KR100523835B1 - Diagnosis of Female Sterility Using Protein PrxII As Diagnostic Marker - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자성 포유동물의 불임, 특히 조기폐경에 의한 자성 포유동물의 불임의 진단 마커로 사용하기 위한 PrxII 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 PrxII 단백질에 대한 항체를 포함함을 특징으로 하는 자성 포유동물의 불임, 특히 조기폐경에 의한 자성 포유동물의 불임 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 (a) 자성 포유동물로부터 혈청을 분리하여 채취하고, (b) 채취된 혈청 시료에서 PrxII 단백질을 검정하며, (c) 검정 결과 PrxII 단백질이 검출된 경우 조기폐경에 의한 불임으로 판정하는 반면 PrxII 단백질이 검출되지 않은 경우에는 정상 또는 다른 원인에 의한 불임으로 판정함을 특징으로 하는 자성 포유동물의 불임 진단 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 자성 포유동물의 불임의 진단 마커로서 사용되는 PrxII 단백질을 포유동물의 조직으로부터 추출하고 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a PrxII protein for use as a diagnostic marker for infertility of female mammals, in particular for fertility of female mammals due to early menopause. The present invention also relates to compositions and kits for diagnosing infertility of female mammals, in particular, infertility of female mammals due to early menopause, characterized by comprising an antibody against the PrxII protein. In addition, the present invention is (a) separating and collecting serum from the magnetic mammal, (b) assaying the PrxII protein in the collected serum samples, (c) when the PrxII protein is detected as a result of infertility due to early menopause On the other hand, when the PrxII protein is not detected, the present invention relates to a method for diagnosing infertility of a female mammal characterized by determining infertility due to normal or other causes. The present invention also relates to a method for extracting and preparing PrxII protein from mammalian tissue, which is used as a diagnostic marker for infertility of a female mammal.
Description
본 발명은 자성 포유동물의 불임 진단에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 진단 마커로서 PrxII 단백질을 사용하여 자성 포유동물, 특히 사람 여성의 불임, 특히 조기폐경(Premature Ovarian Failure, POF)에 의한 자성 포유동물의 불임을 진단하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to the diagnosis of infertility in female mammals. More specifically, the present invention relates to a method of diagnosing infertility of a female mammal, in particular a human female, by infertility, in particular of premature Ovarian Failure (POF), using the PrxII protein as a diagnostic marker.
사람 및 기타 모든 동물은 다양한 원인에 의해 불임증을 앓고 있다. 사람에 있어서 피임을 하지 않고서 정상적인 부부생활을 함에도 불구하고 임신이 되지 않는 경우를 통칭하여 불임이라 하고 있다. 정상인 경우 1년 이내에 80-90%가 임신을 한다. 또한, 2년 후에 임신이 되지 않는 경우는 5% 정도이다. 이중에서도 과거에 한번도 임신을 해본 적이 없는 경우를 원발성 불임증, 자궁외 임신과 같은 임신의 경험이 있는 경우를 속발성 불임증이라 분류한다. 불임의 원인을 규명할 경우 임신 성공율은 64%까지 높아 질 수 있다.Humans and all other animals suffer from infertility for a variety of causes. In the case of a person who does not become pregnant despite living a normal marital life without contraception, it is commonly called infertility. In normal cases, 80% to 90% of women become pregnant within a year. In addition, about 2% of women do not become pregnant after 2 years. Among them, a case where a person has never conceived in the past is classified as a secondary infertility if there is a pregnancy experience such as primary infertility and ectopic pregnancy. Finding the cause of infertility can increase the success rate of pregnancy by 64%.
가임 부부의 약 7.9%가 이런 불임문제와 관련이 있고, 빈도를 보면 35세-44세 여성이 30-34세의 여성에 비해 불임일 확률이 2배가된다. 일반적으로 나이가 많아질수록 수태율이 떨어진다. 통계에 의하면 30-34세에서는 일곱 부부중 하나가 불임이고 35-39세 사이에서는 다섯 부부중 하나, 40-44세에서는 네 부부중 하나가 불임이 된다. 즉, 30대 중반이나 후반까지 임신을 연기했던 많은 여성들이 불임문제를 갖게될 수 있다. 최근에 점차적으로 불임부부가 증가하는 것으로 생각되는데 이러한 증가는 베이비붐 세대의 여성이 가임 연령에서 점차 나이가 들어가면서 생기는 것으로 볼 수 있고 이 연령층이 결혼과 출산을 늦추는 것에 기인한 것으로 분석된다. About 7.9% of childbearing couples are related to this infertility problem, and the frequency of women is 35-44 years, and the probability of infertility is doubled. In general, the older the age, the lower the conception rate. Statistics show that one in seven couples is infertile at age 30-34, one in five at age 35-39, and one in four at age 40-44. In other words, many women who postponed pregnancy until their mid-30s or late 30s may have infertility problems. Recently, infertile couples are thought to increase gradually. This increase may be attributed to the aging of the baby boomers as they get older, and that this age group is delaying marriage and childbirth.
여성불임의 원인으로는 여러 가지가 있다. 첫째, 난관요인은 일차불임 중 가장 큰 원인으로 난관의 통과장애 때문에 임신하지 못하는 사례는 전체 불임의 절반정도를 차지한다고 한다. 원인은 대개가 난관염인데 대장균이나 클라미디아균에 의한 감염이다. 둘째, 배란요인으로서 배란을 포함하는 여성의 생리현상은 뇌속의 간뇌시상하부, 뇌하수체 그리고 난소가 하나의 경로로 연결된 내분비 기능에 의해 조절된다. 따라서, 이러한 내분비기관에서 이상이 생긴다면 정상적인 배란현상은 일어나지 않는다. 난소이상은 선천적으로 발육이 나쁜 경우도 있지만 대개가 후천적인 이상이며, 특히 난소낭종인 경우가 많다. 자궁내막증은 최근 많이 발생하여 주목을 받고 있는 병인데 자궁내막증에 걸려 난소주위에 유작이 일어나면 배란이 되지 않을 수도 있다. 또 난소내에 초코렛 낭포를 만들 수도 있는데 이 가운데 어느 하나의 기능이라도 잘 작동되지 않으면 무월경이 되거나 월경이 있어도 배란이 되지 않는다. 그리고 부신이나 갑상선기능에 이상이 있으면 호르몬의 균형이 무너지기 쉽다. 또한, 과도한 스트레스로 인한 심인성 원인도 있다. 최근에는 무리한 다이어트와 비만으로 인한 배란이상도 많아지고 있다. 여성 불임 원인의 그 셋째는 자궁요인으로서 황체의 이상이 있게 되어 자궁내막이 잘 자라지 못하는 것이다. 황체기 결함에 의한 불임은 3-4%로 초기 유산의 35%는 황체기능 부전때문인 것으로 생각되며 이것은 임신이 되어도 난자가 잘 자라지 못하기 때문이라고도 한다. 그러나, 황체호르몬이 충분히 분비되어도 내막의 조직대사가 떨어져 있으면 호르몬의 활동이 나빠질 수도 있다. 또 다른 큰 이유는 자궁내 유착 또는 자궁 근종으로 인해 자궁 내부에 요철이 생기는 경우를 들 수 있다. 네 번째 요인은 자궁경관요인을 들 수 있다. 이는 전체 불임환자의 1%정도를 차지한다. 자궁경관에 자궁경부 점액이 있어 정자가 헤엄치고 자궁쪽으로 가야 하는데 이 점액이 적어서 정자가 헤엄쳐서 지나가지 못하는 경우와 자궁점액내에 항정자 항체(anti-sperm antibody)가 존재하여 처음에 들어간 정자가 항원이 되어 여성의 점액 속에서 항체가 형성되어 나중에 들어온 정자가 자궁으로 들어가지 못하는 경우가 있다. 다섯째, 자궁, 난관, 난소와 장 등이 유착되어 불임증을 유발하는 경우이다. 이 경우는 자궁내막증에 의한 경우가 많다. 여섯째, 면역학적 요인으로서 남편의 정액이 정상이고, 여성 또한 정상임에도 불구하고 정액 또는 정자가 항원으로 작용하여 여성의 몸속에서 항체를 생성하는 경우이다.There are many reasons for female infertility. First, fallopian factor is the biggest cause of primary infertility, and it is said that about half of all infertility cases fail to conceive because of impairment of the fallopian tube. The cause is usually tubal infections caused by E. coli or chlamydia. Second, the physiological phenomena of ovulatory women, including ovulation, are regulated by endocrine function in which the hepatic hypothalamus, pituitary gland and ovary are connected in one path. Therefore, if abnormalities occur in these endocrine organs, normal ovulation does not occur. Ovarian abnormality may be congenitally poor, but usually acquired, especially ovarian cysts. Endometriosis is a disease that has attracted a lot of attention recently. If uterine endometriosis is caused by a late operation around the ovary, ovulation may not be possible. You can also make chocolate cysts in the ovary. If either of these functions does not work well, you will not be amenorrhea or ovulation even if you have menstruation. And if the adrenal gland or thyroid function is abnormal, the hormone balance is likely to collapse. There are also psychogenic causes of excessive stress. In recent years, too many ovulation due to excessive diet and obesity. The third cause of female infertility is that the uterus causes the abnormality of the corpus luteum. Infertility due to luteal phase defects is 3-4% and 35% of early abortions are thought to be due to luteal insufficiency. However, even when the progesterone is secreted enough, the tissue metabolism of the lining is off, hormone activity may worsen. Another major reason is the occurrence of irregularities inside the uterus due to intrauterine adhesions or uterine fibroids. The fourth factor is cervical factor. This accounts for about 1% of all infertility patients. If there is cervical mucus in the cervix, the sperm swims and must go toward the uterus.The sperm swims due to the small amount of mucus, and the anti-sperm antibody is present in the uterine mucus. As a result, antibodies are formed in the mucus of women, and sperm may not enter the uterus later. Fifth, the uterus, fallopian tubes, ovaries and intestines are adhered to infertility. This case is often due to endometriosis. Sixth, although the semen of a husband is normal as an immunological factor and a woman is also normal, semen or sperm act as an antigen to produce antibodies in a woman's body.
상기 불임의 원인은 자궁내막검사, 월경혈 배양검사, 난관통기, 자궁난관조영검사를 하여 여성불임의 원인을 높은 비율로 밝혀낼 수 있다. 그러나, 불임증의 원인가운데 60-70%는 이러한 검사를 통해 밝혀지지만 현대 의학의 수준으로는 아무리 상세하게 검사해도 약 20%는 원인을 알아낼 수 없는 불임이 있다.The cause of infertility can be found in a high rate of female infertility by performing an endometrial test, menstrual blood culture test, tubal aeration, uterine tubal angiography. However, 60-70% of the causes of infertility are identified through these tests, but at the level of modern medicine, about 20% of them have infertility that cannot be identified.
최근 들어, 조기폐경, 즉 조기난소부전에 의한 불임의 발생빈도가 높아지고 있는데, 40세 이전 가임기의 여성 중 동서를 막론하고 약 1%에 이르고 있다. 조기폐경은 40세 이전에 폐경이 되는 것으로 에스트로젠(estrogen) 수치가 낮아지고 난포 자극 호르몬(Follicle Stimulating Hormone, FSH)과 같은 생식호르몬의 생성이 줄어드는 것에 기인한다. 통계에 따르면 조기폐경은 40세 이전에 약 100명당 1명, 30세 이전의 경우 1000명당 1명 꼴로 나타나는 것으로 알려져 있고 산업화, 환경호르몬에의 노출 등으로 지속적인 증가 추세에 있다.Recently, the incidence of infertility due to premature menopause, or early ovarian failure, is increasing, reaching about 1% of women of childbearing age before age 40, both east and west. Early menopause occurs before age 40, due to lower levels of estrogen and reduced production of reproductive hormones such as Follicle Stimulating Hormone (FSH). According to statistics, premature menopause is known to be about 1 in 100 people before 40 years old, 1 in 1000 people before 30 years old, and is continuously increasing due to industrialization and exposure to environmental hormones.
오크랜드 대학(University of Auckland) 연구팀은 조기폐경을 경험한 여성의 병력과 DNA를 분석한 결과 분석대상 여성 중 7%에서 인히빈 알파 유전자(inhibin alpha gene)의 돌연변이가 발견되었음을 공개하고(Andrew N. Shelling, et al., Human Reproduction vol. 15 no. 12 pp. 2644-2649, 2000) 이러한 인히빈 알파 유전자의 돌연변이를 진단 마커로 사용하여 여성의 조기폐경을 진단하는 방법을 특허 출원중에 있다(WO 00/50638). 이러한 비율은 정상여성의 10배에 해당하는 빈도이다. 조기폐경의 원인에 있어서 젊은 여성의 경우 인히빈 알파 유전자가 조기폐경에 어느 정도 원인을 제공하지만 나이든 여성에 있어서는 미묘한 유전자 기능변화가 결정적인 원인을 제공하는 것으로 보인다고 한다. 조기폐경과 난소암(ovarian cancer)과의 상관관계도 최근 들어 대두되고 있으나, 환경적 요인과 유전적 요인이 복합적으로 작용할 것으로 제시되고 있는 상태로 병인(etiology)을 판정할 수 있는 마커(marker)는 아직 개발되어 있지 않은 상태이다.The University of Auckland researchers have analyzed the history and DNA of women who have had early menopause and found that 7% of the women analyzed found inhibin alpha gene mutations (Andrew N. Shelling, et al., Human Reproduction vol. 15 no. 12 pp. 2644-2649, 2000) A patent pending method for diagnosing early menopause in women using a mutation of this inhibin alpha gene as a diagnostic marker (WO) 00/50638). This ratio is 10 times the frequency of normal women. In young men, the cause of premenopausal genes contributes to early menopause, but in older women, subtle changes in gene function appear to be the decisive factor. The relationship between early menopause and ovarian cancer has also been emerging recently, but it is suggested that a combination of environmental and genetic factors can be used to determine etiology. Is not yet developed.
사람이외의 기타 동물에 있어서 불임증은 개개 동물마다 약간의 차이는 있으나 주요 원인으로서 지연교배, 영양결핍, 선천성 생식기 이상(유전성 불임증), 각종 질병 감염(요네병, 우결핵, 트리고모나스, IRB 등), 자궁내 질환(태아지침, 내막염, 경관염, 질염, 만성자궁염, 수란관염, 자궁축농, 태아 미이라변성, 난소낭종), 난소의 발육부진, 난포형성 부지 등을 예로 들 수 있다. 인류의 경제적 발전과 함께 애완견(예, 소형견, 중형견, 대형견, 특수견 종), 고양이(예, 페르시안, 아비니시안, 러시안블루, 아메리칸 숏헤어), 대동물/특수동물(예, 호랑이, 사자, 표범, 기린, 낙타, 사슴, 타조, 학, 독수리, 칠면조, 공작), 특수애완동물(예, 토끼, 햄스터, 이구아나, 거북, 기니아피그, 앵무새)물과 같은 많은 동물을 번식시키고자 하는데 많은 관심이 고조되고 있으며, 이러한 관심과 함께 각종 동물의 불임증을 진단하고 치료하는데에도 점증적으로 많은 연구와 노력을 기울이고 있다. In animals other than humans, infertility varies slightly from animal to animal, but the main causes include delayed mating, malnutrition, congenital genital abnormalities (genetic infertility), and various disease infections (Yone's disease, tuberculosis, trigomonas, IRB, etc.) , Intrauterine diseases (fetal guidelines, endocarditis, cervicitis, vaginitis, chronic uterus, oviductitis, uterine husbandry, fetal mummy degeneration, ovarian cysts), ovarian growth, follicular site, and the like. With the economic development of humanity, pet dogs (e.g. small dogs, medium-sized dogs, large dogs, special dog species), cats (e.g. Persian, Abinician, Russian Blue, American Shorthair), large animals / special animals (e.g. tigers, lions, leopards, Interested in breeding many animals such as giraffes, camels, deer, ostriches, cranes, eagles, turkeys, peacocks, and special pets (e.g. rabbits, hamsters, iguanas, turtles, guinea pigs, parrots). With such interests, a great deal of research and efforts are being made to diagnose and treat infertility of various animals.
이러한 추세에 맞추어 사람은 물론 기타 동물의 불임증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다. In line with this trend, there is an urgent need to develop a method for quickly and accurately diagnosing infertility of humans and other animals.
본 발명자들은 정상인과 조기폐경 환자의 혈청 프로테옴 이차원 전기영동 양상을 연구하던 중 정상인과 조기폐경 환자사이에 혈청에 존재하는 PrxII 단백질의 수준이 현저한 차이가 있음을 발견하였다. 이러한 발견을 기초로 하여 본 발명자들은 PrxII 단백질을 분리 정제하고 이 단백질에 대한 항체를 개발함으로써 PrxII 단백질을 진단 마커로 하여 여성불임, 특히 조기폐경에 의한 여성불임을 신속하고 정확하게 결정할 수 있는 새로운 진단방법을 완성하게 되었다.The inventors of the present invention, while studying the serum proteome two-dimensional electrophoresis pattern of normal and early menopause patients found that there is a significant difference in the level of PrxII protein present in serum between normal and early menopausal patients. Based on these findings, the present inventors have isolated and purified the PrxII protein and developed an antibody against the protein. As a diagnostic marker, the present inventors can quickly and accurately determine female infertility, especially female infertility due to early menopause. To complete.
한 가지 관점으로서, 본 발명은 여성불임의 진단 마커로 사용하기 위한 PrxII 단백질을 제공한다. 보다 특정적으로는, 본 발명은 조기폐경에 의한 여성불임의 진단 마커로 사용하기 위한 PrxII 단백질을 제공한다.In one aspect, the present invention provides a PrxII protein for use as a diagnostic marker of female infertility. More specifically, the present invention provides a PrxII protein for use as a diagnostic marker for female infertility due to early menopause.
다른 관점으로서, 본 발명은 PrxII 단백질에 대한 항체를 포함함을 특징으로 하는 여성불임 진단용 조성물을 제공한다. 보다 특정적으로는, 본 발명은 PrxII 단백질에 대한 항체를 포함함을 특징으로 하는 조기폐경에 의한 여성불임 진단용 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a composition for diagnosing infertility, characterized in that it comprises an antibody against the PrxII protein. More specifically, the present invention provides a composition for diagnosing female infertility due to early menopause, comprising an antibody against PrxII protein.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 PrxII 단백질에 대한 항체를 포함함을 특징으로 하는 여성불임 진단 키트를 제공한다. 보다 특정적으로는, 본 발명은 PrxII 단백질에 대한 항체를 포함함을 특징으로 하는 조기폐경에 의한 여성불임 진단 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a female infertility diagnostic kit, characterized in that it comprises an antibody against PrxII protein. More specifically, the present invention provides a kit for diagnosing infertility by early menopause, characterized in that it comprises an antibody against the PrxII protein.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 여성으로부터 혈청을 분리하여 채취하고, (b) 채취된 혈청 시료에서 PrxII 단백질을 검정하며, (c) 검정 결과 PrxII 단백질이 검출된 경우 조기폐경에 의한 불임환자로 판정하는 반면 PrxII 단백질이 검출되지 않은 경우에는 정상인 또는 다른 원인에 의한 불임환자로 판정함을 특징으로 하는 여성불임 진단 방법을 제공한다. 보다 특정적으로, 본 발명은 (a) 여성으로부터 혈청을 분리하여 채취하고, (b) 채취된 혈청 시료에서 PrxII 단백질을 검정하며, (c) 검정 결과 PrxII 단백질이 검출된 경우 조기폐경에 의한 불임환자로 판정함을 특징으로 하는, 조기폐경에 의한 여성불임 진단 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for (a) separating and collecting serum from a woman, (b) assaying the PrxII protein in the collected serum sample, and (c) infertility due to premature menopause when the PrxII protein is detected as a result of the assay. The present invention provides a method for diagnosing infertility of a female, characterized in that if a PrxII protein is not detected while the patient is judged to be a patient, a normal person or an infertile patient of another cause is determined. More specifically, the present invention relates to (a) separation of serum from females, (b) assaying PrxII protein in the collected serum samples, and (c) infertility due to premature menopause when PrxII protein is detected as a result of the assay. Provided is a method for diagnosing female infertility due to early menopause, characterized by judging by a patient.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 포유동물 조직을 균질화하여 균질액을 생성하고, (b) 생성된 균질액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, (c) 분리된 상층액을 DEAE-sephacel 컬럼에서 크로마그래피하고, (d) 단계 (c)에서 얻은 분획을 페닐-5PW 컬럼에서 크로마토그래피하고, (e) 단계 (d)에서 얻은 분획을 헤파린-5PW 컬럼에서 크로마토그래피하고, 임의로 (f) 단계 (e) 단계에서 얻은 분획을 Superdex 200 컬럼에서 크로마토그래피하여 PrxII 단백질을 정제함을 특징으로 하여, PrxII 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for producing a homogenate by (a) homogenizing mammalian tissue, (b) separating the supernatant by centrifuging the resulting homogenate, and (c) separating the supernatant from DEAE-. chromatography on a sephacel column, (d) chromatography the fractions obtained in step (c) on a phenyl-5PW column, (e) the fractions obtained in step (d) on a heparin-5PW column, optionally (f ) Purifying the PrxII protein by chromatography of the fraction obtained in step (e) in a Superdex 200 column, to provide a method for producing a PrxII protein.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 포유동물 조직을 균질화하여 균질액을 생성하고, (b) 생성된 균질액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, (c) 단계 (b)에서 얻은 상층액을 페닐-5PW 컬럼에서 크로마토그래피하고, (e) 단계 (d)에서 얻은 분획을 헤파린-5PW 컬럼에서 크로마토그래피하고, (f) 단계 (e)에서 얻은 분획을 MONO Q 컬럼에서 크로마토그래피하고, 임의로 (g) 단계 (e) 단계에서 얻은 분획을 Superdex 200 컬럼에서 크로마토그래피하여 PrxII 단백질을 정제함을 특징으로 하여, PrxII 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.In another aspect, the invention provides a homogenate by (a) homogenizing mammalian tissue, (b) separating the supernatant by centrifuging the resulting homogenate, and (c) the supernatant obtained in step (b) The liquid is chromatographed on a phenyl-5PW column, (e) the fractions obtained in step (d) are chromatographed on a heparin-5PW column, (f) the fractions obtained in step (e) are chromatographed on a MONO Q column, And optionally (g) purifying the PrxII protein by chromatography on the Superdex 200 column of the fraction obtained in step (e).
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 포유동물 조직을 균질화하여 균질액을 생성하고, (b) 생성된 균질액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, (c) 분리된 상층액을 DEAE-sephacel 컬럼에서 크로마그래피하고, (d) 단계 (c)에서 얻은 분획을 페닐-5PW 컬럼에서 크로마토그래피하고, (e) 단계 (d)에서 얻은 분획을 헤파린-5PW 컬럼에서 크로마토그래피하고, (f) 단계 (e)에서 얻은 분획을 MONO Q 컬럼에서 크로마토그래피하고, 임의로 (g) 단계 (f) 단계에서 얻은 분획을 Superdex 200 컬럼에서 크로마토그래피하여 PrxII 단백질을 정제함을 특징으로 하여, PrxII 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for producing a homogenate by (a) homogenizing mammalian tissue, (b) separating the supernatant by centrifuging the resulting homogenate, and (c) separating the supernatant from DEAE-. chromatography on a sephacel column, (d) chromatography the fractions obtained in step (c) on a phenyl-5PW column, (e) chromatography the fractions obtained in step (d) on a heparin-5PW column, and (f) The fraction obtained in step (e) is chromatographed on a MONO Q column, and optionally (g) the fraction obtained in step (f) is chromatographed on a Superdex 200 column to purify the PrxII protein, thereby preparing the PrxII protein. Provide a way to.
퍼옥시레독신(Peroxiredoxin, Prx)은 활성자리에 잘 보존된 시스테인 잔기를 이용하여 퍼옥시다제(Peroxidase) 활성을 보이는 커다란 단백질 군(family)으로 시원세포에서 사람에 이르기까지 거의 모든 생명체에 잘 보존되어 있다(Chae, HZ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 7017-7021). Prx 단백질들은 아주 낮은 농도의 H2O2도 제거하는 활성을 보이며 따라서 세포내외에서 항산화효소로서, 또한 2차 신호전달 물질의 농도를 조절하는 신호전달 조절인자로서 중요한 기능을 수행한다. 포유동물에는 6종의 Prx 동위효소가 알려져 있다. PrxI부터 PrxIV까지는 티오레독신(Thioredoxin, Trx)의 환원력을 사용하여 과산화물을 환원시키는 티오레독신 퍼옥시다제(Thioredoxin peroxidase, TPx)이며 신호전달서열(signaling sequence)들을 제외하면 서로 상동성(homology)이 매우 높다. 그 중에서 PrxII는 TSA, NKEFB, 칼프로모틴(calpromotin) 이라는 명칭으로 포유동물의 뇌, 적혈구 및 K-562 적백혈병(erythroleukemia) 세포에서 알려져 있다. 흥미로운 것은 적혈구에 존재하는 PrxII가 항산화 효소로의 역할 뿐 아니라 세포분화나 이온수송 등의 특별한 기능을 담당할 가능성도 있다. 하지만 퍼옥시다제 기능(Kang SW, et al., The Journal of Biology Chemistry, Vol. 273, No. 11, pp. 6297-6302, March 13, 1998; and Chae HZ, et al., Diabetes Res Clin Pract 1999 Sep; 45(2-3): 101-102) 및 마우스의 PrxII 유전자의 DNA 서열(Lim MJ, et al., Gene 1998 Aug 17; 216(1): 197-205)만이 자세히 밝혀졌을 뿐 다른 생리적 기능에 대해서는 명확하게 밝혀지지 않았다.Peroxiredoxin (Prx) is a large family of proteins that exhibits peroxidase activity using well-conserved cysteine residues in active sites and is well conserved in almost all organisms, from primitive cells to humans. (Chae, HZ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 7017-7021). Prx proteins also have the ability to remove very low concentrations of H 2 O 2 , and thus play an important role as antioxidants in cells and as a signaling regulator that regulates the concentration of secondary signaling substances. Six Prx isoenzymes are known in mammals. PrxI to PrxIV are thioredoxin peroxidases (TPx) that reduce peroxides using the reducing power of thioredoxin (Trx) and are homologous to each other except for signaling sequences. This is very high. Among them, PrxII is known in mammalian brain, erythrocytes and K-562 erythroleukemia cells under the names TSA, NKEFB, calpromotin. Interestingly, PrxII, which is present in erythrocytes, may play a role not only as an antioxidant enzyme, but also for special functions such as cell differentiation and ion transport. However, peroxidase function (Kang SW, et al., The Journal of Biology Chemistry, Vol. 273, No. 11, pp. 6297-6302, March 13, 1998; and Chae HZ, et al., Diabetes Res Clin Pract 1999 Sep; 45 (2-3): 101-102) and only the DNA sequence of the PrxII gene in mice (Lim MJ, et al., Gene 1998 Aug 17; 216 (1): 197-205), Physiological function is not clear.
본 발명에 따르면 조기폐경환자의 혈청에서 특이적으로 고수준의 PrxII 단백질이 현저한 차이를 보이는 것으로 밝혀졌다. 즉, 조기폐경환자의 혈청에서 나타난 PrxII 단백질의 발현은 66.7%의 양성반응을 나타내는 반면, 정상인에서 PrxII 단백질 발현은 100% 음성반응을 나타낸다. 그리고, 또 다른 불임의 원인으로 알려진 자궁내막증(endometriosis) 환자에서 PrxII 단백질의 발현은 100% 음성반응을 나타낸다. 그러나, 다낭성난소증후군(polycystic ovarian syndrome) 환자에서 PrxII 단백질의 발현은 50% 양성반응을 나타낸다. According to the present invention, it was found that the high level of PrxII protein showed a significant difference in the serum of early menopausal patients. That is, the expression of PrxII protein in serum of early menopause patients was 66.7% positive, whereas the expression of PrxII protein in normal subjects was 100% negative. In addition, the expression of PrxII protein is 100% negative in endometriosis patients known to be another cause of infertility. However, the expression of PrxII protein in patients with polycystic ovarian syndrome is 50% positive.
상기한 바와 같은 사람혈청 시료로부터 나타나는 PrxII 단백질 발현의 현저한 차이는 본 발명에 따라 여성불임의 원인을 진단하는데 응용될 수 있으며 그럼으로써 여성불임을 효율적으로 치료하는데 유용될 수 있다. Significant differences in PrxII protein expression from human serum samples as described above may be applied in diagnosing the cause of female infertility according to the present invention and thereby may be useful for the efficient treatment of female infertility.
본 발명은 PrxII가 조기폐경에 의한 불임의 경우 그 발현이 증가하는 것에 기초하여 조기폐경에 의한 불임을 진단하기 위한 조성물, 진단 킷트 및 이를 이용한 진단방법을 제공한다. 본 발명의 진단 방법은 사람 또는 동물의 시료, 바람직하게는 사람 또는 동물의 혈액으로부터 분리한 혈청을 분리하여 혈청 내의 PrxII의 양 내지 활성을 측정하는 것을 특징으로 한다. 한 양태로서 본 발명의 진단방법은 (a) 여성으로부터 혈청을 분리하여 채취하고, (b) 채취된 혈청 시료에서 PrxII 단백질을 검정하며, (c) 검정 결과 PrxII 단백질이 검출된 경우 조기폐경에 의한 불임환자로 판정하는 반면 PrxII 단백질이 검출되지 않은 경우에는 정상인 또는 다른 원인에 의한 불임환자로 판정함을 특징으로 하여 여성의 불임을 진단하는 방법을 제공한다. 보다 특정적으로, 본 발명은 (a) 여성으로부터 혈청을 분리하여 채취하고, (b) 채취된 혈청 시료에서 PrxII 단백질을 검정하며, (c) 검정 결과 PrxII 단백질이 검출된 경우 조기폐경에 의한 불임 환자로 판정함을 특징으로 한다.The present invention provides a composition, a diagnostic kit, and a diagnostic method using the same for diagnosing infertility caused by early menopause based on the increased expression of PrxII in the case of infertility caused by early menopause. The diagnostic method of the present invention is characterized by separating serum from human or animal samples, preferably human or animal blood, and measuring the amount to activity of PrxII in the serum. In one embodiment, the diagnostic method of the present invention comprises (a) separating and collecting serum from a woman, (b) assaying the PrxII protein from the collected serum sample, and (c) detecting the PrxII protein by early menopause. When the infertility patient is determined while the PrxII protein is not detected, it is determined that the infertility patient by a normal person or another cause is characterized by a method for diagnosing infertility in women. More specifically, the present invention relates to (a) separation of serum from females, (b) assaying PrxII protein in the collected serum samples, and (c) infertility due to premature menopause when PrxII protein is detected as a result of the assay. Characterized in that it is determined as a patient.
다른 양태로서, 본 발명의 진단방법은 (a) 자성 동물로부터 혈청을 분리하여 채취하고, (b) 채취된 혈청 시료에서 PrxII 단백질을 검정하며, (c) 검정 결과 PrxII 단백질이 검출된 경우 조기폐경에 의한 불임으로 판정하는 반면 PrxII 단백질이 검출되지 않은 경우에는 정상 또는 다른 원인에 의한 불임으로 판정함을 특징으로 하여 자성 동물의 불임을 진단하는 방법을 제공한다. 보다 특정적으로, 본 발명은 (a) 자성 동물로부터 혈청을 분리하여 채취하고, (b) 채취된 혈청 시료에서 PrxII 단백질을 검정하며, (c) 검정 결과 PrxII 단백질이 검출된 경우 조기폐경에 의한 불임으로 판정함을 특징으로 한다. In another embodiment, the diagnostic method of the present invention comprises (a) separating and collecting serum from a magnetic animal, (b) assaying the PrxII protein from the collected serum sample, and (c) premenopausal when the PrxII protein is detected as a result of the assay. When the PrxII protein is not detected while the infertility is determined by infertility, the infertility is determined by infertility due to normal or other causes. More specifically, the present invention relates to (a) separating and collecting serum from a magnetic animal, (b) assaying the PrxII protein in the collected serum sample, and (c) detecting the PrxII protein as a result of premature menopause. It is characterized by the determination of infertility.
본 발명의 불임 진단용 조성물은 PrxII에 대한 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 조성물에는 항체를 이용하여 각종의 면역화학적 반응을 수행하기에 적합한 물질들, 예를 들어, 항체의 보존제, 완충액 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 진단용 키트는 시료 내의 PrxII의 존재를 측정하기 위한 것이면 어떤 것이든 제한 없이 사용될 수 있다. 즉, 단용 키트 내지 혈청 시료에 존재하는 PrxII 단백질의 검출은 당업계에 공지된 통상의 기술 내지 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로는 PrxII에 대한 항체를 이용한 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블로팅 방법(Western Blotting) 등을 예로 들 수 있다. 또한, 96-웰 내부에 다수의 항체를 고정화하여 한꺼번에 많은 수의 시료를 분석하는 ELISA 변형법이 이용될 수 있다. Infertility diagnostic composition of the present invention is characterized in that it comprises an antibody against PrxII. The composition may include substances suitable for carrying out various immunochemical reactions using the antibody, for example, preservatives, buffers, and the like of the antibody. The diagnostic kit of the present invention can be used without limitation as long as it is for measuring the presence of PrxII in a sample. That is, the detection of PrxII protein present in the single-use kit or serum sample may use conventional techniques or methods known in the art. Examples of such methods include radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), and Western blotting using antibodies against PrxII. In addition, ELISA modifications can be used in which a large number of samples are analyzed by immobilizing a plurality of antibodies in a 96-well.
본 발명에 있어서, 혈청 시료중의 PrxII 단백질을 검출하기 위한 다른 양태로서는 면역크로마토그라피 방법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)를 사용하는 것이다. 측방 유동 검정 키트는 혈청 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항체 항원 반응이 일어나는 전개용 막(주로, 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수패드(absorption pad)로 되어 있다. 탐지용 항체는 탐지를 표지하기 위하여 예를 들면 콜로이드성 금입자에 고정되어 있다. 금입자 대신 라텍스 비드(latex bead) 또는 탄소입자를 사용하기도 한다. 또한, 탐지용 항체는 형광물질(fluorescence), 발광물질, 레독스 분자(redox molecule), 마그네틱 입자(magnetic particels) 등으로 표지될 수 있다.In the present invention, another embodiment for detecting PrxII protein in serum samples is to use a lateral flow assay kit based on an immunochromatography method. Lateral flow assay kits include a sample pad to which serum samples are applied, a release pad coated with a detection antibody, a developing membrane (primarily nitrocellulose) in which the sample is moved and separated and an antibody antigen reaction occurs. ) Or strips, and an absorption pad for the sample to move continuously. Detection antibodies are immobilized, for example, on colloidal gold particles to label detection. Latex beads or carbon particles may be used instead of gold particles. In addition, the detection antibody may be labeled with a fluorescence material, a luminescent material, a redox molecule, magnetic particels, or the like.
측방 유동 검정 키트는 대개 샌드위치 형태로 분석물을 탐지하도록 고안된다. 시료 속에 들어 있는 분석물이 샘플패드에 적용되어 이동하기 시작하면서 먼저 방출패드에 코팅되어 탐지용 항체와 반응을 하여 항원-항체 결합체 형태로 계속하여 전개된다. 이동하면서 전개막에 고정되어 있는 포획 항체와 한번 더 반응을 하여 샌드위치 형태의 복합체를 만든다. 포획 항체는 전개막에 고정되어 있기 때문에 항원-항체 반응이 계속하여 일어나면 복합체의 축적이 포획 항체의 고정면에서 이루어진다. 단백질은 육안으로는 투명하기 때문에 복합체의 생성 여부와 상대적인 양을 부착된 금입자의 양으로 판단하거나 표지물질의 세기로 결정한다.Lateral flow assay kits are usually designed to detect analytes in the form of sandwiches. As the analyte in the sample is applied to the sample pad and begins to move, it is first coated on the release pad, reacts with the detection antibody, and continues to develop in the form of an antigen-antibody conjugate. As it moves, it reacts once more with the capture antibody immobilized on the developing membrane to form a sandwich-type complex. Since the capture antibody is immobilized on the developing membrane, if antigen-antibody reactions continue to occur, accumulation of the complex takes place on the fixed side of the capture antibody. Since proteins are transparent to the naked eye, the formation and relative amounts of complexes are determined by the amount of gold particles attached or the strength of the label.
형광물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 형광 입자, 퀀텀 도트(quantum dot), 란타니드 킬레이트(lanthanide chelate)(예, 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu) 및 테르븀(Tb)) 및 플루오레슨스(fluorescence)(예, FITC, 로다민 그린, 티아디카르보시아닌, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Alexa 488, Alexa 546, Alexa 594 및 Alexa 647)이 포함된다. 레독스 분자의 예로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3 ]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4-를 들 수 있다.Fluorescent materials include, but are not limited to, fluorescent particles, quantum dots, lanthanide chelates (e.g., samarium (Sm), europium (Eu) and terbium (Tb)) and fluorescence ( fluorescence) (eg, FITC, rhodamine green, thiadicarbocyanine, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Alexa 488, Alexa 546, Alexa 594 and Alexa 647). Examples of redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K 4 W (CN) 8 , [Os (bpy) 3 ] 2+ , [RU (bpy) 3 ] 2+ , and [MO (CN) 8 ] 4- .
본 발명에 있어서 상기 라벨은 링커를 통해 분석물과 특이적으로 결합하는 탐지자(PrxII 항체)와 결합된다. 이러한 링커로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 N-[k-말레이미도운데카노일옥시])-설포석신아미드 에스테르(설포-KMUS), 석신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]-사이클로헥산-1-카르복시[6-아미도카프로레이트](LC-SMCC ), N-K-말레이미도우데칸산(KMUA), 석신이미딜-4-[p-말레이미도페닐]부티레이트 (SMBP), 석신이미딜-6-[(β-말레이미도-프로피온아미도)헥사노에이트] (SMPH), 석신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]-사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 설포석신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]-사이클로헥산-1-카르복실레이트(설포-SMCC), N-석신이미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트(SIAB), 설포석신이미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트(설포-SIAB), N-[γ-말레이미도부티릴옥시]설포-석신이미드 에스테르(설포-GMBS), N-[γ-말레이미도부티릴옥시]석신이미드 에스테르(GMBS), 석신이미딜-3-[브로모아세트아미도]프로피오네이트(SBAP),N-β-말레이미도프로피온산(BMPA), N-[α-말레이미도아세톡시]석신이미드 에스테르(AMAS), N-석신이미딜 S-아세틸티오프로피오네이트(SATP), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르 (MBS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포석신이미드 에스테르(설포-MBS), N-e-말레이미도카프린산(EMCA), N-[e-말레이미도카프로일옥시]석신이미드 에스테르 (EMCS), N-석신이미딜-[4-비닐설포닐]벤조에이트(SVSB), N-[β-말레이미도프로필옥시]석신이미드 에스테르(BMPS) 및 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)가 포함된다. 상기 링커들은 예를 들면 탐지자의 티올 그룹과 반응하게 된다.In the present invention, the label is bound to a detector (PrxII antibody) that specifically binds to the analyte via a linker. Such linkers include, but are not limited to, N- [k-maleimidoundocanoyloxy])-sulfosucciamide ester (sulfo-KMUS), succinimidyl-4- [N-maleimidomethyl] -cyclo Hexane-1-carboxy [6-amidocaprorate] (LC-SMCC), NK-maleimidodecanoic acid (KMUA), succinimidyl-4- [p-maleimidophenyl] butyrate (SMBP), succinimi Diyl-6-[(β-maleimido-propionamido) hexanoate] (SMPH), succinimidyl-4- [N-maleimidomethyl] -cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) Posuccinimidyl-4- [N-maleimidomethyl] -cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), N-succinimidyl [4-iodoacetyl] aminobenzoate (SIAB), sulfostone Cinimidyl [4-iodoacetyl] aminobenzoate (sulfo-SIAB), N- [γ-maleimidobutyryloxy] sulfo-succinimide ester (sulfo-GMBS), N- [γ-maleimidobuti Ryloxy] succinimide ester (GMBS), Di--3- [bromoacetamido] propionate (SBAP), N-β-maleimidopropionic acid (BMPA), N- [α-maleimidoacetoxy] succinimide ester (AMAS), N-succinate Imidyl S-acetylthiopropionate (SATP), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester (sulfo-MBS ), Ne-maleimidocaprylic acid (EMCA), N- [e-maleimidocaproyloxy] succinimide ester (EMCS), N-succinimidyl- [4-vinylsulfonyl] benzoate (SVSB) , N- [β-maleimidopropyloxy] succinimide ester (BMPS) and 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC). The linkers will react with the thiol group of the detector, for example.
한 양태로서 본 발명의 측방 유동 검정 키트는 스트립으로 제공된다. 이러한 스트립은 직사각형, 원형, 난형, 삼각형, 기타 여러 모양을 취할 수 있는데 단 시험 용액이 모세관력에 의해 이동할 수 있는 적어도 하나의 방향이 존재하여야 한다. 시험 용액이 가운데서 접촉되는 난형 또는 원형과 같이 다른 이동 방향이 존재할 수 있다. 그러나, 고려되어야 하는 것은 시험 용액이 적어도 하나의 방향으로 예정된 위치로 이동되어야 한다. 본 발명에 따른 스트립의 두께는 중요하지 않지만 보통 0.1 내지 2mm, 더욱 보통은 0.15 내지 1mm, 바람직하게는 0.2 내지 0.7mm이다. 일반적으로, 최소 두께는 스트립 재질의 강도 및 용이한 검출 신호의 생성 필요성에 의해 결정되는 한편 최대 두께는 시약의 취급 용이성 및 시약의 비용에 의해 결정된다. 시약을 보존하고 한정된 크기의 샘플을 제공하기 위해, 스트립의 너비는 일반적으로 비교적 좁게 만들며, 보통은 20mm 미만, 바람직하게는 10mm 미만이다. 일반적으로, 스트립의 너비는 약 1.0mm 미만이어서는 안되며 보통의 범위는 약 2mm 내지 12mm이고, 바람직한 범위는 약 4mm 내지 8mm이다. 스트립의 길이는 분석물의 종류, 크로마토그래피 매질상의 시험 선 또는 점 및 표준선의 수, 패드사이의 공간, 취급의 편리성 등을 고려하여 결정된다. 보통은 1 내지 40cm이고, 바람직하게는 약 2 내지 25cm이며, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 20cm이다. 그러나, 스트립은 실질적으로 어떠한 길이로도 가능할 수 있다. In one aspect, the lateral flow assay kit of the present invention is provided in a strip. Such strips may take the form of rectangles, circles, ovals, triangles, and many other shapes, provided that there is at least one direction in which the test solution can be moved by capillary force. There may be other directions of movement, such as oval or circular, in which the test solution is in contact in the middle. However, it should be considered that the test solution must be moved to a predetermined position in at least one direction. The thickness of the strip according to the invention is not critical but is usually 0.1 to 2 mm, more usually 0.15 to 1 mm, preferably 0.2 to 0.7 mm. In general, the minimum thickness is determined by the strength of the strip material and the need to generate an easy detection signal while the maximum thickness is determined by the ease of handling of the reagent and the cost of the reagent. In order to preserve the reagents and provide a sample of defined size, the width of the strip is generally made relatively narrow, usually less than 20 mm, preferably less than 10 mm. In general, the width of the strips should not be less than about 1.0 mm and the usual range is about 2 mm to 12 mm and the preferred range is about 4 mm to 8 mm. The length of the strip is determined by considering the type of analyte, the number of test or point and standard lines on the chromatography medium, the spacing between the pads, and the ease of handling. It is usually 1 to 40 cm, preferably about 2 to 25 cm, and more preferably about 4 to 20 cm. However, the strip can be of virtually any length.
분석할 시료을 위한 용매는 보통 수성 매질이며, 이러한 매질은 약 40 중량% 이하의 다른 극성 용매, 특히 알코올, 에테르 등을 포함하여 탄소수 1 내지 6, 더욱 보통은 탄소수가 1 내지 4인 산화 용매를 포함할 수 있다. 보통, 공동용매가 약 20 중량% 미만으로 존재한다. 샘플의 성질에 따라 일부 환경하에서 수성 매질중 일부 또는 전부가 샘플 자체에 의해 제공될 수 있다.The solvent for the sample to be analyzed is usually an aqueous medium, which comprises up to about 40% by weight of other polar solvents, in particular oxidizing solvents having 1 to 6 carbon atoms, more usually 1 to 4 carbon atoms, including alcohols, ethers and the like. can do. Usually, the cosolvent is present at less than about 20 weight percent. Depending on the nature of the sample, some or all of the aqueous medium may be provided by the sample itself under some circumstances.
매질에 대한 pH는 보통 4 내지 11, 더욱 보통은 5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9이다. pH는 결합 요소들의 중요한 결합 친화성 부위 및 신호 생성 시스템에 의한 신호의 임의 생성을 유지하는 정도로 선택된다. 검정동안에 원하는 pH로 조절하고 그 pH를 유지하기 위해 다양한 완충액을 사용할 수 있다. 대표적인 완충액으로는 보레이트, 포스페이트, 카르보네이트, 트리스, 바르비탈(barbital)이 포함된다. 사용되는 특정 완충액이 중요하지는 않지만 개개의 검정에서 한 완충액이 다른 완충액에 비해 바람직할 수 있다. 또한, 바람직하게는 약 0.05 내지 0.5 중량%의 비이온성 세정제(nonionic detergent)가 샘플에 포함된다. 약 200 내지 20,000 달톤의 여러 폴리옥시알킬렌 화합물이 사용될 수 있다.The pH for the medium is usually 4 to 11, more usually 5 to 10, preferably 6 to 9. The pH is chosen to maintain an important binding affinity site of the binding elements and any generation of the signal by the signal generating system. Various buffers can be used to adjust and maintain the desired pH during the assay. Representative buffers include borate, phosphate, carbonate, tris, barbital. Although the particular buffer used is not critical, one buffer may be preferred over the other in individual assays. In addition, preferably about 0.05 to 0.5% by weight of a nonionic detergent is included in the sample. Various polyoxyalkylene compounds of about 200 to 20,000 daltons can be used.
검정을 실시하는데는 보통 온화한 온도가 사용되며 바람직하게는 실질적으로 일정한 온도가 사용된다. 검정 및 검출 신호의 생성을 위한 온도는 일반적으로 약 4℃ 내지 50℃, 더욱 보통은 약 10℃ 내지 40℃이고, 흔히는 주변 온도, 즉 약 15℃ 내지 25℃이다.Mild temperatures are usually used to perform the assay, and preferably substantially constant temperatures are used. The temperature for the generation of the assay and detection signals is generally about 4 ° C. to 50 ° C., more usually about 10 ° C. to 40 ° C., and often at ambient temperature, ie about 15 ° C. to 25 ° C.
피검 수용액중의 검정될 분석물의 농도는 일반적으로 약 10-4 내지 약 10-15M, 더욱 보통은 약 10-6 내지 10-14M이다. 다른 시약의 농도는 목적하는 분석물의 농도 및 프로토콜과 같은 것을 고려하여 결정하는 것이 보통이다. 샘플 및 시약 용액중에 여러 많은 시약의 농도는 일반적으로 목적하는 분석물의 농도 범위에 의해 결정되는 한편, 각 시약의 최종 농도는 목적하는 범위에서 검정의 감도(sensitivity)를 경험에 의해 최적화하는 정도로 결정된다. 특정 프로토콜과 함께 개개의 시약은 검정의 감도를 저하시키지 않는 한 과량으로 사용할 수 있다.The concentration of the analyte to be assayed in the aqueous test solution is generally about 10 -4 to about 10 -15 M, more usually about 10 -6 to 10 -14 M. The concentration of other reagents is usually determined taking into account such as the concentration and protocol of the desired analyte. The concentrations of many different reagents in the sample and reagent solutions are generally determined by the concentration range of the desired analyte, while the final concentration of each reagent is determined by experience to optimize the sensitivity of the assay in the desired range. . Individual reagents with specific protocols can be used in excess unless the sensitivity of the assay is degraded.
본 발명에 있어서, 혈청중의 PrxII 단백질과의 면역반응을 위해 사용되는 PrxII에 대한 항체는 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, PrxII 단백질을 인산염완충 생리식염수(PBS)에 용해하고, 필요에 따라 같은 용량의 프로인드 완전 보조제(Freund's Complete Adjuvant)로 혼합하여 유화한 후, 동물에 약 1주간 간격으로 피하 투여하고 수회 면역한다. 항체 역가를 측정하고 최고의 항체 역가에 달한 시점에서 추가 접종하고, 투여 후 적당한 시점에서 채혈을 한다. 얻은 항혈청을 황산암모늄 분획 침전하고, 글로불린 분획을 음이온 교환 크로마토그라피에 의해 정제하던가, 혹은 항혈청을 결합 완충액 (Binding Buffer, Bio-rad)으로 2배 희석하고, 그 희석 항혈청을 예를 들면 프로테인 A 또는 프로테인 G 세파로스 컬럼 크로마토그라피에 의해 정제하여 항 PrxII 단백질 폴리클로날 항체를 얻을 수 있다.In the present invention, an antibody against PrxII used for immune reaction with PrxII protein in serum can be prepared by conventional methods well known in the field of immunology. For example, the PrxII protein is dissolved in phosphate buffered saline (PBS), mixed with an equal amount of Freund's Complete Adjuvant as needed, emulsified, and then subcutaneously administered to the animal at about 1 week intervals. Immunize several times. Antibody titers are measured and boosted at the point when the highest antibody titer is reached and blood drawn at the appropriate time point after administration. The obtained antiserum was precipitated with ammonium sulfate fraction and the globulin fraction was purified by anion exchange chromatography, or the antiserum was diluted twice with binding buffer (Binding Buffer, Bio-rad), and the diluted antiserum was, for example, protein A or Purification by protein G Sepharose column chromatography can yield anti-PrxII protein polyclonal antibodies.
다른 양태로서, PrxII 단백질에 대한 모노클로날 항체를 면역학 분야의 종사자에게 잘 알려진 일반적인 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 즉, PrxII 단백질에 의해 포유동물을 면역하던가 혹은 인비트로법에 의해 면역한 임파구세포를 골수종 세포주 등과 융합시켜 통상적인 방법에 의해 하이브리도마(hybridoma)를 생성한다. 이 하이브리도마 배양액에 대하여 고도로 정제된 각각의 항원을 사용하여 솔리드 페이스(solid phase) ELISA에 의해 각각의 항원을 인식하는 항체생산 하이브리도마를 선택한다. 얻은 하이브리도마를 클로닝하고, 얻은 안정한 항체생산 하이브리도마를 각각 배양하여 목적으로 하는 항체를 얻는다. 하이브리도마의 제작에 마우스와 랫트를 사용할 수 있다.In another embodiment, monoclonal antibodies against PrxII protein can be prepared using general methods well known to those skilled in the art of immunology. In other words, lymphoma cells immunized with a PrxII protein or immunized with an in vitro method are fused with a myeloma cell line or the like to generate hybridomas by a conventional method. Antibody-producing hybridomas that recognize each antigen by solid phase ELISA are selected using each highly purified antigen for this hybridoma culture. The obtained hybridomas are cloned, and each of the obtained stable antibody-producing hybridomas is cultured to obtain the desired antibody. Mouse and rat can be used to make hybridomas.
상기 항체의 제조에 사용하기 위한 PrxII는 천연에서 분리된 것을 사용하거나 문헌[Kang, S. W., et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, No. 11, pp. 6297-6302, 1998]에 기술된 바와 같이 유전자 재조합 방법에 의하여 제조할 수 있다. 상기 강 등의 재조합 방법을 간략히 소개하면 다음과 같다. Taq 폴리머라제(Perkin Elmer)를 이용한 중합효소 연쇄 반응법(PCR)에 의해 Prx II 단백질에 상응하는 cDNA를 얻는다. Prx II cDNA의 증폭을 위한 주형으로는 사람 골수성 백혈병 K562 세포(CLONTECH)로부터 얻은 cDNA 라이브러리를 사용할 수 있다. Prx II의 전방 프라이머(5'-TCA/CAT/ ATG /GCC/TCC/GGT/AAC/GCG-3')는 NdeI 부위(밑줄부분) 및 개시코돈(이탤릭체부분)을 함유한다. Prx II의 역방 프라이머3'-AAT/GGA/TCC/CTA/ATT/GTG/TTT/GGA/GGA/ATA-5')는 BamHI 부위(밑줄부분) 및 정지코돈(이탤릭체부분)을 함유한다. PCR 산물은 pCR3.1(Invitrogen)내로 아클로닝한다. pCR3.1로부터의 NdeI-BamHI 단편을 pET-17b 플라스미드(Novagen)로 삽입하여 재조합 플라스미드 pETprxII를 형성한다. 형성된 재조합 플라스미드 pETprxII로 이. 콜라이를 형질감염시키고 이에 따라 생성된 형질감염체로부터 재조합 Prx II 단백질을 정제한다.PrxII for use in the preparation of the antibody may be isolated from nature or described in Kang, SW, et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, no. 11, pp. 6297-6302, 1998]. Briefly introducing a recombination method such as the steel as follows. Polymerase chain reaction (PCR) using Taq polymerase (Perkin Elmer) to obtain cDNA corresponding to the Prx II protein. As a template for amplification of Prx II cDNA, a cDNA library obtained from human myeloid leukemia K562 cells (CLONTECH) can be used. The forward primer of Prx II (5'-TCA / CAT / ATG / GCC / TCC / GGT / AAC / GCG-3 ') contains the NdeI site (underlined) and the start codon (italic). Reverse primer 3'-AAT / GGA / TCC / CTA / ATT / GTG / TTT / GGA / GGA / ATA-5 'of Prx II contains a BamHI site (underlined) and a stop codon (italic). PCR products are cloned into pCR3.1 (Invitrogen). The NdeI-BamHI fragment from pCR3.1 is inserted into the pET-17b plasmid (Novagen) to form the recombinant plasmid pETprxII. The recombinant plasmid pETprxII formed. E. coli is transfected and the recombinant Prx II protein is purified from the resulting transfectants.
본 발명은 다른 양태로서 PrxII 단백질을 포유동물의 조직으로부터 분리하여 제조하는 방법을 제공한다. PrxII 단백질의 공급원은 이들로 한정되는 것은 아니지만 소 및 랫트 조직을 대표적인 예로 들 수 있으며, 여기서 조직은 태반, 흉선, 심장, 간, 신장, 폐, 비장, 뇌, 시상하부, 갑상선, 부신 등이 포함된다. In another aspect, the present invention provides a method for preparing PrxII protein isolated from mammalian tissue. Sources of PrxII protein include, but are not limited to, bovine and rat tissues, where tissues include placenta, thymus, heart, liver, kidney, lung, spleen, brain, hypothalamus, thyroid, adrenal gland, etc. do.
본 발명에 따른 제조방법의 한 가지 양태로서, PrxII 단백질은 (a) 포유동물의 조직을 균질화하여 균질액을 생성하고, (b) 생성된 균질액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, (c) 분리된 상층액을 DEAE-sephacel 컬럼에서 크로마그래피하고, (d) 단계 (c)에서 얻은 분획을 페닐-5PW 컬럼에서 크로마토그래피하고, (e) 단계 (d)에서 얻은 분획을 헤파린-5PW 컬럼에서 크로마토그래피하고, (f) 단계 (e)에서 얻은 분획을 MONO Q 컬럼에서 크로마토그래피하고, (g) 단계 (f) 단계에서 얻은 분획을 Superdex 200 컬럼에서 크로마토그래피하여 PrxII 단백질을 정제함으로써 수득할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 PrxII의 제법에서 사용한 컬럼 중 DEAE-sephacel과 Mono Q는 모두 음이온 교환법을 이용한 것이므로 둘 중 하나만 사용할 수 있다. 보통은 Mono Q를 사용하지 않는다. 또한, Superdex 200 컬럼은 정제가 덜 되었을 경우에 사용하는 것이므로 반드시 실시할 필요는 없으며 이의 실시 여부는 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. In one embodiment of the preparation method according to the invention, the PrxII protein is (a) homogenized mammalian tissue to produce a homogenate, (b) centrifugation of the resulting homogenate to separate the supernatant, (c) A) the separated supernatant was chromatographed on a DEAE-sephacel column, (d) the fractions obtained in step (c) were chromatographed on a phenyl-5PW column, and (e) the fractions obtained in step (d) were heparin-5PW columns. By chromatography in (f) the fraction obtained in step (e) on a MONO Q column, and (g) the fraction obtained in step (f) on a Superdex 200 column to purify the PrxII protein. Can be. DEAE-sephacel and Mono Q in the column used in the preparation method of PrxII according to the present invention are all using an anion exchange method, so only one of them can be used. Normally Mono Q is not used. In addition, since the Superdex 200 column is used when the purification is less necessary, it is not necessarily performed, and it can be easily determined by those skilled in the art.
본 발명의 바람직한 양태로서 PrxII 단백질은 (a) 소뇌를 균질화하여 균질액을 생성하고, (b) 생성된 균질액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, (c) 분리된 상층액을 DEAE-sephacel 컬럼에서 크로마그래피하고, (d) 단계 (c)에서 얻은 분획을 페닐-5PW 컬럼에서 크로마토그래피하고, (e) 단계 (d)에서 얻은 분획을 헤파린-5PW 컬럼에서 크로마토그래피하고, (f) 단계 (e)에서 얻은 분획을 MONO Q 컬럼에서 크로마토그래피하고, (g) 단계 (f) 단계에서 얻은 분획을 Superdex 200 컬럼에서 크로마토그래피하여 PrxII 단백질을 정제함으로써 수득할 수 있다. As a preferred embodiment of the present invention, the PrxII protein comprises (a) homogenizing the cerebellum to generate a homogenate, (b) centrifuging the resulting homogenate to separate the supernatant, and (c) separating the supernatant from DEAE-sephacel. Chromatography on the column, (d) chromatography the fraction obtained in step (c) on a phenyl-5PW column, (e) chromatography the fraction obtained in step (d) on a heparin-5PW column, and (f) The fraction obtained in (e) can be obtained by chromatography on a MONO Q column and (g) the fraction obtained in step (f) is chromatographed on a Superdex 200 column to purify the PrxII protein.
본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현 예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. The invention will be more specifically illustrated by the following examples. However, these examples are merely embodiments of the present invention and do not limit the scope of the present invention.
<실시예><Example>
실시예 1Example 1
사람 혈청 시료채취Human Serum Sampling
혈청시료는 사람으로부터 혈액을 채취하여, 채취한 혈액은 채취 후 바로 1800g, 상온에서 5분간 원심분리하여 혈청을 마이크로튜브에 옮기고, 혈청 중 5㎕를 취하여 단백질 정량을 시행하고, 나머지는 -70℃에 보관하였다. 단백질 정량은 브래드포드(Bradford, Biorad) 방법을 사용하였다. 혈청단백질의 정량시에는 BSA를 표준 단백질로 사용하였다. Serum samples were collected from human blood, and the collected blood was immediately centrifuged at 1800 g for 5 minutes at room temperature, the serum was transferred to microtubes, 5 μl of serum was taken for protein quantification, and the rest was -70 ° C. Stored in. Protein quantification was performed using the Bradford, Biorad method. BSA was used as a standard protein for the quantification of serum proteins.
검사혈청은 서울대병원 산부인과로부터 확보하여 사용하였다. 검사대상은 서울대병원 산부인과에 내원한 여성불임환자 중 불임의 원인이 조기폐경(POF)인 환자 32예, 다낭성난소증후군(PCOD)인 환자 8예, 자궁내막증(Endometriosis)인 환자 30예, 정상인 28예로 모두 98예를 검사하였다.Test serum was obtained from Obstetrics and Gynecology, Seoul National University Hospital. The subjects were 32 female patients with early menopause (POF), 8 patients with polycystic ovary syndrome (PCOD), 30 patients with endometriosis, and 28 normal women. All 98 cases were examined.
실시예 2Example 2
혈청 프로테옴의 이차원 전기영동Two-dimensional Electrophoresis of Serum Proteome
200 ㎍의 단백질을 포함하는 혈장시료에 SDS 농도를 0.2% 까지 가해 20분 동안 처리하여 녹이고, 용해 완충액(lysis buffer)(8 M 요소, 2% CHAPS, 7 mg DTT/2.5 ml 용해 완충액, 2% IPG 완충액)로 90㎕가 되도록 부피를 맞추어 15분 정도 실온에 방치하였다. 90㎕의 시료를 미리 수화시킨(rehydration) 이모빌린 드라이스트립(Immobiline DryStrip)(pH 4-7, 길이 13cm)에 로딩(loading)하고 MultiPhorⅡ 유니트와 EPS 3501XL 전원장치(power supply)(Phamacia)를 이용하여 15℃에서 12시간(26,600 Vh)동안 일렉트로포커싱(electrofocusing)하였다. SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE) 단계로 넘어가기 전에 일렉트로포커싱된 스트립 스트립들을 ml 당 1mg의 DTT를 포함하는 5ml의 평형용액(equilibration solution)(50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6 M 요소, 30% 글리세롤, 2% SDS)에 15분 동안 평형시키고, 다음에 ml 당 25mg IAA를 포함하는 5ml의 평형용액에 15분 동안 평형시켰다. 그런 다음 처리된 스트립들을 SDS-PAGE 겔(4% 적층용, 13.5% 분리용)에 로딩하여 전기영동하였다. SDS-PAGE된 겔들은 변형된 은염색법으로 염색하고 단백질 양상은 PD-QUEST 소프트웨어(Bio-rad)를 사용하여 영상분석해서 변화양상을 관찰하였다. Plasma samples containing 200 μg of protein were dissolved by adding SDS concentrations up to 0.2% for 20 minutes and dissolved in lysis buffer (8 M urea, 2% CHAPS, 7 mg DTT / 2.5 ml lysis buffer, 2%). IPG buffer) and the volume was adjusted to 90 μl and left at room temperature for about 15 minutes. 90 μl of the sample was loaded into a previously hydrated Immobiline DryStrip (pH 4-7, 13 cm long) using a MultiPhor II unit and an EPS 3501XL power supply (Phamacia). Was electrofocused at 15 ° C. for 12 hours (26,600 Vh). Electrofocused strip strips were transferred to 5 ml equilibration solution (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6) containing 1 mg of DTT per ml before proceeding to SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) step. M urea, 30% glycerol, 2% SDS) for 15 minutes and then equilibrated in 5 ml of equilibrium solution containing 25 mg IAA per ml for 15 minutes. The treated strips were then electrophoresed by loading onto SDS-PAGE gels (for 4% lamination, 13.5% separation). SDS-PAGE gels were stained with modified silver staining and protein profiles were analyzed by PD-QUEST software (Bio-rad) to observe changes.
도 1a는 정상인의 혈청을 이차원 전기영동으로 얻은 영상 결과이고, 도 1b는 POF 환자 혈청을 이차원 전기영동으로 얻은 영상 결과이다. 이 두 영상은 PD-QUEST 소프트웨어(Bio-rad)를 이용하여 분석하여 POF 환자에서 유의성 있게 증가하는 단백질 스폿(spot)을 찾아 동그라미로 표시하고, 고유번호를 붙였다. 도 1c는 PD-QUEST 소프트웨어(Bio-rad)를 이용하여 분석한 값을 그래프로 나타낸 것이다.FIG. 1A is an image result obtained by two-dimensional electrophoresis of serum of a normal person, and FIG. 1B is an image result obtained by two-dimensional electrophoresis of serum of a POF patient. These two images were analyzed using PD-QUEST software (Bio-rad) to identify and circle the protein spots that significantly increased in POF patients and to assign them unique numbers. FIG. 1C is a graph showing values analyzed using PD-QUEST software (Bio-rad).
실시예 3Example 3
MALDI-TOF 분석과 데이터베이스 적용MALDI-TOF Analysis and Database Application
도 1에서 분석한 여러 단백질 스폿중에서 BI-POF-24를 젤로부터 오려내어 100% 아세토니트릴로 15분간 탈수시켰다. 젤 조각은 100mM 탄산암모늄으로 10분간 씻어내고 100% 아세토니트릴로 다시 탈수시켰다. 진공건조기를 이용하여 완전히 건조시켰다. 건조된 젤조각에 5mM 염화칼슘/50mM 탄산암모늄용액에 녹인 25㎍/㎖ 시퀀싱-그래이드 트립신을 넣어주었다. 이것을 얼음 위에 45분간 방치해 두었다. 상층액을 버리고, 50mM 염화칼슘/50mM 탄산암모늄용액 10㎕를 다시 채우고 37℃에서 하룻밤 방치해 두었다. 이때, 분해된 펩타이드들은 5% 포름산/50% 아세토니트릴 용액으로 추출하였다. MALDI-TOF 분석의 이온화 효율을 증가시키기 위하여, 마이크로피펫 팁에 C18 역상 미니컬럼(reversed-phase miniculumn)으로 충전된 ZipTipC18 (Millipore, Bedford, MA, USA)을 사용하여 정제하였다. 정제된 펩타이드는 30% 아세토니트릴/0.1% 트리플로로아세트산 용액에 녹였다. Among the various protein spots analyzed in FIG. 1, BI-POF-24 was cut out of the gel and dehydrated with 100% acetonitrile for 15 minutes. The gel pieces were washed with 100 mM ammonium carbonate for 10 minutes and dehydrated again with 100% acetonitrile. It was dried completely using a vacuum dryer. To the dried gel pieces was added 25 ㎍ / ㎖ sequencing-grade trypsin dissolved in 5 mM calcium chloride / 50 mM ammonium carbonate solution. It was left on ice for 45 minutes. The supernatant was discarded, refilled with 10 µl of 50 mM calcium chloride / 50 mM ammonium carbonate solution and left at 37 ° C. overnight. At this time, the digested peptides were extracted with 5% formic acid / 50% acetonitrile solution. To increase the ionization efficiency of the MALDI-TOF assay, the micropipette tip was purified using ZipTipC18 (Millipore, Bedford, Mass., USA) filled with C18 reversed-phase miniculumn. Purified peptides were dissolved in 30% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid solution.
정제된 펩타이드는 30% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산 용액으로 녹인 10㎎/㎖ α-시아노-4-하이드록시신남산과 동량으로 혼합하였다. 혼합용액 1㎕를 취하여 플레이트 위에 점적하고 상온에 놓아두고 말렸다. 펩타이드 분석은 PE Biosystems MALDI-TOF 질량 분광광도계(Voyager DE-STR)를 사용하여 실시하였다. 데이터베이스 적용 프로그램은 MS-Fit를 사용하였다. 도 2는 BI-POF-24 단백질 스폿으로부터 얻은 펩타이드 프로필을 보여준다. 또한, 도 2에서 얻은 펩타이드 프로필을 MS-Fit 데이터베이스 프로그램에 적용하였다. 이의 결과는 표 1에 기술되어 있으며, 이 결과로부터 BI-POF-24 단백질 스폿은 PrxII 단백질임을 알 수 있다.The purified peptides were mixed in equal amounts with 10 mg / ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid dissolved in 30% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid solution. 1 μl of the mixed solution was taken, dropped onto a plate, and dried at room temperature. Peptide analysis was performed using PE Biosystems MALDI-TOF mass spectrophotometer (Voyager DE-STR). The database application program used MS-Fit. 2 shows peptide profiles obtained from BI-POF-24 protein spots. In addition, the peptide profile obtained in Figure 2 was applied to the MS-Fit database program. The results are described in Table 1, which shows that the BI-POF-24 protein spot is PrxII protein.
표 1 Table 1
실시예 4Example 4
소의 뇌로부터 PrxII 단백질 정제 및 항체제작Purification and Antibody Production of PrxII Protein from Bovine Brain
소 뇌 600g에 50mM 트리스(pH 7.5), 1mM EDTA, 1mM PMSF를 포함하는 용해액 4L를 넣고 호모게나이져(homogeniger)를 이용하여 균질화시켰다. 이 균질화 용액을 3,500rpm으로 20분간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 취했다. 상층액에 1M 아세트산을 넣어 pH를 5.0으로 맞춘 다음, 4℃에 15분간 방치해 두었다. 다시 3,500rpm으로 20분간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 취했다. 상층액에 1M 트리스 염기를 넣어 pH를 7.5로 맞춘 다음, 15,000rpm으로 20분간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 취했다. 여기에서 얻어진 상층액의 총 부피는 2.8L이고, 상층액은 브래드포드 (BioRad) 방법을 이용하여 단백질 정량을 실시하였다. 이때 얻어진 단백질 총량은 7g이었다. 이 상층액에 20mM 트리스-HCl(pH 7.5) 용액 4.2L를 넣어 희석시켰다. 5 X 20cm인 컬럼에 DEAE-sephacel을 충전시켜 희석용액을 흘려보냈다. 이어서, 20mM 트리스(pH 7.5)인 A 용액과 0.5M NaCl이 첨가된 20mM 트리스(pH 7.5)인 B 용액에서 B용액의 비율을 점차 높여가면서 컬럼에 흘려보내고, 이때 컬럼을 통해 나오는 분획(fraction)을 유리관에 나누어 받았다. 이때, 유속은 분당 4㎖이고, 분획 크기 (fraction size)는 8㎖이다. 도 3은 DEAE-sephacel로부터 얻어진 희석용액의 크로마토그래피 프로필을 보여준다.4 g of lysate containing 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, and 1 mM PMSF was added to 600 g of the cerebellum and homogenized using a homogener. This homogenization solution was centrifuged at 3,500 rpm for 20 minutes at 4 DEG C to obtain a supernatant. 1M acetic acid was added to the supernatant, the pH was adjusted to 5.0, and left at 4 ° C. for 15 minutes. Again, the supernatant was collected by centrifugation at 3,500 rpm for 20 minutes at 4 ° C. 1M Tris base was added to the supernatant to adjust the pH to 7.5, and the supernatant was taken by centrifugation at 4 ° C. for 20 minutes at 15,000 rpm. The total volume of the supernatant obtained here was 2.8 L, and the supernatant was subjected to protein quantitation using the Bradford (BioRad) method. The total amount of protein obtained at this time was 7 g. Into this supernatant, 4.2 L of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) solution was added and diluted. DEAE-sephacel was charged to a column of 5 × 20 cm to allow dilution to flow. Subsequently, in a solution of 20 mM Tris (pH 7.5) and a solution of 20 mM Tris (pH 7.5) added with 0.5 M NaCl, B solution was gradually flowed into the column while increasing the ratio of B solution. Was divided into glass tubes. At this time, the flow rate is 4 ml per minute and the fraction size is 8 ml. Figure 3 shows the chromatographic profile of the dilute solution obtained from DEAE-sephacel.
DEAE 분획중 50번부터 105번까지를 모두 합하여 30-70% 황화암모늄으로 침전시켰다. 이때 얻은 단백질의 총량은 900mg이었다. 이것을 동일하게 두 부분(450mg)으로 나누어 각각 2.15 X 15cm 인 TSK 페닐-5PW 컬럼을 시행하였다. 1M (NH4)2SO4 가 첨가된 20mM Hepes(pH 7.0)인 A 용액과 20mM Hepes(pH 7.0)인 B 용액에서 A 용액의 비율을 점차 높여가면서 컬럼에 흘려보내고, 이때 컬럼을 통해 나오는 분획을 유리관에 나누어 받았다. 이때 유속은 분당 5㎖이고, 분획 크기는 5㎖이다. 도 4는 페닐-5PW로부터 얻어진 희석용액의 크로마토그래피 프로필을 보여준다.All 50 to 105 of the DEAE fractions were combined and precipitated with 30-70% ammonium sulfide. The total amount of protein obtained was 900 mg. This was equally divided into two portions (450 mg) and a TSK phenyl-5PW column of 2.15 X 15 cm, respectively. A solution of 20 mM Hepes (pH 7.0) A and 20 mM Hepes (pH 7.0) B with 1M (NH 4 ) 2 SO 4 was added to the column, gradually increasing the ratio of the solution A. Was divided into glass tubes. The flow rate is 5 ml per minute and the fraction size is 5 ml. 4 shows the chromatographic profile of the dilute solution obtained from phenyl-5PW.
두 부분으로 나누어 시행한 모두에서 얻은 페닐 분획중 60번부터 64번까지를 합하고, 아미콘 농축기(amicon concentrator)를 이용하여 농축시킨 다음, 20mM Hepes(pH 7.0)로 투석하였다. 이 투석액을 다시 동일하게 세 부분으로 나누어 각각 0.75 X 7.5cm 인 TSK 헤파린-5PW 컬럼을 시행하였다. 20mM Hepes(pH 7.0)인 A 용액과 1M (NH4)2SO4가 첨가된 20mM Hepes(pH 7.0)인 B 용액에서 B 용액의 비율을 점차 높여가면서 컬럼에 흘려보내어, 이때 컬럼을 통해 나오는 분획을 유리관에 나누어 받았다. 이때 유속은 분당 1㎖이고, 분획 크기는 1㎖이다.60 to 64 of the phenyl fractions obtained in both parts were combined, concentrated using an amicon concentrator, and dialyzed with 20 mM Hepes (pH 7.0). The dialysis solution was divided into three parts and subjected to a TSK heparin-5PW column, each 0.75 × 7.5 cm. In a solution of 20 mM Hepes (pH 7.0) and a solution of B (20 mM Hepes, pH 7.0) with 1M (NH 4 ) 2 SO 4 , the ratio of solution B was gradually flowed into the column, whereby Was divided into glass tubes. The flow rate is 1 ml per minute and the fraction size is 1 ml.
도 5는 헤파린-5PW로부터 얻어진 크로마토그래피 프로필이다. 세 부분으로 나누어 시행한 모두에서 얻은 헤파린 분획 중 6번부터 10번까지를 합하여 브래드포드(BioRad) 방법을 이용하여 단백질 정량을 실시하였다. 이때 얻어진 단백질 총량은 30mg이었다. 이것을 다시 1.5 X 10cm MONO Q 컬럼을 시행하였다. 20mM 트리스(pH 7.5)인 A 용액과 1M NaCl이 첨가된 20mM 트리스(pH 7.5)인 B 용액에서 B용액의 비율을 점차 높여가면서 컬럼에 흘려보내어, 이때 컬럼을 통해 나오는 분획을 유리관에 나누어 받았다. 이때 유속은 분당 2.5㎖이고, 분획 크기는 2.5㎖이다. 5 is a chromatographic profile obtained from heparin-5PW. Proteins were quantified using the Bradford (BioRad) method by combining 6 to 10 of the heparin fractions obtained from all three trials. The total protein obtained at this time was 30 mg. This was again run on a 1.5 × 10 cm MONO Q column. A solution of 20 mM Tris (pH 7.5) and a solution of 20 mM Tris (pH 7.5) with 1M NaCl were added to the B solution while gradually increasing the ratio of B solution. The flow rate is 2.5 ml per minute and the fraction size is 2.5 ml.
도 6은 MONO Q로부터 얻어진 크로마토그래피 프로필을 보여준다. MONO Q 분획중 59번부터 66번까지를 합하여 브래드포드(BioRad) 방법을 이용하여 단백질 정량을 실시하였다. 이때 얻어진 단백질 총량은 11mg이었다. 합친 MONO Q 분획은 센트리콘 30(Centricon 30)을 이용하여 농축시켰다. 이 농축액을 동일하게 두 부분으로 나누어 각각 1.5 X 30cm Superdex 200 컬럼을 시행하였다. 100mM NaCl이 첨가된 50mM 인산나트륨 용액(pH 7.0)을 흘려보내어 이때 컬럼을 통해 나오는 분획을 유리관에 나누어 받았다. 이때 유속은 분당 0.25㎖이고, 분획 크기는 0.25㎖이다. 6 shows the chromatographic profile obtained from MONO Q. Proteins were quantified using the Bradford (BioRad) method by combining 59 to 66 of the MONO Q fraction. The total amount of protein obtained was 11 mg. The combined MONO Q fractions were concentrated using Centricon 30. The concentrate was equally divided into two portions, each of 1.5 x 30 cm Superdex 200 columns. 50 mM sodium phosphate solution (pH 7.0) added with 100 mM NaCl was flowed, and the fractions passed through the column were divided into glass tubes. The flow rate is 0.25 ml per minute and fraction size is 0.25 ml.
도 7은 Superdex 200으로부터 얻어진 크로마토그래피 프로필이다. Superdex 200 분획중 51번부터 57번까지를 합하여 브래드포드(BioRad) 방법을 이용하여 단백질 정량을 실시하였다. 이때 얻어진 단백질 총량은 5.3mg이었다. 현재까지 각 컬럼에서 얻어진 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 정제 정도를 확인하였다.7 is a chromatographic profile obtained from Superdex 200. Proteins were quantified using the Bradford (BioRad) method by combining 51 to 57 of the Superdex 200 fraction. The total amount of protein obtained was 5.3 mg. To date, the degree of purification of the protein obtained in each column was confirmed using SDS-PAGE.
도 8은 13% SDS-PAGE로 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색한 결과이다. 레인 1은 DEAE 컬럼전의 시료, 레인 2는 헤파린 컬럼전의 시료, 레인 3은 MONO Q 컬럼전의 시료, 레인 4는 정제된 시료이다. Figure 8 is the result of staining with Coomassie blue (13% SDS-PAGE). Lane 1 is the sample before the DEAE column, lane 2 is the sample before the heparin column, lane 3 is the sample before the MONO Q column, lane 4 is the purified sample.
위와 같은 방법으로 정제한 단백질 1mg(0.5 ㎖)을 동일 부피의 프로인드 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)와 섞어 생후 6주된 토끼의 피하 네 부위에 나누어 주사하였다. 첫 번째 주사 4주 후에 0.25mg의 정제 단백질을 동일 부피의 프로인드 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant)와 섞어 토끼의 피하에 3주 간격으로 2회 주사하였고, 마지막 주사 후 7일이 경과했을 때 토끼 귀의 정맥으로부터 소령을 채혈하였다. 여기서 얻은 항혈청을 1:1000으로 희석하여 웨스턴 면역블로팅(western immunoblotting) 방법으로 항체의 생성을 확인하였다. 항체 생성을 확인한 2주 후에 같은 방법으로 0.25mg의 정제 단백질을 한 번 더 주사하고 10일 후에 토끼의 심장으로부터 대량 채혈하였다.1 mg (0.5 mL) of purified protein was mixed with the same volume of Freund's complete adjuvant and injected into four subcutaneous sites of 6-week-old rabbits. Four weeks after the first injection, 0.25 mg of purified protein was mixed with an equal volume of Freund's incomplete adjuvant and injected twice into the rabbit subcutaneously, three weeks apart, and at 7 days after the last injection. A major blood was drawn from the vein. The antiserum obtained here was diluted 1: 1000 to confirm the production of antibodies by western immunoblotting. Two weeks after confirmation of antibody production, 0.25 mg of purified protein was injected once more in the same manner and 10 days later, a large amount of blood was drawn from the rabbit heart.
실시예 5Example 5
혈장 프로테옴의 PrxII 단백질 분석PrxII Protein Analysis of Plasma Proteome
100 ㎍의 단백질에 해당하는 혈청시료를 12% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하였다. SDS-PAGE 후에 겔을 PVDF 막에 전기영동 전이(electrophoretic transfer)하였다. 막은 5% 탈지유(skim milk)를 포함하는 PBS로 밤새 차단(blocking)(4℃)시키고, 1:1000으로 희석한 PrxII 항체로 5시간 동안 하이브리드화 하였다. 막을 0.05% 트리톤 X-100을 포함하는 PBS로 10분씩 3번 세척한 후, 항 토끼 항체를 1:3000으로 희석한 용액에서 1시간 배양하였다. 다시 0.05% 트리톤 X-100을 포함하는 PBS로 10분씩 3번 세척한 후, 상온에서 웨스턴 블로팅 검출 시약 ECL(Amersham Life Science)로 1분 동안 염색하였다. ECL 염색된 막은 후지 사이언티픽 영상필름(Fuji Scientific Imaging Film)에 노출시켜 단백질 스폿이 나타나도록 하였다. Serum samples corresponding to 100 μg of protein were loaded onto 12% polyacrylamide gels and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After SDS-PAGE, the gels were subjected to electrophoretic transfer to PVDF membranes. The membrane was blocked overnight (4 ° C.) with PBS containing 5% skim milk and hybridized with PrxII antibody diluted 1: 1000 for 5 hours. The membrane was washed three times with PBS containing 0.05% Triton X-100 for 10 minutes, and then incubated for 1 hour in a solution diluted 1: 3000 of anti-rabbit antibody. Again washed three times with PBS containing 0.05% Triton X-100 for 10 minutes, and then stained with Western blotting detection reagent ECL (Amersham Life Science) at room temperature for 1 minute. ECL stained membranes were exposed to Fuji Scientific Imaging Film to reveal protein spots.
아래 표2은 서울대병원 산부인과로부터 확보한 시료 중 조기폐경 환자의 혈청을 PrxII 단백질 분석한 결과이다. 32예를 분석한 결과 20예에서 양성반응으로 나타났다.Table 2 below shows the results of PrxII protein analysis on serum of early menopausal patients from Seoul National University obstetrics and gynecology department. Twenty-two cases showed positive results in 20 cases.
표 2TABLE 2
아래 표 3은 다낭성난소증후군(PCOD) 환자의 혈청을 PrxII 단백질 분석한 결과이다. 8예를 분석한 결과 4예에서 양성반응으로 나타났다.Table 3 below shows the results of the PrxII protein analysis of the sera of PCOS patients. Analysis of 8 cases showed positive in 4 cases.
표 3TABLE 3
아래 표 4는 자궁내막증(Endometriosis) 환자의 혈청을 PrxII 단백질 분석한 결과이다. 30예를 분석한 결과 모두 음성반응으로 나타났다. Table 4 below shows the results of PrxII protein analysis on the serum of patients with endometriosis. Analysis of 30 cases showed negative responses.
표 4Table 4
아래 표 5는 정상인 혈청을 PrxII 단백질 분석한 결과이다. 28예를 분석한 결과 모두 음성반응으로 나타났다. Table 5 below shows the results of PrxII protein analysis on normal serum. Analysis of 28 cases showed negative responses.
표 5Table 5
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art will appreciate that the present invention can be implemented in other specific forms without changing the technical spirit or essential features. In this regard, it should be understood that the embodiments and experimental examples described above are illustrative in all respects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed that all changes or modifications derived from the meaning and scope of the appended claims and their equivalents, rather than the detailed description, are included in the scope of the present invention.
본 발명은 PrxII 단백질을 진단마커로 하여 PrxII 항체를 사용함으로써 사람을 포함한 자성 포유동물의 불임, 특히 조기폐경에 의한 불임을 정확하고 신속하게 진단할 수 있으므로 산업적으로 이용가치가 매우 높다 할 것이다. In the present invention, the use of PrxII protein as a diagnostic marker makes it possible to accurately and quickly diagnose infertility, particularly infertility due to early menopause, of human mammals including humans.
도 1a는 정상인의 혈청을 이차원 전기영동하여 얻는 영상이다.1A is an image obtained by two-dimensional electrophoresis of serum of a normal person.
도 1b는 조기폐경 사람 환자의 혈청을 이차원 전기영동하여 얻는 영상이다.Figure 1b is an image obtained by two-dimensional electrophoresis of the serum of a premenopausal human patient.
도 1c는 도 1a 및 1b에 나타낸 스폿에 대하여 PD-QUEST 소프트웨어를 이용하여 얻은 분석 그래프이다.1C is an analysis graph obtained using PD-QUEST software for the spots shown in FIGS. 1A and 1B.
도 2는 BI-POF-24 단백질 스폿에 대하여 MALDI/TOF-MS로 분석하여 얻은 펩타이드 프로필이다.2 is a peptide profile obtained by analysis of MALDI / TOF-MS for BI-POF-24 protein spot.
도 3은 소 뇌의 원심분리 상층액에 대하여 DEAE-sephacel로부터 크로마토그래피 프로필이다.3 is a chromatographic profile from DEAE-sephacel for centrifugal supernatant of cerebellum.
도 4는 도 3의 DEAE 분획에 대하여 페닐-5PW로부터 얻은 크로마토그래피 프로필이다.4 is a chromatographic profile obtained from phenyl-5PW for the DEAE fraction of FIG.
도 5는 도 4의 페닐-5PW 분획에 대하여 헤파린-5PW로부터 얻은 크로마토그래피 프로필이다.FIG. 5 is a chromatographic profile obtained from heparin-5PW for the phenyl-5PW fraction of FIG. 4.
도 6은 도 5의 헤타핀-5PW 분획에 대하여 MONO Q로부터 얻은 크로마토그래피 프로필이다.FIG. 6 is a chromatographic profile obtained from MONO Q for the hetapin-5PW fraction of FIG. 5.
도 7은 도 6의 MONO Q 분획에 대하여 Superdex 200으로부터 얻은 크로마토그래피 프로필이다.FIG. 7 is a chromatographic profile obtained from Superdex 200 for the MONO Q fraction of FIG. 6.
도 8은 시료의 SDS-PAGE 후 쿠마시 블루 염색 사진이다(1: DEAE 전; 2: 헤파린 전; 3: MONO Q 전; 4: 정제된 PrxII 단백질).8 is a Coomassie blue staining picture after SDS-PAGE of the sample (1: before DEAE; 2: before heparin; 3: before MONO Q; 4: purified PrxII protein).
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