나 심혈관계 질환의 병력이 없는, 체질량지수(Body Mass Index; 이하 BMI)가 27(kg/m2) 이상인 85명을 대상으로 하였다. 대조군으로는 2002년 현재, 경희대학교 한의과대학 한의학과에 재학 중인 자로, 유전자 검사를 희망한 건강한 여학생 지원자 중 BMI가 25(kg/m2) 미만인 80명을 대상으로 하였다.

2. 신체계측, BMI의 계산, 체성분의 측정

신체계측은 신장-체중 자동측정계(HM-202, Fanics, Seoul, Korea)를 이용하여 신장과 체중을 측정하였으며, BMI는 체중(kg)을 미터로 환산한 신장의 제곱([height(m)]2)으로 나눈 값으로 하였다.

BMI = 체중(kg)/[신장(m)]²

허리둘레와 엉덩이둘레는 줄자를 이용하여 호기 후 편한 상태에서 기립시 배꼽을 지나는 선을 허리둘레 길이(waist circumference)로 하였고, 엉덩이 둘레 중 가장 큰 둘레선을 엉덩이둘레 길이(hip circumference)로 하여 측정한 뒤 허리엉덩이둘레비(waist hip ratio; 이하, "WHR"이라 칭함)를 구하였다.

WHR = 허리둘레 길이(cm)/엉덩이둘레 길이(cm)

신체전기저항의 정도를이용하여 체성분을 측정하는 체성분분석기(Inbody2.0, Biospace Co. Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 체지방량을 측정하였고, 체중에서 체지방이 차지하는 비율을 퍼센트로 환산하여 체지방률(body fat distribution ratio)을 구하였다.

3. 공복시 혈당, 간효소 수치 및 혈청지질의 측정

비만환자의 공복시 혈당, 간효소 수치 및 혈청지질의 측정은 공복 10시간 후에 10ml의 혈액을 채취하여 원심분리한 후 분석하였다. 공복시 혈당은 자동분석기(autoanalyzer; Beckman CX-7)를 이용하여 측정하였다. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(이하 "AST"라 칭함)와 아닐린 아미노트랜스퍼라제(이하 "ALT" 라 칭함), 총콜레스테롤 및 중성지방은 효소법에 의하여 측정하였으며, 고밀도지단백콜레스테롤(HDL-cholesterol)은 haparin-Mn 침전법을 이용하여 측정하였다. 저밀도지단백콜레스테롤(LDL-cholesterol)은 Friedewald의 공식(Total cholesterol － [Triglyceride/5] － HDL-cholesterol)에 의하여 간접적으로 계산하였다.

4. 유전자 분석

피시험자의 GNB3 유전자형은 상기 본 발명의 구성에 기술된 방법에 따라, 피험자의 DNA 분리를 분리하고 분리된 DNA의 GNB3 유전자형은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 방법을 통하여 확인하였다.

5. 통계처리

데이터는 통계프로그램 윈도우용 SPSS(version 11.0, SPSS Inc., USA)를 사용하여 비만군과 대조군의 일반적인 특성을 비교할 경우에는 T-테스트를, 비만군과 대조군의 유전자형을 비교할 경우에는 키-스퀘어 테스트(Chi-square test) 및 로지스틱 회귀 분석(logistic regression analysis)을, 비만군의 유전자 다형성에 따른 비만관련지표를 비교할 경우에는 원-웨이 아노바(Oneway ANOVA)를 실시하였다. 통계는 양측검정을 하였고 유의수준은 p 값 < 0.05로 하였다.

6. 결과.

1) 비만군 및 대조군의 일반적 특성

표 1에 나타난 바와 같이 비만군은 총 85명의 여성으로, 평균 연령은 28.28세 였으며, 평균 신장은 161.32 cm, 평균 체중은 79.45 kg, 이에 따른 평균 BMI는 30.50 kg/m2 이었다. 대조군은 총 80명의 여성으로, 평균 연령은 27.31세 였으며, 평균 신장은 160.89 cm, 평균 체중은 52.19 kg, 이에 따른 평균 BMI는 20.16 kg/m2 이었다. 두 그룹간의 나이와 신장은 통계학적으로 차이가 없었으나, 체중 및 BMI는 통계학적으로 유의성 있는 차이를 보였다.

	비만	대조군	P
평균 나이(년)	28.28 ±11.63	27.31 ±3.28	0.473
평균 신장(cm)	161.32 ±5.53	160.89 ±4.13	0.574
평균 체중(kg)	79.45 ±8.89	52.19 ±4.90	0.000
평균 BMI(kg/m²)	30.50 ±2.82	20.16 ±1.75	0.000

2) 유전자 분석 결과

본 실시예에서 사용한 프라이머로 PCR 반응 후 BseDI 제한 효소로 처리하면 T 알렐은 268bp에서, C 알렐은 152bp, 116bp에서 관찰되므로 268bp의 band만 관찰되면 T/T 타입(homozygote), 152bp, 116bp의 두 밴드만 관찰되면 C/C 타입(homozygote), 268bp, 152bp, 116bp 밴드가 모두 관찰되면 T/C 타입(heterozygote)이다(도 1참고).

상기와 같이 GNB3 유전자를 분석한 결과 비만군 85명의 유전자 다형성은 C/C 타입이 12명(14.1%), T/C 타입이 47명(55.3%), T/T 타입이 26명(30.6%)이었으며, 대조군 80명의 유전자 다형성은 C/C 타입이 24명(30.0%), T/C 타입이 36명(45.0%), T/T 타입이 20명(25.0%)으로 나타나, 비만군에서 T/C 타입이 많고 C/C 타입이 적게 나타났으며 통계적으로 유의성 있는 차이가 있었다(Chi-square test, Pearson Chi-Square value: 6.095, P = 0.047).

로지스틱 회귀분석으로 대응위험도를 구한 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 T/T 타입의 경우 C/C 타입에 비해 비만 위험도가 2.600배(95% CI 1.051 - 6.430, p = 0.039)로 높게 나타났으며, T/C 타입은 C/C 타입에 비해 2.611배(95% CI 1.153 - 5.914, P = 0.021)로 높게 나타났다(도 2참고).

	GNB3 다형성			기수비	P
	C/C 타입	T/C 타입	T/T 타입	기수비	P
비만	12 (14.1%)	47 (55.3%)	26 (30.6%)	T/T vs C/C 2.600 (1.051 - 6.430)	0.039
대조군	24 (30.0%)	36 (45.0%)	20 (25.0%)	T/C vs C/C 2.611 (1.153 - 5.914)	0.021

한편, GNB3 유전자 다형성 중 T 알렐의 존재가 본태성 고혈압 및 비만과 유의한 통계적 관련성을 보인다는 보고를 감안하여 분석한 결과, 비만군 85명의 유전자 다형성은 C 알렐이 12명(14.1%), T 알렐이 73명(85.9%)이었으며, 대조군 80명의 다형성은 C 알렐이 24명(30.0%), T 알렐이 56명(70.0%)으로 나타나, 비만군에서 T 알렐이 높게 나타났으며 통계적으로 유의한 차이(Chi-square test, Pearson Chi-Square value: 6.094, P = 0.014)가 있었다(도 3 참고).

또한, 로지스틱 회귀분석으로 대응위험도를 구한 결과, T 알렐의 경우 C 알렐에 비해 비만 위험도가 2.607배(95% CI 1.200 - 5.661, P = 0.015)로 높게 나타났다.

상기 실시예에 나타난 바와 같이 GNB3 유전자 분석결과 비만군에서 T/C 타입이 많고 C/C 타입이 적게 나타났으며 통계적으로 유의성 있는 차이가 있었다. 또한, GNB3 유전자 알렐의 빈도를 분석한 결과, 비만군에서 T 알렐이 높게 나타났으며 통계적으로 유의한 차이가 있었다.

상기와 같이, 한국인 여성 비만은 GNB3 유전자 T 알렐의 경우 높은 관련성이 있었다. 뿐만 아니라, GNB3 유전자 T 알렐을 가진 경우 C 알렐을 가진 경우에 비해 비만에 이환될 위험도는 2.6배 이상 높은 것을 알 수 있다.

상기와 같이 구성되는 본 발명은 한국인에 있어서 비만을 일으키기 쉬운 특정유전자를 밝혀내고 이 유전자형을 용이하게 확인할 수 있는 진단용 키트를 제공하는 유용한 발명이다.

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한국인의 혈액으로부터 분리된 DNA로부터 G 프로테인 β3 (GNB3) 유전자타입을 분석하여 GNB3 유전자의 268bp 영역만에서의 T/T 타입과 268bp, 152bp, 116bp 영역 모두에서 관찰되는 T/C 타입의 존재 여부를 확인하여, 한국인의 비만발생 위험도를 진단하는 키트로서,

1) 센스인 5’-TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC - 3’와 안티센스인 5’-GCA GCA GCC AGG GCT GGC - 3’의 프라이머;

2) BseDI 제한 효소;

3) GNB3 를 전기 영동하기 위한 겔전기영동장치; 및

4) 상기 GNB3의 유전자형에 대한 특이적 염색을 위한 브롬화에티듐을 포함하는 것을 특징으로 하는 한국인의 비만발생 위험도를 진단하는 키트.