KR100543354B1 - Herb extract having anti-Hepatitis activity - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혼합 생약재 추출물에 관한 것으로 각각 육계, 자완, 시호, 단삼, 천오, 오수유, 인삼, 길경, 건강, 석창포, 후박, 복령, 황련, 조협, 쑥 및 감초로 구성된 혼합 생약재를 추출하여 항종양활성, 간염억제활성 및 면역증강활성을 나타내는 추출물에 관한 것이다.The present invention relates to a mixed herbal medicine extract anti-tumor by extracting the mixed herbal medicine consisting of broiler, Jawan, Shiho, Dansam, Cheonoh, Osuyu, Ginseng, Gilgyeong, Health, Seokchangpo, Hubak, Fuyeong, Hwangyeon, Johyup, Mugwort and Licorice It relates to an extract showing activity, hepatitis inhibitory activity and immunopotentiating activity.
항종양활성, 간염억제활성, 면역증강활성 Antitumor activity, hepatitis inhibitory activity, immune enhancing activity
Description
도 1은 MMP-9과 MMP-2를 모두 생산하는 SK-Hep1 세포주를 이용하여 각 생약재의 열수 추출물을 이용하여 MMP 자이모그라피(zymography)를 한 결과는 육계의 경우 MMP-2에 대한 높은 저해활성과 MMP-9에 대한 저해 효과도 나타났다Figure 1 shows the results of MMP zymography using the hydrothermal extract of each medicinal herb using SK-Hep1 cell lines producing both MMP-9 and MMP-2 showed high inhibition of MMP-2 in broilers. Activity and inhibitory effect on MMP-9
1: 대조군 2:석창포1: control group 2: Seokchangpo
3: 황련 4: 육계3: Husband 4: Broiler
5: 후박 6: 조협5: thick 6
7: 복령 8: 단삼7: Fuling 8: Dansam
9: 천오 10: 오수유9: Cheon 10: Oh Su-yu
11: 자완 12: 시호11: Jawan 12: Shiho
13; 길경 14: 인삼13; Street Scene 14: Ginseng
15: 건강15: health
도 2는 총에탄올 추출물(A) 총열수추출물(B)의 MMP 저해활성을 측정한 결과이다.Figure 2 is the result of measuring the MMP inhibitory activity of the total ethanol extract (A) total hydrothermal extract (B).
도 3은 열수 추출물의 간암세포주HFH-T2의 세포사에 대한 영향을 관찰한 겻이다.Figure 3 shows the effect of hot water extract on the cell death of HFH-T2 liver cancer cell line.
A) 정상 간암세포주, B) 열수 추출물 10 ㎍/㎖처리군, A) normal liver cancer cell line, B)
C) 열수 추출물 50㎍/㎖ 처리군(세포사가 관찰됨)C) hot water extract 50 ㎍ / mL treated group (cell death observed)
본 발명은 생약재 추출물에 관한 것으로, 좀더 자세히는 각각 육계, 자완, 시호, 단삼, 천오, 오수유, 인삼, 길경, 건강, 석창포, 후박, 복령, 황련, 조협, 쑥 및 감초로 구성된 생약재를 열수추출하여 항종양활성, 간질환억제활성 및 면역증강활성 갖는 추출물에 관한 것이다.The present invention relates to herbal medicine extract, in more detail, each of the broiler, Jawan, Shiho, Dansam, Cheonoh, Osuyu, Ginseng, Gilgyeong, health, Seokchangpo, Hubak, Fuling, Hwangyeon, Johyup, Wormwood and licorice It relates to an extract having antitumor activity, liver disease inhibitory activity and immunopotentiating activity.
암의 전이(metastasis)는 초기 종양으로부터 암세포가 신체의 다른 부위로 전파되는 과정으로 악성 종양의 가장 큰 특징이라 할 수 있다. 최근 암 연구보고에서 암전이로 인한 사망은 암 관련환자 사망의 약 90%를 차지하며, 바로 암의 전이가 암환자 사망의 중요한 원인임을 확인하였다. 지난 수년간의 종양세포 확산에 대한 집중적인 연구는 암 전이 과정의 분자 수준 기작에 대한 적지 않은 이해를 가져왔다. 암의 전이는 암세포와 암세포 주위와의 복잡한 상호작용으로 발생한다. 암세포 주위는 암세포가 정상적으로는 통과할 수 없는 지지구조체인 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane)으로 되어 있다.Metastasis of cancer is the most characteristic of malignant tumors because cancer cells are spread from an early tumor to other parts of the body. Recent cancer research reports indicate that cancer-related deaths account for about 90% of cancer-related deaths, and cancer metastasis is an important cause of cancer deaths. Intensive studies of tumor cell proliferation over the last few years have led to a considerable understanding of the molecular level mechanisms of cancer metastasis. Cancer metastasis results from complex interactions between cancer cells and their surroundings. Around the cancer cells is an extracellular matrix (ECM) and basement membrane, which are support structures that cancer cells cannot normally pass through.
암세포는 이러한 세포외 장벽을 극복하기 위하여 ECM과 기저막을 분해할 수 있는 다양한 종류의 프로테나제(proteinase)를 생산, 분비하는데, 그중에서도 특히 MMP(matrix metalloproteinase)가 중요한 역할을 담당한다. 정상적인 생리적 환경에서의 MMP들은 TIMP(tissue inhibitors of metalloproteinases)라는 내생 MMP 저해제에 의하여 엄격하게 조절된다. 그러나 암의 증식, 침윤(invasion), 전이 과정 중에는 MMP 와 TIMP 간의 평형이 무너지고 과다한 MMP가 분비된다. 따라서 MMP 저해제는 암의 침윤과 전이를 효과적으로 막을 수 있는 새로운 표적으로 기대되어 많은 암 연구자들이 새로운 개념의 항암 치료제로서 MMP 저해제 개발에 연구를 집중하고 있다. To overcome these extracellular barriers, cancer cells produce and secrete various types of proteinases that can degrade ECM and basement membranes, especially matrix metalloproteinases (MMPs). In normal physiological environments, MMPs are tightly regulated by endogenous MMP inhibitors called tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). However, during cancer proliferation, invasion, and metastasis, the equilibrium between MMP and TIMP is broken and excess MMP is released. Therefore, MMP inhibitors are expected to be a new target to effectively prevent cancer invasion and metastasis, and many cancer researchers are focusing on developing MMP inhibitors as a new concept of anticancer treatment.
그러므로, 현재 많은 연구자들에 의해 MMP에 대한 저분자의 선택적 저해제의 탐색 및 합성 디자인의 연구가 활발히 진행되고 있으며, 화학적으로 합성된 저해제와 천연물로부터 분리된 저해제의 전임상 또는 임상 실험의 결과는 MMP 저해제가 암의 치료에 있어서 새롭고 유망한 치료제가 될 수 있음을 보여주고 있다. 그러나 기존의 펩타이드 구조의 부분적인 변형에 관한 것으로 합성 저해제의 경우, 이들의 제한된 생체이용성(bioavailabilty), 짧은 반감기(half-life), 효소 선택성의 결여, 수용액에서 낮은 용해도 등의 적지 않은 문제점들이 있다. MMP의 중요한 생리적 활성에 비추어 볼 때 특정 MMP에 대해 선택성이 떨어지는 강력한 저해제의 지속적인 투여는 심각한 부작용을 야기할 것으로 예상할 수 있다. 식물이나 미생물 등 의 천연물로부터 몇 종류의 MMP 저해제가 탐색되어 개발과정 중에 있지만 효소 저해활성의 빈약함과, 강한 세포 독성 때문에 치료약으로 개발되기까지는 많은 문제점이 있다. 기존의 MMP 저해제들의 이러한 문제점들을 극복하기 위한 한 방법으로 민간에서 임상효능이 실증되어온 한약재로부터 MMP 저해제를 탐색하여 치료약으로의 개발은 매우 실제적이고 효과적인 전략이라 할 수 있다.Therefore, many researchers are currently actively searching for a low molecular selective inhibitors for MMPs and researching synthetic designs, and the results of preclinical or clinical trials of chemically synthesized inhibitors and inhibitors isolated from natural products have been investigated. It has been shown to be a new and promising drug in the treatment of cancer. However, partial modifications of existing peptide structures are related to synthetic inhibitors, including their limited bioavailabilty, short half-life, lack of enzyme selectivity, and low solubility in aqueous solutions. . In view of the important physiological activity of MMPs, continuous administration of potent inhibitors that are less selective for certain MMPs can be expected to cause serious side effects. Several kinds of MMP inhibitors have been discovered in the development process from natural products such as plants and microorganisms, but there are many problems until they are developed as therapeutic drugs due to the poor enzyme inhibitory activity and strong cytotoxicity. As a way of overcoming these problems of the existing MMP inhibitors, the development of MMP inhibitors from Chinese herbal medicines, which have been demonstrated clinical efficacy in the private sector, is a very practical and effective strategy.
한편 한방에서는 오랜 기간의 경험에 의하여 암 치료에 사용되어온 수많은 약재들이 있다. 몇몇 암 연구가들이 이들 약재로부터 항암제 개발의 연구결과 상당한 진전이 있었다. 지금까지 개발된 항암제 중에서 가장 우수한 항암제로 평가받고 있으며 난소암에 특히 효능이 높은 탁솔(taxol)은 실제로 중국에서 많이 사용하고 있는 항암성 약재인 주목(Taxus류)으로부터 분리하였으며, DNA 토포이소머라제 (topoisomerase)-I 저해제인 캄프토세신(camptothecin)류는 희수(Camptotheca acuminata)로부터 그리고, 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine) 등은 장춘화(Catharanthus roseus)에서 분리되었음은 잘 알려진 사실이다. 그러나, 이들은 암세포의 분화와 증식억제라는 측면에서 탐색, 개발되었기 때문에 강한 임상독성을 갖고 있고, 환자의 치료 중 상당한 부작용을 낳고 있으며, 장기적인 암치료를 요하는 경우에는 적용이 불가능하다. 지금까지 한방 생약재에서 암의 침윤, 전이, 암세포의 혈관신생 등을 방지하여 세포증식을 억제하는 사이토스테틱 요법(cytostatic therapy) 개념의 치료제 개발을 위한 연구는 거의 없다. 이러한 맥락에서 앞으로 한약재로부터 생화학적 접근방법에 의한 MMP 저해제의 개발은 새로운 항암 치료제의 개발의 본보기가 될 수 있다.On the other hand, there are a number of herbs that have been used in the treatment of cancer through long experience. Several cancer researchers have made significant progress in the development of anticancer drugs from these drugs. Taxol, which has been evaluated as the best anticancer agent developed so far and is particularly effective for ovarian cancer, has been separated from taxus , an anticancer drug commonly used in China, and DNA topoisomerase. It is well known that camptothecin, a topoisomerase-I inhibitor, was isolated from Camptotheca acuminata and vincristine, vinblastine, etc. from Catharanthus roseus . to be. However, since they have been explored and developed in terms of differentiation and proliferation of cancer cells, they have strong clinical toxicity, have significant side effects in the treatment of patients, and are not applicable to long-term cancer treatment. Until now, few herbal medicines have been developed for the treatment of cytostatic therapy, which inhibits cell proliferation by preventing cancer invasion, metastasis and neovascularization of cancer cells. In this context, the development of MMP inhibitors by biochemical approaches from herbal medicines could be an example of the development of new anticancer drugs.
지금까지 보고된 바에 의하면 타입 IV 콜라게나제(collagenase or gelatinaes)인 MMP-2와 MMP-9가 암의 전이와 밀접한 관련이 있다. 암의 전이에 가장 큰 장벽인 ECM과 기저막의 주된 성분은 타입 IV 콜라겐인데, MMP-2와 MMP-9는 촉매적 도메인(catalytic domain) 내에 젤라틴(gelatin)과 콜라겐에 대해 친화성이 있는 유사 피브로넥틴 도메인(fibronectin-like domain)을 포함하고 있으며, 타입 IV 콜라겐에 대하여 기질 특이성을 갖고 있다. 뿐만 아니라 인간 암세포주 배양과 실험 동물모델에서 MMP-2와 MMP-9가 암의 전이와 연관되었다고 입증되었으므로, 이를 분비하는 세포주를 이용하여 MMP 저해제를 탐색하는 전략이 효과적이다.So far reported, type IV collagenase (collagenase or gelatinaes) MMP-2 and MMP-9 is closely associated with cancer metastasis. The major components of ECM and basement membranes, which are the biggest barriers to cancer metastasis, are type IV collagen, and MMP-2 and MMP-9 are similar fibronectins with gelatin and collagen affinity in the catalytic domain. It contains a domain (fibronectin-like domain) and has substrate specificity for type IV collagen. In addition, MMP-2 and MMP-9 have been shown to be associated with cancer metastasis in human cancer cell line cultures and experimental animal models.
타입 IV 콜라게나제를 분비하는 세포주 탐색을 위해 HT1080, C32TG, HepG2 T98G, MIA-PaCa2, UAcc62, U937, G361 등 다양한 종양 세포주를 이용하여 무혈청 배지에 TPA와 TGF- 1등의 첨가에 따른 타입 IV 콜라게나제의 유도정도를 확인한다. 젤라티나제의 효소 활성측량법으로는 방사능 동위원소가 표지된 젤라틴(3H-acetylated gelatin)이나 광합성 펩타이드(fluorogenic MMP-2/MMP-9 sustrate, DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH)를 이용하여 분해산물의 방사능량이나 형광량을 측량하는 방법과, 활성 단백질 전기영동법을 이용한 젤라틴 자이모그라피 (gelatin zymography)가 있다. 이들 중 젤라틴 자이모그라피가 비교적 간편하고, 적은 시료량으로 효소활성 측량이 가능하다. 또한 대략적인 분자량을 알 수 있기 때문에 분비되는 MMP를 동정할 수 있으므로 편리하다.In order to detect cell lines secreting type IV collagenase, various tumor cell lines such as HT1080, C32TG, HepG2 T98G, MIA-PaCa2, UAcc62, U937, and G361 were used. Check the degree of induction of IV collagenase. Enzymatic activity measurement of gelatinases involves radiolabeled gelatin (3H-acetylated gelatin) or photosynthetic peptides (fluorogenic MMP-2 / MMP-9 sustrate, DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-). Arg-OH) is used to measure the radioactivity or fluorescence of the degradation products, and gelatin zymography using active protein electrophoresis. Among them, gelatin zymography is relatively simple and enzymatic activity can be measured with a small sample amount. In addition, since the approximate molecular weight is known, the secreted MMP can be identified, which is convenient.
일반적으로 대부분의 한방 생약재들은 건조된 상태로 보관 유통되고 있으므로 저장기간 중에 바이러스, 세균 곰팡이 등에 감염되었는지 유의하여야 한다. 또한 다른 재료들이 유입되지 않았는지 유의하여야 하며, 특별히 고려해야할 점은 한약재료의 정확한 감정을 필요로 한다. 건조된 식물재료를 추출할 때는 적당한 크기로 자른 다음, 막자사발, 분쇄기 등을 이용하여 완전히 분말로 하여 유기용매와 열수추출을 한다. 건조된 재료는 먼저 메탄올이나 에탄올로 추출하는 것이 좋다. 알코올은 세포막을 파괴함으로 세포내의 성분을 추출할 수 있으나 에테르 또는 삼염화탄소와 같은 비극성 용매로는 세포내 성분을 용출시킬 수 없다. In general, most herbal medicines are stored and distributed in a dry state, so care should be taken to protect them from viruses, bacterial fungi, etc. during the storage period. It is also important to note that no other ingredients have been introduced, and special considerations require accurate appraisal of herbal ingredients. When extracting the dried plant material, cut it to a suitable size, and then, using a mortar and pestle, grinder, etc. to completely powder the organic solvent and hot water extraction. The dried material is first extracted with methanol or ethanol. Alcohol can extract the components in the cell by breaking the cell membrane, but the intracellular components cannot be eluted with a nonpolar solvent such as ether or carbon trichloride.
일반적으로 탐색 초기단계에서는 활성물질이 완전하게 분리, 정제가 되지 않은 상태에서 적은 양을 탐색시료로 이용한다. 본 실험에서는 젤라틴 자이모그라피를 약간 변형하여 MMP 저해제 탐색에 이용하였다. 먼저 아크릴아마이드 젤 제조시 기질인 젤라틴을 1.0㎎/㎖첨가한 분리 젤을 만들어 SK-Hep1의 무혈청 배양액을 SDS시료 완충용액(4% SDS, 125mM Tris-Cl(pH 6.8), 10% glycerol)으로 전기영동한 후 Triton X-100이 포함된 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액으로 30분간 2회 세척하여 SDS를 제거한 후 자이모그라피용 배양완충용액(50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM CaCl2, 0.01% NaN3)으로 20분간 다시 세척하였다. 용매추출물과 지모그라피용 배양완충용액을 혼합하여 37℃에서 20시간 배양한 다음 겔(gel)을 2.5% 젤(Gel)을 0.1% 쿠마시브릴리언트 블루(Coomasie brilliant blue)로 염색시킨 후 탈색하여 젤라틴 분해능이 현저하게 저하된 것을 MMP 저해제 활성이 있는 것으로 판단하였다.Generally, in the early stage of exploration, a small amount is used as the exploration sample without the active substance being completely separated and purified. In this experiment, gelatin zymography was slightly modified and used to search for MMP inhibitors. First, when preparing acrylamide gel, a separation gel containing 1.0 mg / ml of gelatin, which is a substrate, was prepared. Serum-free serum of SK-Hep1 was added to SDS sample buffer solution (4% SDS, 125 mM Tris-Cl (pH 6.8), 10% glycerol). After electrophoresis, 50-MM Tris-HCl (pH 7.5) buffer containing Triton X-100 was washed twice for 30 minutes to remove SDS, followed by culture buffer solution for Zymography (50 mM Tris-HCl (pH 7.5)). , 10
최근, 한방약재의 약리활성을 이용한 암의 치료 및 예방이 중요시되고 있다. 예를 들어, 대나무잎에서 추출한 다당류는 사르코마-180 (Sarcoma-180)이 이식된 생쥐의 복강암에 효과적인데[Ikekawa, T.등 (1968) Gann 59: 155-157], 이러한 종양억제 약리활성은 간접적인 숙주를 매개로 한 면역증강효과에 기인하며, 특히 담자균류 세포벽에 존재하는 다당류의 활성이 중요한 것으로 알려져 있다[Tanaka, T. 등 (1965) Gann, 56: 529-536; Hamuro, J. 등 (1978) Cancer Res., 38: 3080-3085; Maeda, Y. 및 Chihara, G., (1971) Nature, 229: 634-635; Komatsu, N. 등 (1969) Gann. 60: 137-144; Oh, G. T. 등 (1992) Arch. Pharm. Res., 15: 379-381].In recent years, the treatment and prevention of cancer using the pharmacological activity of the herbal medicine has been important. For example, polysaccharides extracted from bamboo leaves are effective against celiac cancer in mice transplanted with Sarcoma-180 [Ikekawa, T. et al. (1968) Gann 59: 155-157]. The activity is due to an indirect host-mediated immune-enhancing effect, in particular the activity of polysaccharides present in basidiomycetes cell walls is known to be important [Tanaka, T. et al. (1965) Gann, 56: 529-536; Hamuro, J. et al. (1978) Cancer Res., 38: 3080-3085; Maeda, Y. and Chihara, G., (1971) Nature, 229: 634-635; Komatsu, N. et al. (1969) Gann. 60: 137-144; Oh, G. T. et al. (1992) Arch. Pharm. Res., 15: 379-381.
한방약재의 다른 약리활성에는 면역증강, 항응고 활성 및 소화기계 활성이 알려져 있다[Wagner, H. (1989) Planta Medica 55: 235-241; Wagner, H. (1990) Pure Appl. Chem. 62: 1217-1222.; Hodges, L.C. 등 (985) Carbohyd. Polym. 5: 141-154; Kiyohara, H. 등 (1996) Planta Medica 62: 14-19]. 또한, Sargassum fulvellum의 알긴산, Sargassum kjellmanianum의 황화 갈락토퓨칸(sulfated galactofucan) 등은 숙주를 매개로 한 항종양활성을 가지고 있으며 [Yamada, H. 등 (1987) Agric. Biol. Chem. 51, 785-790; Shimizu, S. 등 (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 150, 335-341], Porphyra yezoensis의 다당류는 시험관내 및 생체내 탐식세포의 활성화 활성을 가지며[Shimizu, S. 등 (1989) J. Am. Oil. Chem. Soc., 66, 237-241], Gracilaria verrucosa 다당류는 생쥐의 탐식활성을 증대시킨다 [Shinmen, Y. 등, (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 31, 11-16].Other pharmacological activities of herbal medicines are known to be immune enhancing, anticoagulant and digestive system [Wagner, H. (1989) Planta Medica 55: 235-241; Wagner, H. (1990) Pure Appl. Chem. 62: 1217-1222; Hodges, L.C. Et al. (985) Carbohyd. Polym. 5: 141-154; Kiyohara, H. et al. (1996) Planta Medica 62: 14-19]. In addition, alginic acid of Sargassum fulvellum and sulfated galactofucan of Sargassum kjellmanianum have antitumor activity through the host [Yamada, H. et al. (1987) Agric. Biol. Chem. 51, 785-790; Shimizu, S. et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 150, 335-341], the polysaccharides of Porphyra yezoensis have activating activity of phagocytic cells in vitro and in vivo [Shimizu, S. et al. (1989) J. Am. Oil. Chem. Soc., 66, 237-241], Gracilaria verrucosa polysaccharides enhance the phagocytic activity of mice [Shinmen, Y. et al., (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 31, 11-16.
또한, 약리활성을 나타내는 식물계 황화다당류의 혈관내의 지방 제거활성과 항응고(anticoagulant) 활성은 이미 알려진 바 있으며[Nakagawa, K. 등 (1972) Carbohyd. Res., 21: 420-426; Hatanaka, K. 등 (1987) J. Med. Chem. 30, 810-814], 다당류 중 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 펜토산 (pentosan), 폴리설페이트(polysulfate) [Erik De Clercq. (1989) J. Antimicrob. Chemother., 23 :35-46.22], 레티난 설페이트(lentinan ulfate)[Hatanaka, K. 등 (1989) Jpn. J. Cancer Res. 80: 95-98.23], 리보퓨라난 설페이트(ribofuranan sulfate)[Hatanaka, K. 등 (1991) J. Carbohy. Chem., 10: 681-690.24], 퓨칸 설페이트 (fucan sulfate) [Nishino, T. 등, (1991) Agric. Biol. Chem. 55: 791-796], 및 갈락탄 설페이트(galactan sulfate)[Nagumo, T. 등 (1988) Kitasato Arch. of Exp. Med., 61: 59-67]는 인체 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus)에 의해 유발된 세포독성에 효과를 나타내며, 특히 리보퓨라난 설페이트(ribofuranan sulfate)의 활성은 황화 (sulfation) 정도에 의존한다. In addition, the fat removal and anticoagulant activity in blood vessels of physiologically sulphide polysaccharides have been known [Nakagawa, K. et al. (1972) Carbohyd. Res., 21: 420-426; Hatanaka, K. et al. (1987) J. Med. Chem. 30, 810-814], dextran sulfate, pentosan, polysulfate in polysaccharides [Erik De Clercq. (1989) J. Antimicrob. Chemother., 23: 35-46.22], lentinan ulfate [Hatanaka, K. et al. (1989) Jpn. J. Cancer Res. 80: 95-98.23], ribofuranan sulfate (Hatanaka, K. et al. (1991) J. Carbohy. Chem., 10: 681-690.24], fucan sulfate (Nishino, T. et al., (1991) Agric. Biol. Chem. 55: 791-796, and galactan sulfate (Nagumo, T. et al. (1988) Kitasato Arch. of Exp. Med., 61: 59-67] have an effect on the cytotoxicity caused by human immunodeficiency virus, in particular the activity of ribofuranan sulfate depends on the degree of sulfation. .
이러한 약리활성을 가지는 식물은 숙주방어활성(host-defense activity)과 탐식세포(macrophage)활성을 촉진하므로써 면역증강(immuno- potentiating)과 항종양활성(actitumoral activity)을 나타내는 것으로 평가된다. 또한, 면역계 활성화와 항종양에 대하여 임상적으로 효과가 인정되는 약물은 소수에 불과하므로 현재까지 많은 연구자에 의해 항종양에 유효한 약물탐색이 이루어지고 있다.Plants with such pharmacological activity are evaluated to exhibit immunopotentiating and antitumoral activity by promoting host-defense activity and macrophage activity. In addition, since only a few drugs have been clinically recognized as effective against immune system activation and antitumor, many researchers have been searching for effective drugs for antitumor.
한편, 예정된 세포사(apoptosis)는 간염의 주요 원인으로 Fas-FasL결합에 의한 간세포(hepatocyte)파괴로 급성간염과 만성간염을 야기한다[Feldmann, G. (1997) J. Hepatol. 36: 1-11]. 즉, 예정된 세포사멸은 종양괴사인자 수용체계 단백질인 Fas(또는 CD95, APO-1)가 그의 리간드(ligand)인 FasL과 결합함으로써 전개되며[Nagata,S. 및 Golstein, P. (1995) Science 267: 1449-1456], 이로 인해 간염 또는 당뇨병이 생성된다[Chervonsky, A. V. 등 Cell 89: 17-24; Griffith, T. S. 등 (1995)Science 270: 1189-1192; Bellgrau, D. (1995) Nature 377: 630-632]. 따라서, Fas-FasL 매개에 의한 세포사 억제활성을 나타내는 물질은 간염치료제로 유용하게 사용될 수 있다.On the other hand, scheduled apoptosis is a major cause of hepatitis and causes acute hepatitis and chronic hepatitis due to hepatocyte destruction by Fas-FasL binding [Feldmann, G. (1997) J. Hepatol. 36: 1-11. In other words, predetermined apoptosis is developed by binding Fas (or CD95, APO-1), a tumor necrosis factor receptor protein, with FasL, its ligand [Nagata, S. And Golstein, P. (1995) Science 267: 1449-1456, resulting in hepatitis or diabetes [Chervonsky, A. V. et al. Cell 89: 17-24; Griffith, T. S. et al. (1995) Science 270: 1189-1192; Bellgrau, D. (1995) Nature 377: 630-632. Therefore, the material showing cell death inhibitory activity by Fas-FasL media can be usefully used as a therapeutic agent for hepatitis.
본 발명의 육계, 자완, 시호, 단삼, 천오, 오수유, 인삼, 길경, 건강, 석창포, 후박, 복령, 황련, 조협, 쑥 및 감초로 구성되는 생약재는 건조한 약재이다. 비록 다른 약재와의 복합처방에 한정되어 있을지라도, 과거 한방약재로서 청열해독에 주로 사용되어 왔으며 특히, 산부인과 질환과 관련한 염증질환 및 자궁경부암의 치료에 효과적임이 알려져 있다(허준, 동의보감). 그러나 상기 생약성분에 항종양 활성 및 간염억제활성이 있는지에 대한 연구는 알려진 바가 없다.Herbs of the present invention broiler, Jawan, Shiho, Dansam, Cheonoh, Osuyu, Ginseng, Gilgyeong, health, Seokchangpo, Hubak, Bokryeong, Hwangyeon, Johyup, Mugwort and Licorice are herbal medicines. Although it is limited to a combination prescription with other medicines, it has been used in the past as a herbal medicine mainly for clearing detoxification, and is known to be particularly effective in the treatment of inflammatory diseases and cervical cancers related to obstetrics and gynecological diseases (Huh, Jun Bo). However, there is no known research on the antitumor activity and the hepatitis inhibitory activity of the herbal components.
본 발명자들은 전통 천연생약인 상기 구성의 생약재 추출물의 활성을 연구하여 오던 중, 추출물에 대한 B-임파구(lymphocyte) 자극활성과 탐식세포 자극활성과 같은 면역증강활성 및 항종양활성을 확인하였으며, 또한 본 발명에서는 추출 다당류가 간세포 세포사(apoptosis)에 있어서 간세포 염증의 원인인 Fas-FasL의 결합을 저해하고 FasL의 발현을 억제하는 효과를 가지고 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention, while studying the activity of the herbal extract of the composition, which is a traditional natural herbal, confirmed the immuno-enhancing and anti-tumor activity such as B-lymphocyte stimulating activity and phagocytic stimulating activity against the extract, In the present invention, it was found that the extracted polysaccharides have the effect of inhibiting the binding of Fas-FasL, which is the cause of hepatocellular inflammation, and inhibiting the expression of FasL in hepatocellular apoptosis.
따라서, 본 발명의 목적은 생약재로부터 추출한 항종양, 감염억제 및 면역증강활성을 갖는 추출물을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an extract having antitumor, infection suppression and immunopotentiating activity extracted from the herbal medicine.
또한, 본 발명의 목적은 상기의 추출물을 유효 성분으로 하는 건강보조식품을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a dietary supplement comprising the extract as an active ingredient.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 우리나라에서 전통적으로 한방의료 및 민족의학적 분야에 주로 쓰이는 생약재로부터 열수추출물을 얻고, 이를 세분획 및 정제하여 그 활성을 검정함으로써 간세포의 세포사 억제활성, 항암활성 및 면역증강활성을 가짐을 확인하였다.In order to achieve the above object, the present invention obtains the hot water extract from the herbal medicine traditionally used mainly in the field of herbal medicine and ethnic medicine in Korea, and fractionated and purified it to test its activity by inhibiting cell death, anticancer activity and It was confirmed to have immunopotentiating activity.
본 발명은 육계, 자완, 시호, 단삼, 천오, 오수유, 인삼, 길경, 건강, 석창포, 후박, 복령, 황련, 조협, 쑥 및 감초로 구성되는 생약재로부터 추출되는 항종양활성, 간질환억제활성 및 면역증강활성을 갖는 생약재 추출물에 관한 것이며, 상기 생약재를 구성하는 약재는 각각 동량으로 사용할 수 있다.The present invention is anti-tumor activity, liver disease suppression activity extracted from herbal medicine consisting of broiler, Jawan, Shiho, Dansam, Cheonoh, Osuyu, Ginseng, Gilgyeong, health, Seokchangpo, Hubak, Bokryeong, Hwangyeon, Johyup, Mugwort and Licorice The present invention relates to a herbal extract having immuno-enhancing activity, and the medicinal herbs constituting the herbal medicine can be used in the same amount.
또한, 본 발명은 상기 생약재를 세절하여 물, 수용액 또는 완충용액에서 분쇄한 뒤 원심분리 후의 침전물을 열수추출하여 제조되고 항종양활성, 간질환억제활성 및 면역증강 활성을 가지는 생약재 추출물을 제공한다.In addition, the present invention is prepared by pulverizing the herbal medicine in water, an aqueous solution or a buffer solution, and then extracting the precipitate after centrifugation with hot water and has an antitumor activity, hepatic disease inhibitory activity and immune enhancing activity.
또한, 본 발명은 상기 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 항종양제, 간기능관련질환 치료제 및 면역증강제용 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 간기능 질환은 Fas-FasL 상호작용을 매개로 하는 간세포사에 의한 염증, 간기능장해, 알콜성 간염, 환경성 간염, 바이러스성 간염, 스트레스성 간염, 지방간 질환 등인 것을 특징으로 한다.The present invention also relates to an anti-tumor agent, a liver function-related disease treatment agent, and an immunopotentiator pharmaceutical composition containing the herbal extract as an active ingredient. The liver function disease is characterized by inflammation, hepatic impairment, alcoholic hepatitis, environmental hepatitis, viral hepatitis, stress hepatitis, fatty liver disease and the like caused by Fas-FasL interaction.
약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical preparations.
즉, 본 발명의 추출물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 생약추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.That is, the extract of the present invention may be administered in various oral and parenteral dosage forms during actual clinical administration, and when formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. that are commonly used. Is prepared using. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, or the like in one or more herbal extracts. (Sucrose) or lactose (Lactose), gelatin, etc. are mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used. Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. . Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As a suppository base, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
추출물의 유효용량은 200∼600mg/kg 이고, 바람직하기로는 200∼500mg/kg 이며, 하루 1~3회 투여될 수 있다. 용량이 200mg/kg 미만이면 효과가 미미하며, 600mg/kg 초과하면 투여량에 대한 기대효과의 증가치가 적어 경제적이지 못하다.The effective dose of the extract is 200 to 600 mg / kg, preferably 200 to 500 mg / kg, may be administered 1 to 3 times a day. If the dose is less than 200mg / kg the effect is insignificant, if it exceeds 600mg / kg the increase in the expected effect on the dosage is not economical.
또한, 본 발명의 추출물을 유효성분으로 하는 건강보조식품을 제공할 수 있다. In addition, it can provide a health supplement with the extract of the present invention as an active ingredient.
이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세하게 설명한다.The present invention will be described in detail by the following examples.
하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.The following examples illustrate the present invention in detail, and the content of the present invention is not limited by the examples.
<실시예 1: 생약재 추출><Example 1: Herbal Medicine Extraction>
육계, 자완, 시호, 단삼, 천오, 오수유, 인삼, 길경, 건강, 석창포, 후박, 복령, 황련, 조협, 쑥 및 감초로 구성되는 건조 생약재 500g을 세절하여, 50mM PBS(pH 7.2)용액에서 분쇄한 뒤, 4℃, 15,000Xg에서 20분간 원심분리하였다. 그 후 샘플 5g을 취하여 10배량의 메탄올을 가하여 70℃에서 3시간 동안 가온 침출하여 여과(동양여지 No. 1)하고 여액을 모아 감압농축 후 정량하여 실험에 사용하였다.500 g of dried herbal medicine consisting of broiler, Jawan, Shiho, Dansam, Cheonoh, Osuyu, Ginseng, Gilkyung, Health, Seokchangpo, Hubak, Bokryeong, Hwangyeon, Johyup, Mugwort and Licorice are chopped and crushed in 50mM PBS (pH 7.2) solution. Afterwards, the mixture was centrifuged at 4 ° C. and 15,000 × g for 20 minutes. Thereafter, 5 g of the sample was added, and 10 times the amount of methanol was added thereto, followed by warm leaching at 70 ° C. for 3 hours, followed by filtration (Oriental filter No. 1). The filtrates were collected, concentrated under reduced pressure, and used for the experiment.
<실시예 2: 생약재 추출물의 MMP-9 저해활성(MMP Zymography)과 세포사멸 유도활성><Example 2: MMP-9 Inhibitory Activity (MMP Zymography) and Apoptosis Inducing Activity of Medicinal Herb Extracts>
상기 건조 생약재(이하, 발명의 상세한 설명 등에서 "미삼정"이라는 상표명과 혼용하여 사용함) 구성약재를 세절하여, 50mM PBS(pH 7.2)용액에서 분쇄한 뒤, 4℃, 15,000Xg에서 20분간 원심분리하였다. 그 후 샘플 5g을 취하여 10배량의 메탄올을 가하여 70℃에서 3시간 동안 가온 침출하여 여과(동양여지 No. 1)하고 여액을 모아 MMP-9 저해실험에 사용하였다.The dried herbal medicines (hereinafter, used in combination with the trade name "Misamjeong" in the detailed description of the invention) are finely divided, pulverized in 50 mM PBS (pH 7.2) solution, and centrifuged at 4 ° C. and 15,000 × g for 20 minutes. It was. Thereafter, 5 g of the sample was added, 10 times the amount of methanol was added, and the mixture was filtered and leached by heating at 70 ° C. for 3 hours (Oriental filter No. 1), and the filtrates were collected and used for the MMP-9 inhibition experiment.
열수 추출에 의해 획득한 각 구성성분 한약재의 수율은 표 1과 같고, MMP-9과 2를 모두 생산하는 SK-Hep1 세포주를 이용하여각 한약재의 열수 추출물을 이용하여 MMP 저해활성 실험을 한 결과 도 1에서 보는 바와 같이 육계와 후박의 MMP 저해활성이 가장 강한 것으로 나타났다. 육계의 경우 MMP-2에 대한 높은 저해활성과 MMP-9에 대한 저해 효과도 나타났다. 특히 후박에서 MMP-9과 MMP-2모두 높은 저해효과가 나타났다. MMP-9과 MMP-2에 대해 저해활성을 나타낸 육계와 후박의 경우 각각 50, 100, 300, 500㎍/㎖의 농도변화를 준 후 MMP 저해활성 실험을 한 결과는 도 2에서 보는 바와 같이 50㎍/㎖의 농도에서 에탄올 추출물의 경우 MMP-2와 MMP-9 모두 현저한 감소를 보여주고 있다. 그에 반해 열수 추출물의 경우에는 300㎍/㎖의 농도에서 에탄올 추출물과 유사한 결과를 보여주고 있다. 열수 추출 및 에탄올 추출은 실시예 1의 추출 방법과 유사하며, 메탄올 대신 물 또는 에탄올을 사용하였다.Yields of each medicinal herb obtained by hydrothermal extraction are shown in Table 1, and the results of MMP inhibitory activity using the hydrothermal extract of each herb using SK-Hep1 cell line producing both MMP-9 and 2 are shown. As shown in Fig. 1, the MMP inhibitory activity of broilers and hunch was the strongest. In broilers, high inhibitory activity against MMP-2 and inhibitory effect against MMP-9 were also observed. In particular, the inhibitors of MMP-9 and MMP-2 showed high inhibitory effects. In the case of broilers and thick gourds showing inhibitory activity against MMP-9 and MMP-2, the results of MMP inhibitory activity experiments after 50, 100, 300, 500 ㎍ / mL change were 50 as shown in FIG. Methanol extract showed a significant decrease in both MMP-2 and MMP-9 at the concentration of ㎍ / mL. In contrast, the hydrothermal extract showed similar results to the ethanol extract at the concentration of 300 µg / ml. Hot water extraction and ethanol extraction were similar to the extraction method of Example 1, using water or ethanol instead of methanol.
참고로 본 발명의 생약재를 구성하는 각 약재들의 열수 추출물에 의한 암세포사멸에 대한 영향은 도 3에서 보는 바와 같다. 열수 추출액의 처리에 의해 간암세포주 HFH-T2의 세포사가 유발됨을 알수 있었다. 특히 정상 간암세포주(A)에 추출액 10㎍/㎖처리군 (B)에서는 약간의 암세포주 사멸이 보이지만 추출액 50㎍/㎖ 처리군 (C)에서는 간암세포주의 대부분이 세포사가 유도됨을 관찰되었다.For reference, the effect on the cancer cell death by the hydrothermal extract of each of the medicinal herbs of the present invention is as shown in FIG. The treatment of HFH-T2 induced cancer cell death by treatment with hot water extract. In particular, in the normal liver cancer cell line (A), a slight death of cancer cell lines was observed in the
에탄올 추출물과 동일하게 열수 추출물에서도 생약재의 저해활성이 가장 강하게 나타났다. 생약재의 열수 추출물을 이용하여 농도별로 MMP-2와 MMP-9에 대한 저해능 비교해 보면 에탄올 추출물은 열수 추출물보다 50㎍/㎖의 농도에서도 MMP-2와 9의 저해능이 높게 나타났으며 100㎍/㎖ 의 농도에서는 MMP-2의 활성이 거의 억제되는 것을 알 수 있었다.In the same way as ethanol extract, hydrothermal extract showed the strongest inhibitory activity of herbal medicines. Inhibition of MMP-2 and MMP-9 by the concentration of hot water extract of herbal medicine showed that the inhibition of MMP-2 and 9 was higher at the concentration of 50㎍ / ㎖ than that of the hot water extract. It was found that the activity of MMP-2 was almost suppressed at the concentration of.
<실시예 3: Fas-FasL 매개에 의한 간세포의 세포사에 대한 생약재 추출물의 억제효과> <Example 3: Inhibitory effect of herbal extracts on cell death of hepatocytes by Fas-FasL mediated >
본 발명의 생약재 추출물의 Fas-FasL 매개에 의한 세포사 억제 및 간염의 치료효과를 확인하기 위하여, 생쥐의 초대 간세포(primary hepatocyte)를 분리 후 배양하였다(cm5당 2 x 105). 또한 FasL을 발현하거나 발현하지 않는 NIH3T3 섬유아세포(cm5당 5 x 105)를 합하여 공배양하였다. 이때, 대조군으로는 Fas-FasL 결합에 의한 세포사의 핵심효소이자 카스파제(caspase) 저해제인 zVAD.fmk를, 카스파제-/-와 카스파제-3-는 대조 생쥐군으로 사용하였다[Hughes, D. P 및 Crispe, I. N. (1995) J. Exp. Med. 182: 1395-1401]. 간세포의 생존성은 3uM의 프로피디움 아이오다이드 (PI)로 10분간 염색하여 현미경으로 관찰하였으며, 이때 정상적인 간세포의 형태는 PI-음성 생존세포로 구분하였다.In order to confirm the therapeutic effect of inhibiting cell death and hepatitis caused by Fas-FasL mediated saengyakjae the extract of the present invention, after the invitation liver (hepatocyte primary) separation of the mice were incubated (2 x 10 5 cm per 5). In addition, ball and cultured by adding the NIH3T3 fibroblasts (5 x 10 5 per 5 cm) that do not express or express FasL. In this case, zVAD.fmk, a key enzyme and caspase inhibitor of cell death by Fas-FasL binding, and caspase-/-and caspase-3- were used as control mice [Hughes, D]. P and Crispe, IN (1995) J. Exp. Med. 182: 1395-1401. The viability of hepatocytes was observed under a microscope after staining with 3 uM of propidium iodide (PI) for 10 minutes, and normal hepatocytes were classified as PI-negative viable cells.
상기 방법대로 간세포를 FasL을 발현하는 섬유아세포와 공배양 하였을 때 생쥐의 간세포가 24시간 내에 사멸하였으나 대조군의 섬유아세포와 같이 배양된 간세포는 대부분이 생존하였다. 더우기 간세포를 FasL을 발현하는 섬유아세포와 동시에 배양하였을 때 일시적인 블렙(bleb) 형성이 시작되었으며 DNA절단이 확인되었으나, 카스파제 저해제인 zVAD.fmk를 첨가하였을 때는 간세포의 사멸이 일어나지 않았다(표 1 참조). 이로부터 FasL이 간세포의 세포사의 원인이며, zVAD.fmk에 의해서 저해되는 카스파제가 세포사에 관여하고 있음을 알 수 있다. When hepatocytes were co-cultured with FasL-expressing fibroblasts as described above, mouse hepatocytes died within 24 hours, but most of the hepatocytes cultured with the fibroblasts of the control group survived. In addition, when the hepatocytes were incubated with FasL-expressing fibroblasts, transient blep formation began and DNA cleavage was observed. However, the addition of the caspase inhibitor zVAD.fmk did not cause the death of hepatocytes (see Table 1). ). This shows that FasL is the cause of cell death of hepatocytes, and that caspase inhibited by zVAD.fmk is involved in cell death.
한편, 열수 추출물을 50mg/15ml 농도로 첨가시, FasL발현-NIH3T3에 의한 세포사를 약 40%이상 감소시켜 간세포 생존능력을 향상시켰다. 이러한 결과는 섬유아세포가 생성하는 FasL에 의한 간세포의 Fas 수용체결합을 추출물이 방해 내지 저해함으로서 Fas 수용체에 세포사의 신호가 전달되는 것이 차단되기 때문으로 보인다(표 2). 또한 추출물의 보호효과는 야생형 간세포보다는 카스파제-3이 결손된 생쥐에서 분리된 간세포에서 보다 효과적임이 확인되어 Fas-FasL에 의한 세포사는 주로 카스파제-3를 매개하고 있음을 확인하였다(표 3).On the other hand, when hot water extract was added at a concentration of 50 mg / 15ml, cell death by FasL expression-NIH3T3 was reduced by about 40% or more to improve hepatocyte viability. This result seems to be due to the blockage or inhibition of Fas receptor binding of hepatocytes by FasL produced by fibroblasts, thereby preventing the transmission of signal of cell death to Fas receptor (Table 2). In addition, the protective effect of the extract was found to be more effective in hepatocytes isolated from caspase-3 deficient mice than wild-type hepatocytes, confirming that cell death by Fas-FasL mainly mediates caspase-3 (Table 3). .
한편, 선유아세포와 24시간 공배양시 간세포의 세포사에 대한 생약재 추출물의 억제효과 (PI-음성 세포)를 검정한 결과, 추출물 처리군에서 강한 억제효과를 보였다(표 4).On the other hand, as a result of assaying the inhibitory effect (PI-negative cells) of herbal extracts on cell death of hepatic cells during coculture with fibroblasts for 24 hours, the extract treatment group showed a strong inhibitory effect (Table 4).
<실시예 4: 생약재 추출물의 화학적 조성>Example 4: Chemical Composition of Herbal Extracts
실시예 1에서 얻어진 생약재 추출물의 화학적 특성을 조사하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 총당(total sugar)의 정량은 페놀-황산법[Dubois, M. 등 (1956) Anal. Chem. 28: 350-354]을 사용하였으며, 환원당은 넬슨-쏘모지(Nelson-Somogyi)방법[Nelson, N. J. 및 Somogyi, M. (1952) J. Biol. CHem. 195: 19-23]을, 표준물질로는 포도당을 사용하였다. 단백질 정량은 소혈청알부민 (BSA)을 표준으로 하여 로우리(Lowry)법 [Lowry, H.O.,등 (1951) J. Biol. Chem., 193: 265-275]으로 하였으며, 다당류의 가수분해는 2M 황산으로 100℃에서 6시간동안 스크루캡 바이알에서 수행하였다. 가수분해 후 바륨 카보네이트(BaCO3)로 중화시키고 엠버라이트(Amberite) IR-120(H+ form)컬럼에서 분리하였다. 갈락토퓨라노실(galactofuranosyl) 잔기를 제거하기 위한 다당류의 부분가수분해는 25mM 황산(10 ml)으로 100℃에서 4시간동안 수행하였으며, 이때 0.5M NaOH로 중화하고 증류수로 투석하였다.In order to investigate the chemical properties of the herbal extract obtained in Example 1 was carried out as follows. Quantification of total sugars was carried out using the phenol-sulfuric acid method [Dubois, M. et al. (1956) Anal. Chem. 28: 350-354, and the reducing sugars were used in the Nelson-Somogyi method [Nelson, NJ and Somogyi, M. (1952) J. Biol. CHem. 195: 19-23] and glucose was used as a standard. Protein quantitation is based on Low Serum Albumin (BSA), Lowry method [Lowry, HO, et al. (1951) J. Biol. Chem., 193: 265-275], and the hydrolysis of the polysaccharides was carried out in a screwcap vial for 6 hours at 100 ℃ with 2M sulfuric acid. After hydrolysis it was neutralized with barium carbonate (BaCO 3 ) and separated in Amberlite IR-120 (H + form) column. Partial hydrolysis of polysaccharides to remove galactofuranosyl residues was performed with 25 mM sulfuric acid (10 ml) at 100 ° C. for 4 hours, neutralized with 0.5 M NaOH and dialyzed with distilled water.
표 5로부터 생약재 추출물의 구성성분 중 대부분이 당류(93.7%)이며, 미량의 단백질과 황이 포함되어 있음을 확인했다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 생약재 추출물에 존재하는 황에 의한 항바이러스제로서의 기능도 예상된다.It was confirmed from Table 5 that most of the components of the herbal extracts were saccharides (93.7%) and contained trace amounts of protein and sulfur. From these results, the function as an antiviral agent by sulfur which exists in the herbal extract of this invention is also anticipated.
<실시예 5: 생약재 추출물의 B-임파구 자극활성><Example 5: B-lymphocyte stimulating activity of the herbal extracts>
실시예 1에서 얻어진 생약재 추출물에 대한 B-임파구 자극활성을 검토하기 위해 실험동물은 암컷의 생쥐(C57BL/6XC3H) F1(B6C3F1)을 생명공학연구소로부터 구입하여 17~22g 중량이 될 때 비장적출실험에 이용하였다. 양의 적혈구(sRBC)는 한국배지주식회사(서울)에서 구입하였고 기니아피그 보체와 RPMI 1640배지는 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)사 제품을, 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS)는 시그마사 제품을 사용하였다.In order to examine the B-lymphocyte stimulating activity of the herbal extracts obtained in Example 1, the experimental animals were obtained from spleen extraction experiments when female mice (C57BL / 6XC3H) F1 (B6C3F1) were purchased from the Biotechnology Research Institute and weighed 17-22 g. It was used for. Sheep red blood cells (sRBC) were purchased from Korea Medium Company (Seoul), guinea pig complement and RPMI 1640 medium from Gibco BRL (Grand Island, NY, USA), and lipopolysaccharide (LPS) from Sigma Product was used.
임파구의 시험관내 활성화 및 항체생성세포수(AFC) 검정은 다음과 같다. 비장세포를 RPMI 1640배지(10% 소태아혈청함유)에서 배양하여 세포수를 5x106 cells/ml로 조정한 후, 웰당 0.5 ml씩(처리군당 4개씩) 48-웰의 플레이트(Costar사 제품)에 옮긴 후, 시료 또는 LPS (25 ㎍/ml, 시그마)를 첨가한다. 시험관내 자극을 위하여 플레이트를 37C의 Bellco (Bellco Biotech., Vineland, NJ, USA) 스테인레스철 조직배양기에서 흔들어 가면서 배양하였다. In vitro activation and lymphocyte production (AFC) assay of lymphocytes are as follows. Splenocytes were cultured in RPMI 1640 medium (containing 10% fetal bovine serum) to adjust the cell number to 5x10 6 cells / ml, and then 0.5 ml per well (4 per treatment group) 48-well plates (Costar) After transfer to, sample or LPS (25 μg / ml, Sigma) is added. Plates were incubated with shaking in a 37C Bellco (Bellco Biotech., Vineland, NJ, USA) stainless steel tissue incubator for in vitro stimulation.
항체생성은 배양 2일 뒤에 측정하며 TNP(trinitrophenyl)-합텐 처리된 sRBC에 대한 AFC를 Jerne 플라크검정법으로 측정하고 세포수는 헤마시토미터 (hemacytometer)를 사용하였다. 이때 항체생성 세포수를 활성치로 나타내고 비활성은 다음과 같이 나타냈다. 즉, 일반적으로 항체생성능이 강한 대조군으로 사용되는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS) 25㎍/㎖를 대조군으로 처리하였을 때를 기준했다. LPS의 활성이 거의 25 ㎍/㎖농도에서 포화되므로 이 양을 대조군으로 사용하였다.Antibody production was measured 2 days after the culture, AFC for TNP (trinitrophenyl) -hapten treated sRBC was measured by Jerne plaque assay and the number of cells using a hemacytometer. In this case, the antibody-producing cell number was expressed as an activity value, and the specific activity was expressed as follows. That is, it was based on the treatment of 25 μg / ml lipopolysaccharide (LPS), which is generally used as a control with high antibody production, as a control. The amount of LPS was used as a control since the activity of LPS was saturated at nearly 25 μg / ml.
생약재 추출물 2mg를 B-임파구 자극활성을 C57BL/6XC3H 생쥐에서 다클론 항체생성으로 검정한 결과를 표 6에 나타냈다.Table 6 shows the results of assaying B-lymphocyte stimulating activity by polyclonal antibody production in C57BL / 6XC3H mice.
<실시예 6: 생약재 추출물의 항종양활성의 검정>Example 6: Assay of Antitumor Activity of Medicinal Herb Extracts
실시예 1에서 얻은 생약재 추출물의 항암작용을 다음 방법으로 검정하였다. 생후 4주된 ICR계 생쥐에 사르코마(Sarcoma) 180세포를(0.1 ml, 7 x 106 세포) 쥐의 우측서혜부 피하에 이식하였다. 실험표본 물질은 PBS에 적당한 농도로 용해시켜 고압멸균한 뒤 내부복막 가까이에 종양이식한 후, 24시간 이후부터 10일동안 매일 주사(2 mg/100 g)하였다. 모든 쥐들을 5주간 관찰한 후 종양의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해, 쥐를 죽이고 종양을 절제하여 무게를 측정하므로써 다음의 식으로부터 종양의 성장억제비율을 구하였다.The anticancer activity of the herbal extract obtained in Example 1 was assayed by the following method. Sarcoma 180 cells (0.1 ml, 7 × 10 6 cells) were implanted subcutaneously in the right groin of rats at 4 weeks old ICR mice. Experimental samples were dissolved in PBS at an appropriate concentration, autoclaved, and transplanted near the inner peritoneum, followed by daily injection (2 mg / 100 g) for 10 days after 24 hours. After observing all the rats for 5 weeks, the tumor growth inhibition rate was calculated from the following equation by killing the rats, resecting the tumors, and weighing them.
억제율 (%) = 100 (A-B)/AInhibition Rate (%) = 100 (A-B) / A
A는 대조군의 종양무게의 평균값이며 B는 실험군의 종양무게의 평균값이다. 완전한 퇴행은 실험쥐 숫자에 대한 완전한 퇴행을 보이는 쥐 숫자의 비율이다. A is the mean value of the tumor weight of the control group and B is the mean value of the tumor weight of the experimental group. Complete regression is the ratio of rat numbers showing complete regression to the number of mice.
그 결과 생약재 추출물은 사르코마 180 고형종양을 이식한 쥐에서 항종양활성이 2mg/100g 투여로 48.5%으로 매우 높은 억제활성을 나타냈다(표 7).
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<실시예 7: 생약재 추출물의 B-임파구 자극 활성 검정>Example 7: B-lymphocyte stimulation activity assay of herbal extracts
실시예 1에서 얻은 생약재 추출물을 각각의 시료 0.1mg/ml에서 1.0 mg/ml에 대한 면역자극 검정을 한 결과, 대조군인 LPS군의 89% 활성을 나타내었다(표 8).The herbal extract obtained in Example 1 was subjected to an immunostimulatory assay for 1.0 mg / ml in 0.1 mg / ml of each sample, showing 89% activity of the control LPS group (Table 8).
<실시예 8: 생약재 추출물의 탐식세포 자극활성(macrophage-stimulating activity)>Example 8: Macrophage-stimulating activity of herbal extracts
생약재 추출물은 복강 및 구강식이를 위해 PBS에 녹인 뒤 투여하였다. 구강식이를 위해서 강제로 섭취하게 하였으며, PEC 분리와 비장의 탐식세포 활성을 위해 적출하였다.The herbal extracts were administered after dissolving in PBS for abdominal and oral diet. Forced intake for oral diet and extraction for PEC isolation and phagocytic activity of the spleen.
비장의 탐식세포(Splenic macrophage)분리는 조직을 부드럽게 부순 뒤 Tris완충액-염화암모늄 용액으로 조직을 단일 세포화시키고, 세포 추출기(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA)를 통과시켜 수행하였다. 잔존세포는 HBSS를 완벽하게 세척하고, RPMI배지(10 % 가열불활성화 소태아혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 g/ml 스트렙토마이신 함유, RPMI-FCS)로 재희석하였다. 희석된 세포는 플라스틱 용기에, 배양된 탐식세포는 RPMI-FCS-HEPES에 부착시키도록 만들었다.Splenic macrophage separation of the spleen was performed by gently crushing the tissue, then single cellizing the tissue with Tris buffer-ammonium chloride solution and passing through a cell extractor (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA). Remaining cells were thoroughly washed with HBSS and rediluted with RPMI medium (10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100 U / ml penicillin, containing 100 g / ml streptomycin, RPMI-FCS). Diluted cells were made to adhere to plastic containers and cultured phagocytes to RPMI-FCS-HEPES.
PEC는 추출물을 복강 및 구강 섭취후에 5ml의 Hank의 균형용액(HBSS)으로 말초동공으로부터 분리하고, 원심분리하여 세포덩어리를 HBSS로 두 번 세척한 후 HBSS(25mM-HEPES(-2-hydroxyethyl-peperazine-N-2-ethane s㎕fonic acid 함유) 1 ml에 녹였다. 이렇게 얻은 PEC는 F-300 세포측정기(Medical Electronics, Kobe, Japan)를 사용하여 그 수를 측정하였다.PEC extracts from the periphery of the extract with 5 ml Hank's Balance Solution (HBSS) after intraperitoneal and oral intake, and centrifuged to wash the cell mass twice with HBSS, followed by HBSS (25mM-HEPES (-2-hydroxyethyl-peperazine). It was dissolved in 1 ml of -N-2-ethane sulfonic acid) The number of PECs thus obtained was determined using an F-300 cytometer (Medical Electronics, Kobe, Japan).
PEC의 탐식활성의 측정은 형광 마이크로파티클(microparticle)에서 배양하여 측정한다. 즉, PEC(1 x 105)를 원심분리하고 100㎕의 HBSS-HEPES에 재희석 한 뒤, HBSS-HEPES로 100배 희석시킨 플루오레스브라이트 카복실레이트 마이크로스피어즈 (Fluoresbrite carboxylate microspheres, 2.0m; Polyscience, Warrington, PA, USA)를 20㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 배양액에 2ml의 냉PBS(3 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt; EDTA-PBS함유)를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 세포덩어리를 모아 EPICS-프로파일 II 플로우시토미터 (EPICS-Profile II flow-cytometer, Coulter, Hialeah, FL, USA)를 이용하여 탐식활성을 측정하였다.The phagocytic activity of PEC is measured by culturing in fluorescent microparticles. In other words, PEC (1 × 10 5 ) was centrifuged, rediluted in 100 μl of HBSS-HEPES, and then diluted 100-fold with HBSS-HEPES to Fluoresbrite carboxylate microspheres (2.0 m; Polyscience, Warrington, PA, USA) was incubated for 1 hour at 37 ℃ to 20μl. 2 ml of cold PBS (containing 3 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA-PBS)) was added to the culture to stop the reaction, and the cell masses were collected to collect the EPICS-Profile II flow-cytometer, Coulter, Hialeah , FL, USA) was used to measure phagocytic activity.
화학 루미네센스 활성측정은 F-300 마이크로셀(microcell) 측정기를 사용하여 PEC와 비장의 탐식세포 밀도가 4 x 105/ml이 되도록 트리판 블루(Trypan Blue) 염색으로 세포수를 세고 RPMI-FCS-HEPES로 조정한 뒤, 500㎕의 세포용액을 20㎕의 0.2% 루미놀(luminol, 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazine-dione, Sigma, Co., USA)이 함유된 폴리스티렌 큐벳에 옮긴다. 각각의 큐벳을 부드럽게 섞은 뒤 15분 후에 루미노미터(luminometer, Multi-biolumat LB9505; Berthold, Wildbad, Germany)를 사용하여 측정하였다. 활성은 15분동안의 총활성으로 나타냈다.For chemical luminescence activity measurement, the cells were counted by trypan blue staining using the F-300 microcell measuring instrument so that the phagocytic density of PEC and spleen was 4 x 10 5 / ml and RPMI- After adjusting with FCS-HEPES, 500 μl of cell solution contained 20 μl of 0.2% luminol (luminol, 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazine-dione, Sigma, Co., USA) Transfer to polystyrene cuvettes. After 15 minutes of mixing each cuvette gently, it was measured using a luminometer (luminometer, Multi-biolumat LB9505; Berthold, Wildbad, Germany). Activity was expressed as total activity for 15 minutes.
비장의 탐식세포 활성에 대한 효과를 측정하기 위하여, 실시예 1의 생약재 추출물을 10마리의 생쥐복강내에 투여하여 이 중 3마리에서 비장의 탐식세포를 투여후 3, 6, 18일째에 분리하여 일시적인 화학 루미네센스를 측정하였다(표 9). 추출물 투여 생쥐에서의 화학 루미네센스가 대조군보다 증가하였다.In order to measure the effect on the phagocytic activity of the spleen, the herbal extract of Example 1 was administered intraperitoneally in 10 mice, in which three of the spleen phagocytic cells were isolated at 3, 6 and 18 days after administration. Chemical luminescence was measured (Table 9). The chemical luminescence in the mice receiving the extract was higher than that of the control group.
생쥐당 5mg씩 생약재 추출물을 투여한 생쥐의 PEC가 가장 높은 화학 루미네센스를 나타내었다. 이들 생쥐에서 비장의 탐식세포의 생성은 투여량 의존적임이 확인되었다. 추출물의 B세포자극활성을 다클론 항체생성 세포를 C57BL/6XC3H 생쥐에서 측정한 결과 5 mg 투여에서 가장 높았으며(표 10), B-세포자극활성을 나타내었다.PEC showed the highest chemical luminescence of the mice administered with the herbal extracts at 5 mg per mouse. The production of phagocytic phagocytes in these mice was found to be dose dependent. The B cell stimulatory activity of the extract was measured in polyclonal antibody-producing cells in C57BL / 6XC3H mice, which was the highest at 5 mg administration (Table 10) and showed B-cell stimulatory activity.
<실시예 9: 생약재 추출물의 독성 및 혈중누출효소에 대한 영향>Example 9 Effects of Herbal Extracts on Toxicity and Blood Leak Enzymes
상기 생약재 추출물을 임상적으로 사용하려면 독성이 없어야 하므로, 독성검사와 간세포계 효소에 미치는 영향을 검토하였다. 무처리군의 정상랫트 (1군 5마리)에 대한 추출물의 복강 내 투여시 치사량을 구하고자 하였으나, 5일 동안 950mg/kg이하 투여시 사망을 일으키지 않았다. 또한 950 mg/kg을 복강 내 투여시, 24시간 후의 S-GOT, S-GPT, S-Alp에 어떠한 영향도 미치지 않았다(표 11).Clinical use of the herbal extracts should not be toxic, so we examined the effects on toxicity and hepatocellular enzymes. Intraperitoneal administration of the extracts to normal rats (
이상과 같이, 본 발명의 생약재 추출물은 항종양활성, 간염억제활성, 면역증강활성 및 당뇨병치료효과를 가지며, 이에 따라 항종양제, 간기능관련치료제, 면역활성화제용 치료제 및 당뇨병 치료제로 사용될 수 있다.As described above, the herbal extract of the present invention has antitumor activity, hepatitis inhibitory activity, immunopotentiation activity and diabetes treatment effect, and thus can be used as antitumor agent, therapeutic agent for liver function, therapeutic agent for immunoactivator and diabetes treatment agent. .
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