KR100517120B1 - Method for measuring ciliary wave disorder of airway using digital image - Google Patents
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Abstract
본 발명은 디지털 영상분석 방법을 응용하여 배양액에서 실제로 운동하고 있는 기도 섬모파에 대한 방향의 무질서도를 측정하는 방법에 관한 것으로, 카메라와 현미경을 이용하여 섬모 배양액에서 섬모 운동의 디지털 영상을 획득하는 제 1 단계; 상기 영상을 같은 크기의 사각형 스폿(Spot)으로 나누고, 상기 각 스폿에 포함된 픽셀의 모든 그레이 값을 더하여 주기적인 섬모 비트(Beat)를 나타내는 타임시리즈(Time Series)를 생성하는 제 2 단계; 지정된 영역(Region Of Interest)에서 상기 타임시리즈를 이용하여 하나의 기준 스폿과 주위의 다른 스폿들의 상관계수를 구하고 상기 상관계수를 이용하여 공간적 위상차 지도를 구성하는 제 3 단계; 상기 지도에 대하여 2개의 주 관성축을 결정하고 관성 모멘트가 최소가 되는 주 관성축을 섬모운동의 동위상 방향으로 결정하는 제 4 단계; 상기 동위상 방향과 수직인 섬모파의 진행 방향 분포에 대해 표준편차를 계산하여 무질서도를 구하는 제 5 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 영상을 이용한 기도 섬모파의 무질서도 계측 방법을 제공하는 것을 요지로 한다.The present invention relates to a method for measuring the disorder of the direction to the airway cilia actually moving in a culture medium by applying a digital image analysis method, and using a camera and a microscope to obtain a digital image of the cilia movement in the ciliary medium First step; Dividing the image into rectangular spots of equal size and adding all gray values of pixels included in the spots to generate a time series representing periodic cilia beats; A third step of obtaining a correlation coefficient between one reference spot and other surrounding spots using the time series in a region of interest and constructing a spatial phase difference map using the correlation coefficient; Determining a second main inertia axis with respect to the map and determining a main inertia axis in which the moment of inertia is minimum in the in-phase direction of the cilia motion; Comprising a fifth step of calculating the standard deviation with respect to the distribution of the direction of the ciliary wave perpendicular to the in-phase direction to obtain a disorder degree; providing a method for measuring the disorder of the airway cilia using a digital image, characterized in that it comprises a Let's make a point.
Description
본 발명은 섬모파의 무질서도 계측 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 디지털 영상분석 방법을 응용하여 배양액에서 실제로 운동하고 있는 기도 섬모파에 대한 방향의 무질서도를 측정하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for measuring the disorder of the cilia, and more particularly, to a method of measuring the disorder of the direction with respect to the airway cilia actually moving in a culture medium by applying a digital image analysis method.
기도 내 점액층의 섬모는 외부로부터 끊임없이 들어오는 미생물, 독성 물질 및 불순물을 동기화되고 정렬된 움직임을 통하여 제거함으로써 우리 몸을 보호하는 1차 방어기전으로서 중요한 역할을 한다. The cilia of the mucous layer in the airways play an important role as the primary defense mechanism that protects our bodies by removing microorganisms, toxic substances and impurities constantly coming from outside through synchronized and aligned movements.
섬모기능의 장애에 의한 질병에는 선천적인 원발성 섬모운동 이상증(Primary Ciliary Dyskinesia, PCD)과 후천적으로 장애가 초래되는 후천성 섬모운동 이상증, 섬모정체, 섬모운동 이상으로 인하여 유발되는 비강 및 부비동염, 기관지염, 기관지 확장증 등이 있다. Diseases caused by ciliary dysfunction include congenital primary Ciliary Dyskinesia (PCD) and acquired ciliary dyskinesia, which is caused by acquired disorders, ciliary congestion, bronchitis, and bronchitis. Etc.
섬모는 시간적 및 공간적 위상차를 가지고 조화되어 움직이며 연속적인 파를 형성하는데 이것을 메타그로니즘(Metachronism)이라 하며, 섬모 수송계의 추진력은 섬모운동 주파수(Ciliary Beat Frequency, CBF) 뿐만 아니라 섬모의 정렬 정도와 섬모간의 메타크로니즘적인 관계 등에 의해 결정된다. 섬모의 정렬 방향은 정상인에서도 상당한 변동이 있을 뿐만 아니라 정렬 방향의 무질서도(Disorder)가 질환에 의해서 2차적으로 발생할 수 있으며, 반대로 정상적인 CBF를 가지면서도 섬모파들의 방향에 있어서 정렬도가 부족한 경우에는 섬모 수송계가 제대로 작동하지 못하며 여러 가지 기도질환을 유발하게 된다. 질병 및 치료 약물에 의해 섬모운동 특성이 변화되는 양상을 검사하기 위해서는 이러한 특성들을 정량적이고 객관적으로 측정할 수 있어야 한다.Cilia move in harmony with temporal and spatial phase differences and form a continuous wave. This is called metachronism, and the driving force of the ciliary transport system is not only the Ciliary Beat Frequency (CBF) but also the degree of alignment of the cilia. And the metachromatic relationship between the cilia and the cilia. In addition to the significant fluctuations in the alignment of cilia in normal individuals, disorders in the alignment direction may occur secondarily due to diseases.On the contrary, in the case of having normal CBF but lacking alignment in the direction of the cilia. The ciliary transport system is not working properly and causes various airway diseases. In order to examine how ciliary motility changes with disease and therapeutic drugs, these qualities must be quantitative and objectively measured.
CBF를 측정하기 위해서 가장 많이 이용되는 방법은 광전 신호(Photoelectric Signal)를 이용하는 방법이다. 이 방법은 섬모의 규칙적인 운동에 의해 반사 또는 산란되는 광량의 변동을 광소자가 감지하여 광학적 신호를 전기적 신호로 변환하여 CBF를 측정하는 방법이다. 이는 실제로 운동하고 있는 섬모파의 방향을 측정할 수 있으나, 한 번 측정시 하나의 방향만을 제공하므로, 다수의 섬모에 대한 운동 방향의 측정이 필요한 섬모파의 무질서도(Ciliary wave disorder)를 정량화하는 것은 불가능하다. The most widely used method for measuring CBF is to use a photoelectric signal. This method is to measure the CBF by converting the optical signal into an electrical signal by detecting the change in the amount of light reflected or scattered by the regular movement of the cilia. It can measure the direction of cilia in motion, but it provides only one direction at a time, thus quantifying the ciliary wave disorder that requires measurement of the direction of motion for multiple cilia. It is impossible.
또한, 섬모의 운동 방향을 측정하기 위해서 주로 사용되는 방법은 염색된 상피의 단면을 전자 현미경을 이용하여 높은 배율로 관찰하는 것이다. 그러나, 섬모의 비트(Beat)와 메타크로니즘은 섬모간, 세포간 및 세포내의 상호작용에 의해서 조절되기 때문에, 활동하지 않는 상피 세포의 단면의 관찰에 의해 얻어진 섬모의 방향은 실제로 배양액에서 운동하고 있는 섬모의 방향과 다를 수 있다. 또한 이 방법은 염색, 세포점막의 절단 등 복잡한 전처리 과정을 필요로 한다.In addition, a method mainly used to measure the direction of movement of the cilia is to observe the cross section of the dyed epithelium at high magnification using an electron microscope. However, because the beat and metachromism of the cilia are controlled by interciliary, intercellular and intracellular interactions, the orientation of the cilia obtained by observation of cross-sections of inactive epithelial cells actually moves in culture. It may be different from the direction of the cilia. This method also requires complex pretreatments such as staining and cleavage of the cell mucosa.
본 발명은 상기 문제를 해결하기 위하여, 복잡한 전처리 과정을 거치지 않으면서 실제로 배양액에서 운동하고 있는 다수의 섬모들에 대한 위상차 관계 및 섬모파의 방향성의 정렬도 즉 무질서도를 정량적으로 측정할 수 있도록, 디지털 영상분석 방법을 응용하여 섬모파에 대한 방향의 무질서도(Disorder)를 측정하는 계측 방법을 제공함을 목적으로 한다. In order to solve the problem, the present invention is capable of quantitatively measuring the phase difference relationship and the alignment of the cilia waves, ie, the disorder, of a plurality of cilia that are actually moving in a culture medium without undergoing a complicated pretreatment process. An object of the present invention is to provide a measurement method for measuring disorder of a cilia wave by applying a digital image analysis method.
본 발명은 상기 목적을 위해, 카메라와 현미경을 이용하여 섬모 배양액에서 섬모 운동의 디지털 영상을 획득하는 제 1 단계; 상기 영상을 같은 크기의 사각형 스폿(Spot)으로 나누고, 상기 각 스폿에 포함된 픽셀의 모든 그레이 값을 더하여 주기적인 섬모 비트(Beat)를 나타내는 타임시리즈(Time Series)를 생성하는 제 2 단계; 지정된 영역(Region Of Interest)에서 상기 타임시리즈를 이용하여 하나의 기준 스폿과 주위의 다른 스폿들의 상관계수를 구하고 상기 상관계수를 이용하여 공간적 위상차 지도를 구성하는 제 3 단계; 상기 지도에 대하여 2개의 주 관성축을 결정하고 관성 모멘트가 최소가 되는 주 관성축을 섬모운동의 동위상 방향으로 결정하는 제 4 단계; 상기 동위상 방향과 수직인 섬모파의 진행 방향 분포에 대해 표준편차를 계산하여 무질서도를 구하는 제 5 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 영상을 이용한 기도 섬모파의 무질서도 계측 방법을 제공한다.The present invention for the above purpose, the first step of acquiring a digital image of the ciliary movement in the ciliary culture using a camera and a microscope; Dividing the image into rectangular spots of equal size and adding all gray values of pixels included in the spots to generate a time series representing periodic cilia beats; A third step of obtaining a correlation coefficient between one reference spot and other surrounding spots using the time series in a region of interest and constructing a spatial phase difference map using the correlation coefficient; Determining a second main inertia axis with respect to the map and determining a main inertia axis in which the moment of inertia is minimum in the in-phase direction of the cilia motion; It provides a method for measuring the disorder of the airway cilia using a digital image, characterized in that it comprises a fifth step of calculating the standard deviation with respect to the distribution of the direction of the ciliary wave perpendicular to the in-phase direction; .
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 단계별로 상세히 설명한다.Hereinafter, with reference to the accompanying drawings will be described in detail step by step the embodiment of the present invention.
1. 디지털 영상 획득1. Digital Image Acquisition
섬모의 무질서도 계측을 위해서는 먼저 디지털 영상의 획득이 필요하다. 도 1은 이 과정을 도시한 것이다. 섬모운동은 CCD(Charge Coupled Device) 카메라를 이용하여 인버티드 현미경(Inverted Microscope, 11)으로부터 비디오 테잎(12)에 저장된다. 이때, 비디오 영상은 컴퓨터(13)에 내장된 영상 저장 보드에 의해 디지털화되며 빠른 섬모운동 특성을 정확히 분석하기 위해 초당 30 프레임의 속도로 획득되고, 분석 프로그램(14)이 이를 이용해 섬모운동을 분석하게 된다. In order to measure the disorder of the cilia, the digital image is first acquired. 1 illustrates this process. The cilia are stored in the video tape 12 from an Inverted Microscope 11 using a Charge Coupled Device (CCD) camera. At this time, the video image is digitized by an image storage board embedded in the computer 13 and acquired at a rate of 30 frames per second to accurately analyze the fast cilia characteristics, and the analysis program 14 uses them to analyze the cilia movements. do.
2. 섬모 비트와 상관된 타임시리즈(Time Series) 추출2. Extracting Time Series Correlated with Cilia Bits
섬모의 비트(Beat)와 상관된 영상의 밝기 변화를 추출하기 위해, 상기에서 획득된 영상의 전체 필드(640×480)는 같은 크기(M×N 픽셀)의 사각형 스폿(Spot)으로 나누어지며, 각각의 스폿에 포함되는 픽셀의 모든 그레이 값이 더해진다. 이는 다음 수학식 1과 같이 주기적인 섬모 비트를 나타내는 하나의 타임시리즈(Time Series) 함수 I(k)를 형성한다.In order to extract the brightness change of the image correlated with the beat of the cilia, the entire field (640 × 480) of the obtained image is divided into square spots of the same size (M × N pixels), All gray values of the pixels included in each spot are added up. This forms one time series function I (k) representing periodic cilia bits as shown in Equation 1 below.
여기서, k는 영상 프레임의 번호, g k 는 프레임 k의 픽셀 (i,j)에서의 그레이 레벨, M과 N은 각 블록(스폿)의 넓이 및 높이(픽셀 단위)이다.Where k is the number of the image frame, g k is the gray level at pixel (i, j) of frame k , and M and N are the width and height (in pixels) of each block (spot).
3. 상관계수를 이용한 섬모 비트간의 공간적 위상차 지도(Map) 구성3. Construction of Spatial Phase Difference Map between Cilia Bits Using Correlation Coefficient
섬모는 시간적 및 공간적 위상차를 가지고 조화되어 움직이며, 이러한 특성은 영상에서 각 픽셀의 밝기와 상관되어 나타난다. 섬모의 비트 간의 일치도는 두 스폿의 타임시리즈의 피어슨 상관계수(Correlation Factor) P에 의해 결정된다. 즉 같은 주파수를 가지는 두 사인파에서 위상차가 0(0˚)이면 상관계수는 1이며, π/2(90˚)이면 0, π(180˚)이면 -1이 된다. 같은 주파수의 사인파에서는 상관계수가 위상차에 비례하게 된다. 지정된 영역(Region Of Interest, ROI)에서 하나의 스폿을 기준으로 주위의 다른 스폿들과의 상관계수 값들을 계산하면 기준 스폿에 대한 위상차를 측정할 수 있으며, 이를 각각의 스폿들에 표시하면 기준 스폿에 대한 상관계수 즉 공간적인 위상차를 표시하는 지도(Map)를 구성할 수 있다. The cilia move in unison with temporal and spatial phase differences, and these characteristics are correlated with the brightness of each pixel in the image. The degree of coincidence between the bits of the cilia is determined by the Pearson Correlation Factor P of the time series of the two spots. That is, in two sine waves having the same frequency, the correlation coefficient is 1 when the phase difference is 0 (0 °), 0 when π / 2 (90 °), and -1 when π (180 °). For sine waves of the same frequency, the correlation coefficient is proportional to the phase difference. By calculating the correlation coefficient values with other surrounding spots based on one spot in a region of interest (ROI), the phase difference with respect to the reference spot can be measured. It is possible to construct a map indicating a correlation coefficient for the spatial phase difference.
도 2 및 도 3은 기준 스폿에 대한 상관계수 즉 공간적인 위상차를 표시하는 지도로서, 전자는 시뮬레이션을 통해 얻어진 지도이고 후자는, 실제로 움직이고 있는 섬모들에 대해 본 발명에 따른 계산을 하여 얻어진 지도이다. 2 and 3 are maps showing a correlation coefficient, or spatial phase difference, with respect to a reference spot, the former being a map obtained through simulation, and the latter being a map obtained by performing calculation according to the present invention on actual moving cilia. .
상관계수는 다음 수학식 2에 의해 계산된다.The correlation coefficient is calculated by the following equation.
여기서, N은 분석시 사용되는 연속적인 영상의 프레임 수 즉 타임시리즈를 구성하는 구성원의 수를 나타내며, I a 는 기준 스폿(Reference Spot)의 그레이 강도(Intensity) 타임시리즈, I b 는 다른 스폿(Considered Spot)의 그레이 강도 타임시리즈, 는 그레이 강도 타임시리즈의 평균이다.Here, N denotes the number of frames of consecutive images used in the analysis, that is, the number of members constituting the time series, I a denotes a gray intensity time series of a reference spot, and I b denotes another spot ( Considered Spot's Gray Intensity Time Series, Is the average of the gray intensity time series.
4. 관성축을 이용한 섬모운동의 동위상 방향 결정4. Determination of in-phase direction of cilia using inertial axis
섬모들이 공간적으로 위상차가 0이 되는 방향 즉 동위상 방향(Uniphase Lines)이 존재하며, 이 방향에 수직인 방향이 섬모파(Ciliary Wave)의 진행 방향이 된다. There are directions in which the cilia are spatially zero in phase, i.e., Uniphase Lines, and a direction perpendicular to this direction becomes a traveling direction of the ciliary wave.
이전 단계에서는 사각형의 지정영역(Neighborhood)에서 중심 스폿에 대하여 주위의 다른 스폿과의 상관계수를 계산한 후 상관계수 지도(Map)를 구성하였다. 이러한 상관계수 지도에 대하여 주 관성축(Principal Axes of Inertia, θ)을 결정한 후, 두 개의 주 관성축 가운데 관성 모멘트가 최소가 되는 축이 섬모의 위상차가 0이 되는 동위상 방향으로 결정된다. 섬모파의 진행 방향은 동위상 방향에 수직인 방향으로 정의되며 0˚에서 180˚ 사이에서 결정된다. 도 3에서 직선이 나타내고 있는 방향이 섬모파의 진행 방향이다. 다음 수학식 3은 동위상 방향을 계산하는 식을 보인 것이다.In the previous step, the correlation coefficient with other spots around the center spot was calculated in the designated neighborhood of the rectangle, and then the correlation coefficient map was constructed. After determining the principal Axes of Inertia (θ) for the correlation coefficient map, the axis in which the moment of inertia is the minimum among the two main inertia axes is determined in the in-phase direction where the phase difference of the cilia becomes zero. The direction of motion of the cilia is defined as a direction perpendicular to the in-phase direction and is determined between 0 ° and 180 °. The direction shown by the straight line in FIG. 3 is the advancing direction of a cilia wave. Equation 3 shows the equation for calculating the in-phase direction.
여기서, x 0 , y 0 는 위상차를 나타내는 픽셀값들의 무게중심(Center of Mass), M ij 는 위상차 지도의 지정영역에서의 모멘트, 2N+1은 지정영역의 넓이(픽셀 단위), θ는 관성 모멘트가 최소가 되는 관성축의 방향이다.Where x 0 and y 0 are the center of mass of the pixel values representing the phase difference, M ij is the moment in the designated area of the phase difference map, 2N + 1 is the width (in pixels) of the specified area, and θ is the inertia. The direction of inertia where the moment is minimum.
5. 측정된 섬모파의 진행방향을 이용한 무질서도의 측정5. Measurement of disorder using the measured direction of ciliated wave
사각형으로 지정된 영역(Region Of Interest, ROI) 내에서 결정된 섬모의 운동 방향의 분포에 대하여 표준편차를 계산하여, 이를 ROI 내에서 운동하고 있는 섬모파의 진행 방향의 무질서도(Ciliary Wave Disorder, CWD)를 나타내는 파라미터로 정의한다. 도 4는 이를 도식적으로 나타낸 것이고, 도 5는 지정된 영역 내에 포함된 모든 점에서 섬모운동 방향을 결정하여 RGB 칼라를 이용하여 맵핑한 것이다.The standard deviation is calculated for the distribution of the cilia's movement direction determined in a region designated as a rectangle (Region Of Interest, ROI), and it is a disorder of the cilia wave moving in the ROI (Ciliary Wave Disorder, CWD). It is defined as a parameter representing. 4 is a diagram illustrating this, and FIG. 5 is a map of the cilia using RGB colors by determining the cilia motion direction at all points included in the designated area.
본 발명에 따르면 다른 방법들에 비하여 한 개의 세포 내에서 또는 다수의 세포에 대한 CBF, 위상차, CWD의 동시 측정이 가능하다는 장점을 가진다. 본 발명은 섬모운동 주파수와 상피 위에서 운동하고 있는 섬모들의 방향을 동시에 측정하므로 섬모 운동특성의 더 정확한 평가가 가능하며, 기도 점막의 질환에 대한 한 단계 높은 진단 및 연구가 가능하다.According to the present invention, compared to other methods, it is possible to simultaneously measure CBF, phase difference, and CWD in one cell or multiple cells. Since the present invention measures the frequency of ciliary motor movement and the direction of cilia moving on the epithelium at the same time, more accurate evaluation of ciliary motor characteristics is possible, and a higher level of diagnosis and research on diseases of the airway mucosa is possible.
도 1은 본 발명에 따른 섬모파 무질서도 계측 과정을 도시한 도면,1 is a diagram illustrating a process for measuring ciliated disorder in accordance with the present invention;
도 2는 시뮬레이션을 통해 얻은 공간적 위상차 지도를 도시한 도면,2 is a diagram illustrating a spatial phase difference map obtained through a simulation;
도 3은 실제로 움직이고 있는 섬모들에 대한 계산을 통해 얻은 공간적 위상차 지도를 도시한 도면,3 is a diagram illustrating a spatial phase difference map obtained through calculation of cilia actually moving;
도 4는 섬모파의 진행 방향의 무질서도를 나타낸 도면,4 is a diagram showing a disorder in the advancing direction of the cilia;
도 5는 섬모의 운동 방향 분포를 나타낸 도면.5 is a diagram showing the distribution of the movement direction of the cilia.
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E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
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Payment date: 20120914 Year of fee payment: 8 |
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FPAY | Annual fee payment |
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LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |