KR100601986B1 - 유전자를 혼성화하는 방법 - Google Patents

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KR100601986B1
KR100601986B1 KR1020050009743A KR20050009743A KR100601986B1 KR 100601986 B1 KR100601986 B1 KR 100601986B1 KR 1020050009743 A KR1020050009743 A KR 1020050009743A KR 20050009743 A KR20050009743 A KR 20050009743A KR 100601986 B1 KR100601986 B1 KR 100601986B1
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박준식
이묘용
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삼성전자주식회사
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Abstract

본 발명은 유전자 마이크로 어레이 상에 혼성화 반응용액을 가하는 것을 포함하는 유전자의 혼성화 방법에 있어서, 혼성화 반응용액에 하기 화학식 1의 화합물을 첨가제로서 부가하여 혼성화 반응용액을 제조하는 것을 특징으로 하는 유전자의 혼성화 방법, 및 하기 화학식 1의 화합물을 그러한 첨가제로서 사용하는 용도를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112005006388217-pat00001
상기 화학식 1에서, R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로 직선형 또는 분지형의 C1-C5 알킬이고, X-는 유기산의 음이온이다.

Description

유전자를 혼성화하는 방법{Method of hybridizing gene}
도 1은 나트륨 양이온이 혼성화된 ds-DNA의 포스페이트 음이온과 정전기적 상호작용에 의해 결합되는 양상을 나타낸 것이다.
도 2는 화학식 1의 화합물로부터 유래되는 트리알킬암모늄 이온이 혼성화된 ds-DNA의 포스페이트 음이온에 정전기적 상호작용에 의해 결합되는 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 화학식 1의 화합물에 해당하는 트리에틸암모늄 아세테이트가 혼성화된 ds-DNA의 포스페이트의 음이온에 정전기적 상호작용에 의해 결합되는 양상을 국소적으로 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1에서 유전자 마이크로 어레이 제작 시 유전자의 스팟팅 배열을 나타낸 것이다.
도 5는 유전자 마이크로 어레이 상에서 혼성화 반응용액을 가하여 혼성화 반응을 수행하기 위해 마이크로 어레이 상에 적절한 패치를 부착시킨 형태와 그 패치를 통해 혼성화 반응용액을 가하는 양상을 나타낸 것이다.
도 6은 첨가제를 부가한 혼성화 반응용액을 이용하여 혼성화 반응이 완료된 마이크로 어레이를 Axon Scaner를 이용하여 스캔한 결과를 나타낸 것으로서,
도 6a는 대조군의 스캔 결과 및 TEAA를 0.75M로 처리한 경우의 스캔 결과를 나타낸 것이고;
도 6b는 TEAA를 0.5 M, 0.75 M, 1.0 M로 처리한 경우의 결과를 나타낸 것이고;
도 6c는 DIEAA를 0.5 M, 0.75 M로 처리한 경우의 결과를 나타낸 것이고;
도 6d는 TMAC를 0.5 M, 0.75 M로 처리한 경우의 결과를 나타낸 것이고;
도 6e는 NaCl을 1.0 M로 추가한 경우, 포름아미드를 각각 5% 및 25%의 농도로 사용한 경우의 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 도 6a 내지 도 6d의 각각의 결과로부터 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도, 미스 매치 프로브의 혼성화 강도, 및 PM/MM의 비율을 그래프와 표로서 종합적으로 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 2에서 마이크로 어레이를 제작 시 20 가지의 교육용 핵산 프로브의 배치 방법을 나타낸 것이다.
도 9는 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도 및 퍼펙트 매치 프로브가 아닌 핵산 프로브 중 혼성화 강도가 가장 센 핵산 프로브의 혼성화 강도를 막대 그래프로 나타내고, 그것과 함께 퍼펙트 매치 프로브가 아닌 핵산 프로브 중 혼성화 강도가 가장 센 핵산 프로브의 혼성화 강도에 대한 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도의 비율을 꺽은선 그래프로서 나타낸 것으로서,
도 9a은 서열번호 12와 완전히 매치되는 서열번호 24에 대한 결과를 나타낸 것이고,
도 9b는 서열번호 20과 완전히 매치되는 서열번호 25에 대한 결과를 나타낸 것이며,
도 9c는 서열번호 21과 완전히 매치되는 서열번호 26에 대한 결과를 나타낸 것이다.
< 도면의 사용된 부호의 설명 >
PM : 혼성화 반응용액 중의 핵산과 퍼펙트 매치 프로브와의 혼성화 강도
MM : 혼성화 반응용액 중의 핵산과 미스 매치 프로브와의 혼성화 강도
NM : 혼성화 반응용액 중의 핵산과 퍼펙트 매치 프로브 이외의 프로브 중에서 가장 혼성화 강도가 센 프로브와의 혼성화 강도
본 발명은 유전자 마이크로 어레이 상에 유전자의 혼성화 반응용액을 가하는 것을 포함하는 유전자의 혼성화 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도는 동등 이상으로 유지하면서 미스 매치 프로브의 혼성화 강도(MM)에 대한 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도(PM)의 비율(PM/MM)을 증가시킴으로써 퍼펙트 매치의 혼성화 특이성을 증가시키기 위한 유전자의 혼성화 방법에 관한 것이다.
유전자 마이크로 어레이는 샘플중의 유전자를 분석해 내기 위한 바이오칩으로서, 기판 상에 고정된 유전자 프로브에 샘플을 가하여 기판 상의 유전자 프로브와 상보적 서열을 갖는 샘플 중의 유전자가 기판상의 유전자와 혼성화 반응이 이루 어지도록 함으로써 샘플 중의 유전자를 분석할 수 있다. 이러한 유전자 마이크로 어레이를 이용하여 샘플 중의 유전자를 분석하기 위해 수행하는 유전자의 혼성화 과정에서, 유전자 분석이 정확하게 이루어지기 위해서는 유전자 마이크로 어레이 상의 유전자의 염기서열과 정확하게 상보적인 염기서열을 갖는 타겟 샘플만이 유전자 마이크로 어레이 상의 유전자 프로브와 혼성화를 이루어야 한다. 그러나, 실제 혼성화 과정 중에서는 유전자 마이크로어레이 상의 유전자 프로브의 염기 서열과 대부분 상보적이면서 1 개 이상의 염기가 상보적이지 않은 염기 서열을 갖는 샘플도 유전자 마이크로 어레이상의 유전자 프로브(미스 매치 프로브)와 혼성화 반응이 이루어져 상보적인 결합을 하게 된다. 이러한 유전자칩 상의 프로브와, 이에 미스 매치되는 염기서열을 갖는 샘플 DNA간의 혼성화는 샘플 중의 유전자를 정확하게 분석하는데 있어서 오차를 발생시키는 원인이 된다. 따라서, 유전자 마이크로어레이 상에서 샘플을 반응시킬 때 샘플의 정확한 유전자 분석을 위해서는, 미스 매치 프로브의 혼성화 결합 강도(이하, MM 이라고도 한다)를 상대적으로 낮추고 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 결합 강도(이하, PM 이라고도 한다)를 상대적으로 높임으로써 MM 혼성화 강도에 대한 PM 혼성화 강도의 비율(PM/MM)을 증가시키는 것이 필요하다.
종래에 유전자의 혼성화 반응에서 PM/MM을 증가시키기 위한 방법이 사용되었다. 그러한 방법은 주로 유전자의 혼성화 반응에 대한 가혹조건을 부가하는 방향으로 이루어져 왔다. 그러한 가혹조건으로는 샘플인 혼성화 반응액에서의 NaCl의 농도를 감소시키는 방법, 혼성화 반응의 온도를 증가시키는 방법, 혼성화 반응액에 변성제(denaturant)를 부가하는 방법 등이 있다. 이러한 가혹 조건은 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도를 약화시키는 정도보다 미스 매치 프로브의 혼성화 강도를 약화시키는 정도가 상대적으로 커서 PM/MM의 비율을 증가시킬 수 있다(US 6,632,605).
그러나, 상기 가혹조건을 이용하는 방법은 모두 PM/MM의 비율을 증가시킬 수는 있으나, 퍼펙트 매치 프로브 자체의 절대적인 혼성화 강도는 낮아져 퍼팩트 매치 프로브의 혼성화를 측정하기 위한 측정감도가 떨어지는 문제점이 있다.
특히, 상기 혼성화 반응의 온도를 증가시키는 방법은 온도의 증가로 인해 유전자 마이크로 어레이에서 기판 상에 고정된 유전자들이 기판으로부터 이탈될 우려가 있어 문제가 된다(US 6,632,605).
또한, 상기 방법 중 변성제를 부가하는 방법에 있어서, 변성제로는 포름아미드, 포름알데히드, 글리세롤, DMSO, DMF, GuSCN, 또는 요소 등 주로 유기 변성제가 사용될 수 있으나, 이러한 유기 변성제는 혼성화 용액 내에서 사용 시 용해도가 낮아 염석이 이루어져 높은 농도로 사용하기 어려운 문제점이 있다. 또한 유기 변성제는 독성이 있어 사용자가 취급하기 부적절한 문제점이 있다.
한편, 일반적으로 유전자의 혼성화 반응에서는 혼성화된 유전자의 안정화를 위해 NaCl을 혼성화 반응 용액 내에 첨가제로서 사용한다. NaCl의 나트륨 양이온은 유전자의 포스페이트 중의 산소 음이온과 정전기적 인력에 의해 이온 결합을 이루어 핵산의 포스페이트 음이온 간의 반발력에 의한 유전자 혼성화의 불안정화를 낮추어 유전자의 혼성화 결합을 안정화시키는 역할을 한다. 이러한 나트륨 양이온 이 유전자 혼성화 결합에서 포스페이트 중의 음이온과 정전기적 상호작용에 의해 결합되는 양상을 도 1에 나타내었다. 이러한 유전자의 혼성화 결합을 안정화시키는 역할을 하는 NaCl의 염의 농도를 감소시키는 것은 상기한 바와 같이 유전자의 혼성화에 대한 가혹 조건에 해당하며 이러한 NaCl 농도의 감소는 비록 PM/MM의 비율을 증가시킬 수는 있으나, PM 자체의 혼성화 강도가 낮아지는 문제점이 있다.
또 다른 한편으로는, 유전자 마이크로어레이 상에서 유전자의 혼성화 반응에 사용되는 첨가제로서 TMAC(tetramethyl ammonium chloride)가 제기된 바 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 198582: 1585-1588). 또한, 미국특허 US 6,632,605는 4급 암모늄염인 베테인(betaine)을 마이크로어레이 상에서 유전자의 혼성화 반응에 사용되는 첨가제로서 개시하고 있다. 그러나, 여기에서 제기된 TMAC 또는 베테인은 PM/MM의 비율을 증가시키기 위한 것이 아니라, 핵산 프로브의 염기 서열 중 아데닌 및 티민 간의 수소결합과, 시토신 및 구아닌 간의 수소결합의 강도를 유사하게 함으로써 혼성화 강도의 차이를 핵산 프로브의 염기서열의 종류에 의존하지 않고, 단지 염기 서열의 길이에만 의존하도록 하기 위한 것이었다.
따라서, PM/MM의 비율을 증가시키면서도 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도는 동등 이상으로 유지시킬 수 있는 새로운 혼성화 방법이 필요하다.
본 발명의 목적은 유전자 마이크로 어레이 상에서 혼성화 반응을 수행할 때, 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도를 동등 이상으로 유지시키면서 PM/MM의 비율을 증가시킬 수 있는 유전자의 혼성화 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 유전자 마이크로 어레이 상에 가하는 샘플인 혼성화 반응용액에 부가함으로써 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도를 동등 이상으로 유지시키면서 PM/MM의 비율을 증가시킬 수 있는 첨가제를 제공하는 것을 포함한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유전자 마이크로 어레이 상에 유전자의 혼성화 반응용액을 가하는 것을 포함하는 유전자의 혼성화 방법에 있어서, 유전자의 혼성화 반응용액에 하기 화학식 1의 화합물을 첨가제로서 부가하여 유전자의 혼성화 반응용액을 제조하는 것을 특징으로 하는 유전자의 혼성화 방법을 제공한다:
Figure 112005006388217-pat00002
상기 화학식 1에서, R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로 직선형 또는 분지형의 C1-C5 알킬이고, X-는 유기산의 음이온이다.
상기 화학식 1에서 R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로 에틸, n-프로필, 또는 iso-프로필일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화학식 1에서 X-는 구체적으로 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이 트, 부티레이트, p-툴루엔 술포네이트, 벤젠 술포네이트, 트리플루오로아세테이트, 옥살레이트, 또는 타르타레이트일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
화학식 1의 화합물은 바람직하게는 트리에틸암모늄 아세테이트 또는 N,N-디이소프로필에틸암모늄 아세테이트이다.
본 발명은 또한, 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는, 유전자 마이크로 어레이 상에 가하는 유전자의 혼성화 반응용액에 부가하기 위한 첨가제를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112005006388217-pat00003
상기 화학식 1에서, R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로 직선형 또는 분지형의 C1-C5 알킬이고, X-는 유기산의 음이온이다.
상기 첨가제로서 사용되는 화학식 1의 화합물에서 R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로 에틸, n-프로필, 또는 iso-프로필일 수 있다.
또한, 상기 화학식에서 유기산의 음이온은 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, p-톨루엔 술포네이트, 벤젠 술포네이트, 트리플루오로아세테이트, 옥살레이트, 또는 타르타레이트일 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물로서 바람직하게는 트리에틸암모늄 아세테이트 또는 N,N-디이소프로필에틸암모늄 아세테이트가 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 유전자 마이크로어레이 상에 샘플인 혼성화 반응액을 가하여 혼성화 반응을 시키는 과정에서 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도는 동등이상으로 유지하면서 PM/MM의 비율을 증가시키기 위한 방법으로서 하기 화학식 1의 화합물을 샘플인 혼성화 반응액에 가하는 방법을 이용한다:
[화학식 1]
Figure 112005006388217-pat00004
상기 화학식 1에서, R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로 직선형 또는 분지형의 C1-C5 알킬이고, X-는 유기산의 음이온이다. 여기에서, R1 , R2, 및 R3는 각각 독립적으로 C1-C5 알킬이이다. 알킬기의 탄소수가 5개를 넘게 되면 화학식 1의 화합물이 고체가 될 가능성이 높아져 본 발명의 혼성화 방법에 적용되기 부적절하다.
또한, 상기 알킬기로는 탄소수 2 개 내지 3 개의 알킬이 바람직하며, 구체적으로는 에틸, n-프로필, 또는 이소프로필이 사용될 수 있다.
또한, X-는 유기산의 화합물로서 구체적으로 포르메이트, 아세테이트, 프로 피오네이트, 부티레이트, p-툴루엔 술포네이트, 벤젠 술포네이트, 트리플루오로아세테이트, 옥살레이트, 또는 타르타레이트일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 화학식 1의 화합물은 트리에틸암모늄 아세테이트 또는 N,N-디이소프로필에틸암모늄 아세테이트이다.
이러한 화학식 1의 화합물은 트리알킬암모늄의 양이온 부분과 유기산의 음이온 부분으로 구분될 수 있다. 화학식 1의 화합물은 샘플의 혼성화 반응액에 부가되면 그 반응액 내에서 트리알킬암모늄 양이온이 생성될 것이다. 이러한 트리알킬암모늄 양이온은 혼성화 반응액에 통상적으로 부가되는 염화나트륨의 나트륨 양이온과 같이 혼성화된 유전자의 포스페이트 음이온과 정전기적 상호 작용에 의해 이온 결합을 이루게 된다. 화학식 1의 화합물로부터 유래되는 트리알킬암모늄 이온이 혼성화된 ds-DNA의 포스페이트의 산소 음이온에 정전기적 이온 결합을 이루는 양상을 도 2에 나타내었다. 또한, 도 3에는 상기 화학식 1의 화합물의 대표적인 화합물에 해당하는 트리에틸암모늄 아세테이트가 혼성화된 ds-DNA의 포스페이트 음이온에 정전기적 이온 결합을 이루는 양상을 국소적으로 나타내었다.
이러한 정전기적 상호 작용에 의한 이온 결합은 포스페이트에 의한 유전자의 혼성화 결합에 대한 반발력을 감소시키는 역할을 한다. 이러한 포스페이트에 의한 혼성화 결합에 대한 반발력의 감소는 유전자의 혼성화 강도를 증가시키는 역할을 한다.
그러나, 상기 화학식 1의 화합물이 NaCl과 같이 단순히 유전자의 포스페이트에 대한 카운터 이온의 역할만을 수행한다면 퍼펙트 매치의 혼성화 강도를 증가시 키는 것뿐만 아니라 미스 매치의 혼성화 강도 또한 동시에 증가시키는 역할을 수행하게 되어, 퍼펙트 매치의 혼성화 강도를 증가시킬 수는 있어도 PM/MM의 비율을 증가시킬 수는 없을 것이다. 따라서, 상기 화학식 1의 화합물은 유전자의 포스페이트에 대한 카운터 이온으로서의 역할을 수행할 뿐만 아니라, 유전자의 혼성화에 대한 가혹조건으로서도 작용할 수 있도록 하기 위해 구조적으로 NaCl에 비해 양이온의 크기가 충분히 크게 디자인 되었다.
즉, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 혼성화 반응액 내에서 구조적으로 크기가 큰 트릴알킬암모늄 양이온을 생성시킨다. 이러한 큰 구조의 양이온은 포스페이트와 정전기적으로 결합되어 포스페이트에 의한 혼성화 반발력을 감소시키는 역할을 수행하기도 하지만, 그와 동시에 혼성화된 ds-DNA의 포스페이트에 결합된 트리알킬암모늄 양이온간에 정전기적 반발력이 생성되어 유전자의 혼성화에 있어 가혹조건으로서도 작용하게 된다. 이러한 반발력의 생성을 도 2에 화살표로서 나타내었다. 이러한 가혹조건은 유전자 마이크로 어레이에서의 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도보다 미스 매치 프로브의 혼성화 강도를 상대적으로 더욱 감소시켜 PM/MM의 비율을 증가시킬 수 있게 되는 것이다. 또한, 앞서 설명한 바와 같이 본 발명의 화학식 1의 화합물은 가혹조건으로서 작용하는 것 이외에도 포스페이트에 의한 혼성화 결합의 불안정화를 안정화시키는 역할을 수행하여 퍼펙트 매치의 혼성화 강도를 증가시키는 역할을 동시에 수행한다. 화학식 1의 화합물의 이러한 이중적인 효과는 결과적으로 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도를 동등이상으로 유지하면서 PM/MM의 비율을 증가시킬 수 있는 결과를 낳을 수 있게 된다.
이러한 화학식 1의 화합물을 유전자 마이크로 어레이에 대한 혼성화 반응액에 첨가제로 사용할 경우, 그 혼성화 반응액에서의 화학식 1의 화합물의 농도는 사용되는 화학식 1의 화합물에 따라 달라질 수 있으며, 또한 혼성화되는 유전자의 염기 서열에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 혼성화 반응액에 사용되는 화학식 1의 화합물의 적절한 농도는 실제로 유전자 마이크로어레이를 이용하여 샘플에 대한 유전자 분석을 수행하기 전에, 실험조건의 최적화 과정에 의해 화학식 1의 화합물의 적절한 농도를 찾은 다음 수행할 수 있을 것이다.
한편, 본 발명이 또 다른 측면에서 제공하는, 유전자 마이크로 어레이 상에 가하는 유전자의 혼성화 반응액에 부가하기 위한 첨가제는 상기 정의된 바와 같은 화학식 1의 화합물을 포함한다. 이러한 첨가제는 상기 화학식 1의 화합물만을 포함할 수도 있으나, 선택적으로는 유전자 마이크로 어레이 상에 가하는 혼성화 반응액에 통상적으로 부가되는 물질을 더 포함할 수도 있다. 이러한 화학식 1의 화합물을 포함하는 첨가제는 상기 혼성화 방법에서 설명한 바와 같은 원리에 의해, 유전자 마이크로 어레이에 혼성화 반응액을 적용 시, 유전자 칩 중의 퍼펙트 매치 프로브에 대한 샘플 중의 유전자의 혼성화 강도를 동등 이상으로 유지하면서 동시에 PM/MM의 비율을 증가시킴으로써, 샘플 중의 유전자 분석을 보다 정확하게 수행하는데 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1
유전자 마이크로 어레이 상에서의 퍼펙트 매치 프로브 및 미스 매치 프로브에 대한 샘플의 혼성화 반응의 특이성 시험
(1) 마이크로 어레이의 제작
아민 웨이퍼(wafer)에 서열번호 1의 핵산과 서열번호 2(100umol/L, 10ul)의 핵산을 각각 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)(9mmol/L, 10ul), 포름아미드(formamide)(10ul), 및 완충용액(buffer)(0.025mol/L pH 10.0, carbonate 10uL)을 포함하는 용액과 혼합한 것을 각각 3X3의 스팟으로 하여 좌우로 배치시키고, 그것을 각각 2 회 반복하여 스팟팅함으로써 도 4와 같이 배치시켰다. 이와 같이 스팟팅된 기판을 일정 온도와 습도(70도, 40% 습도) 하에서 1 시간동안 고정시킨 후, 스팟 외의 다른 영역의 아민은 숙신산 안하이드라이드를 이용하여 반응성이 없도록 한 후 세척과정과 건조과정을 거쳐 다음 마이크로 에레이를 제작하였다.
(2) 혼성화 반응액의 제조
A. Cy3가 표지된 혼성화 대상 핵산(target DNA)의 제조
서열번호 3의 핵산(타겟 DNA)과 활성화된 Cy3를 pH 12의 용액에서 상온에서 12시간 반응시켰다. 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 Cy3가 표지된 서열번호 3의 핵산을 분리하였다. 그 분리된 것은 UV-vis 측정 장비로 농도 보정 및 순도를 확인하여 제조하였다.
B. 혼성화 반응용 완충용액의 제조(4X SSPET)
인산수소나트륨(NaH2PO4ㆍH2O), 염화나트륨, 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산(Ethylene Diamine Tetra Acetic acid, EDTA), 수산화나트륨(NaOH), 트라이톤 X-100(Triton X-100)를 사용하여 원하는 조성의 완충용액인 4XSSPET, pH 7.4의 용액을 만들었다.
C. 첨가제의 제조
- TEAA(triethylammonium acetate) 용액의 제조
트리에틸아민을 물에 4 M의 농도로 녹인 후 아세트산을 첨가하여 pH 7.3으로 하였다. 그 용액을 3/4, 1/2, 1/4으로 희석시켜, 각각 1 M, 2 M, 3 M, 4 M의 용액으로 제조하였다.
- DIEAA(N,N-diisopropylethylammonium acetate) 용액의 제조
DIEAA를 물에 3 M의 농도로 녹인 후 아세트산을 첨가하여 pH 7.3으로 하였다. 그 용액을 2/3, 1/3으로 희석시켜, 각각 1 M, 2 M, 3 M의 용액으로 제조하였다.
- TMAC(tetramethylammonium chloride) 용액의 제조
Sigma Aldrich사에서 판매되는 테트라메틸암모늄 클로라이드를 물에 3M로 맞추어 제조하였다. 그 용액을 2/3, 1/3으로 희석시켜, 각각 1 M, 2 M, 3 M의 용액으로 제조하였다.
D. 마이크로 어레이에 대한 혼성화 반응액의 제조
Cy3가 표지된 혼성화 대상 핵산을 4nM 15 ㎕(최종 혼성화 반응 시 농도 1nM 로 맞추기 위함), 3차 증류수 15 ㎕, 혼성화 반응용 완충용액(4X SSPET) 15 ㎕(최종 혼성화 반응 시 농도 1X SSPET로 맞추기 위함), 및 하기 표 1에 나타낸 첨가제 15 ㎕를 혼합하여 각각 혼성화 반응용액 60 ㎕를 제조하였다.
[표 1]
실험 조건 첨가제(15 ㎕) 종류 실험 조건 첨가제(15 ㎕) 종류
TEAA(0.25 M) 1 M DIEAA TMAC(0.5 M) 2 M TMAC
TEAA(0.5 M) 2 M DIEAA TMAC(0.75 M) 3 M TMAC
TEAA(0.75 M) 3 M DIEAA NaCl(1.0 M) 4X SSPET
TEAA(1 M) 4 M DIEAA 포름아미드 5% 포름아미드 3 + 물 12
DIEAA(0.5 M) 2 M DIEAA 포름아미드 25% 포름아미드
DIEAA(0.75 M) 3 M DIEAA
대조군 물
(3) 혼성화 반응 후 세척용 완충액의 제조(3X SSPET, 1X SSPET)
인산수소나트륨(NaH2PO4ㆍH2O), 염화나트륨(NaCl), 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산(Ethylene Diamine Tetra Acetic acid, EDTA), 수산화나트륨(NaOH), 및 트라이톤 X-100(Triton X-100)를 사용하여 원하는 3X, 1X농도의 세척용 완충용액인 각각 3X SSPET, 1X SSPET pH 7.4의 용액을 제조하였다.
(4) 유전자 마이크로 어레이에 대한 혼성화 반응
A. 혼성화 반응 과정
도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 제작된 마이크로 에레이에 적절한 패치를 부쳤다. 전체 부피 60??L의 미리 제조된 혼성화 반응용액을 한쪽 구멍으로 투입시키고, 발생한 기포를 제거한 후 혼성화 반응 용기에 넣고, 42??에서 1시간 동안 반응시켰다.
B. 혼성화 반응 후 세척 및 건조
혼성화 반응이 완료된 유전자 마이크로 어레이를 세척용 3X SSPET, 1X SSPET 완충용액으로 각각 5분간 세척하였다. 그 마이크로어레이를 원심분리기를 이용하여 건조하였다(300 rpm, 5초).
(5) 유전자 마이크로 어레이에 대한 혼성화 반응 결과
상기 혼성화 반응이 완료된 마이크로 어레이를 Axon Scaner를 이용하여 파장 532 nm에서 PMT 500으로 스캔한 결과를 확인하였다. 각각의 첨가제에 해당하는 스캔 결과를 도 6a 내지 도 6e에 나타내었다.
도 6a에는 대조군의 스캔 결과 및 TEAA를 0.75M로 처리한 경우의 스캔 결과를 나타내었다. 대조군 및 TEAA 0.75M은 각각 2회 실험하여, 각각 2개의 스캔 결과가 나타났다. 도 6a에는 스캔 결과를 Axon Scanner의 운영 프로그램을 이용하여 분석한 결과 나타난 퍼펙트 매치 프로브와 미스 매치 프로브 각각의 혼성화 강도를 각각의 스팟 아래에 기록하고, 그것을 기초로 각각의 PM/MM의 비율을 계산한 수치를 박스 안에 나타내었다.
도 6b에는 TEAA를 0.5 M, 0.75 M, 1.0 M로 처리한 경우의 결과를 나타내었다. 도 6c에는 또 다른 화학식 1의 화합물에 해당하는 DIEAA를 0.5 M, 0.75 M로 처리한 경우의 결과를 나타내었다. 도 6d에는 종래의 첨가제로서 사용된 TMAC를 각각 0.5 M 및 0.75 M로 사용한 경우의 결과를 나타내었다. 도 6e에는 NaCl을 1.0 M로 추가한 경우, 포름아미드를 각각 5% 및 25%의 농도로 사용한 경우의 결과를 나타내었다.
이러한 도 6a 내지 도 6d의 각각의 첨가제를 여러 농도로 사용한 경우의 스 캔 결과를 Axon Scanner의 운영 프로그램을 이용하여 각각의 혼성화 강도를 분석하였다. 그리하여 각각의 첨가제를 이용한 경우에 대한 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도, 미스 매치 프로브의 혼성화 강도, 및 PM/MM의 비율을 도 7에 그래프와 표로서 종합적으로 나타내었다.
(6) 결과
도 7에 나타낸 그래프 및 표에서 보는 바와 같이 본 발명의 화합물인 TEAA를 0.25 M, 0.5 M, 0.75 M, DIEAA를 0.5 M, 0.75 M로 사용한 경우에 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도가 대조군보다 증가되었으며, PM/MM의 비율이 대조군보다 증가하여 퍼팩트 매치 프로브의 혼성화 특이성을 위해 첨가제로서 사용될 수 있는 것으로 나타났으며, 그 중에서도 특히 TEAA를 0.75 M로 사용한 경우와 DIEAA를 0.75 M로 사용한 경우에 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도 및 PM/MM의 비율이 대조군에 비해 매우 현저하게 증가하여 첨가제로서 사용하기에 더욱 바람직한 것으로 판명되었다.
이에 반해, 종래에 혼성화 반응의 첨가제로서 사용되었던 TMAC는 비록 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도는 현저히 증가하였으나 PM/MM의 비율은 화학식 1의 화합물의 PM/MM에 비해 현저하게 낮았다. 종래에 가혹조건으로 사용되었던 포름아미드의 경우에는 예상대로 PM/MM의 비율은 대조군에 비해 현저하게 증가하였으나, 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도가 매우 낮았다. NaCl을 더욱 부가한 경우는 PM/MM의 비율이 대조군과 차이가 없었다.
실시예 2
다수의 프로브가 고정화된 교육용 칩과 다수의 타겟 샘플 간 혼성화 반응에서, 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도의 증가 및 혼성화 반응의 특이성 시험
(1) 마이크로 어레이 제작
아민 웨이퍼 상에 서열번호 4 내지 23의(100umol/L, 10ul)의 핵산을 각각 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)(9mmol/L, 10ul), 포름아미드(formamide)(10ul), 및 완충용액(buffer)(0.025mol/L pH 10.0, carbonate 10uL)을 포함하는 용액과 혼합한 것을 각각 2X3의 스팟으로 스팟팅하여 도 8에 나타낸 바와 같이 배치하였다. 도 8에 기재된 번호는 서열번호에 해당한다. 이와 같이 스팟팅된 기판을 일정 온도와 습도(70도, 40%습도) 하에서 1 시간동안 고정시킨 후, 스팟 외의 다른 영역의 아민은 숙신산 안하이드라이드를 이용하여 반응성이 없도록 한 후 세척과정과 건조과정을 거쳐 다음 마이크로 에레이를 제작하였다.
(2) 혼성화 반응액의 제조
A. Cy3가 표지된 혼성화 대상 핵산(target DNA)의 제조
서열번호 24의 핵산(서열번호 12에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산), 서열번호 25의 핵산(서열번호 20에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산), 및 서열번호 26의 핵산(서열번호 21에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산) 각각을 활성화된 Cy3와 함께 pH 12의 용액에서 상온에서 12시간 반응시켰다. 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 Cy3가 표지된 각각의 핵산을 분리하였다. 그 분리된 것은 UV-vis측정 장비로 농도 보정 및 순도를 확인하여 제조하였다.
B. 혼성화 반응용 완충용액의 제조(4X SSPET)
인산수소나트륨(NaH2PO4ㆍH2O), 염화나트륨, 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산(Ethylene Diamine Tetra Acetic acid, EDTA), 수산화나트륨(NaOH), 트라이톤 X-100(Triton X-100)를 사용하여 원하는 조성의 완충용액인 SSPET pH 7.4의 용액을 만들었다.
C. 첨가제의 제조
- TEAA(triethylammonium acetate) 용액의 제조
트리에틸아민을 물에 3M의 농도로 녹인 후 아세트산을 첨가하여 pH 7.3으로 하였다. 그 용액을 2/3, 1/3으로 희석시켜, 각각 1 M, 2 M, 3 M의 용액으로 제조하였다.
D. 마이크로 어레이에 대한 혼성화 반응액의 제조
Cy3가 표지된 혼성화 대상 핵산인 서열번호 24, 25, 또는 26을 각각에 대해 4nM 15 ㎕(최종 혼성화 반응 시 농도 1nM로 맞추기 위함), 3차 증류수 15 ㎕, 혼성화 반응용 완충용액(4X SSPET) 15 ㎕(최종 혼성화 반응 시 농도 1X SSPET로 맞추기 위함), 및 하기 표 2에 나타낸 첨가제 각각에 대해 15 ㎕를 혼합하여 각각 혼성화 반응용액 60 ㎕를 제조하였다.
[표 2]
실험 조건 첨가제(15??L)종류
TEAA(0.25 M) 1M TEAA
TEAA(0.5 M) 2M TEAA
TEAA(0.75 M) 3M TEAA
(3) 혼성화 반응 후 세척용 완충액의 제조(3X SSPET, 1X SSPET)
인산수소나트륨(NaH2PO4ㆍH2O), 염화나트륨(NaCl), 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산, 수산화나트륨, 및 트라이톤 X-100을 사용하여 원하는 3X, 1X농도의 세척용 완충용액인 각각 3X SSPET, 1X SSPET pH7.4의 용액을 제조하였다.
(4) 유전자 마이크로 어레이에 대한 혼성화 반응
A. 혼성화 반응 과정
도 5에 나타낸 바와 같이 상기 제작된 마이크로 에레이에 적절한 패치를 부쳤다. 전체 부피 60??L의 미리 제조된 혼성화 반응용액을 한쪽 구멍으로 투입시키고, 발생한 기포를 제거한 후. 혼성화 반응 용기에 넣고, 42??에서 1시간 동안 반응시켰다.
B. 혼성화 반응 후 세척 및 건조
혼성화 반응이 완료된 유전자 마이크로 어레이를 세척용 3X SSPET, 1X SSPET 완충용액으로 각각 5분간 세척하였다. 그 마이크로어레이를 원심분리기를 이용하여 건조하였다(300 rpm, 5초).
(5) 유전자 마이크로 어레이에 대한 혼성화 반응 결과
상기 혼성화 반응이 완료된 마이크로 어레이를 Axon Scaner를 이용하여 파장 532 nm에서 PMT 500으로 스캔한 결과를 확인하였다. TEAA 첨가제를 여러 농도로 사용한 경우의 스캔 결과를 Axon Scanner의 운영 프로그램을 이용하여 각각의 혼성화 강도를 분석하였다. 첨가제를 사용하지 않은 대조군, TEAA를 각각 0.25 M, 0.5 M, 0.75 M로서 사용한 경우의 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도 및, 그 이외의 핵산 프로브에 대한 혼성화 강도 중 가장 세게 나타나는 핵산 프로브에서의 혼성화 강도(이하, NM이라고도 한다)를 도 9에 나타내었다. 도 9에는 상기 혼성화 강도와 함께 퍼펙트 매치 프로브가 아닌 핵산 프로브 중 혼성화 강도가 가장 센 핵산 프로브의 혼성화 강도에 대한 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도의 비율을 꺽은선 그래프로서 함께 나타내었다. 도 9a은 서열번호 12와 완전히 매치되는 서열번호 24에 대한 결과를 나타낸 것이고, 도 9b는 서열번호 20과 완전히 매치되는 서열번호 25에 대한 결과를 나타낸 것이며, 도 9c는 서열번호 21과 완전히 매치되는 서열번호 26에 대한 결과를 나타낸 것이다.
(6) 결과
도 9에 나타낸 그래프를 살펴보면 서열번호 24, 25, 및 26의 모든 경우에 있어서, TEAA를 특정 농도로 부가한 경우에 퍼펙트 매치 프로브의 타겟 샘플에 대한 혼성화 강도가 증가하였다는 것을 알 수 있다. 이와 같이, 여러 종류의 타겟 샘플을 사용한 경우에 있어서, 본원발명의 화학식 1의 화합물을 첨가제로서 특정 농도로 사용한 경우가 대조군에 비해 혼성화 강도가 증가한다는 것은 본원발명의 화학식 1의 화합물을 유전자 마이크로 어레이와 샘플의 혼성화 반응에 있어서 타겟 샘플과 퍼펙트 매치 프로브 간의 혼성화 강도를 증가시키고, 혼성화 특이성을 증가시키는데 사용될 수 있다는 사실을 뒷받침해 준다.
상기한 바와 같이, 유전자 마이크로 어레이 상에 혼성화 반응용액을 가하여 혼성화 반응을 수행할 때 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 강도를 동등 이상으로 증가시키면서 미스매치 프로브의 혼성화에 대한 퍼펙트 매치 프로브의 혼성화 특이성을 증가시키기 위한 첨가제로서 화학식 1의 화합물을 사용할 수 있다.
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Claims (8)

  1. 유전자 마이크로 어레이 상에 혼성화 반응용액을 가하는 것을 포함하는 유전자의 혼성화 방법에 있어서, 혼성화 반응용액에 하기 화학식 1의 화합물을 첨가제로서 부가하여 혼성화 반응용액을 제조하는 것을 특징으로 하는 유전자의 혼성화 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112005006388217-pat00005
    상기 화학식 1에서, R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로 직선형 또는 분지형의 C1-C5 알킬이고, X-는 유기산의 음이온이다.
  2. 제 1 항에 있어서, R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로 에틸, n-프로필, 또는 iso-프로필인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 유기산의 음이온은 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, p-툴루엔 술포네이트, 벤젠 술포네이트, 트리플루오로아세 테이트, 옥살레이트, 또는 타르타레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 화학식 1의 화합물은 트리에틸암모늄 아세테이트 또는 N,N-디이소프로필에틸암모늄 아세테이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는, 유전자 마이크로 어레이 상에 가하는 DNA 또는 RNA의 혼성화 반응용액에 부가하기 위한 첨가제.
    [화학식 1]
    Figure 112005006388217-pat00006
    상기 화학식 1에서, R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로 직선형 또는 분지형의 C1-C5 알킬이고, X-는 유기산의 음이온이다.
  6. 제 5 항에 있어서, R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로 에틸, n-프로필, 또는 iso-프로필인 것을 특징으로 하는 첨가제.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 유기산의 음이온은 포르메이트, 아세테이트, 프로피 오네이트, 부티레이트, p-툴루엔 술포네이트, 벤젠 술포네이트, 트리플루오로아세테이트, 옥살레이트, 또는 타르타레이트인 것을 특징으로 하는 첨가제.
  8. 제 6 항에 있어서, 화학식 1의 화합물은 트리에틸암모늄 아세테이트 또는 N,N-디이소프로필에틸암모늄 아세테이트인 것을 특징으로 하는 첨가제.
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