KR100564161B1 - Ｓｃｈ47554 및 Ｓｃｈ47555 생합성에 관여하는 효소 및그 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Sch47554 및 Sch47555 생합성에 관여하는 효소 및 그 유전자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, Sch47554 및 Sch47555 생합성에 관여하는 유전자 클러스터의 염기서열, Sch47554와 Sch47555 생합성계 효소인 dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제 및 상기 효소를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명에 따른 Sch47554 및 Sch47555 생합성에 관여하는 유전자 클러스터, dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제(SchS2) 및 그 유전자는 Sch47554, Sch47555 또는 이와 유사한 신규 앙구사이클린계 항생제의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Sch47554, Sch47555, 앙구사이클린, dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제

Description

Ｓｃｈ47554 및 Ｓｃｈ47555 생합성에 관여하는 효소 및 그 유전자{An Enzyme Concerning in Biosynthesis of Sch47554 ＆ Sch47555 and the Genes Thereof}

도 1은 Sch47554 및 Sch47555의 구조와 생합성 예상경로를 나타낸 것이다.

도 2는 Sch47554 및 Sch47555의 유전자 클러스터 지도를 나타낸 것이다. 화살표는 각 유전자들을 나타내고, 화살표의 방향은 전사방향을 나타낸다.

도 3은 본 발명에 따른 SchS2 효소의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 것이다. 레인 1은 표준분자량 마커를 나타내고 레인 2 및 3은 각각 soluble protein 및 insoluble protein을 나타낸다.

도 4는 표준 말톨(maltol)(A)과 SchS2 효소의 반응산물(B)에 대한 HPLC 분석결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 Sch47554 및 Sch47555의 생합성에 관여하는 효소 및 그 유전자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, Sch47554 및 Sch47555 생합성에 관여하는 유전자 클러스터의 염기서열, Sch47554 및 Sch47555 생합성계 효소인 dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제 및 상기 효소를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

앙구사이클린 그룹의 항생제는 미생물에 의해 생산되어, 넓은 약학적 활성 및 생물학적 활성을 가지는 천연물질이다 (Rohr, J. et al., Nat. Prod. Rep., 9:103, 1992). 이들은 테트라싸이클릭 벤자안트라센(tetracyclic benz(a)anthracene) 아글리콘 시스템을 포함하며, 빠르게 개발되고 있는 새로운 항생제 중 하나이다 (Rohr, J., "Bioorganic Chemistry, Deoxysugars, Polyketides and related classes: Synthesis, Biosynthesis, Enzymes", Springer Verlag, Germany, 2000).

데카케타이드(decaketide) 방향족 탄소사슬은 폴리케타이드 경로를 거친 열개의 아세테이트 유닛의 비대칭적 조합에 의해 유도된다. 마크로라이드와는 달리, 상기 방향족 폴리케타이드는 탄소사슬을 완전하게 하도록 반복 사용되는 단일 또는 이중 기능의 개개 단백질로 구성된 타입 II PKS(polyketide synthase)에 의해 생합성된다 (Rawlings, B.J., Nat. Prod. Rep. 16:425, 1999).

Sch47554 및 Sch47555는 Strepomyces sp. SCC-21362에 의해 생성되는 2개의 새로운 앙구사이클린 항생제이다. 이들은 1992년에 처음으로 발견되었으며, Candida albus, C. tropicalis, C. Stellaoidea 등의 곰팡이에 대하여 활성을 나타내는 항진균제이다. 구조적으로, Sch47554 및 Sch47555는 다중방향성 앙구사이클린 아글리콘으로 구성되고, 데옥시당(DOH) 부분을 갖는, 아쿠아야마이신(aquayamycine) 및 어다마이신 A(urdamycin A)와 유사하다.

Sch47554는 D-amicetose/L-aculose의 C-9 및 C-3 위치에 각각 C-glycosidated disaccharide 및 O-glycosidated L-aculose를 가지고 있다. Sch47555는 D-amicetose/L-amicetose의 C-9 및 C-3 위치에 각각 C-glycosidated L-aculose 및 O-glycosidated L-aculose를 가지고 있다 (도 1). 이러한 항생제들은 C-12b 위치 대신에 C-3에 O-glycosidated olicosaccharide를 가지고 있는 점에서 어다마이신 A와 다르다.

지난 십년간 구조적으로 연관되고, 생물학적 활성을 가지는 앙구사이클린을 코딩하는 유전자 클러스터가 클로닝되고, 유전자 서열이 결정되었다. 이들 중에는 어다마이신(urdamycin) A, 랜도마이신 A(landomycin A), 자도마이신 B(jadomycin B), 오비에도마이신(oviedomycin) 및 PD116740과 같은 항생제의 클러스터와 시모사이클리논(simocyclinone), 그리세오로딘 A(griseorhodin A) 및 오리신(auricin) 등의 새로운 항생제 클러스터가 포함되어 있다 (Decker, H. and Hagg, S., J. Bacteriol., 177:6126, 1995; Westrich, L., FEMS Microbiol. Lett., 170:381, 1999; Han, L., Microbiol., 140:3379, 1994; Hong, S.T., J. Bacteriol., 179:470, 1997; Trefzer, A., Antimicrob. Agents Chemother., 46:1174, 2002; Galm, U., Arch. Microbiol., 178:102, 2002; Li, A. et al., J. Chem. Biol., 9:1017, 2002; Novakova, R., Gene, 297:197, 2002). 앙구사이클린을 생산하지 않는 균주인 Streptomyces sp. PGA64 균주에서도 다른 앙구사이클린 유전자 클러스터 와 높은 상동성을 가지는 타입 II PKS와 유사한 사일런트 유전자 클러스터가 클로닝된 바 있다. 이 유전자 패밀리에 속하는 다른 유전자 클러스터들이 계속적으로 발견되고 있다.

앙구사이클린 생산에 관여하는 유전자는 하이브리드의 조합을 이용하여 더 많이 분리될 수 있을 것이다. 폴리케타이드 경로의 유전적 조작은 이미 여러 실험실에서 행하여지고 있으며, 서로 다른 클러스터의 폴리케타이드 합성 도메인을 각각 조합하는 것도 가능할 것이다. 이들의 조합에 의해 활성 효소 복합체를 형성하고, 이들 하이브리드 PKS를 이종 숙주에서 발현시키면, 새로운 방향성 폴리케타이드를 생성할 수 있다. 다른 한편으로, 생물학적 활성을 조절하여 항생제를 인식하는 데옥시당의 구조를 변화시키고자 하는 노력이 계속되고 있다.

Sch47554 및 Sch47555의 생합성 유전자 클러스터의 클로닝은 이들 항생제의 생합성에 관한 정보를 제공할 뿐만 아니라, 하이브리드 폴리케타이드 및 데옥시당 조합의 생합성에 대한 유전적 배경을 넓힐 수 있게 한다. Sch47554 및 Sch47555에서의 특별한 2,3,6-트리데옥시당의 존재는 생화학 및 분자수준의 연구에 있어서 매우 중요하다.

이에 본 발명자들은, Streptomyces sp. SCC-2136의 염색체 DNA에서 Sch47554 및 Sch47555의 생합성 유전자 클러스터로 예상되는 유전자 단편을 클로닝하여, 염기서열을 결정하고, Sch47554 및 Sch47555의 생합성에 관여하는 유전자를 발현시켜 효소활성을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 Sch47554 및 Sch47555 생합성에 관여하는 유전자 클러스터의 염기서열을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Sch47554 및 Sch47555 생합성계 효소인 dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 가지는 Sch47554 및/또는 Sch47555 생합성계 유전자 클러스터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 클러스터는 Streptomyces sp. SCC-2136(ATCC55186) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제를 코딩하는 유전자(schS2), 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 33361~34758 영역의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 박테리아를 배양하는 것을 특징으로 하는 dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제의 제조방법을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 발명에서 사용된 Streptomyces sp. SCC-2136(ATCC55186)는 ISP2(Difco, USA) 고체 배지에서 배양하였으며, Streptomyces sp. SCC-2136의 염색체 DNA는 액체 YEME 배지(bacto-yeast extract 0.15g/l, bacto-peptone 0.25g/l, malt extract 0.15g/l, glucose 0.5g/l, sucrose 17g/l, MgCl₂·6H₂O(1M) 2.5㎖/l, glycine(20%) 3㎖/l)에서 3일간 배양하여 분리하였다. 고체배양과 액체배양은 모두 28℃에서 수행하였다. 유전자 조작과 재조합 플라스미드의 제조에는 E.coli XL1Blue MRF(Stratagene, USA) 를 사용하였다. 유전자 발현용 숙주로는 E.coli BL21(DE3)(Invirogen, USA)을 사용하였다. E.coli의 배양은 LB액체배지에서 37℃로 수행하였으며, 재조합 플라스미드의 선택마커로서 암피실린(100μg/ml) 및 아프라마이신(100μg/ml)을 사용하였다. 벡터로는 코스미드 라이브러리를 위하여 pOJ446(Invitrogen, USA)을 사용하였으며, E.coli에서의 유전자 발현을 위하여 pET-32a(Novagen, USA)를 사용하였다. PCR 단편을 클로닝하기 위하여는 pGEM-T easy 벡터(Promega)를 사용하였다.

실시예 1. DNA 라이브러리 구축 및 코스미드 라이브러리 스크리닝

DNA 라이브러리를 구축하기 위하여, Streptomyces. sp. SCC-2136의 염색체 DNA를 MboI를 사용하여 절단한 다음, 35~45kb 크기의 단편을 취하여, BamHI과 HpaI으로 처리된 pOJ446과 라이게이션하였다. 라이게이션된 시료의 인비트로 팩키징은 GigapackIII XL(Stratagene, USA)을 사용하여 행하였으며, E.coli XL1Blue MRF로 형질전환시켰다.

Streptomyces. sp. SCC-2136의 염색체 DNA로부터 얻은 340bp의 dTDP-글루코스-4,6-디하이드라테이즈 유전자는 DW11(서열번호 3), DW32(서열번호 4)의 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물은 pGEM-T easy 벡터에 라이게이션시켜 서열분석 및 염색체 라이브러리의 프로브로 사용하였다.

DW11(서열번호 3): 5'-CACTTCGGGGGCGAGTCGCACGT-3'

DW32(서열번호 4): 5'-GGGCCGTAGTTGTTCGAGCA-3'

프로브는 32P로 표지된 랜덤 프라이머 라벨링 키트(Stratagene, USA)를 사용하여 표지하였으며, 젤 여과법을 사용하여 정제하였다.

하이브리다이제이션은 50℃에서 6시간동안 10㎖의 2X SSC용액에서 수행하였다. 콜로니 하이브리다이제이션과 써던 하이브리다이제이션은 Hybond N 나일론 막(Amersham, 독일)을 이용하여 수행하였다.

스크리닝 결과, 12개의 양성 코스미드 클론을 수득하였으며, 이중 하나의 클론을 선택하여 pSCC-1으로 명명하고 서열분석을 수행하였다. DNA 서열분석은 디데 옥시 체인 터미네이션법을 사용하여 자동 서열기에서 수행하였으며, 결정된 서열은 DNASIS(버젼 2.1, 히타치 소프트웨어, 일본)를 이용하여 정리하였으며, BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 사용하여 상동성을 검색하였다.

pSCC-1은 42.9kb의 단편이 삽입된 재조합 플라스미드로, 30개의 예상 ORF를 가지고 있고, DOH 생합성 유전자 및 두개의 PKS 관련 유전자를 포함하고 있으며, PKS 유전자는 DOH 클러스터의 upstream에 위치한다는 것을 알 수 있었다. 염색체상의 워킹(walking)에 의하여 업스트림 쪽으로 확장하여, 55개의 ORF를 가진 34.6kb의 서열을 분석하였다 (서열번호 1). 그 결과, 본 발명에 따른 유전자 클러스터는 입증된 타입 II PKS 및 여러 Streptomyces spp.의 데옥시당 생합성 유전자 클러스터와 광범위한 유사성을 나타내었다. 상동성 검색에 의해 확인된 본 발명에 따른 모든 유전자의 방향성과, 유전자 지도 및 예상되는 기능을 표 1과 도 2에 나타내었다.

서열번호 1의 염기서열에서 전체 55개 ORF의 영역은 다음과 같다: schA1 [498~1481]; schA2 [1515~2402]; schA3 [complement, 4587~5666]; schA4 [complement, 6218~6883]; schA5 [7072~7965]; schA6 [8041~9921]; schA7 [10223~11704]; schA8 [11716~12678]; schA9 [complement, 13077~13670]; schA10 [complement, 13683~14561]; schA11 [complement, 14577~15980]; schA12 [complement, 16240~17175]; schA13 [complement, 17172~18848]; schA14 [complement, 18845~20005]; schA15 [complement, 20025~22100]; schA16 [22247~23140]; schA17 [complement, 23237~24619]; schA18 [complement, 25015~26022]; schA19 [complement, 26093~27883]; schP1 [complement, 28019~29872]; schP2 [complement, 30033~31604]; schS1 [complement, 32312~33334]; schS2 [complement, 33361~34758]; schS3 [complement, 35871~37175]; schS4 [complement, 37175~38134]; schS5 [complement, 38166~39152]; schS6 [complement, 39149~40216]; schS7 [complement, 40301~41437]; schS8 [complement, 41434~42024]; schS9 [complement, 42086~43258]; schS10 [complement, 43298~44590]; schA20 [complement, 44623~45846]; schP3 [complement, 45969~47792]; schP4 [complement, 47970~48908]; schP5 [complement, 48935~49735]; schP6 [complement, 49768~50037]; schP7 [complement, 50097~51323]; schP8 [complement, 51320~52582]; schP9 [complement, 52606~52932]; schP10 [complement, 52990~54474]; schP11 [complement, 54705~55580]; schA21 [complement, 55722~56477]; schA22 [56595~57194]; schA23 [57209~58792]; schA24 [58880~59998]; schA25 [60242~61093]; schA26 [complement, 62333~63931]; schA27 [complement, 64202~64954]; schA28 [65981~66589]; schA29 [66593~67477]; schA30 [67521~69065]; schA31 [complement, 69585~70373]; schA32 [complement, 70497~72167]; schA33 [complement, 72198~73847]; 및 schA34 [complement, 74161~77076].

실시예 2. Sch47554 및 Sch47555 생합성 유전자 클러스터의 분석

실시예 1의 서열분석과 상동성 분석을 통해, 본 발명에 따른 유전자 클러스터가 Sch47554 및 Sch47555의 생합성을 위한 유전자를 코딩한다는 것을 확인할 수 있었다. PKS 및 DOH 유전자는 같은 전사방향을 가지고 있었다. schS3-schS4, schS5-schS6, schS7-schS8 및 schP7-schP8의 시작코돈과 정지코돈은 겹쳐져 있어, 트랜스래이션 커플임을 알 수 있었다. schS1, schS4, schS7 및 schP8은 특이하게 GTG를 시작코돈으로 사용하고 있었다. PKS 및 DOH 유전자 클러스터는 트랜스포터 유전자에 의하여 분리되어 위치하고 있으며, 측면에는 여러 악세사리 유전자가 위치하고 있었다.

(1) 앙구사이클린 부분(moiety)의 형성에 관여할 것으로 예상되는 유전자

PKS 유전자는 schP3 -schP10에 의해 코딩된다. 이들 유전자들은 어다마이신 A 및 랜도마이신 A의 해당 유전자와 아미노산 서열과 유전적 조합에 있어서 매우 유사하다. 클러스터 중 가장 작은 ORF는 90개의 아미노산을 코딩하는 schP6이고, 이 유전자는 PKS-ACP와 상동성을 나타내며, 포스포판테틴(phosphopantethine)의 결합활성을 나타내는 ⁴³Ser 잔기를 포함하는 높은 보존적 모티브인 ³⁹LGYESLALLE⁴⁹ 를 포함한다. schP7의 시작코돈은 schP8의 정지코돈과 겹쳐, 타입II PKS의 특징인 CLF/KS 쌍을 나타낸다. schP8의 아미노 말단의 촉매 도메인은 활성 ¹⁷²Cys 잔기를 가진 보존구역인 ¹⁶⁶TVVSTGCTSGLD¹⁷⁷을 가지고, 카르복실기 말단부분에는 아실사슬과 결합하는 활성 ³⁵⁰Ser과 함께 AT 도메인을 나타내는 ³⁴⁸GHSLG³⁵²(GHSXG)를 가진다.

schP4, schP5 및 schP9는 각각 초기 폴리케타이드 사슬의 변형에 관여하는 아로마타아제(aromatase), 케토리덕타아제(ketoreductase) 및 싸이클라아제(cyclase)를 코딩하고 있다. schP4의 DNA 서열에서 추정되는 산물은 첫 번째 링의 아로마제이션에서 중요한 역할을 하는 효소와 상동성을 나타내었다. 싸이클라아제인 SchP9는 안트라싸이신보다 앙구사이클린 싸이클라아제와 유사하였다 (Fernandez-Moreno, M.A., et al., J. Biol. Chem., 267:19278, 1992).

schP5의 서열에서 추정되는 산물은 UrdD와 88%의 높은 상동성을 나타내었을 뿐만 아니라, 오비에도마이신 및 자도마이신과 같은 여러 앙구사이클린의 케토리덕타아제와도 상동성을 나타내었다. SchP5의 아미노기 말단에는 NAD(P)H의 결합 도메인인 ¹⁸GATSGIG²⁴를 가지고 있었다. 이들 케토리덕타아제는 다른 방향성 PKS 케토리덕테아제와 높은 상동성을 가지고, 초기 폴리-β-케톤사슬의 C-9 카르보닐 그룹의 부위 특이적인 환원에 관여하고 있다 (Hopwood, D.A., Chem. Rev., 97:2465, 1997).

모듈라 PKS와 다르게, 앙구사이클린 유전자 클러스터의 가장 중요한 성질은 많은 산화효소(oxygenase)가 존재한다는 것이며, 예상에 맞게 본 발명의 유전자 클러스터는 2개의 산화효소가 schP3 및 schP10에 의해서 코딩되고 있었다. schP10은 링 B의 산화적 오프닝에 관여하는 산화효소인 UrdE 및 JadF(Jad-ORF6)과 상동성을 나타내었다. 최근, NADH 및 FAD에 의존적인 모노옥시게나아제(MtmOIV)가 미스라마 이신(mithramycin) 생산균주로부터 정제되었으며, 링의 오프닝에서 Baeyer-Villiger 타입 산화기작을 담당하고 있다. 다른 유전자들과 마찬가지로, SchP10도 아미노기 말단에 FAD 결합도메인을 가지고 있었으며, 카르복실기 말단에는 산소 결합도메인을 가지고 있었다. 한편, schP3은 UrdM의 어다마이신 A의 생합성에서의 역할과 마찬가지로, C-12b위치에 수산기를 첨가하는 역할을 수행한다. 이는 산화-환원효소이고, 아미노기 말단에는 산소 결합도메인을, 카르복실기 말단에는 NAD(P)H 결합도메인을 가진다.

Sch47554 및 Sch47555의 코어 PKS는 C₂₀ 사슬로 구성되고, 아세틸- 및 9개의 말로닐-CoA 확장자에 의해 조합되기 때문에 대사적 말로닐-CoA가 필수적이다. 아세틸-CoA의 카르복실레이션은 말로닐-CoA를 생산하기 위해 첫 번째로 행하여지는 단계이며, 이 단계는 JadJ와 상동성을 나타내는 Sch 유전자 클러스터의 schP1에 의해 촉매된다. 이 그룹의 단백질은 종종 ACC(Acetyl-CoA Carboxylase)라는 약자로 표시되며 이중적인 기능을 가진다. 이러한 카르복실라아제는 FAS(fatty acid synthases)와 자주 혼용된다. 그러나, JadJ는 FAS와 혼용되지 않으며, 대신 기능적으로 PKS와 연관되어 있다 (Han, L. et al., Microbiol., 146: 903, 2000). 인접한 schP2 또한 PKS의 전구체를 생산하는 유전자와 연관이 있으며, 상기 schP2는 말로닐-CoA 디카르복실라아제를 코딩하고, JadN 및 LanP와 상동성이 있었다.

아글리콘 생합성에 의하면, 아세틸-CoA에 의한 사슬의 시작에 의해 코어구조가 형성되고, 9개의 말로닐-CoA가 추가되어 데카케타이드를 형성한다. SchP6, SchP7 및 SchP8은 상기 데카케타이드를 만들고, SchP4는 사슬을 방향성으로 만든다. SchP5는 특이적 케토리덕션을 보조하고, SchP9는 결정화를 촉매하고, SchP10은 마지막 링을 분해시킨다. SchP3는 C-12에 하이드록시기를 덧붙인다. 이와 같이 Ppost PKS 테일러링(tailoring) 효소들은 방향족 아글리콘을 생물학적으로 활성을 띠는 대사산물로 전환하는 역할을 하며, 옥시게네이즈 및 글리코실트랜스퍼라아제의 기능은 앙구사이클린에 있어서 중요한 역할을 한다 (Motamedi, H., et al., J. Bacteriol., 178:5243, 1996).

(2) 데옥시당의 형성에 관여할 것으로 예상되는 유전자

데옥시당 생합성 유전자 클러스터는 schS1-schS10에 의하여 코딩된다. schS5 및 schS6로부터 예상되는 단백질은 각각 dNDP-글루코스-4,6-디하이드라타아제 및 dNDP-글루코스 신세이즈를 코딩하는 단백질들과 상동성을 나타내었다. 이들은 dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스를 생산하는데 있어서, 첫 번째 두단계를 촉매하는 역할을 한다. 세 번째 단계는 dNDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스-2,3-디하이드라타아제에 의한 C-2의 데옥시게네이션이다. schs2 유전자의 산물은 어다마이신 A 생합성에서 L-로디노즈(rhodinose) 및 D-올리보스(olivose)의 생합성에 관여하는 UrdS와 80%의 상동성을 나타내었다. 또한, Gra-ORF27과도 상동성을 나타내었으며, 상기 단백질은 그라나티신(granaticin) 생합성에서 D-올리보스 및 L-로디노스의 생합성에서 C2-H를 유지시켜 C-2 디옥시게네이션에 관여한다고 밝혀졌다 (Spines, C.E. et al., J. Am. Chem. Soc., 101:701, 1979; Draeger, G. et al., J. Am. Chem. Soc., 121:2611, 1999). 그러므로, SchS2는 2,3-디하이드라타아제의 기능을 가진다고 볼 수 있다. Gra-ORF27에 의해 촉매되는 반응의 높은 반응성을 가지는 산물(dTDP-3,4-디케토-2,6-디데옥시-D-글루코스)은 Gra-OPR26(3-케토리덕타아제)에 의해 안정한 산물(말톨)로 전환된다. 그러므로, SchS2의 C-2 디옥시게네이션은 Gra-ORF26과 상동성을 가지는 SchS1(3-케토리덕타아제)에 의해 보조되는 것으로 추정된다. 그러므로, Sch47554 및 Sch47555의 모든 당 부분의 생합성에서 dTDP-4-케토-2,6-디데옥시글루코스가 중간산물이 된다. 이후 나머지 단계는 C-3 데옥시게네이션, 에피머제이션 및 4-케토리덕션이다. 스트렙토마이세스 속에서 수많은 디데옥시당 유전자가 클로닝되었지만, 트리데옥시당 유전자의 클로닝은 소수에 불과하며, 높은 정도의 데옥시게네이션은 생합성 경로에서의 유전자의 기능을 복잡하게 한다.

schS3, schS4 및 schS8의 산물은 여러 데옥시당 생합성 유전자의 아미노산 서열과 높은 상동성을 가지고, 각각 NDP-글루코스-3-디하이드라타아제, NDP-글루코스-4-케토리덕타아제 및 NDP-글루코스-3-(3,5) 에피머라아제의 기능을 가진다. schS7은 어다마이신 A 생합성에서 D-올리보스 경로의 C-C 결합의 C-9 글리코실레이션에 관여하는 UrdGT2와 71%의 높은 상동성을 가지고 있었다. 그러므로, SchS7은 Sch47554 및 Sch47555의 C-9에서 D-아미세토스(amicetose)를 전이시키는 C-글리코실트랜스퍼라아제이다. schS9에 의해 코딩되는 O-글리코실트랜스퍼라아제는 UrdGT1b/c의 아미노산 서열과 상동성을 나타내는 반면, O-글리코실트랜스퍼라아제 SchS10은 UrdGT1a와 상동성을 가지고 있었다. 그러므로, schS9 및 schS10은 Sch47554 및 Sch47555의 C-O 결합경로에서 L-아미세토스 및 L-아큘로스(aculose)의 전이를 담당하는 것으로 추정된다.

이상에서와 같이, Sch47554 및 Sch47555의 폴리케타이드 및 데옥시당 유전자는 어다마이신 A의 생합성 유전자와 매우 높은 상동성을 나타내었고, 랜도마이신 A, 자도마이신 B, PD 117640, 시모사이클리논 및 오비에도마이신과 같은 앙구사이클린 합성 유전자와도 상동성을 가지고 있었다. sch PKS 유전자인 schP9, P8, P7, P6 및 P5는 어다마이신 A의 urdF, A, B, C, D 및 L, 자도마이신 B의 jadI, A, B, C, E 및 D와 랜도마이신 A의 lanF, A, C, D 및 F 등의 앙구사이클린 항생제의 PKS를 코딩하는 유전자와 높은 상동성을 나타내었다. Sch47554 및 Sch47555 유전자 클러스터와 어다마이신 유전자들과의 상동성은 88~48% 범위였다. 이중 어다마이신 유전자와 비교적 낮은 상동성을 보이는 유전자는 schS4(NDP-글루코스 4-케토리덕타아제, UdrZ3와 51% 상동성), schS9(O-글리코실트랜스퍼라아제, UrdGT1b/c와 53%와 상동성), schS10(O-글리코실트랜스퍼라아제, UrdGT1a와 48%의 상동성), schA20(UrdJ2와 52% 상동성) 및 schA23(UrdJ와 33%의 상동성)이었다.

어다마이신 A 유전자 클러스터는 L-로디노스 및 D-올리보스 생합성에 관여하는 UrdZ3 및 UrdR의 2,6-디데옥시당 및 2,3,6-트리데옥시당에 대한 두개의 서로 다른 4-케토리덕타아제를 가지고 있다. 4-케토-2,3,6-트리데옥시당에서 4-케토 그룹의 환원에 관여하는 SchS4는 UrdZ3와 낮은 상동성을 나타내고, 이는 UrdZ3와 SchS4의 입체특이성이 다르다는 증거가 될 수 있다. 유전자 클러스터에서 D- 및 L-아미세토스의 형성은 단일 SchS4에 의해서 설명할 수 있다.

Sch47554 및 Sch47555 생합성에서 세 개의 다른 데옥시당 부분이 전이되는 것은 본 발명의 유전자 클러스터에 존재하는 세개의 글리코실트랜스퍼라아제에 의해 설명될 수 있다. SchS7과 다른 C-글리코실트랜스퍼라아제의 높은 상동성은 이들 글리코실트랜스퍼라아제가 2,3,6-트리데옥시당뿐만 아니라 2,6-디데옥시당을 전이한다는 것을 나타낸다. 게다가, C-글리코실트랜스퍼라아제는 뉴클레오티드 농도에 따라 상기 두 종류의 데옥시당을 전이할 수 있다는 보고가 있었다 (Hoffmeister, D. et al., Chem. Biol., 7:821, 2000). 어다마이신 O-글리코실트랜스퍼라아제와 SchS9 및 SchS10의 낮은 상동성으로 이들이 구조적으로 다른 데옥시당을 전이한다는 것을 알 수 있다. SchS9은 UrdGT1b 및 UrdGt1c와 상동성(~53%)을 나타내고, D-올리보실(C-9, 말단) 및 L-로디노실(rhodinosyl)의 전이(C-9 중간)에 관여한다. 한편, SchS10은 URdGT1a와 상동성(48%)을 가지고, D-로디노실 전이(C-12b)에 관여한다. 상기 결과들로, SchS9가 Sch47555의 C-9에서 D-아미세토실(amicetosyl) 전이에 관여하고, SChS10은 Sch47554 및 SCh47555에서 C-3 및 C-9에서 L-아큘로실(aculosyl)의 전이에 관여할 것이라고 추정된다.

(3) 다른 기능의 유전자들

본 발명에 따른 Sch47554 및 Sch47555의 생합성 유전자 클러스터에는 5개의 조절유전자와 6개의 트랜스포트 유전자 및 4개의 산화환원 기능을 가지는 유전자가 존재하였다. schA4 및 schA21은 몇몇의 Streptomyces PKS 클러스터에서 확인된 TeR-패밀리 조절 유전자에 속하였다. SchA25는 랜도마이신 A의 생합성에서 양성 조절자의 역할을 하는 LanI과 58%의 상동성을 나타내었다 (Rebets, Y. et al., FEMS Microbiol. Lett., 222, 149, 2003). 전사 조절자인 SchA27은 S. coelicolor 염색체에서 발견된 전사조절인자와 78%의 상동성을 나타내었다.

schS1, schA2, schA3, schA7, schA20 및 schA23은 저항성을 나타내는 기능을 하는 단백질들을 코딩하였다. schS1 및 schA2는 박테리아에서 퍼미아제(permeases) 패밀리에 속하며, schA3 및 schA7은 아미노산트랜스포터에 속하였다. schA20 유전자는 어다마이신 A 생합성 유전자 클러스터에서 PKS 및 DOH 유전자 사이에 존재하는 urdJ2와 상동성을 나타내고, 마찬가지로 PKS 및 DOH 유전자 사이에 위치하고 있었다. 또 다른 트랜스포터인 SchA23은 양자 의존성 트랜스포터로 알려진 urdJ/lanJ와 상동성을 나타내었다 (Westrich, L. et al., FEMS Microbiol. Lett., 170:381, 1999; Faust, B. et al., Microbiol., 146:147, 2000).

Sch47554 및 Sch47555의 생합성 과정동안, schA20은 자가 내성을 조절한다. schP11는 PKS 클러스터에 인접하여 있으나, 이의 유전자 산물은 앙그사이클린 생합성 유전자 중 어떤 유전자와도 의미있는 상동성을 나타내지 않았으며, 단지 기능이 밝혀지지 않은 Med-ORF27과 42%의 상동성을 나타내었다.

실시예 3. 발현 플라스미드의 구축 및 형질전환

1389bp의 schS2를 프라이머 S2-I과 S2-II를 사용하여 코스미드 pSCC-1으로부터 증폭시켰다. 증폭된 단편을 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 pET-32a(+)(Novagen, USA)에 클로닝하여 재조합플라스미드 pSCHS2를 제작하였다. 상기 pSCHS2를 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 재조합 대장균을 수득하였다.

S2-I(서열번호 5):5'-GGATCCCATATGCTGTCCCACACCCTT-3'

S2-II(서열번호 6): 5'-GAATTCCCGCGCTCAACGTGCCCT-3'

실시예 4. Sch2 의 발현과 SCH2 효소의 활성분석

pSCHS2로 형질전환된 E. coli BL21(DE3)을 2.5mM 베타인(betaine) 및 1M 솔비톨이 첨가된 LB 배지에서 배양하였다. 상기 배양액을 100㎖의 LB 배지로 옮겨 37℃에서 배양하여, 배양액의 흡광도가 OD₆₀₀에서 0.6에 도달하였을 때, 최종농도가 0.4mM이 되도록 IPTG를 첨가하여 schS2의 발현을 유도한 후, 22℃에서 32시간 추가로 배양하였다. 상기와 같이 schS2의 발현이 유도된 E. coli BL21(DE3)/pSCHS2를 SDS-PAGE로 확인한 결과, 68.2kDa의 재조합 단백질을 확인할 수 있었다 (도 3).

SchS2의 효소활성은 in vitro 효소분석을 통하여 측정하였다. 효소분석을 위한 반응 혼합물은 전체부피 100㎕에 50mM 트리스-HCl(pH7.4) 버퍼, 5.0mM의 기질(dTDP-4-케토-6-데옥시글루코스) 및 30㎕ 세포질 Sch2가 포함된 용액을 사용하였다. 상기 반응 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 반응시키고, 95℃에서 30초동안 열처리하여 반응을 종료시켰다. 원심분리에 의해 단백질을 제거하고, 상등액을 얻어 반응산물의 분석에 사용하였다. SchS2에 의한 반응산물인 말톨(maltol)을 역상 HPLC로 분석함으로서 효소활성을 측정하였다. 즉, SchS2의 반응산물은 260nm 파장에서 UV 검출기를 통해 HPLC를 사용하여 분석하였다. 칼럼은 Mightysil RP-18, GP250-4.5(5μM)를 사용하였으며, 1% HCOOH를 포함한 증류수에서 0-25%의 CH₃CN 그래디언 트로 30분이상 용출하였으며, 유속은 1.0ml/분이었다.

HPLC 분석결과, 반응산물(말톨)의 피크는 15.3분에서 관찰되었으며, 대조군의 단일 말톨로 행한 분석결과와 일치하였다 (도 4). 이 결과로부터 본 발명 따른 SchS2 효소는 dTDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제 활성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 Sch47554 및 Sch47555 생합성에 관여하는 유전자 클러스터의 염기서열, Sch47554 및/또는 Sch47555 생합성계 효소인 dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제(SchS2) 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 Sch47554 및 Sch47555 생합성에 관여하는 유전자 클러스터, dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제(SchS2) 및 그 유전자는 Sch47554, Sch47555 또는 이와 유사한 신규 앙구사이클린계 항생제의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

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Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제.
4. 제3항의 dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제를 코딩하는 유전자(schS2).
5. 제4항에 있어서, 서열번호 1의 33361~34758 영역의 염기서열 또는 이와 상보 적인 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자(schS2).
6. 제4항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
7. 제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아.
8. 제7항의 형질전환된 박테리아를 배양하는 것을 특징으로 하는 dNDP-4-케토-6-데옥시글루코스-2,3-디하이드라타아제의 제조방법.

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