KR100564156B1 - Transcriptional Activator Derived from Streptomyces peucetius and The Gene Thereof - Google Patents
Transcriptional Activator Derived from Streptomyces peucetius and The Gene Thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR100564156B1 KR100564156B1 KR1020040066555A KR20040066555A KR100564156B1 KR 100564156 B1 KR100564156 B1 KR 100564156B1 KR 1020040066555 A KR1020040066555 A KR 1020040066555A KR 20040066555 A KR20040066555 A KR 20040066555A KR 100564156 B1 KR100564156 B1 KR 100564156B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- afsr
- gene
- streptomyces
- present
- transcriptional activator
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 스트렙토마이세스 유래 전사활성체(transcription activator) 및 그 유전자(afsR-p)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 항생물질의 생성을 조절하는 전사활성체의 기능을 가지는 스트렙토마이세스 푸세티우스(Streptomyces peucetius) 유래 afsR-p 유전자에 관한 것이다.The present invention relates to a Streptomyces-derived transcription activator (transcription activator) and its gene ( afsR-p) , more specifically Streptomyces Fusethius (which has the function of a transcriptional activator that regulates the production of antibiotics) Streptomyces peucetius ) To the derived afsR-p gene.
본 발명에 따른 afsR-p 유전자는 스트렙토마이세스 속 미생물이 생산하는 감마-액티노로딘, 독소루비신 등의 항생물질의 생성을 증진시키는데 유용하다. The afsR-p gene according to the present invention is useful for enhancing the production of antibiotics such as gamma- actinolodine , doxorubicin and the like produced by Streptomyces spp .
afsR-p, 조절 유전자, Streptomyces peucetius, 항생물질afsR-p, regulatory gene, Streptomyces peucetius, antibiotic
Description
도 1은 Streptomyces peucetius ATCC 27952 유래 AfsR-p, Streptomyces griseus 유래 AfsR-g 및 Streptomyces coelicolor A3 유래 AfsR의 상동성을 비교한 것이다.1 compares the homology of AfsR-p from Streptomyces peucetius ATCC 27952, AfsR-g from Streptomyces griseus , and AfsR from Streptomyces coelicolor A3.
도 2는 본 발명에 따른 afsR-p에 의해 형질전환된 Streptomyces lividans TK24에서 감마-액티노로딘의 생성이 증가되는 것을 나타낸 그래프이다. 1과 3은 pIBR25로 형질전환된 Streptomyces lividans TK24이고, 2와 4는 pGIBR로 형질전환된 Streptomyces lividans TK24이다. 1과 2는 각 28℃에서 4일 배양한 결과이고, 3과 4는 각 28℃에서 8일 배양한 결과이다. Figure 2 is a graph showing the increased production of gamma- actinolodine in Streptomyces lividans TK24 transformed by afsR-p according to the present invention. 1 and 3 are Streptomyces lividans TK24 transformed with pIBR25, and 2 and 4 are Streptomyces lividans TK24 transformed with pGIBR. 1 and 2 are the results of 4 days incubation at 28 ℃ each, 3 and 4 is the result of 8 days incubation at each 28 ℃.
본 발명은 스트렙토마이세스 유래 전사활성체(transcription activator) 및 그 유전자(afsR-p)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 항생물질의 생성을 조절하는 전사활성체의 기능을 가지는 스트렙토마이세스 푸세티우스(Streptomyces peucetius) 유래 afsR-p 유전자에 관한 것이다.The present invention relates to a Streptomyces-derived transcription activator (transcription activator) and its gene ( afsR-p) , more specifically Streptomyces Fusethius (which has the function of a transcriptional activator that regulates the production of antibiotics) Streptomyces peucetius ) To the derived afsR-p gene.
스트렙토마이세스는 광범위하고 다양한 이차 대사산물들을 생산하는 실모양의 토양 박테리아이다 (Crandall, L.W. and Hamill, R.L. , Antibiotics produced by Streptomyces: major structural classes, In S.W. Queener and L.E. Day (ed.), The Bacteria 9, 355-402, 1986). 스트렙토마이세스의 조절에 대해서는 극소수만 알려져 있다. 일반적으로 이차 대사산물 생산에 관련된 유전자들은 경로 특이적인 것과 글로벌(global)한 것, 두 분류로 나눌 수 있다 (Chater, K.F. and Bibb, M.J., Bio/Technology, 7:57, 1996). 거의 모든 경로 특이적인 조절 유전자들은 항생물질 생합성의 한 종류를 조절하고, 생합성 유전자 클러스터(cluster)안에 위치한다. 반면에 글로벌(global) 조절 유전자들은 생합성 유전자 클러스터(cluster)의 밖에 위치하고, 스트렙토마이세스에서 이차대사, 형태학적 및 생리학적 분화를 조절한다 (Umeyama, T. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 59:419, 2002 ).Streptomyces are threaded soil bacteria that produce a wide variety of secondary metabolites (Crandall, LW and Hamill, RL, Antibiotics produced by Streptomyces : major structural classes, In SW Queener and LE Day (ed.), The Bacteria 9, 355-402, 1986). Very few are known about the regulation of Streptomyces. In general, genes involved in secondary metabolite production can be divided into two classes, pathway specific and global (Chater, KF and Bibb, MJ, Bio / Technology, 7:57, 1996). Almost all pathway-specific regulatory genes regulate one type of antibiotic biosynthesis and are located in a biosynthetic gene cluster. Global regulatory genes, on the other hand, are located outside the biosynthetic gene cluster and regulate secondary metabolism, morphological and physiological differentiation in Streptomyces (Umeyama, T. et al ., Appl. Microbiol. Biotechnol . , 59: 419, 2002).
경로 특이적인 조절 유전자들은 두 구성조절 시스템에 의해 작동하고, 아스파테이트(aspartate) 잔기의 변이를 타겟으로 한다. 세린/트레오닌, 티로신 키나아제가 원핵생물, 진핵생물 둘 다에서 존재한다는 최근의 보고가 있었다 (Cozzone, A.J., Folia Microbiol, 42:165, 1997).Pathway specific regulatory genes operate by two constitutive regulatory systems and target mutations in aspartate residues. There have been recent reports that serine / threonine and tyrosine kinases are present in both prokaryotes and eukaryotes (Cozzone, AJ, Folia Microbiol , 42: 165, 1997).
스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) A3에서 진핵세포 타 입 세린/트레오닌, 티로신 키나아제들이 40개 이상 발견되었다(http://www. sanger.ac.uk/Projects/S_coelicolor/). 이차 대사과정에서 이러한 단백질 키나아제들의 영향은 AfsK에서 처음 연구되었다. More than 40 eukaryotic type serine / threonine and tyrosine kinases have been found in Streptomyces coelicolor A3 (http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_coelicolor/). The effect of these protein kinases on secondary metabolism was first studied at AfsK.
AfsR은 AfsK-AfsR 시스템에서 사용되는 AfsK의 기질들 중 하나이다. 이는 원핵세포에서 세린과 트레오닌 인산화 시스템에 기능적으로 관련된 첫 예이다 (Kennelly, P.J. and Potts, M., J. Bacteriol., 178:4759, 1996). 이후의 연구에서, AfsK-AfsR 시스템은 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 넓게 사용되고 있고, 이차 대사과정과 형태형성에 작용한다는 것을 확인하였다. 더욱이 AfsR은 액티노로딘(actinorhodin) 생합성 유전자 클러스터에서 경로 특이적 유전자인 actⅡ-ORF4들을 활성화시키는 afsS의 transcriptional activator로서 작용한다는 것이 밝혀졌다 (Lee, P.C. et al., Mol. Microbiol., 43:1413, 2002).AfsR is one of AfsK's substrates used in the AfsK-AfsR system. This is the first example of a functionally related serine and threonine phosphorylation system in prokaryotic cells (Kennelly, PJ and Potts, M., J. Bacteriol ., 178: 4759, 1996). In later studies, the AfsK-AfsR system was found to be widely used in Streptomyces and to act on secondary metabolism and morphogenesis. Moreover, AfsR has been shown to act as a transcriptional activator of afsS that activates the pathway-specific gene actII-ORF4 in the actinorhodin biosynthetic gene cluster (Lee, PC et al ., Mol. Microbiol ., 43: 1413 , 2002).
감마-액티노로딘은 항생물질로 의약품을 만드는 데 사용된다. 대부분의 항생물질은 단백질이 아니며 서로 다른 유전자 산물인 수많은 효소가 관여하는 복잡한 과정을 거쳐 합성된다.Gamma-actinolodine is used to make medicines from antibiotics. Most antibiotics are not proteins and are synthesized through a complex process involving numerous enzymes that are different gene products.
S. coelicolor A3의 AfsR은 993개의 아미노산을 코딩한다. AfsR은 다른 DNA 결합 단백질과는 달리, 두 개의 ATP 결합 모티브를 지니고, 한 개의 촉매 도메인을 지닌다. 그러므로 afsR은 이차 대사산물 생산을 위한 조절 유전자로 불린다. AfsR의 NH2기 말단부분은 actⅡ-ORF4, redD, dnrI 및 ccaR과 같은 스트렙토마이세스의 경로 특이적인 조절 유전자들과 상동성을 나타내었다 (Fernandez-Moreno, M.A. et al., Cell, 66:769, 1991; Narva, K.E. and Feitelson, J.S., J. Bacteriol., 172:326, 1990; Stutzman-Engwall, K.J. et al., J. Bacterial., 174:144, 1992; Perez-Llarena, F.J. et al., J. Bacteriol., 179:2053, 1997). 스트렙토마이세스 속의 AfsR을 코딩하는 유전자에 대해서는 일부만이 규명되어 있고, 특히 보존된 서열에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.AfsR of S. coelicolor A3 encodes 993 amino acids. AfsR, unlike other DNA binding proteins, has two ATP binding motifs and one catalytic domain. AfsR is therefore called the regulatory gene for secondary metabolite production. The NH 2 terminus of AfsR showed homology with pathway-specific regulatory genes of Streptomyces such as actII-ORF4, redD, dnrI and ccaR (Fernandez-Moreno, MA et al., Cell , 66: 769) , 1991; Narva, KE and Feitelson, JS, J. Bacteriol ., 172: 326, 1990; Stutzman-Engwall, KJ et al., J. Bacterial ., 174: 144, 1992; Perez-Llarena, FJ et al. , J. Bacteriol ., 179: 2053, 1997). Only a few have been identified for genes encoding AfsR in Streptomyces, and particularly not well known for conserved sequences.
이에 본 발명자들은 S. peucetius에서 afsR 유전자를 클로닝하고, AfsR간의 보존된 서열을 밝힌 다음, 상기 클로닝된 유전자로 S. lividans TK24를 형질전환시킨 후, 배양한 결과, 감마-액티노로딘의 생성이 증가한다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. Therefore, the present inventors cloned the a fsR gene from S. peucetius , revealed the conserved sequence between AfsRs, transformed S. lividans TK24 with the cloned gene, and cultured the cells to produce gamma-actinolodine. This increase was confirmed and the present invention was completed.
본 발명의 목적은 항생물질의 생성을 조절하는 전사활성체인 AfsR-p 및 그 유전자를 제공하는데 있다.An object of the present invention to provide a transcriptional activator AfsR-p and its gene that regulates the production of antibiotics.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a recombinant vector containing the gene and a microorganism transformed with the recombinant vector.
본 발명의 또 다른 목적은, afsR 동정용 프라이머를 제공하는데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a primer for identifying afsR .
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 항생물질의 생성을 조절하는 전사활성체의 기능을 가지는 AfsR-p를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides AfsR-p having the function of a transcriptional activator to regulate the production of antibiotics having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 afsR-p 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환된 미생물을 제공한다.The present invention also provides an afsR-p gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a recombinant vector containing the gene, and a transformation obtained by introducing the recombinant vector into a host cell selected from the group consisting of bacteria, fungi and yeast. Microorganisms.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 Streptomyces peucetius 유래인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 숙주세포는 항생물질 생성능을 가지는 스트렙토마이세스 속 균주인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the gene may be characterized as derived from Streptomyces peucetius , the host cell may be characterized in that the strain Streptomyces genus having antibiotic production ability.
본 발명은 또한, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 가지는 afsR 유전자 동정용 프라이머 쌍을 제공한다.The present invention also provides a primer pair for identifying afsR gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
Streptomyces peucetius ATCC 27952는 독소루비신 생성균주로 널리 알려져 있다. 본 발명에서는 상기 균주로부터 독소루비신 생성에 관여하는 전사활성체의 유전자(afsR-p)를 다른 스트렙토마이세스 속 조절유전자와의 상동성 검색을 통해 찾아내고, 그 기능을 규명하기 위하여, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 감마-액티노로딘 생성균주인 Streptomyces lividans을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 Streptomyces lividans에서 감마-액티노로딘의 생성이 증가하는지 여부를 조사하였다. Streptomyces peucetius ATCC 27952 is widely known as a doxorubicin producing strain. In the present invention, to find a gene of a transcriptional activator ( afsR-p ) involved in the production of doxorubicin from the strain through homology with other Streptomyces genes, and to identify its function, the gene is contained. The recombinant vector was transformed into Streptomyces lividans , a gamma- actinolodine- producing strain, and then examined whether the production of gamma- actinolodine was increased in the transformed Streptomyces lividans .
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 구체적으로 제한되지 않는다는 것은, 당 업계에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명할 것이다. Through the following examples will be described the present invention in more detail. It will be apparent to those skilled in the art that these examples are only for explaining the present invention in detail, and the scope of the present invention is not specifically limited by the examples according to the gist of the present invention.
실시예1: 코스미드 라이브러리의 구축Example 1 Construction of Cosmid Library
여러 코스미드들과 샷건 방법(Himmelreich, H., et al., Nucleic Acids Res., 24:4420, 1996)을 사용하여 S. peucetius의 전체 게놈의 염기서열을 결정하였다. 서열분석된 단편들은 PRED(Ewing B. and Green P., Genome Res., 8:186, 1998) 및 PHRAP(http://www.phrap.org)를 사용하여 중복된 부분이 없도록 정리하였다. 전체 게놈 염기서열을 위해서 부가적인 게놈 라이브러리를 제작하였다. 약 2000~3000bp의 DNA 단편들을 pGEM-3Zf(+)(Promega, USA) 또는 pGEM7-7Zf(+)(Promega, USA)에 서브클로닝하고 디데옥시뉴클레오티드 사슬 결정법으로 염기서열을 분석하였다. Several cosmids and shotgun methods (Himmelreich, H., et al., Nucleic Acids Res ., 24: 4420, 1996) were used to determine the sequence of the entire genome of S. peucetius . Sequenced fragments were cleaned up using PRED (Ewing B. and Green P., Genome Res. , 8: 186, 1998) and PHRAP (http://www.phrap.org) to ensure that there were no overlaps. Additional genomic libraries were constructed for the entire genome sequence. DNA fragments of about 2000-3000 bp were subcloned into pGEM-3Zf (+) (Promega, USA) or pGEM7-7Zf (+) (Promega, USA) and sequenced by dideoxynucleotide chain determination.
실시예 2: 조절유전자의 동정과 분석Example 2 Identification and Analysis of Regulatory Genes
S. peucetius의 게놈 데이터베이스는 본 발명자들에 의해 처음으로 구축되었다 (Parajuli N. et al., Arch. Biochem. Biophys., 425:233, 2004). Glimmer 2.0을 사용하여 얻어진 조절 유전자들의 ORF(open reading frames)는 BLAST를 통해 해석하였다 (Delcher A.L., Nucleic Acids Res., 27:4636, 1999). Global 조절유전자는 두 ATP 결합도메인의 서열인 GIGGVGKT(A타입) 및 LLDNA(B타입)와 촉매 도메인인 AEPET을 사용하여 1차 스크리닝하였다. The genome database of S. peucetius was first built by the inventors (Parajuli N. et al., Arch. Biochem. Biophys ., 425: 233, 2004). Open reading frames (ORFs) of regulatory genes obtained using Glimmer 2.0 were interpreted via BLAST (Delcher AL, Nucleic Acids Res., 27: 4636, 1999). Global regulators were first screened using the sequences of two ATP binding domains, GIGGVGKT (type A) and LLDNA (type B), and AEPET, the catalytic domain.
상기 모티브 또는 도메인을 가지는 유전자들은 GenBank의 BLAST에서 검색하 고, GeneDoc 프로그램(Nicholas K.B. and Nicholas H.B., GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments, Editor and Shading Utility Version 2.6.002, 1997)을 이용하여 각 유전자의 아미노산 서열을 예측하였다. 상기 예측된 S. peucetius의 글로벌 조절유전자의 아미노산 서열은 Clust X(Thompson J.D. et al., Nucleic Acids Res., 24:4876, 1997)를 사용하여 S. coelicolor A3(2)의 afsR 및 Streptomyces griseus의 afsR-g 의 아미노산 서열과 함께 정열하여 비교하였다 (도 1).Genes having the motifs or domains were searched in GenBank's BLAST, and using a GeneDoc program (Nicholas KB and Nicholas HB, GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments, Editor and Shading Utility Version 2.6.002, 1997). The amino acid sequence of each gene was predicted. The amino acid sequence of the predicted global regulator of S. peucetius was determined by Clust X (Thompson JD et al., Nucleic Acids Res ., 24: 4876, 1997) using afsR and Streptomyces griseus of S. coelicolor A3 (2). The amino acid sequences of afsR-g were aligned and compared (FIG. 1).
S. peucetius의 게놈분석을 통해 afsR과 상동성이 있는 다섯 개의 지역을 찾아내었으며, NtrC (Salmonella typhimurium), NifA (Klebsiella pneumoniae), DnaA (Bacillus subtilis), FtsH (Pseudomonas multocida), AtpD와 MalK (E. coli) 및 RecA (Mycobacterium tuberculosis)와는 다르게, 983개의 아미노산을 코딩하는 afsR-p만이 보존된 두개의 ATP 결합부위(A-Type: 321GIGGVGKT328 및 B-Type: 399MVLLD403)와 한 개의 촉매도메인(399 MVLLD403)을 가지고 있었다. Genome analysis of S. peucetius revealed five regions homologous to afsR . I found it, NtrC (Salmonella typhimurium), NifA ( Klebsiella pneumoniae), DnaA (Bacillus subtilis), FtsH (Pseudomonas multocida), AtpD the MalK (E. coli) and RecA (Mycobacterium tuberculosis) than afsR-p differently, coding for 983 amino acids Only two conserved ATP binding sites (A-Type: 321 GIGGVGKT 328 and B-Type: 399 MVLLD 403 ) and one catalytic domain ( 399 MVLLD 403 ) were present.
AfsR-p는 S. coelicolor A3(2)의 AfsR 단백질(993 아미노산)과 60%의 상동성을 나타내고, S. griseus의 AfsR-g(979 아미노산)와 61%의 상동성을 나타내었다(도 1). 또한, ATG 개시코돈과 TGA 종결코돈을 가지고, 시작코돈의 앞에 분명한 리보솜 결합부위(ribosome-binding site)를 가지고 있었다. 더욱이, AfsR-p의 NH2기 말단은 dnrI와 상동성을 나타내었다. 이 결과는 AfsR-p가 DNA 결합단백질이라는 것을 나타낸다. AfsR-p showed 60% homology with S. coelicolor A3 (2) AfsR protein (993 amino acids) and 61% homology with S. griseus AfsR-g (979 amino acids) (FIG. 1). ). In addition, it had an ATG start codon and a TGA stop codon, and had a clear ribosome-binding site in front of the start codon. Moreover, the NH 2 group terminal of AfsR-p showed homology with dnrI. This result indicates that AfsR-p is a DNA binding protein.
S. coelicolor A3(2)의 afsR은 afsK 및 다른 조절유전자들과 클러스터를 이루고 있다. 그러나 S. peucetius에서 afsR-p는 hypothetical 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 위치하고 있었다. The afsR of S. coelicolor A3 (2) clusters with afsK and other regulatory genes. But in S. peucetius , afsR-p was located with the gene encoding the hypothetical protein.
실시예 3: Example 3: S. peucetiusS. peucetius 로부터 from afsRafsR 의 클로닝 및 발현 Cloning and Expression of
EcoRI과 HindⅢ 사이트를 가진 서열번호 3과 4의 프라이머를 사용하여, S. peucetius의 게놈에서 afsR-p 유전자를 증폭시켰다. 이때, PCR 조건은 94℃에서 변성, 65℃에서 어닐링, 74℃에서 신장시켰으며, 2.5U의 Taq-DNA 폴리머레이즈, 10% 디메틸설폭사이드, 2.5pmol의 프라이머, 0.2mM dNTP 및 0.1㎍의 게놈 DNA를 적정버퍼에 녹여 50㎕로 맞추어 사용하였다. The primers of SEQ ID NOs: 3 and 4 with Eco RI and Hin dIII sites were used to amplify the afsR-p gene in the genome of S. peucetius . At this time, PCR conditions were denatured at 94 ℃, annealing at 65 ℃, elongated at 74 ℃, 2.5U Taq-DNA polymerase, 10% dimethylsulfoxide, 2.5pmol primer, 0.2mM dNTP and 0.1μg genome DNA was dissolved in a titration buffer and used at 50 μl.
서열번호 3: 5'-TCCGGAATTCCCGGCAGGGGGC-3'SEQ ID NO: 5'-TCCGGAATTCCCGGCAGGGGGC-3 '
서열번호 4: 5'-CGAAGCTTCGGACCGAGCACGA-3'SEQ ID NO: 5'-CGAAGCTTCGGACCGAGCACGA-3 '
상기 증폭된 afsR-p는 EcoRI 및 HindⅢ 부위를 사용하여 pIBR25에 클로닝하여, pGIBR을 제작하였다. 최종적으로 S. lividans TK24의 protoplast에 pGIBR 및 pIBR25(Sthapit B. et al., FEBS Lett., 566:201, 2004)를 각각 형질전환시켜 S. lividans/GIBR 및 S. lividans/IBR을 수득하였다. The amplified afsR-p was cloned into pIBR25 using Eco RI and Hin dIII sites to prepare pGIBR. Finally, the protoplasts of S. lividans TK24 were transformed with pGIBR and pIBR25 (Sthapit B. et al., FEBS Lett ., 566: 201, 2004) to obtain S. lividans / GIBR and S. lividans / IBR, respectively.
실시예 4: 다른 Example 4: other Streptomyces peucetiusStreptomyces peucetius 로부터 from afsRafsR 의 보존부위 클로닝Cloning of the Conservation Site
도 1에서 나타낸 것과 같은, afsR-p, afsR-g 및 afsR의 보존된 잔기를 기초로 하여 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, 이를 사용하여 Streptomyces achromogens var rubradiris NRRL 3061(rubradirin 생산균주)과 Streptomyces clavuligerous NRRL 3585(clavulanic acid 생산균주)의 게놈DNA로부터 상동성 있는 부분을 증폭시켰다. 증폭조건은 실시예 3과 동일하게 하였다. Oligonucleotides of SEQ ID NOs: 5 and 6 were synthesized based on the conserved residues of afsR-p , afsR-g and afsR as shown in FIG. 1, and were used to prepare Streptomyces achromogens var rubradiris NRRL 3061 And homologous portions from the genomic DNA of Streptomyces clavuligerous NRRL 3585 (clavulanic acid producing strain). Amplification conditions were the same as in Example 3.
서열번호 5: 5'-GCSGGSATCGGSGGSGTSGGSAAGACSA-3'SEQ ID NO: 5'-GCSGGSATCGGSGGSGTSGGSAAGACSA-3 '
서열번호 6: 5'-SGCSAGSGCSGASACSGCCATSAC-3'SEQ ID NO: 5'-SGCSAGSGCSGASACSGCCATSAC-3 '
여기서, S는 G 또는 C를 나타낸다. Here, S represents G or C.
증폭산물은 pGEMT-easy vector(Promega, USA)에 클로닝하였다. S. achromogens에서 클로닝된 AfsR-a(171개 아미노산)는 S. coelicolor A3(2)의 AfsR과 66% 상동성을 나타내었고, S. clavuligerous에서 클로닝된 AfsR-c(178개 아미노산)는 S. griseus의 AfsR-g와 86%의 상동성을 나타내었다. 이 결과로부터 스트렙토마이세스 속 afsR 유전자에 특이적인 염기서열이 성공적으로 증폭된 것을 알 수 있었고, 결국 다른 액티노마이세테스로부터 afsR 유전자를 분리하는데, 상기 서열번호 5와 6의 프라이머가 유용하다는 것을 확인할 수 있었다. Amplified products were cloned into pGEMT-easy vector (Promega, USA). Cloned from S. achromogens AfsR-a (171 amino acids) are S. coelicolor were shown to AfsR with 66% homology of A3 (2), the AfsR-c (178 amino acids) cloned from S. clavuligerous is S. 86% homology with AfsR-g of griseus . These results indicate that the nucleotide sequence specific for the afsR gene in Streptomyces was successfully amplified. Finally, the primers of SEQ ID NOS: 5 and 6 are useful for isolating the afsR gene from other actinomycetes. I could confirm it.
한편, 본 발명에서 규명된 afsR-p, afsR-a 및 afsR-c의 염기서열은 각각 EMBL Accession No. AJ786384, AJ786385 및 AJ786386으로 등록하였다.On the other hand, the base sequence of afsR-p , afsR-a and afsR-c identified in the present invention are EMBL Accession No. It was registered as AJ786384, AJ786385 and AJ786386.
실시예5: Example 5: S. lividansS. lividans TK24의 감마-액티노로딘 Gamma-actinorodin of TK24 생산에 미치는 Production afsR-pafsR-p 의 효과Effect
실시예 3에서 수득한 S. lividans/GIBR 및 S. lividans/IBR을 50㎍/㎖의 thiostrepton이 포함된 TSB배지 50㎖에서 이틀 동안 250rpm, 온도 28℃의 조건으로 각각 배양하였다. 1㎖의 배양액은 100㎍/㎖의 thiostrepton이 포함된 100㎖ R2YE배 지(US 5,843,735)로 옮겨, 28℃, 250rpm에서 배양하였다. 이틀에 한번씩 5㎖의 배양액을 채취하여, 세균은 원심분리에 의해 제거하고, 상층액은 1N HCl을 사용하여 pH2가 되도록 한 다음, 1/2부피의 메탄올:CHCI3 (1:1) 용액을 사용하여 추출하였다. 클로로포름 분획을 수득하여 UV-스펙트로포토메타(Shimadzu, USA)를 사용하여 A542(ε542=18600 for pure compound)에서 측정하였다. S. lividans / GIBR and S. lividans / IBR obtained in Example 3 were incubated in 50 ml of TSB medium containing 50 µg / ml thiostrepton for 2 days at 250 rpm and a temperature of 28 ° C., respectively. 1 ml of the culture was transferred to 100 ml R2YE medium (US 5,843,735) containing 100 µg / ml thiostrepton and incubated at 28 ° C and 250 rpm. Take 5 ml of the culture solution every other day, remove the bacteria by centrifugation, supernatant to pH2 with 1N HCl, and then add 1/2 volume of methanol: CHCI 3 (1: 1) solution. Extracted using. Chloroform fractions were obtained and measured on A 542 (ε 542 = 18600 for pure compound) using UV-Spectrophotometer (Shimadzu, USA).
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, S. lividans/GIBR에서 감마-액티노로딘의 생성이 대조군(S. lividans/IBR)에 비해 약 3배 증가하였다 (도 2). 이 결과로부터 본 발명 따른 afsR-p 유전자는 S. lividans에서 감마-액티노로딘의 생성을 증진시키는 전사활성체의 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. The production of gamma-actinolodine in S. lividans / GIBR was increased about three-fold compared to the control ( S. lividans / IBR) (FIG. 2). From this result, it was confirmed that the afsR-p gene according to the present invention plays a role of a transcriptional activator to enhance the production of gamma- actinolodine in S. lividans .
이 결과로부터 본 발명에 따른 afsR-p 유전자는 Streptomyces peucetius에서 독소루비신의 생성을 조절하는 전사활성체의 기능을 가진다는 것을 간접적으로 확인할 수 있었다.From this result, it was confirmed indirectly that the afsR-p gene according to the present invention has a function of a transcriptional activator that regulates the production of doxorubicin in Streptomyces peucetius .
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. Having described the specific part of the present invention in detail, it is obvious to those skilled in the art that such a specific description is only a preferred embodiment, thereby not limiting the scope of the present invention. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 스트렙토마이세스 속 미생물에서 항생물질의 생성을 조절하는 전사활성체의 기능을 가지는 afsR-p 유전자를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 afsR-p 유전자는 스트렙토마이세스 속 미생물에서 항생물질의 생성을 증진시키는데 유용하다. As described in detail above, the present invention has an effect of providing an afsR-p gene having a function of a transcriptional activator that regulates the production of antibiotics in Streptomyces sp. The afsR-p gene according to the present invention is useful for enhancing the production of antibiotics in Streptomyces spp .
서열목록 전자파일 첨부 Attach sequence list electronic file
Claims (9)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020040066555A KR100564156B1 (en) | 2004-08-23 | 2004-08-23 | Transcriptional Activator Derived from Streptomyces peucetius and The Gene Thereof |
| PCT/KR2005/001800 WO2006022476A1 (en) | 2004-08-23 | 2005-06-14 | Transcriptional activator derived from streptomyces peucetius and the gene thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020040066555A KR100564156B1 (en) | 2004-08-23 | 2004-08-23 | Transcriptional Activator Derived from Streptomyces peucetius and The Gene Thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20060018190A KR20060018190A (en) | 2006-02-28 |
| KR100564156B1 true KR100564156B1 (en) | 2006-03-24 |
Family
ID=35967658
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020040066555A KR100564156B1 (en) | 2004-08-23 | 2004-08-23 | Transcriptional Activator Derived from Streptomyces peucetius and The Gene Thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100564156B1 (en) |
| WO (1) | WO2006022476A1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102408301B1 (en) * | 2020-03-16 | 2022-06-10 | 강원대학교산학협력단 | Novel Strain of Streptomyces sp. SBC-4 Having Anti-bacterial Activity, and Uses thereof |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6197591B1 (en) * | 1998-09-14 | 2001-03-06 | Pfizer Inc. | Streptomyces avermitilis regulatory genes for increased avermectin production |
-
2004
- 2004-08-23 KR KR1020040066555A patent/KR100564156B1/en not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-06-14 WO PCT/KR2005/001800 patent/WO2006022476A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 논 문 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2006022476A1 (en) | 2006-03-02 |
| KR20060018190A (en) | 2006-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2504584C2 (en) | METHOD FOR OBTAINING PYRROLOQUINOLINE QUINONE (PQQ) USING BACTERIUM OF Methylobacterium OR Hyphomicrobium TYPE | |
| Yao et al. | GlnR-mediated regulation of nitrogen metabolism in the actinomycete Saccharopolyspora erythraea | |
| Crombie et al. | Regulation of plasmid‐encoded isoprene metabolism in R hodococcus, a representative of an important link in the global isoprene cycle | |
| EP2186880A1 (en) | Improved production of riboflavin | |
| Flinspach et al. | Heterologous expression of the biosynthetic gene clusters of coumermycin A1, clorobiocin and caprazamycins in genetically modified Streptomyces coelicolor strains | |
| Zhu et al. | Metabolic and genetic factors affecting the productivity of pyrimidine nucleoside in Bacillus subtilis | |
| Parajuli et al. | Identification and characterization of the afsR homologue regulatory gene from Streptomyces peucetius ATCC 27952 | |
| Lesnyak et al. | Identification of Escherichia coli m2G methyltransferases: I. the ycbY gene encodes a methyltransferase specific for G2445 of the 23 S rRNA | |
| Kim et al. | Functional expression and characterization of the two cyclic amidohydrolase enzymes, allantoinase and a novel phenylhydantoinase, from Escherichia coli | |
| Adalsteinsson et al. | Efficient genome editing of an extreme thermophile, Thermus thermophilus, using a thermostable Cas9 variant | |
| Rachid et al. | Deciphering regulatory mechanisms for secondary metabolite production in the myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56 | |
| Rodríguez et al. | Identification of transcriptional activators for thienamycin and cephamycin C biosynthetic genes within the thienamycin gene cluster from Streptomyces cattleya | |
| WO2015000327A1 (en) | Biosynthesis gene cluster of streptomyces xiamenensis, purpose, and bacterial strain | |
| CN110777155B (en) | Minimal mycin biosynthesis gene cluster, recombinant bacterium and application thereof | |
| US20180319851A1 (en) | Wap genes and proteins that improve bacillus competitiveness | |
| Zhu et al. | Identification and characterization of ectoine biosynthesis genes and heterologous expression of the ectABC gene cluster from Halomonas sp. QHL1, a moderately halophilic bacterium isolated from Qinghai Lake | |
| Wolf et al. | The MalR type regulator AcrC is a transcriptional repressor of acarbose biosynthetic genes in Actinoplanes sp. SE50/110 | |
| Clifton et al. | Evolutionary repair reveals an unexpected role of the tRNA modification m1G37 in aminoacylation | |
| Fu et al. | Biosynthesis of 3-hydroxy-5-methyl-O-methyltyrosine in the saframycin/safracin biosynthetic pathway | |
| WO2011160573A1 (en) | Method for producing rifamycin sv with high activity and high purity | |
| KR100564156B1 (en) | Transcriptional Activator Derived from Streptomyces peucetius and The Gene Thereof | |
| MX2012013099A (en) | Spnk strains. | |
| Xie et al. | Cyclohexadienyl dehydrogenase from Pseudomonas stutzeri exemplifies a widespread type of tyrosine-pathway dehydrogenase in the TyrA protein family | |
| US7989184B2 (en) | Endoribonuclease | |
| JPWO2019216248A1 (en) | Macrocyclic enzymes of peptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20110321 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |