KR100517817B1 - Novel SW culture medium for culturing animal and human oocytes fertilized in vitro, and culture method of oocytes using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동물 및 사람의 체외수정란의 배양배지용 조성물 및 이를 이용한 수정란의 배양방법에 관한 것으로, 본 발명은 배양액의 삼투압을 낮춤으로 체외에서 수정란의 발육이 기존의 시판되는 배양액보다도 매우 양호한 성적을 나타내었으며 결과적으로 기존보다 높은 임신율을 유지할 수 있는 뛰어난 효과를 제공한다. 또한, 본 발명은 전량 수입에 의존하여 수입 통관 과정에서 많은 시간이 경과되어 배양액의 신선도를 보장받을 수가 없었던 문제점을 해결하고, 임신율의 향상뿐만 아니라 배양액의 국산화에도 크게 기여할 수 있는 동물 및 사람 체외수정란의 배양배지용 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.The present invention relates to a composition for culturing medium for in vitro fertilization of animals and humans, and to a method for culturing fertilized eggs using the same. The present invention provides a better result than that of conventional culture medium by lowering the osmotic pressure of the culture medium. As a result, it provides an excellent effect of maintaining a higher pregnancy rate than conventional. In addition, the present invention solves the problem that the freshness of the culture medium can not be guaranteed after a long time in the import customs clearance process depending on the total amount of import, and in vitro fertilization of animals and humans that can greatly contribute to the localization of the culture solution as well as to improve the pregnancy rate There is an excellent effect of providing a composition for the culture medium.

Description

동물 및 사람 체외수정란의 배양배지용 ＳＷ 배양액 및 이를 이용한 수정란의 배양방법 {Novel SW culture medium for culturing animal and human oocytes fertilized in vitro, and culture method of oocytes using the same} Novel SW culture medium for culturing animal and human oocytes fertilized in vitro, and culture method of oocytes using the same

본 발명은 동물 및 사람의 체외수정란의 배양배지용 조성물 및 이를 이용한 수정란의 배양방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 불임시술에 수반되는 동물 및 사람의 체외수정란의 체외배양을 위한 배양액의 삼투압을 조절하여 임신성공율을 높이는 배양액 조성과 이를 이용한 수정란의 배양방법을 제공함에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for culture medium of in vitro fertilized eggs of animals and humans and a method of culturing fertilized eggs using the same. More specifically, the present invention relates to providing a culture composition and method for culturing fertilized eggs using the same to control the osmotic pressure of the culture medium for in vitro fertilization of in vitro fertilized eggs of animals and humans involved in infertility procedures to increase the gestational success rate.

동물 체세포의 체외배양법은 이미 수 십 년 전부터 여러 종류의 배양액이 개발되어 체외에서도 증식을 양호하게 시킬 수 있게 되었으나, 생식세포인 난자의 연구 역사는 비교적 짧은 편이다. 아직 이런 짧은 연구로 인하여 일종의 같은 세포라는 통념 속에서 수정란을 체세포 배양액으로 배양해 왔으며 난자의 대사생리가 아직 명확히 구명되지 않아 난자를 용이하게 체외에서 배양시킬 수 있는 배양액이 없었으므로 체세포 배양액에 난자 배양을 의존해 왔다고 볼 수 있다. 따라서 종래의 수많은 연구문헌을 살펴보면 포유동물의 수정란은 이와 같은 체세포 배양액으로 배양시킬 경우 대부분의 동물 종에서 8 세포기 이전에 발육정지 현상이 나타나 이 시기의 난자를 자궁에 이식할 경우 대부분의 난자를 사멸시켜 극히 저조한 임신율을 나타내어 이미 소등의 경제성이 높은 동물과 사람의 시험관아기 시술에 있어서 큰 문제로 대두되어 왔다. 그러나, 최근 이와 같은 문제점을 개선한 배양액이 개발, 시판되어 사람의 임신율도 많이 향상된 것이 사실이다.In vitro culture of animal somatic cells has been developed several decades ago to improve the growth in vitro, but the research history of the germ cells egg is relatively short. Because of this short research, we have been cultivating fertilized eggs in somatic cell culture under the notion that they are a kind of same cell. Since the metabolic physiology of the egg has not been clearly identified, there is no culture medium that can easily incubate the egg in vitro. It can be seen that it has depended on. Therefore, in a number of conventional literatures, embryonated embryos in mammalian embryos exhibited developmental arrest before 8 cell stages in most animal species, and when most of them were implanted into the uterus, It has become a big problem in the in vitro baby procedure of animals and humans, which has been extinguished and showed extremely low pregnancy rate and has high economic efficiency. However, the recent development of a culture solution that improves these problems is the fact that the pregnancy rate of humans has also improved a lot.

그러나, 시판되고 있는 배양액은 이와 같은 문제점을 어느 정도 해결하였으나 아직도 체외배양조건에 부적합한 점이 많고, 현재 전 세계적으로 시험관아기 시술에 임하는 대다수의 병원에서는 제약사에서 제조한 사람의 체액과 등장액인 배양액(285 mOsm)을 사서 시술에 임하고 있는 실정이며, 더욱이 국내의 병원에서는 이러한 배양액을 전량 수입에 의존하고 있으며 또한 수입 통관 과정에서 많은 시간이 경과되어 배양액의 신선도를 보장받을 수가 없는 면도 있다. 또한, 사람을 포함한 많은 포유동물에 있어서 배양액의 삼투압이 초기 수정란의 발생에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는데, 시판용 배양액은 삼투압이 사람의 체액과 등장액 조건(285 mOsm)으로 구성되어 있다. 이는 현재까지의 통념상 체외에서 이루어지는 환경을 체내 조건과 유사한 환경으로만 접근시키려는 고정관념에만 기인한 것으로 여겨진다.However, the commercially available culture solution has solved this problem to some extent, but it is still inadequate for in vitro culture conditions, and in most hospitals currently undergoing in vitro baby procedures, the culture fluid, which is the body fluid and isotonic solution of a person manufactured by a pharmaceutical company (285) mOsm) is buying and performing the procedure, and moreover, domestic hospitals rely on imports of these cultures in their entirety, and there is a possibility that the freshness of the cultures cannot be guaranteed due to a long time in the import customs clearance process. In addition, in many mammals, including humans, the osmotic pressure of the culture medium is known to affect the development of the initial fertilized egg, but commercially available culture medium is composed of human body fluid and isotonic fluid conditions (285 mOsm). It is believed that this is due to the stereotype of the conventional wisdom to approach the environment outside the body only to the environment similar to the internal conditions.

따라서, 본 발명자들은 생체 조건 즉, 자연임신이 이루어지는 체내 환경 조건과 체외수정과 배양의 체외 환경 조건(복강내의 압력 또는 미지 인자) 은 반드시 일치하지 않을 수도 있다는 점에 착안하여 소 수정란을 기초실험모델로 하여 배양액의 삼투압을 체액보다 낮게 조절하여 사람을 포함한 포유동물의 높은 임신율을 유지하고자 하였다.Therefore, the present inventors focus on the fact that in vivo, i.e., the in vivo environmental conditions in which the natural pregnancy occurs and the in vitro fertilization and in vitro environmental conditions (intraperitoneal pressure or unknown factors) may not necessarily coincide. By adjusting the osmotic pressure of the culture medium lower than the body fluid to maintain a high pregnancy rate of mammals, including humans.

따라서, 본 발명의 목적은 불임시술에 수반되는 사람 체외수정란의 체외배양에 적합한 배양액을 개선하고자 한다.Therefore, it is an object of the present invention to improve a culture medium suitable for in vitro culture of human in vitro fertilized eggs involved in infertility procedures.

또한, 본 발명의 다른 목적은 단태동물이며 수정란의 대사양식이 사람과 유사하며 임신기간이 같은 소의 수정란을 기초실험모델로 하여 배양액의 삼투압이 수정란의 체외발생에 미치는 영향을 규명한 후 사람의 임상에 적용하여 높은 임신율을 유지하고자 한다.In addition, another object of the present invention is to examine the effect of the osmotic pressure of the culture medium on the in vitro development of fertilized eggs by using a fertilized egg of a bovine animal whose metabolism is similar to that of human and similar pregnancy period. To maintain a high pregnancy rate.

본 발명의 상기 목적은 체외수정란의 체외배양 시 배양액의 삼투압에 따른 배발생율을 조사하고, 상기 결과로부터 체외배양에 적합한 삼투압으로 조절된 배양액을 제조하고, 종래의 배양액과 본 발명 배양액에서 소 수정란과 사람 수정란을 체외배양시키고 이들의 발육율을 조사함으로써 달성하였다. The object of the present invention is to investigate the embryonic rate according to the osmotic pressure of the culture medium in vitro culture of in vitro fertilization, and to prepare a culture medium adjusted to osmotic pressure suitable for in vitro culture from the above results, and in the conventional culture medium and the culture medium of the present invention Human fertilized eggs were in vitro cultured and their growth rates were investigated.

본 발명은 소 수정란의 체외배양 시 배발생에 대한 삼투압의 영향을 조사하는 단계; 및 종래의 배양액과 본 발명 배양액에서 소 수정란과 사람 수정란을 체외배양시켜 이들의 발육율을 조사하는 단계로 구성된다.The present invention comprises the steps of investigating the effect of osmotic pressure on embryo development during in vitro culture of bovine fertilized egg; And in vitro culture the bovine fertilized egg and the human fertilized egg in the conventional culture medium and the culture medium of the present invention to investigate their growth rate.

본 발명의 동물 및 사람의 체외수정란의 배양액은 사람의 시험관아기시술 전용 배양액으로 사용됨을 특징으로 한다.The culture medium of the in vitro fertilized eggs of animals and humans of the present invention is characterized in that it is used as a culture medium dedicated to human in vitro fertilization.

본 발명은 종래 배양액의 저해인자를 제거하고 종래의 285 mOsm의 삼투압에 비해 265 mOsm의 낮은 삼투압을 유지시키는 조성으로 구성됨을 특징으로 하는 동물 및 사람의 체외수정란의 체외배양을 위한 배양액을 제공한다.The present invention provides a culture medium for in vitro culture of in vitro fertilization of animals and humans, characterized in that the composition is configured to remove the inhibitory factor of the conventional culture medium and maintain a low osmotic pressure of 265 mOsm compared to the conventional osmotic pressure of 285 mOsm.

본 발명 SW1과 SW2 배양액에 있어서, SW1 배양액은 수정 후 수정란의 발육 단계상 16 세포기까지 배양이 가능하며, SW2 배양액은 16 세포기 이상부터 포배기까지의 수정란 배양에 사용됨을 특징으로 한다In the SW1 and SW2 culture solution of the present invention, the SW1 culture solution is capable of culturing up to 16 cell phases in the developmental stage of fertilized eggs after fertilization, and the SW2 culture solution is used for culturing fertilized eggs from 16 cell phase to blastocyst phase.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the specific method of the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited only to these Examples.

[실시예]EXAMPLE

실시예 1: 소 수정란의 체외배양 시 배발생에 대한 삼투압의 영향 조사Example 1 Investigation of the Effect of Osmotic Pressure on Embryogenesis in In Vitro Culture of Bovine Embryos

본 발명 동물 및 사람의 체외수정란의 체외배양에 적합한 배양액을 제공하기 위해, 체외수정란의 초기 발생에 있어서 배양액의 삼투압이 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해 단태동물이며 사람과 임신기간이 같은 소의 수정란이 사람 수정란의 에너지 대사와 흡사한 점이 많다는 것을 출원인 등의 국제논문을 통하여 밝힌 후(Kim JH, et al., Teriogenology, 39:875-886, 1993; Kim JH., et al., Biol. Reprod., 48:1320-1325, 1993; Conaghan J, et al., J. Reprod. Fertil., 99:87-95, 1993) 소를 실험모델로 하여 초기 발생에 미치는 삼투압의 영향에 관하여 조사하였다.In order to provide a culture medium suitable for in vitro culture of in vitro fertilized eggs of animals and humans of the present invention, the effect of the osmotic pressure of the culture on the initial generation of in vitro fertilized eggs. To this end, after an internationally published paper by Applicants et al., It was found that fertilized eggs in cattle with the same gestational age as humans have many similarities to the energy metabolism of human fertilized eggs (Kim JH, et al., Teriogenology , 39: 875-886, 1993; Kim JH., Et al., Biol. Reprod. , 48: 1320-1325, 1993; Conaghan J, et al., J. Reprod. Fertil. , 99: 87-95, 1993) The effect of osmotic pressure on early development was investigated.

우선, 소 난포란을 젖산(5 mM), 피루브산(0.4 mM), 글루코우즈(5.56 mM) 및 소 태아혈청(10%)을 첨가한 TCM-199으로 22 내지 24시간 동안 성숙배양하였다. 그 후 글루코우즈를 첨가하지 않은 조건 하에서 Niwa 등(J. Reprod. Fertil., 91:329, 1991)의 방법을 이용하여 체외수정을 시켰다. 수정 8시간 후 난구세포를 제거한 난자를 각각 다른 삼투압(225∼325 mOsm)을 갖는 발생 배양액(mTLP-PVA)에 옮겨 184시간 배양을 계속하였다(수정 120시간째에 글루코우즈를 첨가함). 배양액의 삼투압은 NaCl과 KCl로 조절하여 최종적으로 삼투압측정기로 실측하였다.First, bovine follicular eggs were matured for 22-24 hours with TCM-199 with lactic acid (5 mM), pyruvic acid (0.4 mM), glucose (5.56 mM) and fetal bovine serum (10%). Thereafter, in vitro fertilization was performed using Niwa et al. ( J. Reprod. Fertil. , 91: 329, 1991) under the condition that glucose was not added. After 8 hours of fertilization, the oocytes from which the oocytes had been removed were transferred to a developing culture medium (mTLP-PVA) having different osmotic pressures (225 to 325 mOsm), and the culture was continued for 184 hours (glucose was added at 120 hours of fertilization). Osmotic pressure of the culture was adjusted by NaCl and KCl and finally measured by an osmotic pressure meter.

체외수정된 소 수정란의 발육에 대한 삼투압의 영향Effect of Osmotic Pressure on the Development of In Vitro Fertilized Bovine Embryos 삼투압(mOsm)Osmotic pressure (mOsm) 체외수정된 난자 수In Vitro Fertilized Egg Count 발생된 배의 수 및 비율(%)Number and percentage of pears generated 2 세포기48시간2 cell phase 48 hours 8 세포기96시간8 cell phase 96 hours 상실배144시간Loss times 144 hours 포배기192시간Blast time 192 hours 225245265285305325225245265285305325 899294939392899294939392 61(69)a68(74)a69(73)a71(76)a65(70)a50(54)b61 (69) a68 (74) a69 (73) a71 (76) a65 (70) a50 (54) b 21(24)a49(53)b49(52)b52(56)b46(49)b18(20)a21 (24) a49 (53) b49 (52) b52 (56) b46 (49) b18 (20) a 6(7)a30(33)b36(38)b23(25)c18(19)c5(5)a6 (7) a30 (33) b36 (38) b23 (25) c18 (19) c5 (5) a 0(0)a17(18)b27(29)c11(12)b6(6)d0(0)a0 (0) a17 (18) b27 (29) c11 (12) b6 (6) d0 (0) a a-d: 각 값의 유의적 차를 나타낸 것이다(최소 P<0.05).a-d: It represents the significant difference of each value (minimum P <0.05).

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 2 세포기로의 분할율은 225∼305 mOsm의 삼투압 범위 내에서는 유의차는 없었으나(69∼76%), 325 mOsm(54%)에서는 유의적으로 낮았다(P<0.05). 8 세포기로의 분할율은 245∼305 mOsm의 범위에서는 유의차가 없었으나(49∼56%), 225(24%)와 325(20%) mOsm에서는 유의적으로 낮았다(P<0.05). 상실배까지의 발생율은 245∼265 mOsm에서 가장 높았고(33∼38%), 285∼305 mOsm(19∼25%), 225(7%)와 325(20%) mOsm의 순으로 유의적으로 저하하였다(P<0.05). 그러나 포배기 발생율은 다른 삼투압(0∼18%)와 비교하여 265 mOsm(29%)에서 가장 높았다(P<0.05).As a result, as shown in Table 1, the splitting rate to 2 cell groups was not significantly different within the osmotic pressure range of 225 to 305 mOsm (69 to 76%), but was significantly lower at 325 mOsm (54%) (P < 0.05). The splitting rate into 8 cell groups was not significantly different in the range of 245 to 305 mOsm (49 to 56%), but was significantly lower at 225 (24%) and 325 (20%) mOsm (P <0.05). The incidence up to loss was highest at 245 to 265 mOsm (33 to 38%), followed by 285 to 305 mOsm (19 to 25%), followed by 225 (7%) and 325 (20%) mOsm. (P <0.05). However, blastocyst incidence was highest at 265 mOsm (29%) compared with other osmotic pressures (0-18%) (P <0.05).

상기 결과로부터, Miyoshi 등(J. Reprod. Fertil., 100:21,1994)이 쥐를 모델로 한 실험 결과와 동일하여 본 발명자들은 소 1 세포기를 포배기까지 발생시킴에 있어서 비교적 낮은 삼투압의 조건이 적당하다는 것을 명확히 밝힘에 따라, 이하 사람 수정란의 배양 시 265 mOsm 삼투압 조건 하의 배양액(SW1, SW2 배양액)을 이용하여 포배기 형성율을 조사하였다. 도 1은 종래의 배양액과 본 발명 배양액에서 체외 배양된 소 수정란의 상태를 나타낸 그림이다.From the above results, Miyoshi et al . ( J. Reprod. Fertil ., 100: 21, 1994) are the same as the experimental results of modeling the rats. As clear as appropriate, the blastocyst formation rate was investigated using the culture medium (SW1, SW2 culture solution) under 265 mOsm osmotic pressure in the culture of human fertilized eggs. 1 is a view showing the state of bovine fertilized egg cultured in vitro in the conventional culture medium and the culture medium of the present invention.

실시예 2: 사람 체외수정란의 체외배양에 적합한 본 발명 배양액의 제조Example 2: Preparation of the culture solution of the present invention suitable for in vitro culture of human in vitro fertilization

상기 실시예 1에서와 같이 배양액의 265 mOsm의 삼투압에서 소의 포배기 발생율이 현저히 증가함에 따라 상기 삼투압 조건에서 사람 체외수정란의 포배기 발생율을 높일 수 있는 배양액을 제조하였다. 상기 배양액의 조성과 농도는 하기 표 2에 나타내었으며, 첨가 성분에 따라 배양액을 SW1 및 SW2로 각각 명명하였으며, 상기 배양액들의 각 조성은 정제수 총 1L 당 g 중량으로 첨가하여 제조되었다. SW1 배양액에는 D-글루코우즈와 소듐 포스페이트가 첨가되지 않았으며, 삼투압은 265 mOsm으로 하였다. 또한, SW2 배양액은 D-글루코우즈(5.56 mM)와 소듐 포스페이트(0.35 mM)가 첨가되었으며, 삼투압은 265 mOsm로 조절하였다. 상기 SW1과 SW2 배양액의 차이는 SW1 배양액은 수정 후 수정란의 발육 단계상 16 세포기까지 배양이 가능하며, SW2 배양액은 16 세포기 이상부터 포배기까지의 수정란 배양에 사용된다. 대조군으로 사용된 종래의 시험관아기시술용 배양액은 HTF(Human Tubal Fluid, Irvine, U.S.A) 배지를 사용하였으며, 상기 배양액은 285 mOsm의 높은 삼투압과 저해인자를 포함하고 있다. As in Example 1, as the incidence rate of bovine blastocyst increased significantly at an osmotic pressure of 265 mOsm of the culture medium, a culture medium capable of raising the blastocyst incidence rate of human in vitro fertilized eggs was prepared under the osmotic pressure. The composition and concentration of the culture solution are shown in Table 2 below, and the culture solution was named SW1 and SW2, respectively, according to the added ingredients, and each composition of the culture solution was prepared by adding g weight per 1 L of purified water. D-glucose and sodium phosphate were not added to the SW1 culture, and the osmotic pressure was 265 mOsm. In addition, D-glucose (5.56 mM) and sodium phosphate (0.35 mM) were added to the SW2 culture medium, and the osmotic pressure was adjusted to 265 mOsm. The difference between the SW1 and SW2 culture medium is that the SW1 culture medium can be cultured up to 16 cell stages in the development stage of fertilized eggs after fertilization, and the SW2 culture solution is used for fertilization of the fertilized egg from 16 cell stage to blastocyst stage. Conventional in vitro baby culture medium used as a control was HTF (Human Tubal Fluid, Irvine, U.S.A) medium, the culture medium contains a high osmotic pressure and inhibitory factor of 285 mOsm.

체외수정란의 배양에 사용된 본 발명 배양액 SW1 및 SW2의 조성Composition of the inventive cultures SW1 and SW2 used for the cultivation of in vitro fertilized eggs 조성(화학식) Composition 농도 (g/1L)Concentration (g / 1L) SW1SW1 SW2SW2 무기염Inorganic salt 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Calcium Chloride(CaCl2·2H2O)Magnesium Chloride(MgCl2·6H2O)Potasium Bicarbonate(KHCO3)Potasium Chloride(KCl)Sodium Bicarbonate(NaHCO3)Sodium Chloride(NaCl)Sodium Phosphate(NaH2PO4·2H2O)Calcium Chloride (CaCl 2 · 2H 2 O) Magnesium Chloride (MgCl 2 · 6H 2 O) Potasium Bicarbonate (KHCO 3 ) Potasium Chloride (KCl) Sodium Bicarbonate (NaHCO 3 ) Sodium Chloride (NaCl) Sodium Phosphate (NaH 2 PO 4 2H 2 O) 0.29000.04800.50800.24001.68045.1780---0.29000.04800.50800.24001.68045.1780 --- 0.29000.04800.50800.24001.68045.00270.05400.29000.04800.50800.24001.68045.00270.0540 아미노산amino acid 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21. L-Alanine(C3H7NO2)L-Arginine(C6H14N4O2)L-Asparagine(C4H8N2O3)L-Aspartic acid(C4H7NO4)L-Cystine(C6H12N2O4S2)L-Glutamic acid(C5H9NO4)L-Glutamine(C5H10N2O3)Glycine(C2H5NO2)L-Histidine·HCl·H2O(C6H9N3O2·HCl·H2O)L-Isoleucine(C6H13NO2)L-Leucine(C6H13NO2)L-Lysine·HCl(C6H14N2O2·HCl)L-Methionine(C5H11NO2S)L-Phenylalanine(C9H11NO2)L-Poline(C5H9NO2)L-Serine(C3H7NO3)L-Taurine(C2H7NO3S)L-Threonine(C4H9NO3)L-Tryptophan(C11H12N2O2)L-Tyrosine(C9H9NO3)L-Valine(C5H11NO2)L-Alanine (C 3 H 7 NO 2 ) L-Arginine (C 6 H 14 N 4 O 2 ) L-Asparagine (C 4 H 8 N 2 O 3 ) L-Aspartic acid (C 4 H 7 NO 4 ) L -Cystine (C 6 H 12 N 2 O 4 S 2 ) L-Glutamic acid (C 5 H 9 NO 4 ) L-Glutamine (C 5 H 10 N 2 O 3 ) Glycine (C 2 H 5 NO 2 ) L- Histidine · HCl · H 2 O ( C 6 H 9 N 3 O 2 · HCl · H 2 O) L-Isoleucine (C 6 H 13 NO 2) L-Leucine (C 6 H 13 NO 2) L-Lysine · HCl (C 6 H 14 N 2 O 2 HCl) L-Methionine (C 5 H 11 NO 2 S) L-Phenylalanine (C 9 H 11 NO 2 ) L-Poline (C 5 H 9 NO 2 ) L-Serine ( C 3 H 7 NO 3 ) L-Taurine (C 2 H 7 NO 3 S) L-Threonine (C 4 H 9 NO 3 ) L-Tryptophan (C 11 H 12 N 2 O 2 ) L-Tyrosine (C 9 H 9 NO 3 ) L-Valine (C 5 H 11 NO 2 ) 0.00890.12640.01500.01330.02400.01470.14600.00750.04200.05250.05240.07250.01510.03300.01150.01050.01260.04760.01020.03600.04680.00890.12640.01500.01330.02400.01470.14600.00750.04200.05250.05240.07250.01510.03300.01150.01050.01260.04760.01020.03600.0468 0.00890.12640.01500.01330.02400.01470.14600.00750.04200.05250.05240.07250.01510.03300.01150.01050.01260.04760.01020.03600.04680.00890.12640.01500.01330.02400.01470.14600.00750.04200.05250.05240.07250.01510.03300.01150.01050.01260.04760.01020.03600.0468

조성(화학식) Composition 농도 (g/1L)Concentration (g / 1L) SW1SW1 SW2SW2 비타민vitamin 1.2.3.4.5.6.7.8.9.1.2.3.4.5.6.7.8.9. Biotin(C10H16N2O3S)D-Ca Pantothenate(C18H32CaN2O10)Choline Chloride(C5H14ClNO)Folic acid(C19H19N7O6)i-Inositol(C6H12O6)Nicotinamide(C6H6N2O)Pyridoxal·HCl(C8H11NO3·HCl)Riboflavine(C17H2ON4O6)Thiamine·HCl(C12H17ClN4OS·HCl)Biotin (C 10 H 16 N 2 O 3 S) D-Ca Pantothenate (C 18 H 32 CaN 2 O 10 ) Choline Chloride (C 5 H 14 ClNO) Folic acid (C 19 H 19 N 7 O 6 ) i-Inositol (C 6 H 12 O 6) Nicotinamide (C 6 H 6 N 2 O) Pyridoxal · HCl (C 8 H 11 NO 3 · HCl) Riboflavine (C 17 H 2 ON 4 O 6) Thiamine · HCl (C 12 H 17 ClN 4 OSHCl) 0.00100.00100.00100.00100.00200.00100.00100.00010.00100.00100.00100.00100.00100.00200.00100.00100.00010.0010 0.00100.00100.00100.00100.00200.00100.00100.00010.00100.00100.00100.00100.00100.00200.00100.00100.00010.0010 기타Etc 1.2.3.4.5.6.7.1.2.3.4.5.6.7. EthyleneDiamineTetraAcetic Acid(EDTA)D-Glucose(C10H14N2O8Na2·2H2O)Insulin(C6H12O6)Penicilline-GDL-Sodium Lactate(C3H5O3Na)Sodium Pyruvate(C3H3O3Na)StreptomycineEthyleneDiamineTetraAcetic Acid (EDTA) D-Glucose (C 10 H 14 N 2 O 8 Na 2 · 2H 2 O) Insulin (C 6 H 12 O 6) Penicilline-GDL-Sodium Lactate (C 3 H 5 O 3 Na) Sodium Pyruvate (C 3 H 3 O 3 Na) Streptomycine 0.0292---0.00070.06001.40000.05000.04000.0292 --- 0.00070.06001.40000.05000.0400 0.02921.00000.00070.06001.40000.05000.04000.02921.00000.00070.06001.40000.05000.0400

도 1에 나타난 바와 같이, 기존의 배양액(285 mOsm)과 본 발명 배양액(265 mOsm)으로 배양된 수정 후 173시간째의 소 수정란은 배양액의 삼투압 조건이 높은 쪽(285 mOsm)보다 낮은 쪽(265 mOsm)에서의 발육율이 현격히 양호함을 알 수 있다. As shown in FIG. 1, the fertilized egg at 173 hours after fertilization incubated with the conventional culture medium (285 mOsm) and the culture medium of the present invention (265 mOsm) has a lower osmotic condition than the higher side (285 mOsm). It can be seen that the growth rate in mOsm) is remarkably good.

도 2에 나타나 바와 같이, 기존의 배양액(285 mOsm)과 본 발명 배양액(265 mOsm)으로 배양된 수정 후 132시간째의 사람 수정란은 배양액의 삼투압 조건이 높은 쪽(285 mOsm)보다 낮은 쪽(265 mOsm)에서의 발육율이 현격히 양호함을 알 수 있다.As shown in Figure 2, human fertilized eggs at 132 hours after fertilization cultured with the conventional culture medium (285 mOsm) and the culture medium of the present invention (265 mOsm) is lower than the higher osmotic conditions (285 mOsm) of the culture medium (265 mOsm) It can be seen that the growth rate in mOsm) is remarkably good.

실시예 3: 본 발명 배양액의 사람 임상(시험관아기시술)에서의 적용Example 3: Application of the Incubation Solution of the Invention in Human Clinical Trials

본 발명 배양액의 임신성공율에 대한 효과를 비교하기 위해, 일반적인 체외수정(시험관아기시술)을 대상으로 하여 HTF 배양액(285 mOsm)을 이용한 임신율의 결과 49주기와 본 발명 배양액(265 mOsm)을 이용한 임신율의 결과 88주기를 비교 분석하였다.        In order to compare the effect on the gestational success rate of the culture medium of the present invention, the result of the pregnancy rate using the HTF culture medium (285 mOsm) for the general in vitro fertilization (in vitro fertilization) 49 cycles and the pregnancy rate using the culture medium (265 mOsm) Results were compared and analyzed for 88 cycles.

일반적인 시술방법은 양 실험군 간의 차이는 없었으며 수정란을 배양시키는 HTF 배양액과 본 발명 배양액을 이용한 차이만 있었다.       The general procedure was not different between the two groups, only the difference between the HTF culture medium for fertilizing the embryo and the culture medium of the present invention.

일반적인 시술방법을 간단히 요약하면 환자로부터 채취한 난자를 실체현미 경하에서 성숙도를 판정하여 100 ㎕ 수정배지 안에 5∼10개의 난자를 넣은 후 Ham's F-10 정자세척용 배지로 정액을 2회 원심분리한 후 최종 정자괴에 Ham's F-10 0.5∼1.0 mL를 첨가하여 생존 정자를 회수한 후 최종 정자농도 1∼2 ×105/mL 가 되도록 조정하여 난자가 들어 있는 수정배지 안에 투입하여 수정시켰다.To summarize the general procedure, oocytes collected from the patient were judged for maturity under stereomicroscopy, and 5-10 eggs were placed in 100 µl fertilization medium, followed by centrifugation of semen twice with Ham's F-10 sperm washing medium. After recovering the viable sperm by adding 0.5 ~ 1.0 mL of Ham's F-10 to the final sperm mass, the final sperm concentration was adjusted to 1 ~ 2 × 10 5 / mL and injected into the fertilized medium containing the egg was fertilized.

수정 후 16시간째 수정 확인을 하여 수정이 확인된 수정란을 10% hFF(human Follicular Fluid; 사람 난포액)가 포함된 배양액으로 이식 전까지 배양하였다.       16 hours after fertilization, fertilization was confirmed, and fertilized eggs were fertilized with a culture solution containing 10% hFF (human Follicular Fluid).

한편, hFF는 난자채취 시 성숙 난자가 포함된 난포액을 회수한 후 시험관아기시술에서 임신이 확인되고 전염성 질병 및 산부인과적 문제가 없는 환자의 난포액만을 선별하여 열처리(56℃에서 30분)한 후 시술에 이용하였다.       On the other hand, hFF recovers follicular fluids containing mature eggs during oocyte collection and then undergoes heat treatment (30 minutes at 56 ° C) by selecting only the follicular fluids of patients without pregnancy and infectious diseases and gynecological problems. It was used for.

5일간의 배양 후 3∼4개의 배아를 각각의 환자에게 이식하고 그 임상결과를 표 3에 나타내었다.       After 5 days of culture, three to four embryos were transplanted to each patient and the clinical results are shown in Table 3.

종래의 배양액(HTF, 285 mOsm)과 본 발명 배양액(SW 배양액, 265 mOsm)간의 임신율의 비교Comparison of pregnancy rates between conventional cultures (HTF, 285 mOsm) and inventive cultures (SW culture, 265 mOsm) SW 배양액SW culture HTF 배양액HTF culture 총 시술 주기 임신율 단태 임신 쌍태 임신 3태 임신 이상The total treatment period singleton pregnancy twin pregnancy pregnancy pregnancy least three states 88주기 43 (48.9) a 23 (53.5)a 16 (37.2)a 4 ( 9.3)a 88 Cycle 43 (48.9) a 23 (53.5) a 16 (37.2) a 4 (9.3) a 49주기 14 (28.6) b 11 (78.6)b 3 (21.4)b 0 ( 0.0)b 49 cycle 14 (28.6) b 11 (78.6) b 3 (21.4) b 0 (0.0) b a-b : 각 값의 유의적 차를 나타낸 것이다(최소 P<0.05)a-b: It shows the significant difference of each value (minimum P <0.05) ( )안의 수치는 각각의 임신율(%)을 나타낸 것이다Figures in () show each pregnancy rate (%)

표 3에 나타난 바와 같이, 상기 시술예는 임신결과를 비교, 분석한 예로 전체적인 임신율에 있어서 본 발명 배양액으로 배양된 시험군에서 월등히 높은 임신성공율을 보이고 있으며 단태임신에 있어서는 기존의 HTF 배양액 쪽이 높게 나타나고 쌍태임신 이상은 본 발명 배양액으로 배양된 시험군에서 보다 낮게 나타나고 있다. 이것은 HTF 배양액으로 배양된 수정란이 임신에 기여할 수 있는 즉, 양호하게 자란 수정란이 적다는 의미로 해석할 수 있으며 쌍태, 3태 이상 임신을 포함한 전반적인 임신율에 있어서 본 발명 배양액 쪽이 월등히 임신성공율이 높음을 알 수 있다.As shown in Table 3, the above example shows a significantly higher gestational success rate in the test group incubated with the culture medium of the present invention in the overall pregnancy rate. And twin pregnancy abnormalities are lower in the test group incubated with the culture of the present invention. This can be interpreted to mean that fertilized eggs cultured with HTF culture can contribute to pregnancy, that is, there are few well-grown fertilized eggs. It can be seen.

상기 실시예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명은 동물 및 사람 체외수정란의 배양배지용 조성물 및 이를 이용한 수정란의 배양방법에 관한 것으로, 본 발명은 배양액의 삼투압을 낮춤으로써 체외에서 수정란의 발육이 기존의 시판되는 배양액보다도 매우 양호한 성적을 나타내었으며 결과적으로 기존보다 높은 임신율을 유지할 수 있는 뛰어난 효과를 제공한다. 또한, 본 발명은 전량 수입에 의존하여 수입 통관 과정에서 많은 시간이 경과되어 배양액의 신선도를 보장받을 수가 없었던 문제점을 해결하고, 임신율의 향상뿐만 아니라 배양액의 국산화에도 크게 기여할 수 있는 동물 및 사람 체외수정란의 배양배지용 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명 배양액은 의학산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described through the above examples, the present invention relates to a composition for culturing medium for in vitro fertilization of animals and humans, and a method for culturing fertilized eggs using the same, and the present invention lowers the osmotic pressure of the culture solution, and thus the development of fertilized eggs in vitro is conventional. The result was much better than the commercially available culture solution, and as a result, it provides an excellent effect of maintaining a higher pregnancy rate than conventional. In addition, the present invention solves the problem that the freshness of the culture medium can not be guaranteed after a long time in the import customs clearance process depending on the total amount of import, and in vitro fertilization of animals and humans that can greatly contribute to the localization of the culture solution as well as to improve the pregnancy rate There is an excellent effect of providing a composition for the culture medium. Therefore, the culture medium of the present invention is a very useful invention in the medical industry.

도 1은 종래의 배양액(285 mOsm)과 본 발명 배양액(265 mOsm)에서 배양된 수정 후 173시간째의 소 수정란을 나타낸 사진도이다. 1 is a photograph showing a bovine fertilized egg at 173 hours after fertilization cultured in a conventional culture medium (285 mOsm) and the culture medium of the present invention (265 mOsm).

도 2는 종래의 배양액(285 mOsm)과 본 발명 배양액(265 mOsm)에서 배양된 수정 후 132시간째의 사람 수정란을 나타낸 사진도이다. Figure 2 is a photograph showing a human fertilized egg at 132 hours after fertilization cultured in a conventional culture medium (285 mOsm) and the culture medium of the present invention (265 mOsm).

Claims (3)

동물 또는 사람 수정란의 16 세포기까지 배양에 적합하며, 265 mOsm의 삼투압으로 조절되며, 다음의 조성을 정제수 총 1L 당 g 중량으로 포함함을 특징으로 하는 동물 및 사람 체외수정란의 배양배지용 SW 배양액: Suitable for culturing up to 16 cell phases of animal or human fertilized eggs, controlled by an osmotic pressure of 265 mOsm, SW culture medium for the culture medium of animal and human in vitro fertilized egg, characterized in that it comprises the following composition in g weight per 1 L of purified water: 0.2900 g/L의 칼슘 클로라이드, 0.0480 g/L의 마그네슘 클로라이드, 0.508 g/L의 포타슘 바이카보네이트, 0.2400 g/L의 포타슘 클로라이드, 1.6804 g/L의 소듐 바이카보네이트, 5.1780 g/L의 소듐 클로라이드, 0.0089 g/L의 L-알라닌, 0.1264 g/L의 L-아르기닌, 0.0150 g/L의 L-아스파라긴, 0.0133 g/L의 L-아스파르트산, 0.0240 g/L의 L-시스틴, 0.0147 g/L의 L-글루탐산, 0.1460 g/L의 L-글루타민, 0.0075 g/L의 0.0420 g/L의 L-히스티딘·HCl·H2O, 0.0525 g/L의 이소루이신, 0.0524 g/L의 L-루이신, 0.0725 g/L의 L-리신·HCl, 0.0151 g/L의 L-메티오닌, 0.0330 g/L의 L-페닐알라닌, 0.0115 g/L의 L-폴린, 0.0105 g/L의 L-세린, 0.0126 g/L의 L-타우린, 0.0476 g/L의 L-트레오닌, 0.0102 g/L의 L-트립토판, 0.0360 g/L의 L-티로신, 0.0468 g/L의 L-발린, 0.0010 g/L의 비오틴, 0.0010 g/L의 D-Ca 판토테네이트, 0.0010 g/L의 콜린 클로라이드, 0.0010 g/L의 폴산, 0.0020 g/L의 i-이노시톨, 0.0010 g/L의 니코틴 아마이드, 0.0010 g/L의 피리독살·HCl, 0.0001 g/L의 리보플라빈, 0.0010 g/L의 티아민·HCl, 0.0292 g/L의 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 0.0007 g/L의 인슐린, 0.0600 g/L의 페니실린-G, 1.400 g/L의 DL-소듐 락테이트, 0.0500 g/L의 소듐 피루베이트 및 0.0400 g/L의 스트렙토마이신.0.2900 g / L calcium chloride, 0.0480 g / L magnesium chloride, 0.508 g / L potassium bicarbonate, 0.2400 g / L potassium chloride, 1.6804 g / L sodium bicarbonate, 5.1780 g / L sodium chloride, 0.0089 g / L L-alanine, 0.1264 g / L L-arginine, 0.0150 g / L L-asparagine, 0.0133 g / L L-aspartic acid, 0.0240 g / L L-cystine, 0.0147 g / L L-glutamic acid, 0.1460 g / L L-glutamine, 0.0075 g / L 0.0420 g / L L-histidine-HCl.H 2 O, 0.0525 g / L isoleucine, 0.0524 g / L L- Leucine, 0.0725 g / L L-lysineHCl, 0.0151 g / L L-methionine, 0.0330 g / L L-phenylalanine, 0.0115 g / L L-polline, 0.0105 g / L L-serine, 0.0126 g / L L-taurine, 0.0476 g / L L-threonine, 0.0102 g / L L-tryptophan, 0.0360 g / L L-tyrosine, 0.0468 g / L L-valine, 0.0010 g / L Biotin, 0.0010 g / L D-Ca pantothenate, 0.0010 g / L choline chloride, 0.0010 g / L folic acid, 0.0020 g / L i- Citol, 0.0010 g / L nicotine amide, 0.0010 g / L pyridoxal HCl, 0.0001 g / L riboflavin, 0.0010 g / L thiamine HCl, 0.0292 g / L ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.0007 g / L insulin, 0.0600 g / L penicillin-G, 1.400 g / L DL-sodium lactate, 0.0500 g / L sodium pyruvate and 0.0400 g / L streptomycin. 동물 또는 사람 수정란의 16세포기∼포배기까지의 배양에 적합하며, 265 mOsm의 삼투압으로 조절되며, 다음의 조성을 정제수 총 1L 당 g 중량으로 포함함을 특징으로 하는 동물 및 사람 체외수정란의 배양배지용 SW 배양액:Suitable for cultivation of animal or human fertilized eggs from 16 cell phase to blastocyst, controlled by osmotic pressure of 265 mOsm, and for the culture medium of animal and human in vitro fertilized egg, characterized in that the following composition is contained in g weight per 1 L of purified water SW cultures: 0.2900 g/L의 칼슘 클로라이드, 0.0480 g/L의 마그네슘 클로라이드, 0.5080 g/L의 포타슘 바이카보네이트, 0.2400 g/L의 포타슘 클로라이드, 1.6804 g/L의 소듐 바이카보네이트, 5.0027 g/L의 소듐 클로라이드, 0.0540 g/L의 소듐 포스페이트, 0.0089 g/L의 L-알라닌, 0.1264 g/L의 L-아르기닌, 0.0150 g/L의 L-아스파라긴, 0.0133 g/L의 L-아스파르트산, 0.0240 g/L의 L-시스틴, 0.0147 g/L의 L-글루탐산, 0.1460 g/L의 L-글루타민, 0.0075 g/L의 0.0420 g/L의 L-히스티딘·HCl·H2O, 0.0525 g/L의 이소루이신, 0.0524 g/L의 L-루이신, 0.0725 g/L의 L-리신·HCl, 0.0151 g/L의 L-메티오닌, 0.0330 g/L의 L-페닐알라닌, 0.0115 g/L의 L-폴린, 0.0105 g/L의 L-세린, 0.0126 g/L의 L-타우린, 0.0476 g/L의 L-트레오닌, 0.0102 g/L의 L-트립토판, 0.0360 g/L의 L-티로신, 0.0468 g/L의 L-발린, 0.0010 g/L의 비오틴, 0.0010 g/L의 D-Ca 판토테네이트, 0.0010 g/L의 콜린 클로라이드, 0.0010 g/L의 폴산, 0.0020 g/L의 i-이노시톨, 0.0010 g/L의 니코틴 아마이드, 0.0010 g/L의 피리독살·HCl, 0.0001 g/L의 리보플라빈, 0.0010 g/L의 티아민·HCl, 0.0292 g/L의 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 1.0000 g/L의 D-글루코우즈, 0.0007 g/L의 인슐린, 0.0600 g/L의 페니실린-G, 1.4000 g/L의 DL-소듐 락테이트, 0.0500 g/L의 소듐 피루베이트 및 0.0400 g/L의 스트렙토마이신.0.2900 g / L calcium chloride, 0.0480 g / L magnesium chloride, 0.5080 g / L potassium bicarbonate, 0.2400 g / L potassium chloride, 1.6804 g / L sodium bicarbonate, 5.0027 g / L sodium chloride, 0.0540 g / L sodium phosphate, 0.0089 g / L L-alanine, 0.1264 g / L L-arginine, 0.0150 g / L L-asparagine, 0.0133 g / L L-aspartic acid, 0.0240 g / L L-cystine, 0.0147 g / L L-glutamic acid, 0.1460 g / L L-glutamine, 0.0075 g / L 0.0420 g / L L-histidine-HCl.H 2 O, 0.0525 g / L isoleucine , 0.0524 g / L L-Leucine, 0.0725 g / L L-LysineHCl, 0.0151 g / L L-Methionine, 0.0330 g / L L-phenylalanine, 0.0115 g / L L-Poline, 0.0105 g / L L-serine, 0.0126 g / L L-taurine, 0.0476 g / L L-threonine, 0.0102 g / L L-tryptophan, 0.0360 g / L L-tyrosine, 0.0468 g / L L -Valine, 0.0010 g / L biotin, 0.0010 g / L D-Ca pantothenate, 0.0010 g / L choline chloride, 0.0 010 g / L folic acid, 0.0020 g / L i-inositol, 0.0010 g / L nicotine amide, 0.0010 g / L pyridoxal HCl, 0.0001 g / L riboflavin, 0.0010 g / L thiamine HCl, 0.0292 g / L ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1.0000 g / L D-glucose, 0.0007 g / L insulin, 0.0600 g / L penicillin-G, 1.4000 g / L DL-sodium lactate , 0.0500 g / L sodium pyruvate and 0.0400 g / L streptomycin. 제1항 또는 제2항 기재의 배양배지용 조성물로 제조된 배지에서 배양됨을 특징으로 하는 동물 및 사람 체외수정란의 배양방법.A method for culturing in vitro fertilized animals and humans, characterized in that cultured in a medium prepared from the composition for culture medium according to claim 1 or 2.
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