KR100551711B1

KR100551711B1 - 메탄산화세균을 이용한 고수율 메탄올 제조방법

Info

Publication number: KR100551711B1
Application number: KR1020020073376A
Authority: KR
Inventors: 김시욱; 이상귀; 김희곤; 최학선; 류광환
Original assignee: 학교법인조선대학교
Priority date: 2002-11-25
Filing date: 2002-11-25
Publication date: 2006-02-13
Also published as: KR20040045562A

Abstract

본 발명은 메탄산화세균을 이용한 고수율 메탄올 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 메탄으로부터 메탄올을 생합성하는 방법에 있어서, 메탄산화세균, 염화나트륨 및 환원제를 이용하여 상기 메탄으로부터 메탄올을 고수율로 생합성하는 방법에 관한 것으로, 본 발명은 메탄올 생합성 조건을 최적화함으로서 종래 메탄올 생합성 방법에 비해 더욱 높은 수율로 메탄올을 얻을 수 있어 경제적으로 메탄올을 생산할 수 있으며, 또한 메탄의 재활용에 유용하게 사용될 수 있다.

메탄, 메탄올, 생합성, 메탄산화세균, 염화나트륨.

Description

메탄산화세균을 이용한 고수율 메탄올 제조방법{METHOD FOR HIGH YIELD PRODUCTION OF METHANOL USING METHANOTR0PHIC BACTERIA}

도 1은 본 발명에서 세균 배양 방식을 나타낸 그림이며,

(a) 단순확산방식,

(b) 강제순환확산방식.

도 2는 본 발명에서 배양 조건에 따른 M. 트리코스포리움 OB3b(M. trichosporium OB3b)의 성장곡선을 나타낸 그래프이며,

도 3은 본 발명에서 구리 농도에 따른 M. 트리코스리움의 성장곡선을 나타낸 그래프이며,

도 4는 본 발명에서 각 인자에 따른 메탄올의 축적 농도를 나타낸 그래프이며,

(a) 셀 농도(㎎/㎖),

(b) 반응온도(℃),

(c) 나트륨 포르메이트의 농도(μM).

도 5는 본 발명에서 NaCl의 농도에 따른 pMMO 및 MDH의 활성도를 나타낸 그래프이며,

도 6은 본 발명에서 NaCl의 농도에 따른 메탄올 축적 농도를 나타낸 그래프이며,

도 7은 본 발명에서 M. 트리코스리움 OB3b의 MDH 저해제로서 NaCl을 사용하여 생합성한 메탄올 농도를 나타낸 그래프이며,

도 8은 본 발명에서 M. 트리코스리움 OB3b의 MDH 저해제로서 NaCl 및 EDTA를 사용하여 생합성한 메탄올 농도를 나타낸 그래프이며,

도 9는 본 발명의 생합성에서 반응 플라스크내 액상과 기체상의 체적비를 나타낸 그래프이며,

도 10은 본 발명에서 반연속식 반응에 의한 메탄올 축적 농도를 나타낸 그래프이다.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명 *

A : 가스팩, B : 0.2 ㎛ 공기 필터,

C : 생반응기, D : 교반기,

E : 물 수집기, F : 가스 탱크,

G : 버블러(bubbler).

본 발명은 메탄산화세균을 이용한 고수율 메탄올 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 메탄으로부터 메탄올을 생합성하는 방법에 있어서, 메탄산화세균, 염화나트륨 및 환원제를 이용하여 상기 메탄으로부터 메탄올을 고수율로 생합성하는 방법에 관한 것이다.

메탄산화세균(Methanotrophic bacteria)은 메탄을 탄소원 및 에너지원으로 사용하여 성장하는 세균집단을 통칭하는 것으로, 메틸로모나스(Methylomonas), 메타노모나스(Methanomonas), 메틸로코쿠스(Methylococcus), 메틸로시누스(Methylosinus), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로미크로비움(Methylomicrobium) 및 메틸로시스티스(Methylocystis) 등이 있다. 상기 메탄산화세균은 메탄을 메탄올로 산화시키는 메탄 일원자산소화효소(methane monooxygenase, 이하 "MMO"라 칭함.) 및 메탄올을 포름알데히드로 산화시키는 메탄올 탈수소효소(methanol dehydrogenase, 이하 "MDH"라 칭함.) 등을 포함하고 있어 메탄가스를 산화시켜 이산화탄소로 전환시키는 역할을 한다. 구체적으로, 메탄산화세균은 하기 반응식 1에서 보는 바와 같이, 메탄을 메탄올로 산화시키고, 메탄올을 다시 포름알데히드로 산화시킨다. 그리고 포름알데히드를 포름산으로 산화시켜 최종적으로 유해성이 적은 이산화탄소로 전환한다. 또한 상기 메탄산화세균은 다탄소 결합을 갖는 유기화합물을 성장물질로는 이용하지 못하지만 메탄을 산화할 때 생성되는 효소인 MMO의 효소작용으로 많은 알칸족과 방향족 화합물도 산화시킬 수 있다.

한편, 현재 쓰레기 처리장 등에서 발생되는 메탄을 재활용하는데 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중 메탄산화세균을 이용하여 메탄을 메탄올로 전환시키는 연구가 진행되고 있다.

메탄으로부터 메탄올을 고효율로 생합성하기 위해서는 상기 반응식 1에서 보는 바와 같이, MMO의 활성을 증가시킴과 동시에 생합성된 메탄올이 포름알데히드로 산화되는 것을 억제하여야 한다. 즉 메탄올의 산화를 막기 위해서는 MDH의 활성을 저해시켜야 하는데, 이러한 MDH의 활성 저해제로는 디티오트레이톨(dithiothreitol), 시클로프로판(cyclopropane), 시클로프로판올(cyclopropanol), 페닐히드라진(phenylhydrazine), 금속 킬레이트제(metal chelating agent), 이오도아세테이트(iodoacetate), MgCl₂ 또는 고농도의 인산염 등을 사용한다.

메탄산화세균을 이용하여 메탄올을 생합성하는 종래의 연구에 의하면, 마사이류키 등에 의해 MDH 활성 저해제로 시클로프로판올을 이용한 메탄올 생합성 방법 이 논문에 개재되었다[Masayuki Takeguchi, Takako Furuto, Daisuke Sugimori, and Ichiro Okura, Applied Biochemistry and Biotechnology, 1997, 68, 143-152; Takako Furuto, Masayuko Takeguchi, Ichiro Okura, Journal of Molecular Catalysis A : Chemical. 1999, 144, 257-261]. 상기 논문에서는 상기 MDH 활성 저해제를 사용하여 100시간 동안 최대 6 mM의 메탄올을 생합성하였다.

또한, Perdeep K. Mehta 등에 의해 메탄올 생합성 방법이 논문에 개재되었다[Perdeep K. Mehta, Saroj Mishra, and Tarun K. Ghose, Biotechnology and Bioengineering, 1991, 37, 551-556]. 상기 논문은 고정화 균체와 MDH저해제로 EDTA를 이용한 연속적인 메탄올의 생합성에 관한 것으로, 70시간 동안 최대 5.43 mM의 메탄올을 생합성하였다.

이에 본 발명자들은 메탄올을 고효율로 생합성하기 위해 노력한 결과, 메탄산화세균, 염화나트륨 및 환원제를 이용하여 메탄으로부터 메탄올을 생합성하였으며, 상기 방법을 통해 메탄으로부터 메탄올을 고효율로 생합성함을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 메탄으로부터 메탄올을 생합성하는 방법에 있어서, 메탄산화세균, 염화나트륨 및 환원제를 이용하여 상기 메탄으로부터 메탄올을 고수율로 생합성하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 메탄산화세균, 염화나트륨, EDTA 및 환원제를 이용하여 상기 메탄으로부터 메탄올을 고수율로 생합성하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메탄으로부터 메탄올을 생합성하는 방법에 있어서, 메탄산화세균, 염화나트륨 및 환원제를 이용하여 상기 메탄으로부터 메탄올을 생합성하는 방법을 제공한다.

또한, 메탄산화세균, 염화나트륨, EDTA 및 환원제를 이용하여 상기 메탄으로부터 메탄올을 생합성하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

메탄산화세균은 메탄을 탄소원 및 에너지원으로 이용하여 성장하는 세균집단으로 메탄을 메탄올로 산화시키는 메탄 일원자산소화효소(methane monooxygenase, 이하 "MMO"라 칭함)와 메탄올을 포름알데히드로 산화시키는 메탄올 탈수소효소(methanol dehydrogenae, 이하 "MDH"라 칭함)를 가지고 있다.

본 발명에서 사용되는 메탄산화세균은 통상적으로 사용되는 모든 메탄산화세균을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메틸로시누스 트리코스포리움 OB3b(Methylosinus trichosporium OB3b)를 포함한 메탄산화세균을 사용한다. 이 때 세포 농도, 즉 건조균체량은 0.6∼2.18 mg 건초균체량/ml이며, 바람직하게는 0.6 mg 건초균체량/ml이다. 상기 범위를 벗어난 경우, 메탄올의 생성되는 양이 감소하게 된다.

본 발명에서 세균 배양은 통상적인 방법을 수행할 수 있다. 그 일예로, 세균 배양은 단순확산방식과 강제순환확산방식을 사용한다(도 1 참조). 상기 단순확산방식은 메탄과 공기의 혼합가스가 들어있는 가스백(gas bag)으로부터 배양 플라스크로 단순히 확신시킴으로써 메탄을 공급하는 방식이다(도 1a 참조). 또한 강제순환확산방식은 메탄혼합가스가 들어있는 밀폐용기내에 미리 에어펌프를 넣어두고 이 펌프를 이용하여 배양용기의 액체배지에 메탄혼합가스를 주입함으로써 배지내 메탄의 용해율을 증가하는 방식이다(도 1b 참조). 본 발명은 상기와 같은 방식들로 메탄을 강제 순환하여 액체 배지에 최대한 용해되도록 하였으며, 최적 성장온도를 30℃로 하였다. 최대 균체 성장을 위해 초기 배지내 구리농도를 5 ??M로 하였다.

하기 도 2에서 보는 바와 같이, 상기 두가지 방식으로 세균을 배양하면서 성장속도를 비교하였을 때 강제순환확산방식이 단순확산방식에 비해 균체의 성장속도가 빠름을 알 수 있다.

또한, 도 3에서 보는 바와 같이, M. 트리코스포리움 OB3b는 배지내 Cu 농도가 증가할수록 성장속도가 감소함을 알 수 있다. 상기 M. 트리코스포리움 OB3b내에 존재하는 메탄 일원자산소화효소(MMO)는 pMMO(particulate methane monooxygenase)와 sMMO(soluble monooxygenase)로 구분되는 이들이 발현되는 정도는 Cu 농도에 의해 결정된다. 즉, Cu 농도가 높으면, pMMO가 발현되며, Cu 농도가 낮으면 sMMO가 발현된다. 본 발명에서 Cu 농도가 1.25 μM 이상이면 pMMO의 발현이 강하게 나타남을 알 수 있다. Cu 농도가 증가함에 따라 pMMO의 발현이 증가함으로 Cu 농도가 50 μM일 때의 pMMO의 발현량이 최고이지만, 성장에는 저해를 받는다. 이에 본 발명에서는 바람직한 Cu 농도는 pMMO 존재와 균체의 성장을 고려하여 1.25∼40 μM이다.

메탄올의 생합성량을 최대로 하기 위해서 합성된 메탄올이 더 이상 산화되지 못하도록 MDH의 활성을 저해시켜야 한다. 이에, 본 발명은 MDH의 저해제로서 염화나트륨(sodium chloride)를 사용하거나, 염화나트륨과 EDTA의 혼합물을 사용한다. 상기 염화나트륨 단독 사용시, 염화나트륨의 농도는 100∼250 mM이며, 바람직하게는 250 mM이다. 또한, 염화나트륨과 EDTA의 혼합물 사용시, 염화나트륨:EDTA의 농도는 100∼250 mM:1∼10 mM이며, 바람직하게는 100 mM:1 mM이다.

하기 도 5는 NaCl의 농도 따른 pMMO 및 MDH의 활성도를 측정한 것으로, 도 5에서 보는 바와 같이, NaCl 농도에 따른 pMMO의 활성은 NaCl 농도가 증가할수록 감소하였으며, 구체적으로 NaCl 농도가 200 mM일 때 활성이 31 % 감소하였으며, NaCl 농도 증가에 따라 pMMO 활성도 심각하게 저해되었다. 또한, MDH의 활성도 NaCl 농도가 증가함에 따라 점점 감소한다. 구체적으로 NaCl 농도가 최대인 300 mM일 때 MDH 활성이 100 % 감소하였다. 상기에 서술한 바와 같이, NaCl 농도가 증가함에 따라 pMMO 및 MDH의 활성이 모두 감소하였으나, NaCl은 pMMO 활성 보다 MDH 활성을 더욱 감소시킨다. 구체적으로, NaCl의 농도가 200 mM일 때 pMMO 활성은 41 % 감소한 반면, MDH활성은 64 % 감소하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, NaCl 농도에 의한 메탄올 생성반응에서 NaCl이 첨가되지 않을 때에는 메탄올이 생성되지 않았으나, 반응액 내 NaCl의 농도가 증가할수록 메탄올 생성량이 증가하였다. NaCl 농도가 250 mM이었을 때 최대의 메탄올 생성을 보였으며, 250 mM 이상일 경우에는 메탄올 생성량이 감소함을 확인하였다.

또한, 본 발명에서는 NaCl 단독으로 처리하는 것보다 NaCl 과 EDTA를 같이 처리할 경우, MDH 활성 저해가 더욱 증가함을 알 수 있었다. 도 7에서 보는 바와 같이, NaCl과 EDTA를 혼합하여 처리한 경우, 더욱 많은 메탄올을 얻을 수 있었다.

또한, 본 발명에서 반응온도 및 첨가되는 환원제에 의해 메탄올의 양이 변화되어진다(도 4 참조). 먼저, 반응온도는 도 4b에서 보는 바와 같이, 20∼30℃가 바람직하며, 가장 바람직하게는 30℃이다. 도에서 보면, 25℃에서 가장 많은 양의 메탄올을 생산하는 것으로 나타나지만, 기타 다른 조건들을 고려하여 생합성하는 경우 30℃가 가장 바람직하다. 본 발명에서 환원제는 나트륨 포르메이트가 바람직하며, 그 농도는 10∼20 μM이다(도 4c 참조). 반응온도 및 환원제의 농도는 상기 범위를 벗어난 경우, 생성되는 메탄올의 양이 적어진다.

본 발명의 메탄올 생합성은 메탄올 생합성 반응에서 반응 플라스크내 액상과 기상의 체적 차이에 따라 생성되는 메탄올의 양도 상이하게 나타난다. 구체적으로, 도 9에서 보는 바와 같이, 액상과 기상의 체적비가 증가할수록 생합성되는 메 탄올의 양이 증가하며, 체적비 1:10에서 20 mM의 메탄올을 생합성하였다. 이 때 최대의 양을 생합성하였으며, 이 후 점점 감소하였다.

또한, 본 발명의 생합성 방법에 의해 생합성 반응시 반연속식 반응에 의해서도 생합성이 가능하다. 도 10에서 보는 바와 같이, 상기 반연속식 반응에 의해서 59 시간 동안 29.8 mM의 메탄올 생합성하였다. 그러나, 반연속식 반응에서 4회 반복한 반응에서는 생성되는 메탄올이 현저하게 감소되는 경향을 보이기 때문에 NaCl을 처리한 균체를 반연속식으로 사용할 수 있는 횟수는 3회가 바람직하다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 메탄올의 생합성

(1) 사용균주 및 배양조건

Methylosinus trichosporium OB3b를 본 실험에 사용하였다. 균체배양용 배지는 Higgins의 무기질산염 최소배지 (pH 7.0)를 변형하여 사용하였다[I. J. Higgins, J. R., Quayle Biochem. J., 1970, 118, 201∼208]. 배지내 구리(Cu) 농도는 각각 1, 5, 50 μM로 조절하였다. 배양에는 5 ℓ용량의 삼각플라스크를 사용하였으며, 배양액의 용량은 2 ℓ이었다. 배양시스템은 단순확산방식(도 1a 참조)과 강제순환확산방식(도 1b 참조)을 이용하였다. 메탄과 공기는 가스 발생기를 이 용하여 각 가스의 유량을 조절하고 메탄과 공기를 1 : 1의 부피비율로 0.45 ㎛의 여과막을 통과시켜 주입하였다. 균체 배양은 30℃에서 교반기를 사용하여 진탕배양하였다. 세균 성장은 분광광도계 (Shimadzu UV-2550)를 이용하여 660 nm 파장에서 흡광도의 변화로 측정하였으며, 대수성장기 말기단계에서 원심분리(10000 ×g, 4℃) 하여 균체를 모았다. 한편 균체의 현탁에는 12.9 mM 표준인산완충용액 (pH 7.0)을 사용하였다.

(2) 메탄올 생합성

세균을 이용한 메탄올 생합성은 23 ㎖ 바이알에 12.9 mM 포스페이트 완충용액(phosphate buffer, pH 7.0) 5 ㎖를 넣고 나트륨 포르메이트(sodium formate)와 NaCl를 첨가하여 반응을 수행하였다. 반응 초기 바이알의 메탄양은 gas-tight syringe를 이용하여 3 ㎖를 주입하였다. 합성된 메탄올양은 불꽃 이온검출기(FID)가 장착된 가스크로마토그래피에서 측정하였다. 사용한 컬럼은 stainless steel (3 mm ×4 m)에 충진제로 25 % Sorbitol Gasport B (60/80)를 사용하였다. 컬럼 온도는 140℃, 주입기의 온도는 210℃, 검출기 온도는 210℃이었다. 운반기체는 헬륨를 사용하였으며, 유출속도는 50 ㎖/min하여 메탄올 생합성량을 측정하였다.

<실험예 1> pMMO 효소 활성 측정

메탄산화세균의 pMMO활성은 프로필렌을 이용하여 프로필렌 옥사이드(propylene oxide)의 생성속도로 측정하였다.

프로필렌 옥사이드는 더 이상 산화되지 않으면서 극성을 띠고 있기 때문에 대부분 반응액 내에 존재하고, 생성량은 불꽃 이온검출기 (FID)가 장착된 가스크로마토그래피로 분석하였다. 사용한 컬럼은 stainless steel (3 mm ×4 m)에 충진제로 25% Sorbitol Gasport B(60/80)를 사용하였다. 컬럼의 온도는 50℃, 주입기 온도 100℃, 검출기 온도 100℃이었다. 운반기체는 헬륨를 사용하였으며, 유출속도는 30 ㎖/min의 조건이었다. 전세포의 pMMO 활성은 시간에 따라 프로필렌 옥사이드 양이 증가하는 속도로 결정하였다. 결과는 도 5에 나타내었다.

pMMO활성은 whole-cell상태에서 프로필렌으로부터 생성된 프로필렌 옥사이드를 기준으로 활성을 측정한 것으로, 도 5에서 보는 바와 같이, NaCl 농도에 따른 pMMO의 활성은 NaCl농도가 증가할수록 감소함을 알 수 있다. 구체적으로 NaCl농도가 200 mM일 때 pMMO활성이 31% 감소하였고, NaCl 농도가 증가함에 따라 활성도 심각하게 저해되었다.

<실험예 2> MDH 효소활성 측정

MDH활성을 측정할 때에는 먼저 균체를 MDH 저해제와 반응시킨 후에 반응액 내의 균체를 모아서 파쇄하고 원심분리(16000 ×g, 4℃)한 후에 그 상등액을 cell free extract로 사용하였다. 활성측정방법으로는 시토크롬 c(cytochrome c) /DCPIP-linked assay system으로 측정하였으며, 첫 번째 전자 수용체로 시트크롬 c 를 이용하고 마지막 전자 수용체로 DCPIP를 이용하였다. 반응액은 100 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0)에 각각 메탄올 (13.4 mM), DCPIP (30 μM), 시토크롬 c (25 μM)을 첨가하여 제조하였다. 이 반응액에 효소액을 넣은 후 분광광도계를 이용하여 600 nm에서의 흡광도 변화로 효소활성을 측정하였다. 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이, NaCl농도가 증가함에 따라 MDH활성은 점점 감소하였다. 구체적으로, NaCl농도가 최대인 300 mM일 때에 MDH활성이 100% 감소하였다.

또한, 도 5에서 보는 바와 같이, NaCl 농도가 200 mM에서 M. trichosporium OB3b의 MMO활성은 69%, MDH활성은 46%만이 남아 있었다. 이러한 결과로부터 NaCl이 pMMO보다는 MDH활성에 더욱 강하게 영향을 미침을 확인할 수 있다.

<실험예 3> NaCl 농도에 따른 메탄올 생성 양의 측정

NaCl 농도에 따른 메탄올 생성 양을 측정하기 위해, 상기 실시예와 동일한 방법으로 메탄올 생합성을 수행하였다. 이때, 첨가되는 NaCl의 농도를 0∼400 mM로 첨가하여 합성되는 메탄올의 양을 측정하였다.

합성된 메탄올양은 불꽃 이온검출기(FID)가 장착된 가스크로마토그래피에서 측정하였다. 사용한 컬럼은 stainless steel (3 mm ×4 m)에 충진제로 25 % Sorbitol Gasport B (60/80)를 사용하였다. 컬럼 온도는 140℃, 주입기의 온도는 210℃, 검출기 온도는 210℃이었다. 운반기체는 헬륨를 사용하였으며, 유출속도는 50 ㎖/min하여 메탄올 생합성량을 측정하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보는 바와 같이, NaCl 농도에 의한 메탄올 생성반응에서 NaCl이 첨가되지 않을 때에는 메탄올이 생성되지 않았으나, 반응액 내 NaCl의 농도가 증가할수록 메탄올의 생성량이 증가하였고, NaCl농도가 250 mM 이었을 때 최대의 메탄올 생성을 보였으며, 250 mM 이상일 경우에는 메탄올 생성량이 감소하였다. 이상과 같이, NaCl 최적 농도는 250 mM이였으며, 이때 생성된 메탄올의 양은 7.7 mM이었다.

<실험예 4> NaCl 및 EDTA의 첨가에 의한 메탄올 생합성 양 측정

종래 기술에 의해 EDTA와 시클로프로판이 MDH 저해제로 효과가 있음이 알려져 있다. 이에, MDH 저해제로 NaCl 단독으로 처리하는 것보다 NaCl 100 mM과 EDTA 1 mM을 같이 처리하였으며, 그 외 방법은 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에서 보는 바와 같이, MDH 저해제로 100 mM NaCl과 1 mM EDTA를 함께 반응액에 처리하여 실험을 수행한 결과, 반응 40 시간 후에 최대 14 mM의 메탄올을 생합성할 수 있었다.

<실험예 5> 반응플라스크내 액상 및 기상의 체적차이에 의한 메탄올의 양 측정

메탄올 생합성 반응에서 반응 플라스크내 액상과 기상의 체적 차이에 따라 생성되는 메탄올의 양을 비교하기 위해 본 실험을 수행하였다.

반응 플라스크내 액상과 기상의 비율 2.1, 2.7, 5, 10, 20으로 한 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 메탄올 생합성을 수행하였다. 단, 액상과 기상의 비율 큰 경우 반응액의 양이 적기 때문에 액상과 기상의 비율을 1:5로 하여 실험을 수행하였다. 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에서 보는 바와 같이, 액상과 기상의 비율이 증가할수록 메탄올의 양이 증가하였으며, 그 비율이 10일 때 20 mM의 메탄올을 생합성하여 최고점을 이루었다. 그 이후 비율이 증가할수록 메탄올의 양이 감소하였다.

<실험예 6> 반연속식 반응에 의한 메탄올의 양 측정

상기 실시예 1의 회분식에 의한 메탄올 생합성과는 달리, 반연속식 반응에 의해 메탄올 생합성을 수행하였다.

반연속식 반응은 처음 반응 후 메탄올이 포함되어 있는 반응액을 원심분리를 통하여 균체와 분리한 다음 이 균체를 새로운 12.9 mM 인산완충용액 100 ㎖에 다시 혼탁하였다. 여기에 20 mM 나트륨 포르메이트를 추가적으로 공급하여 메탄올이 계속 합성되도록 하였다. 이상의 과정들을 여러차례 반복하여 메탄올 생합성 실험을 수행하였다. 결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에서 보는 바와 같이, 반연속식 반응에서 4회 반복한 반응에서는 생성 되는 메탄올이 현저하게 감소되는 경향을 보이기 때문에 NaCl을 처리한 균체를 연속적으로 사용할 수 있는 횟수는 3회가 적당함을 알 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 메탄산화세균, 염화나트륨 및 환원제를 이용하여 상기 메탄으로부터 메탄올을 합성하는 방법은 염화나트륨을 포함하며, 또한 세포 농도, 염화나트륨의 농도, 환원제의 농도 및 반응온도를 최적화하므로서, 종래 메탄올 생합성 방법에 비해 빠른 시간내에 더욱 많은 메탄올을 얻을 수 있어 메탄의 재활용에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

메탄으로부터 메탄올을 생합성하는 방법에 있어서, 메탄산화세균, 염화나트륨 및 환원제를 이용하여 상기 메탄으로부터 메탄올을 생합성하는 방법.
메탄으로부터 메탄올을 생합성하는 방법에 있어서, 메탄산화세균, 염화나트륨, EDTA 및 환원제를 이용하여 상기 메탄으로부터 메탄올을 생합성하는 방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 메탄산화세균이 M. 트리코스포리움 OB3b(M. trichosporium OB3b)를 포함한 메탄산화세균인 것을 특징으로 하는 메탄올 생합성 방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 메탄산화세균의 농도가 0.6∼2.18 mg 건조균체량/ml인 것을 특징으로 하는 메탄올 생합성 방법.
제 1항에 있어서, 상기 염화나트륨의 농도가 100∼250 mM인 것을 특징으로 하는 메탄올 생합성 방법.
제 2항에 있어서, 상기 염화나트륨과 EDTA의 농도가 100∼250 mM:1∼5 mM인 것을 특징으로 하는 메탄올 생합성 방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 환원제가 나트륨 포르메이트인 것을 특징으로 하는 메탄올 생합성 방법.
제 7항에 있어서, 상기 나트륨 포르메이트의 농도가 10∼20 μM인 것을 특징으로 하는 메탄올 생합성 방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 메탄올 생합성시 반응온도가 20∼30℃인 것을 특징으로 하는 메탄올 생합성 방법.