KR100563750B1 - 유전자전이된 응고 인자 (ｘｉｉｉ) 결손 동물, 및 이의 제조 및 이용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 적어도 부분적으로 결손된 응고 인자 (XIII) 유전자에 대해 이형접합성(heterozygous) 또는 동형접합성(homozygous)인 유전자전이된(transgenic) 비-사람 포유동물을 제공한다.
유전자전이, 응고 인자 (XIII), 이형접합성, 동형접합성, 인자 (XIIIa)
Description
도 1은 엑손 마우스 인자 (XIII)의 성상을 확인하는 것이다.
도 2는 마우스 및 랫트 인자 (XIII)의 엑손 7의 서열 배열을 나타낸 것이다.
도 3은 엑손 7 결실 벡터의 작제를 나타낸다.
도 4는 상동성 재조합 클론의 확인을 나타낸다.
본 발명은 적어도 부분적으로 결손된 응고 인자 (XIII) 유전자에 대해 이형접합성(heterozygous) 또는 동형접합성(homozygous)인 유전자전이된(transgenic) 비-사람 포유동물을 제공한다.
인자 (XIII)은 피브린을 가교결합시켜 응혈 플러그의 안정성을 촉진하는 응고 캐스케이드의 효소이다.
응고는 제한된 단백질분해에 의해 후속적으로 활성화되는 단백질분해 효소의 캐스케이드 시스템이다. 상처가 나면 응고의 내인성 및 외인성 경로가 활성화된다. 내인성 활성화는 단백질분해 효소(프로테아제) 및 효소 보조인자(인자 VIII)인 응고 인자 (XII), (XI) 및 (IX)를 포함한다. 외인성 시스템은 조직 인자 및 인자 (VII)을 포함한다. 이들 두가지의 활성화 경로는 불활성 프로트롬빈 (인자 II)를 효소적 활성 트롬빈(IIa, 주: 활성화된 인자는 로마 숫자 뒤에 "a"로 표시하고, 로마 숫자는 단독으로 불활성 효소를 표시한다)으로 전환시키는 프로테아제 인자 Xa 및 이의 보조인자(인자 Va)를 함유하는 공통된 경로를 발생시킨다. 트롬빈은 응고 시스템의 중심 프로테아제인 것으로 간주된다. 이는 상처 봉합을 위한 기질인 피브린을 생성하는 피브리노겐(인자 I)을 절단한다. 혈소판과 함께 피브린은 응혈 플러그를 형성한다. 더욱이, 트롬빈은 제한된 단백질분해에 의해 응혈 인자 (XIII)을 활성화시킨다. 응고 캐스케이드의 다른 프로테아제와 대조적으로, 인자 (XIII)은 트랜스글루타미나제이다. 인자 (XIII)은 리신 및 글루타민 잔기를 통해 피브린 분자를 가교결합시켜, 가용성 피브린이 불용성 피브린이 되게 한다.
혈장에서 발견된 바와 같은 FXIII은 2개의 상이한 아단위, 즉 분자량이 각각 약 83,000 및 76,500Da인 a-쇄와 b-쇄로 구성되어 있다[참조: McDonagh J., in: Hemostasis and Thrombosis, Colman RW, Hirsh J., March V.J. and Salzmann E.W.(eds), Lippincott, Philadelphia, 1994].
혈장내의 4량체성 복합체는 Mr 약 320,000Da의 조성 a2b2를 갖는다. 혈장내의 4량체의 농도는 약 0.07μmol/l이다. 활성화 단계 중에, 트롬빈은 아미노 말단으로부터 Mr 4500의 활성화 펩타이드를 방출하는 a-쇄의 위치 37 및 38에서 Arg-Gly 결합을 절단한다. b-쇄 이량체는 복합체로부터 분리되어 활성 a-쇄 이량체(a2
*, FXIIIa)를 방출한다. FXIIIa는 글루타민-리신 트랜스페라제이다. 촉매되는 반응은 피브린 분자 사이의 글루타민의 γ-카보닐 그룹과 리신의 ε-아미노 그룹간의 이소펩타이드 결합의 형성이며, 이는 피브린 네트워크를 안정화시킨다. 피브린 분자당 4 내지 6개의 리신-글루타밀 가교결합이 형성된다.
환자내의 인자 (XIII)의 결핍은 출혈 소질 및 상처 치유의 손상을 유도할 수 있다[참조: Duckert F., Ann NY Acad Sci, vol. 202, 190-199, 1972]. 선천성 FXIII 결핍증을 앓는 환자는 외상후에 연질 조직 및 관절 출혈로 고통받는다. 가장 심각한 형태의 출혈은 중추신경계에서 일어나며, FXIII 결핍 환자는 두개내 출혈 빈도가 높다. FXIII 결핍증을 앓는 여성은 임신중에 종종 유산이 된다. FXIII은 섬유아세포의 증식을 자극하는데, 이는 상처 치유에 필수적이다. 따라서, FXIII 결핍증을 앓는 환자는 상처 치유가 비정상적인 것으로 보고되었다.
본 발명에는 상처 치유 과정의 장애 및 출혈 질환을 갖는 유전자전이된 응고 인자 (XIII) 결손 마우스의 생산이 기술된다. 또한, 상처 치유 촉진 약물 또는 응고를 정상화하는 약물을 개발하기 위한 이의 용도가 기재되어 있다.
적어도 부분적으로 결손된 응고 인자 (XIII) 유전자를 포함하는 유전자전이된 동물은 공지된 유전자 조작 방법에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 인자 (XIII) 유전자는 삽입, 결실, 치환, 역위 또는 기타 적합한 유전자 조작에 의해 불활성화된다. 본 발명을 수행하는데 있어서, 결손 응고 인자 (XIII) 유전자를 갖는 유전자전이된 동물은 엑손 7 서열을 암호화하는 활성 부위의 결실과 함께 인자 (XIIIa) 아단위에 대한 유전자의 표적화된 파괴에 의해 제조되었다.
따라서, 본 발명의 또다른 양태에 있어서, 1) 적어도 부분적으로 결손된 응고 인자 (XIII) 유전자를 암호화하는 DNA 작제물을 제조하는 단계;
2) 상기 DNA 작제물을 적합한 캐리어 세포내로 도입하는 단계;
3) DNA 작제물이 상동성 재조합에 의해 통합된 세포를 확인하는 단계;
4) 이들 표적화된 세포를 배아에 삽입하는 단계;
5) 배아를 모(侮) 동물내에 넣고, 충분한 기간 동안 배아를 발달시키는 단계;
6) 파괴된 인자 (XIIIa) 유전자에 대해 이형접합성인 자손을 유도하는 단계; 및
7) 이형접합성 자손을 이종교배하여 결손 인자 (XIIIa) 유전자에 대해 동형접합성인 동물을 수득하는 단계를 포함하여, 적어도 부분적으로 결손된 응고 인자 (XIII) 유전자를 갖는 유전자전이된 비-사람 포유동물을 생산하는 방법이 제공된다.
유전자전이된 마우스는 다음과 같이 제조한다.
유전자전이된 마우스의 제조
배아 간세포(ES)내의 상동성 재조합을 사용하여 인자 (XIII)가 결손된 마우스를 수득한다.
인자 (XIIIa) 아단위에 대한 마우스 게놈 서열은 프로브로서 랫트 cDNA 서열을 사용하여 계통(strain) 129 게놈 라이브러리로부터 분리한다. 엑손(엑손 7)을 암호화하는 활성 부위에 특이적인 프로브는 랫트 cDNA의 110bp 동족성 단편을 PCR 증폭시켜 제조한다. 이 프로브를 사용하여 14kb 람다 클론을 분리한다(도 1). 마우스 인자 (XIII) 엑손 7 서열의 존재는 랫트 엑손 7 서열과의 170/174 뉴클레오타이드 동일성을 나타내는 DNA 서열화에 의해 확인한다(도 2 및 서열 목록). 암호화된 아미노산 서열은 랫트 단백질 서열과 완전히 동일하다.
치환 형태의 표적화 벡터는 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 작제한다. 엑손 7을 포함하는 게놈성 DNA의 약 2.95kb 영역은 표적화 작제물에는 결실되어 있고, b-액틴 프로모터 유도된 네오마이신 포스포트랜스페라제 선별가능한 마커 카셋트에 의해 치환되어 있다(도 3). 표적화 작제물을 Sac 1로 분해하여 플라스미드 서열을 절단한 후, 전기천공에 의해 E14TG2a ES 세포내로 도입한다. 안정한 형질전환체는 G418에서의 선별에 의해 분리한다. 상동성 재조합체는 5' 및 3' 상동성 영역 외부의 프로브와 게놈 DNA의 서던 하이브리드화에 의해 확인한다(도 4). 2회의 독립적인 전기천공으로부터, 분석된 278개 클론중 4개의 클론은 상동성 치환 시험에 대한 예상된 하이브리드화 패턴을 제공하였다. 이들 클론중 2개(FXIII-110 및 FXIII-129)를 C57BL/6 배반포내로 미세주사하여 키메라를 생성한다. 키메라를 초기에 교잡 스위스 알비노 마우스와 검정교배한다. 클론 둘 다로부터 생식세포주 전달(germline transmission)이 수득되었다.
전달 키메라를 CBA/Ca 마우스와 교배하여 인자 (XIIIa) 아단위에 대한 돌연변이된 유전자를 보유하는 129Ola×CBA 자손을 유도한다. CBA/Ca에 대한 역교배 생성 후, 이형접합성 마우스를 형매교배한다. 동형접합성 동물은 서던 하이브리드화에 의해 확인한다. 동형접합체내의 엑손 7 서열의 부재는 엑손 7 특이적 프로브를 사용하여 확인한다.
상기 마우스는 트랜스글루타미나제 활성을 특징으로 하였다.
트랜스글루타미나제 활성에 의한 인자(XIII) 결손 마우스의 특성화
정맥 혈액을 채혈하고, 시트레이트 혈장은 트랜스글루타미나제 활성의 또다른 시험을 위해 원심분리하여 수득한다. 사용된 검정은 베링 디아그노스틱스(Behring Diagnostics)에 의해 제조된 시판용 Berichrom F XIII 키트이다. 참조 물질로서 사람 표준 혈장이 사용되었다. 표 1은 이형접합성 FXIII 결손 마우스 및 동형접합성 FXIII 결손 마우스와 동일한 유전자 배경을 갖지만 FXIII 유전자에 결손을 갖지 않는 정상 마우스의 혈장 트랜스글루타미나제 측정 결과를 나타낸다. Berichrom FXIII에 의해 측정된 정상 마우스의 트랜스글루타미나제 수준은 134%이었고, 이형접합성 결손 동물의 측정된 수준은 정상 마우스의 약 절반이었다(70%). 동형접합성 FXIII 결손 마우스의 트랜스글루타미나제 수준은 6% 미만이었다. 이것은 또다른 FXIII 검정, 즉 우레아 또는 TCA 용액에 불용성인 피브린에 대한 이의 가교결합 활성에 의해 FXIII 활성이 보다 구체적으로 측정되는 응혈 안정성 검정으로 확인할 수 있다. 상기 검정에 따르면, 어떠한 FXIII 활성도 검출 한계 2%에서 검출할 수 없었다.
| 표준 사람 혈장에 대한 트랜스글루타미나제 활성(%) | |
| 정상 마우스 | 134%±10.4% |
| 이형접합성 FXIII 결손 마우스 | 70%±13.1% |
| 동형접합성 FXIII 결손 마우스 | <6%* |
* 응혈 안정성 검정에 따른 ￡2%[참조: H.E. Karges: Blood Coagulation Factor XIII: 응혈 안정성 검정에 의해 측정함; Bergmeyer: Methods of Enzymatic Analyses, Third Ed. Vol. V; Verlag Chemie, Weinheim, 1984; pp 400-410].
손상된 상처 치유 및 출혈에 대한 모델로서 FXIII 결손 마우스의 용도
FXIII 결손 마우스를 헥소바비탈로 마취시키고, 등 부분의 털을 깍는다. 충분한 두께의 피부 중간을 척추를 따라 외과용 칼날로 절개한다. 이어서, 상처를 클립으로 봉합하고, 마우스를 마취에서 깨어나게 한다.
2일 후, 집게를 제거한다. 상처후 7일, 9일 및 16일째에, 치유된 상처의 인장 강도를 각각의 동물로부터 조사한다.
마우스를 희생시키고, 등쪽 피부를 벗겨낸다. 이어서, 이 피부를 절개상처가 중심에 위치하는 폭 1cm 및 길이 3cm의 피부편으로 정확히 절단한다. 이어서, 피부편을 인장측정기(Hounsfield Test Equipment, Salford, Redhill, England)에 도입하고, 절개상처의 인장 강도를 문헌[참조: Mustoe et. al., Science, vol. 237, 1333-1336, 1987]에 기술된 방법에 따라 측정한다. 절개상처를 일정한 속도로 잡아당겨 찢어서 절개상처에 교차하여 힘이 가해지도록 한다. 상기 힘을 그래프로 기록하고, 파괴 강도를 상처 분리전의 최대 스트레스 점으로서 정의한다.
파괴 강도는 뉴우톤(N)으로서 제공된다. 대조군으로서, 본 발명자들은 동일한 유전적 배경을 갖지만 삽입된 결손 유전자가 없는 마우스 계통(=정상 마우스)을 사용하였고, 동일한 실험 공정을 수행하였다.
표 2는 상처 치유의 연구 결과를 제시한다. 정상 대조군 마우스와 비교하여, FXIII 결손 마우스의 파괴 강도는 보다 낮았다. 이것은 손상된 상처 치유를 명백히 나타낸다.
| 정상 마우스(N) | FXIII 결손 마우스(N) | |
| 7일 | 1.03±0.09 | 0.69±0.11 |
| 9일 | 2.3±0.22 | 1.46±0.14 |
| 16일 | 5.2±0.03 | 3.3±0 |
출혈 시간의 시험은 응혈 작용의 척도로서 사용된다. 출혈 시간을 위해, 꼬리를 말단으로부터 약 2mm 거리에서 절단한다(꼬리 말단 출혈). 출혈이 중단될 때까지의 시간은 상처로부터의 혈액을 여과지로 빨아내어 모니터한다. 출혈 시간은 출혈 종결까지의 초로서 제공된다. 표 3은 출혈 시간의 결과를 제시한다. FXIII 결손 마우스는 정상 마우스와 비교하여 출혈 시간이 현저히 연장되었다.
| 출혈 시간(초) | |
| 정상 마우스 | 170±3 |
| FXIII 결손 마우스 | 274±50 |
본 발명에 따라 상처 치유 및 출혈을 시험하기 위한 유전자전이된 응고 인자 (XIII) 결손 동물이 제공된다.
<110> Centeon Pharma GmbH
<120> A transgenic coagulation factor XIII defective animal and its use
for testing wound healing and bleeding
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<151> 1998-09-23
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<160> 2
<170> KOPATIN 1.5
<210> 1
<211> 174
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
gtgaatgcca aggatgatga aggtgttctt gttggatcat gggacaatgt ctatgcctac 60
ggctcccttc catcagcctg gacaggaagt gttgacattc tactagaata cagaagctcg 120
gaaacaccag tccgatatgg ccagtgttgg gtttttgctg gtgtctttaa caca 174
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gaaacaccag tccgatatgg ccagtgctgg gtttttgctg gtgtctttaa caca 174
Claims (9)
- 게놈이 응고 인자 XIII 유전자의 엑손 7의 활성 부위가 결실된 결손 응고 인자 XIII 유전자를 포함하는(상기 결손 응고 인자 XIII 유전자는 트랜스글루타미나제 활성의 감소를 초래한다), 유전자 전이된 마우스.
- 삭제
- 삭제
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- 1) 엑손 7의 활성 부위가 결실된 응고 인자 XIII 유전자를 암호화하는 DNA 작제물을 제조하는 단계;2) 상기 DNA 작제물을 적합한 캐리어 세포들 내로 도입하는 단계;3) 상기 작제물이 상동성 재조합에 의해 통합된 세포들을 확인하는 단계;4) 이들 표적화된 세포들을 배아에 삽입하는 단계;5) 배아를 모(mother) 동물 내에 넣고, 충분한 기간 동안 배아를 발달시키는 단계;6) 파괴된 인자 XIIIa 유전자에 대해 이형접합성인 자손을 유도하는 단계; 및7) 이형접합성 자손을 이종교배(interbreeding)하여 결손 인자 XIIIa 유전자에 대해 동형접합성인 동물을 수득하는 단계를 포함하여, 제1항에 따른 유전자 전이된 마우스를 생산하는 방법.
- 제1항에 따른 유전자 전이된 마우스를 응고 인자 XIII 활성과 관련된 화합물과 접촉시키는 단계, 및 상처 치유 과정의 장애 및 출혈 질환에 미치는 상기 화합물의 효과를 모니터링하는 단계를 포함하는, 응고 인자 XIII 활성과 관련된 화합물의 약리학적 특성을 시험하는 방법.
- 삭제
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