KR100499293B1 - 체리 바이오플라보노이드를 이용한 사이클로옥시게나제와염증의 저해방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 체리 또는 체리 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 사용하여 사이클로옥시게나제 효소 및 포유동물의 염증을 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 포함하는 혼합물의 용도에 관한 것이다.

Description

체리 바이오플라보노이드를 이용한 사이클로옥시게나제와 염증의 저해 방법{METHOD FOR INHIBITING CYCLOOXYGENASE AND INFLAMMATION USING CHERRY BIOFLAVONOIDS}

도 1은 발라톤 및 몬트모렌시 체리로부터 분리된 특정 안토시아닌(색소)의 구조를 보여준다. 아글리콘 시아니딘은 3번 위치에서 하이드록실기를 갖는다.

도 2 및 도 3은 체리로부터 분리된 주요 바이오플라보노이드를 보여주는 도면이다.

도 4는 산미 체리로부터 분리된 특정 페놀류를 보여준다.

도 5는 체리로부터 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 분리시키는 방법의 단계를 보여준다.

도 6은 도 5에 도시된 방법에서 사용될 수 있는 장치를 보여주는 개략도이다.

도 7은 시아니딘에 의한 인간 PGHS-1 효소의 저해의 투여량-반응 곡선이다. 시아니딘의 항염증 활성은 PGHS-1 효소의 사이클로옥시게나제 활성을 저해하는 그의 능력에 의해 평가되었다. 시아니딘은 PGHS-1 효소에 대해서 90μM의 IC₅₀ 값을 갖지만, 비스테로이드계 항염증제인 아스피린, 나프록센 및 이부프로펜은 각각 1050, 11 및 25μM의 IC₅₀ 값을 갖는다.

도 8은 시아니딘에 의한 PGHS-1 및 PGHS-2 효소의 저해의 투여량-반응 곡선이다. 시아니딘은 PGHS-1 및 PGHS-2 효소에 대해서 각각 90μM 및 60μM의 IC₅₀ 값을 갖는다.

도 9는 200μM의 농도에서 플라보노이드 및 이소플라보노이드에 의한 PGHS-1(COX-1)의 저해 효과를 보여주는 그래프이다. 데이타는 3회 반복 실험 결과(triplicate)의 평균 ± 표준오차로 표현되었다. 카엠프페롤 3-루티노시드, 3'-메톡시 카엠프페롤 3-루티노시드, 5,8,4'-트리하이드록시-6,7-디메톡시플라본 및 쿠에르세틴은 1000μM 농도에서는 활성이 없었다.

도 10은 비스테로이드계 항염증제인 나프록센, 아스피린 및 이부프로펜과, 발라톤 산미 체리로부터 분리된 플라보노이드에 의한 PGHS-1 효소(COX-1)의 저해의 투여량-반응 곡선을 비교해 보여주는 그래프이다. 카엠프페롤, 쿠에르세틴, 루테올린, 아스피린, 나프록센 및 이부프로펜의 IC₅₀은 각각 180, 350, 300, 1050, 11 및 25μM이었다. 데이타는 3회 반복 실험 결과의 평균 ± 표준오차로 표현되었다.

도 11은 비스테로이드계 항염증제인 나프록센, 아스피린 및 이부프로펜과, 발라톤 산미 체리로부터 분리된 이소플라보노이드에 의한 PGHS-1 효소(COX-1)의 저해의 투여량-반응 곡선을 비교해 보여주는 그래프이다. 다이드제인, 바이오카닌 A, 제니스테인, 아스피린, 나프록센 및 이부프로펜의 IC₅₀은 각각 400, 350, 80, 1050, 11 및 25μM이었다. 데이타는 3회 반복 실험 결과의 평균 ± 표준오차로 표현되었다.

바람직한 실시양태에 대한 설명

체리로부터 얻어진 분리물은 바람직하게는 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 혼합물로서 제조된다. 분리물은 하기 (a) 내지 (d)를 포함하는, 체리로부터 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 포함하는 혼합물을 제조하는 방법에 의해 얻어질 수 있다:

(a) 체리에서 나온 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 함유하는 수용액을 제공하고;

(b) 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 수용액으로부터 수지 표면으로 옮기고;

(c) 수지 표면을 용리액으로 용리시켜 수지 표면으로부터 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 수거하고;

(d) 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류로부터 용리액을 분리시킨다.

분리물을 제조하는데 사용되는 체리는 프루누스속으로부터 얻어질 수 있고, 감미 체리, 산미 체리(프루누스 아비움, 프루누스 세라수스), 그리고 그 혼합물일 수 있다. 산미 체리는, 산미 기타 유기산 외에도 체리의 신 맛에 기여하는 말산을 높은 수준으로 함유한다. 상기 방법으로 식품에 산미와 풍미를 제공하는데 사용될 수 있는 당을 함유하는 말산과 기타 유기산을 분리해낸다. 발라톤 및 몬트모렌시 체리가 가장 바람직하다. 본 발명에서는 체리의 신형 변종, 특히 안토시아닌 함량을 최대로 갖도록 경작되는 것들으로부터 분리된 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 사용하는 것도 고려된다.

분리된, 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 혼합물을 임의의 고체 또는 액체 제형에 도입시켜 천연 뉴트라슈티칼, 파이토슈티칼 또는 규정식의 보충제로서 사용한다. 일반적으로, 특정 제형은 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 1일 총 약 1 내지 1000㎎의 투여량으로 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, 1 내지 200㎎의 1일 투여량이 제공된다. 또다른 실시양태에서, 1일 투여량은 1 내지 100㎎, 1 내지 50㎎, 5 내지 50㎎, 5 내지 25㎎ 및 10 내지 25㎎일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 1일 투여량으로 1㎎ 이상이 제공되며, 더욱 바람직하게는 총 1일 투여량으로서 5㎎ 이상이 제공된다. 비교하면, 체리의 종류에 따라서, 100개의 체리는 약 10 내지 100㎎의 안토시아닌 및 바이오플라보노이드를 제공한다. 유사하게, 100개의 체리는 1 내지 50㎎의 페놀류를 제공한다.

총 1일 투여량은 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 혼합물로 구성될 수 있다. 총 1일 투여량은 또 이 3가지 화합물 유형 중 임의의 하나 또는 이들 화합물 전부 또는 일부의 혼합물에 의해 제공될 수도 있다. 예를 들면, 또다른 실시양태에서는, 체리로부터 얻어진 하나 이상의 안토시아닌을 0.01 내지 200㎎ 제공하는 것이 바람직할 수 있고, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 100㎎, 0.01 내지 50㎎, 1 내지 50㎎, 5 내지 50㎎, 및 5 내지 25㎎을 제공한다. 유사하게, 바이오플라보노이드 및 페놀류는 각각 안토시아닌에 의해 제공되는 상기 투여량과 동일한 투여량으로 사용될 수 있다. 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 양을, 개개의 화합물을 분리시키고 이들을 함께 블렌딩시킴으로써 조절할 수 있다. 한 실시양태에서는, 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 천연 혼합물이 사용된다.

안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 혼합물을 흡착성 수지를 사용하는 추출 방법으로부터 얻을 수 있다. 수지는 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류가 흡착되는 표면을 갖는다. 바람직한 부류의 흡착성 수지는 스티렌과 디비닐벤젠으로 이루어진 교차결합된 중합체 수지, 예를 들면 앰버라이트 계열 수지, 예를 들면 미국 팬실바니아주 필라델피아 소재의 롬 앤드 하스 캄파니(Rohm & Hass Co.)에서 시판되는 앰버라이트 XAD-4 및 앰버라이트 XAD-16이다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 또다른 교차결합된 중합체 스티렌 및 디비닐벤젠 흡착성 수지는 미국 미시간주 미들랜드 소재의 더 다우 케미칼 캄파니(The Dow Chemical Company)에 의해 제조되는 XFS-4257, XFS-4022, XUS-40323 및 XUS-40322 등이다.

시판되는, 국가 공인된(필요한 경우) 스티렌-디비닐-벤젠(SDVB) 교차결합된 공중합체 수지(예를 들면 앰버라이트 XAD-16)를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시양태에서는, 미국 특허 제 4,297,220 호에 기술된, 롬 앤드 하스 캄파니에서 시판되는 앰버라이트 XAD-16이 수지로서 사용된다. 이 수지는 비이온성 소수성 교차결합된 폴리스티렌 디비닐 벤젠 흡착성 수지가다. 앰버라이트 XAD-16은 거대망상(macroreticular) 구조를 갖고 연속 중합체상과 연속 기공상을 둘다 갖는다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 사용된 수지는 100 내지 200마이크론의 입경을 갖는다.

소수성 거대망상 수지 비드를 함유하고, 입경이 100 내지 200 마이크론인, 앰버라이트 XAD 흡착제 계열에 속하는 것들과 같은 기타 흡착제도 본 발명의 방법에서 효과적일 수 있다고 생각된다. 더우기, 입경이 100 내지 200 마이크론인, 애머크롬 CG(AMERCHROM CG) 흡착제 계열과 같은, 상이한 변형 앰버라이트도 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있다. 앰버라이트 XAD-16이 여러번(100회 이상) 재사용될 수 있기 때문에 바람직하다. 그러나, 식품의 경우, 본 발명에서는 국가 공인된 수지를 사용하는 것이 중요하고/하거나 바람직하다고 생각된다.

흡수된 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 수거하는 데에 임의의 용매를 사용할 수 있다. 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 저급 알칸올이 바람직하며, 식품에 사용하도록 허가된 에탄올(에틸 알콜)이 가장 바람직하다. 전형적으로 에탄올은 물과 공비증류되지만, 무수 에탄올도 사용될 수 있다. 체리내의 말산 및 당을 함유하는 물은 칼럼을 통과해 나간다. 이를 수거하고 식품에서 향미제로서 사용할 수 있다.

안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 바람직하게는 발라톤 및 몬트모렌시 체리로부터 얻는다. 이 체리들의 조성은 1997년 2월 12일자로 출원된 미국 특허원 제 08/799,788 호에 일부 개시되어 있고, 1998년 12월 11일자로 출원된 미국 특허원 제 60/111,945 호 및 1999년 2월 16일자로 출원된 미국 특허원 제 60/120,178 호에 일부 개시되어 있다. 이들 특허원에 기술된 바와 같이, 몬트모렌시(프루누스 세라수스) 변종은 미국 미시간주에서 재배되는 산미 체리의 95% 이상을 차지한다. 그러나, 신형 산미 체리 재배변아종인 발라톤 산미 체리(프루누스 세라수스)는 미시간주의 몇몇 과수원에서 몬트모렌시 대신에 경작되고 있다. 이 체리는 더 높은 안토시아닌 함량을 갖고 더 좋은 변종으로 간주되고 있다. 몬트모렌시 및 발라톤 산미 체리의 안토시아닌 함량은 기록되어 있다(왕(Wang) 등, 1997 및 산드라(Chandra) 등, 1993). 그러나, 발라톤 산미 체리내의 기타 페놀류 화합물에 대한 상세한 연구는 이전에는 수행되지 않았다. 초기 연구에 따르면, 몬트모렌시 체리는 시아니딘-3-젠티오바이오시드 및 시아니딘-3-루티노시드를 함유한다(리 케이 씨 등의 문헌[J.Am.Chem.Soc.78:979-980(1956)]을 참조). 시아니딘-3-글루코실루티노시드 역시 7가지의 산미 체리 변종들 중 6가지에서 발견되었다(하보른 제이 비 등의 문헌[Phytochemistry 3:453-463(1964)]을 참조). 데카조스는 몬트모렌시 체리내의 안토시아닌 색소는 페오니딘-3-루티노시드, 페오니딘 및 시아니딘과 함께 시아니딘-3-소포로시드, 시아니딘-3-루티노시드 및 시아니딘-3-글루코시드라고 보고하였다(데카조스 이 디의 문헌[J.Food Sci. 35:237-241(1970)]을 참조). 그러나, 시아니딘-3-글루코시드, 시아니딘-3-소포로시드 및 시아니딘-3-루티노시드 뿐만 아니라 시아니딘-3-글루코실루티노시드가 산미 체리의 주된 색소인 것으로 밝혀졌다. HPLC 체류값을 사용하여, 산드라 등은 시아니딘-3-소포로시드 및 시아니딘-3-글루코시드가 미시간주에서 재배되는 몬트모렌시 체리에서 각각 주된 색소 및 보조 색소라고 하였다(산드라 에이 등의 문헌[J.Agric.Food Chem. 40:967-969(1992)]을 참조). 이와 유사하게, 시아니딘-3-크실로실루티노시드는 몬트모렌시 체리에서 보조 색소라는 것이 밝혀졌다(쉬리크한드 에이 제이 및 에프 제이 프란시스의 문헌[J.Food Sci. 38:649-651(1973)]을 참조).

"담체" 또는 "증량제(bulking agent)"란 체리로부터 정제된 조성물의 부피를 증가시키는데 사용되는 조성물을 의미한다. 한 실시양태에서는, 건조 체리 과육이 담체로서 사용된다. 다른 실시양태에서는, 식이성 전분을 함유하는 물질 또는 단백질, 예를 들면 탈지 분유가 담체로서 사용되었다. 밀가루, 설탕, 대두분, 말토덱스트린 및 다양한 조미료, 예를 들면 소금, 고추, 향신료 및 허브가 이 그룹에 속한다. 증량제는 바람직하게는 혼합물에 대해 약 10^-6 내지 10⁶중량부의 양으로 사용된다. 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류 대 담체의 비는 0.1:100 내지 100:0.1이다.

본 발명은 어떤 실시양태에서는 천연 열매에서 발견되는 항염증 활성보다 우수한 항염증 활성을 갖는 체리 추출물을 포함하는 항염증성 식품 또는 식품 보충제를 섭취하는 잇점에 대해서 기술한다. 당해 분야의 숙련자들은 이러한 식품 또는 식품 보충제는 유리하게는 기타 항염증제와 혼합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이러한 추가의 항염증제는 물론 본 발명의 체리 추출물에 보조적인 것이며, 임의의 공지된 항염증제일 수 있다. 기타 항염증제가 사용될 경우, 체리 추출물 대 기타 항염증제의 비는 1:0 과 0:1 사이일 수 있다.

체리 추출물 및 추가의 항염증제는 세포의 COX-활성을 저해하기 위해서 시험관내에서 또는 생체내에서 세포와 접촉되거나 세포에 노출될 수 있다. 세포와 관련해서 "접촉" 또는 "노출"이라는 용어는, 본원에서는 체리 추출물과 보조적 항염증제가 표적 세포에 전달되거나 표적 세포와 나란히 놓여지게 하는 과정을 기술할 때 사용된다. 이로운 효과를 얻기 위해서는, 체리 추출물과 항염증제 둘다가, COX 활성을 저해하고, 염증을 감소시키고, 염증 유발 프로스타글란딘의 생산을 감소시키거나, 세포 또는 세포가 위치한 개개의 대상에서의 염증 반응을 감소시키는 효과를 나타내기에 효과적인 총량으로 세포에 전달될 수 있다.

항염증제는 당해 분야의 숙련자들에게 잘 공지되어 있으며, 여기에는 살리실산 유도체(예를 들면 아스피린), 파라미노페놀 유도체(예를 들면 아세트아미노펜), 인돌 및 인덴 아세트산(인도메타신, 술린닥 및 에토달락), 헤테로아릴 아세트산(톨메틴 디클로페낙 및 케토롤락), 아릴 프로피온산 유도체(이부프로펜, 나프록센, 케토프로펜, 케오프렌, 페노프렌, 옥사프로진), 안트라닐산(메페남산, 메클로페남산), 에놀 산(피록시캄, 테녹시캄, 페닐부타존 및 옥시펜타트라존)이 포함된다. 상기 및 기타 항염증제는 당해 분야의 숙련자들에게 잘 공지되어 있고, 이 항염제들에 대한 추가적인 내용은 문헌[Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Ed.(1996)]에서 찾을 수 있다.

본 발명은 천연 체리에서 발견되는 항염증 활성보다 우수한 항염증 활성을 갖는, 체리 추출물로부터 만들어진 천연 식품 또는 식품 보충제를 제공한다. 본 발명은 분말, 액체 또는 고체 형태로 제공될 수 있는 체리 추출물을 제공한다. 비제한적 예에는 바람직하고 용이하게 제조될 수 있는 형태가 포함된다.

조성물은 식품의 활성 성분에 대해 약 0.1 내지 10㎎/g의 양으로 식품내에 도입될 수 있다. 이 양은 식품의 맛에 영향을 미치지 않고서 가장 이로운 효과를 내는 양으로 선정되는 것이 바람직하다. 식품은 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 바와 같이 수분 함량이 높거나(습윤) 낮은(건조) 것일 수 있다.

체리 추출물은 물, 우유 또는 몇몇 기타 유사한 액체에 타면 항염증 활성을 필요로 하는 대상에게 항염증 활성을 제공할 수 있는 드링크제(drink)가 되는, 타 먹는 분말 조성물일 수 있다. 분말 조성물 및 이로부터 제조된 드링크제는 특히 통증 관리 기간동안 환자, 특히 장기간 관리되는 환자에게 보다 매력적이어서 보다 효과적인 기력유지가 가능하도록 혼합 및 조합될 수 있는 다양한 형태, 즉 쉐이크, 수프, 과일 드링크제, 스낵 바 및 기타 고체 형태, 예를 들면 정제, 젤 캡 등의 신중하게 계획된 많은 제품을 사용하는 통증 또는 염증 관리 프로그램에서 장내 투여 성분으로서 유용하다.

드링크제 외에도, 본 발명의 체리 추출물은 식료품에도 사용될 수 있다. 이러한 체리 추출물은 임의의 기타 식료품과 혼합될 수 있는데, 예를 들면 본 발명의 추출물을 함유하는 오일은 요리용 오일, 튀김용 오일 또는 샐러드 오일로서 사용될 수 있고, 마아가린, 마요네즈 또는 땅콩 버터와 같은 임의의 오일-기재의 식품에도 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물로 강화된 곡물 가루도 구운 제품, 씨리얼, 파스타 및 수프와 같은 식료품에 사용될 수 있다. 체리 추출물 및 이로부터 추출된 신규한 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 함유하는 오일은 유화될 수 있고 전술된 바와 같은 드링크 믹스(drink mix)릴 비롯한 드링크제와 같은 다양한 수-기재 식료품에 사용될 수 있다. 유리하게는, 이러한 식료품은 저지방, 저콜레스테롤 또는 달리 제한된 식이 요법에도 포함될 수 있다.

또한, 배합물을 보다 맛있게 하기 위해서, 당해 분야의 숙련자들에게 잘 공지된 기타 향미제 및 첨가제를 배합물에 첨가할 수 있다. 예를 들면 배합물은 과일 향미제, 색소, 보존제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 식품 보충제(통상적으로 건강보조식품 또는 뉴트라슈티칼로도 칭해짐)로서 제제화될 경우, 추가로 젤라틴과 같은 고체 담체 또는 보조제를 함유할 수 있다. 정제, 캡슐 및 분말은 본 발명의 항염증성 조성물을 약 0.1 내지 약 95 중량% 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 항염증성 조성물은 보충제의 총 중량의 약 0.01 내지 약 95 중량%를 구성한다. 보다 바람직하게는 항염증성 조성물은 보충제의 총 중량의 약 0.1 내지 약 50중량%, 약 1 내지 약 25 중량% 또는 약 1 내지 약 10 중량%를 구성한다. 액체 형태로 투여될 경우, 액체 담체, 예를 들면 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 예를 들면 땅콩유, 광유, 대두유 또는 참깨씨유, 또는 합성유가 첨가될 수 있다. 유사하게, 뉴트라슈티칼 조성물의 액체 형태는 약 0.01 내지 약 95 중량%의 본 발명의 항염증성 조성물을 함유한다. 더욱 바람직하게는 뉴트라슈티칼 조성물은 약 0.1 내지 약 50 중량%, 약 1 내지 약 25 중량% 또는 약 1 내지 약 10 중량%의 항염증성 조성물을 함유한다. 본 발명의 뉴트라슈티칼 조성물은 또한 안정화제, 보존제, 완충제, 항산화제 또는 당해 분야의 숙련자들에게 잘 공지된 기타 첨가제를 함유할 수 있다.

파이토케미칼(phytochemical)의 추출 및 분리 방법(산드라 에이 등의 문헌[J.Agric.Food Chem. 41:1062(1992); 왕 에이치 등의 문헌[J.Agric.Food Chem. 45:2556-2560(1997)]을 참조) 및 항산화 활성의 고속 스크리닝 방법(아로라 에이(Arora,A.) 및 지 엠 스트라스버그(G.M.,Strasburg)의 문헌[J.Amer.Oil Chem.Soc.74:1031-1040(1997)]을 참조)이 개발되어 왔다. 이 방법은 발라톤 및 몬트모렌시 체리로부터 얻어진 화합물을 동정하고, 특성짓고, 시험하는데 사용된다. 즙을 낸 체리 조직을 헥산, 에틸 아세테이트 및 메탄올로 순차적으로 추출하였다. 메탄올 분획과 에틸 아세테이트 분획 둘다가 이 스크리닝 분석 방법에서 강한 항산화 활성을 나타내었다. 에틸 아세테이트 분획을 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여 4개의 소분획(subfraction)을 얻었고, 이 소분획을 제조용 역상 HPLC에 의해 7개의 분획으로 추가로 분리시켰다. 도 2 및 도 3은 발라톤 체리로부터 분리된 바이오플라보노이드를 보여준다. 산미 체리내에는 수많은 유사 또는 동족 화합물이 많다. 즙 분획으로부터 얻어진 안토시아닌 성분을 동정하고 완전히 특성지었다(산드라 에이 등의 문헌[J.Agric.Food Chem. 41:1062(1992); 왕 에이치 등의 문헌[J.Agric.Food Chem. 45:2556-2560(1997)]을 참조).

두개의 신규한 페놀류 화합물, (I) 1-(3'-4'-디하이드록시 신나모일)-2,3-디하이드록시 사이클로펜탄 및 (II) 1-(3'-4'-디하이드록시 신나모일)-2,5-디하이드록시 사이클로펜탄을 동정하였다. 체리 열매의 에틸 아세테이트 추출물로부터 분리되고 스펙트럼 방법에 의해 특성지어진 기타 화합물에는 1-(3'-메톡시, 4'-하이드록시 신나모일)퀴인산, 2-하이드록시-3-(2'-하이드록시페닐)프로판산, 메틸-2-하이드록시-3-(2'-하이드록시페닐)프로파노에이트, D(+)-말산, β-시토스테롤 및 β-시토스테롤 글루코시드가 포함된다. 도 4는 분리된 몇몇 종류의 페놀류를 보여준다.

실시예 1 및 2

도 5에 나타낸 바와 같이, 개별 급속 냉동된(IQF: individual quick frozen) 체리(씨를 뺀 것)를 해동시키고 공업용 와링(WARING) 블렌더에서 블렌딩시켰다. 이 혼합물을 10000rpm에서 원심분리시키고 즙을 기울여 따라내었다. 잔사인 과육을 추가로 치즈 클로쓰(cheese cloth)로 압착시켜 임의의 여분의 즙을 제거하였다.

과육을 15℃에서 동결건조시켰다. 즙을 앰버라이트 XAD-16 HP 수지상에서 처리하여 체리 산미 성분인 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 얻었다. XAD-16 수지 1㎏을 에탄올(1 내지 2ℓ)로 세척하고 물(6ℓ)로 세척하였다. XAD-16 수지를 물에서 1시간동안 정치시킨 후, 솜마개(cotton plug)를 갖는 유리 칼럼(10ID×90㎝ 길이)에 넣었다. 분리를 위해 즙을 넣기 전에 충전된 칼럼을 물(2ℓ)로 세척하였다. 매번 800㎖의 즙을 정제시켰다. 즙을 칼럼 표면에 첨가하고 흐름이 없게 가만히 정치시켰다. 이어서 이를 물로 용리시키고 처음 1ℓ를 폐기시켰다. 그 다음 2ℓ의 세척물을 수거하였는데, 왜냐하면 여기에는 체리로부터 얻어지는 말산과 당을 함유하기 때문에 산미를 갖는 체리 즙이 함유되어 있기 때문이다. 이어서 칼럼을 발라톤 체리 즙의 경우 추가의 4ℓ의 물로 세척하고, 몬트모렌시 체리 즙의 경우 5ℓ의 물로 세척하였다. 체리 즙이 일단 수거되면, 물로 세척된 나머지 세척물을 폐기시켰다. 이어서 칼럼을 에탄올(1.3ℓ 내지 1.5ℓ)로 용리시키고 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 함유하는 적색 용액(700 내지 800㎖)을 수거하였다. 이어서 칼럼을 건조시키고 10ℓ의 물로 세척한 후, 이 과정을 여러 번(100회 이상) 반복하였다.

이어서 적색 알콜성 용액을 진공(20mTorr)중에서 증발시켜 에탄올 및 수용액을 제거하고, 50ppm의 아스코르브산으로 안정화시키고, 10℃에서 동결건조시켰다. 적색 분말을 수거하고 보관하였다.

실시예 1의 결과

발라톤 체리

IQF 체리의 중량: 15.74㎏

건조 과육의 중량: 605g

즙의 부피: 12.16ℓ

안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류(적색 분말)의 중량 31.35g

산미 부산물(말산 및 당)의 부피: 약 35ℓ

실시예 2의 결과

몬트모렌시 체리

IQF 체리의 중량: 30.45㎏

건조 과육의 중량: 895g

즙의 부피: 24.03ℓ

안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류(적색 분말)의 중량 47g

체리 부산물(말산 및 당)의 부피: 약 75ℓ

실시예 1 및 2의 적색 분말을 바람직하게는 담체로서의 건조 과육과 혼합하고, 담체를 포함하여 1 내지 1000㎎의 정제로 정제화시켰다(성인 1인분의 1일 투여량).

분해를 방지하기 위해서, 다양한 식품 등급 산을 분리된 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 이들은 맛을 부가하지 않는다. 아스코르브산(비타민 C)이 바람직하다. 산을 체리 화합물의 건조 전 또는 후, 바람직하게는 전에 첨가할 수 있다.

소규모의 공정에서는, 동결건조를 사용하여 물을 제거한다. 보다 큰 규모의 공정에서는, 공기 순환 오븐을 사용하여 건조시키는 것이 바람직하다.

실시예 3

도 6에 도시된 바와 같이, 개방 용기(10)에는 각각 밸브(13 및 14)를 갖는 유입관(11) 및 배출관(12)이 장착되어 있다. 수지 비드(15)가 개방 용기(10)내에 충전되어 있다. 물은 용기(10)에 도입된 후 배출관(12)을 통해 제거되고 폐기된다. 실시예 1에서 사용된 것과 같은 체리 즙(과육 또는 씨를 포함하지 않는 것)은 용기(10)로 도입되어 25분동안 정치된다. 물과 즙의 온도는 약 20 내지 30℃이다. 이어서 말산 및 당을 함유하는 체리 즙 잔사가 배출관(12)을 통해 제거되고 식품 향미제로서 사용된다. 이어서 용기내의 수지(15)가 유입관(11)으로 들어오는 물로 다시 세척되고 물은 배출관(12)을 통해 제거되고 폐기된다. 이어서 유입관(11)을 통해 도입된 95% 에탄올에 의해 수지 입자상의 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류가 추출된다. 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 함유하는 에탄올이 용기(10)로부터 수거된다. 에탄올은 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류로부터 제거되고 잔류물은 질소중에서 플래시(flash) 건조된다. 이렇게 얻어진 분말은 바람직하게는 실시예 1과 같이 건조된 체리 과육 또는 기타 담체와 혼합된다. 수지 입자는 물로 세척되며, 수지 및 에탄올은 수회 재순환된다.

실시예 4

안토시아닌 및 시아니딘에 대한 항염증 분석을, 프로스타글란딘 엔도퍼옥시드 H 신타제-1 및 -2 동위효소(PGHS-1 및 -2)를 사용하여 수행하였고, 이는 아라키돈산을 프로스타글란딘(PG)으로 전환시키는 이들의 능력에 근거를 둔 것이다. 이 실험에서 사용된 양성 대조군은 아스피린, 나프록센 및 이부프로펜이었다. 아스피린은 PGHS-1 및 PGHS-2 효소에 대해서 1050μM의 IC₅₀ 값을 갖는다(도 7). 나프록센 및 이부프로펜은 PGHS-1 효소에 대해서 각각 11 및 25nM의 IC₅₀ 값을 갖는다(도 7). 안토시아닌 1 내지 3(도 1)을 함유하는 혼합물을 사용한 예비 실험에서는 33ppm의 농도에서 PGHS-1 및 PGHS-2 활성이 나타났다. 아글리콘 시아니딘은 우수한 PGHS-1 및 -2 저해 활성을 나타내었는데, 각각 IC₅₀ 값이 90 및 60nM이었다(도 7 및 도 8). PGHS-1 대 PGHS-2의 IC₅₀ 값의 비는 약 0.56이었다(도 8). 그러나, 순수한 안토시아닌 1 내지 3은 300nM 시험 농도에서 PGHS-1 및 PGHS-2에 대해서 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. 반대로 보다 높은 농도의 안토시아닌 1 및 2는 효소의 활성을 증가시켰다. 이는 아마도 안토시아닌 1 및 2가 고농도에서 산소 운반체로서의 역할을 하고 산소 흡수량을 증가시키기 때문인 것 같다. 안토시아닌은 포유동물의 장에서 시아니딘 및 기타 화합물로 가수분해되므로 생체내에서 효과적임을 주목하도록 한다.

시아니딘에 의한 PGHS-2 효소 활성의 시간-의존성 저해를 측정하기 위해서, 효소를 37℃에서 15nM(IC₅₀ 농도의 1/4)의 시아니딘과 함께 예비배양시키고, 아라키돈산 기질과 함께 산소 전극 챔버에 첨가하여 반응을 개시하였다. 그 결과, PGHS-2의 저해 속도는 시간에 따라 변하지 않음을 알 수 있었다. PGHS-2 효소의 특이적 저해는 항염증 요법에서 중요한 발전인데, 왜냐하면 이로써 비스테로이드계 항염증제(NSAID)의 부작용이 현저하게 감소하였기 때문이다. 일반적으로 NSAID의 궤양유발성 및 기타 부작용은 PGHS-1의 저해에 기인하는 반면, 치료 효과는 PGHS-2 효소의 저해에 기인하는 것으로 생각된다.

유사하게, 시아니딘은 염증 분석에서 아스피린보다 더 좋은 항염증 활성을 보여주었다. 안토시아닌 및 시아니딘의 항산화성 및 항염증성은 체리를 섭취하면 인간의 심혈관 질환 또는 만성 질환이 감소될 수도 있다는 것을 말해준다.

특히, pH 7.8의 100mM 트리스 및 보존제로서 300μM 디에틸디티오카밤산(DDC)에 현탁된 PGHS-1 효소를 함유하는 숫양 정낭의 마이크로솜 분획(microsomal fraction) 및 아라키돈산을 옥스퍼드 바이오메디칼 리써치(Oxford Biomedical Research)(미국 미시간주 옥스퍼드 소재)에서 구입하였다. 재조합 인간 PGHS-2 효소를 처음에는 데이비드 데위트(David Dewitt) 박사(미국 미시간주 이스트 랜싱 소재 미시간주립대학 생화학과)로부터 입수하였고, 이어서 옥스퍼드 바이오메디칼 리써치(미국 미시간주 옥스퍼드 소재)에서 구입하였다. 나프록센, 이부프로펜 및 헤모글로빈을 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)(미국 미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입하였다. 안토시아닌 1 내지 3을 HPLC에 의해 발라톤 산미 체리로부터 정제하였고, ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼 데이타에 의해서 동정하였다.

시아니딘을 제조하기 위해서, 안토시아닌 1 내지 3을 함유하는 안토시아닌 혼합물(도 1; 500㎎)을 3N HCl(20㎖)과 함께 80℃에서 10시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 안토시아닌 제조 공정에서와 같이 XAD-4 칼럼상에서 정제시켰다. 시아니딘의 MeOH 용액을 증발 건조시켜 적색 무정형 분말(190㎎)을 얻고, 이를 사용전까지 -30℃에서 보관하였다.

항염증 분석에서, 숫양 정낭으로부터 정제된 균질 단백질인 PGHS-1 효소(pH 7.8의 0.1M 트리스 HCl중 약 5㎎ 단백질/㎖)를 사용하여 사이클로옥시게나제 활성을 분석하였다. 재조합 인간 프로스타글란딘 신타제-2(COX-2)로부터의 마이크로솜 제제를 곤충 세포 용해물로부터 얻었다. O₂ 전극(미국 오하이오주 옐로우 스프링스 소재 옐로우 스프링스 인스트루먼트 인코포레이티드(Yellow Springs Instrument Inc.))을 사용하여 37℃에서 초기 O₂ 흡수 속도를 모니터링함으로써 분석을 수행하였다. 각 분석 혼합물은 6M HCl의 첨가에 의해 pH가 7로 조정된 3㎖의 0.1M 트리스 HCl, 1mM 페놀, 85㎍의 헤모글로빈 및 10μM의 아라키돈산을 함유하였다. 5 내지 25㎍의 마이크로솜 단백질을 15 내지 50㎕의 부피로 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 분취량의 PGHS-1 또는 PGHS-2의 마이크로솜 현탁액(10μM O₂/분 사이클로옥시게나제 활성/분취량)을 10μM 아라키도네이트 및 다양한 농도의 시험 물질(10 내지 1100μM)을 함유하는 분석 혼합물에 첨가함으로써 개시되는 사이클로옥시게나제 활성을 측정함으로써, 효소 활성의 순간적 저해를 결정하였다. IC₅₀ 값은 표준 분석 조건하에서 최대 활성의 절반의 활성을 제공하는 시험 화합물의 농도를 말한다.

실시예 5

본 실시예는 플라보노이드 및 이소플라보노이드의 사이클로옥시게나제 저해 활성을 위한 항염증 분석 실험이다. 아라키돈산 및 PGHS-1(COX 1)와 COX-2(PGHS-2)의 마이크로솜 현탁액을 옥스퍼드 바이오메디칼 리써치(미국 미시간주 옥스퍼드 소재)로부터 구입하였다. 제니스테인, 제니스틴, 나린제닌, 쿠에르세틴, 5,8,4'-트리하이드록시-6,7-디메톡시플라본, 카엠프페롤-3-루티노시드 및 3'-메톡시 카엠프페롤 3-루티노시드를 발라톤 산미 체리로부터 HPLC에 의해 정제하고 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼 데이타에 의해 동정하였다. 다이드제인 및 포르모노네틴을 리써치 플러스 인코포레이티드(Research Plus, Inc.)(미국 뉴저지주 베이온 소재)로부터 구입하였다. 바이오카닌 A, 카엠프페롤, 쿠에르세틴, 나프록센, 이부프로펜 및 헤모글로빈을 시그마 케미칼 캄파니(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다. 루테올린을 아담스 케미칼 캄파니(Adams Chemical Co.)(미국 일리노이주 라운드 레이크 소재)로부터 구입하였다.

COX 활성을 측정하기 위해서, 플라보노이드 또는 이소플라보노이드를 DMSO에 용해시켜 40mM 원액을 만들고 이를 추가로 희석시켜 분석되는 각 화합물의 COX-1/COX-2 저해 활성에 따른 목적 농도로 만들었다.

항염증 분석: PGHS-1 및 PGHS-2의 마이크로솜 현탁액을 사용하여 COX 활성을 측정하였다. 마이크로솜 멤브레인(pH 7.4의 0.1M 트리스 HCl중 5㎎ 단백질/㎖)을 제조하고 같은 날에 분석하였다. 5357 산소 전극(미국 팬실바니아주 플라이마우쓰 미팅 소재의 인스테크 래보러토리(INSTECH Laboratory))을 사용하여 O₂ 흡수 속도를 모니터링함으로써, 순환욕(미국 일리노이주 시카고 소재의 브이더블유알 사이언티픽 프로덕츠(VWR Scientific Products)의 모델-1166)에 의해 조절되는 37℃에서, COX-1 및 COX-2 분석을 수행하였다(미드 이 에이(Meade, E.A.) 등의 문헌[J.Biol.Chem.268 6610-6614(1993)]을 참조).

각 분석 혼합물은 pH 8.0의 600㎕의 0.1M 트리스-HCl, 1mM 페놀, 17㎍의 헤모글로빈 및 10μM 아라키도네이트를 함유하고 마이크로챔버(미국 팬실바니아주 플라이마우쓰 미팅 소재의 인스테크 래보러토리)내에서 혼합되었다. 안토시아닌 및 시아니딘의 경우, 첨가제가 없을 때 분해를 방지하기 위해서 pH 7이 바람직하다. 5㎍의 마이크로솜 단백질(5㎕)을 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 10μM 아라키도네이트 및 다양한 농도의 시험 화합물을 함유하는 분석 혼합물중 PGHS-1 또는 PGHS-2의 마이크로솜 현탁액을 첨가함으로써 개시되는 사이클로옥시게나제 활성을 측정함으로써, 순간적 저해를 결정하였다. IC₅₀ 값은 표준 분석 조건하에서 최대 활성의 절반의 활성을 제공하는 저해제의 농도를 말한다. 효소 활성의 역학을 바이올로지컬 옥시젠 모니터(Biological Oxygen Monitor)(미국 오하이오주 옐로우 스프링스 소재의 옐로우 스프링스 인스트루먼트 캄파니 인코포레이티드(Yellow Springs Instrument Co., Inc.)의 YSI 모델 5300)로 모니터링하고 퀵로그 데이타 어퀴지션 앤드 콘트롤(Quicklog Data Acquisition and Control) 컴퓨터 소프트웨어(미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 스트로베리 트리 인코포레이티드(Strawberry Tree Inc.))로 수집하였다.

O₂ 흡수를 모니터링함으로써 발라톤 체리 바이오플라보노이드의 COX-1/COX-2 활성을 결정하였다. PGHS 효소 제제를 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 1단위의 사이클로옥시게나제는 표준 분석 조건하에서 COX 효소에 의한, 1nmol의 아라키도네이트/분의 산화에 해당한다. 이 분석은 데위트 등에 의해 보고된 분석 방법의 변형된 방법이다(데위트 디 엘(Dewitt D.L.) 등의 문헌[J.Biol.Chem. 265:5192-5198(1990)]을 참조). 10μM의 아라키도네이트가 COX-1 분석에 사용되었는데, 왜냐하면 이 물질 농도가 거의 최대인 COX 활성을 제공할 수 있고 친유성 저해제에 의한 효소 저해를 감지할 수 있게 한다고 보고되었기 때문이다(미드 이 에이 등의 문헌[Biol.Chem.268:6610-6614(1993)]을 참조). 이 방법은 COX-2 효소를 사용하는 COX-2 분석에도 사용할 수 있다. 3가지의 공지된 COX 저해제인 아스피린, 이부프로펜 및 나프록센이 양성 대조군으로 선정되었다. 플라보노이드인 카엠프페롤, 쿠에르세틴, 루테올린, 쿠에르세틴 3-람노시드, 5,8,4'-트리하이드록시-6,7-디메톡시플라본의 COX-1 저해 활성을 비교하였다. 카엠프페롤 3-루티노시드, 3'-메톡시 카엠프페롤 3-루티노시드 및 나린제닌(도 9) 및 5가지 이소플라보노이드인 제니스테인, 제니스틴, 다이드제인, 포르모노네틴 및 바이오카닌 A(도 8)의 활성을 비교하였다.

시험 화합물의 탄젠트 O₂ 흡수 곡선을 블렝크 대조군의 것과 비교함으로써 상이한 농도의 각 화합물의 COX-1/COX-2 저해 활성을 계산하였다. 각 분석을 3회 반복하고, 선형 회귀 분석에 의해 IC₅₀ 값(50 저해 농도)을 계산하였다. 플라보노이드 및 이소플라보노이드의 최대-절반 저해 농도를 도 11에 나타내었다. 발라톤 산미 체리로부터 얻어진 플라보노이드 및 이소플라보노이드에 의한 COX-1 효소의 저해에 대한 투여량-반응 곡선을 비스테로이드계 항염증제인 아스피린, 나프록센 및 이부프로펜과 비교한 결과가 각각 표 10 및 11에 나타나 있다.

시험된 플라보노이드중에서, 카엠프페롤이 가장 높은 COX-1 저해 효과를 나타내었고, 그 뒤를 루테올린, 쿠에르세틴, 나린제닌 및 쿠에르세틴 3-람노시드가 이었다(도 9). 카엠프페롤을 쿠에르세틴과 비교해 보면, C₃' 위치에 하이드록실기가 존재하면 COX-1 저해 활성이 감소된다는 것을 알 수 있다(도 9). 카엠프페롤 및 쿠에르세틴의 COX-1 저해 활성은 다른 모델 시스템에도 기록되어 있다(칼크브레너 에프(Kalkbrenner,F) 등의 문헌[Pharmacology 44:1-12(1992)]; 호울트 제이 알 에스(Hoult,J.R.S) 등의 문헌[Agents and Actions 42:787-792(1988)]; 및 모로니 엠 에이(Moroney, M.A.) 등의 문헌[J.Pharm.Pharmacol. 40:787-792(1988)]을 참조). C₃ 위치의 OH기는 활성에도 중요하다. 그러나, C₃ 위치에서 OH기가 글리코실화되면 활성이 상당히 감소된다. 플라본(루테올린)의 COX-1 저해 활성을 그의 상응하는 플라보놀(쿠에르세틴)의 것과 비교해보면, C₃에서 OH기가 없으면 COX-1 활성이 약간 향상된다고 결론지을 수 있다. 쿠에르세틴 3-람노시드가 분석 실험에서는 활성을 갖지 않았지만 생체내에서는 항염증 활성을 갖는다고 보고되었다는 것을 주목하는 것이 중요하다(산체즈 드 메디나 엘 에이치(Sanchez De Medina, L.H.) 등의 문헌[J.Pharmacol.Exp.Ther. 278:771-779(1996)]을 참조). 이것은 쿠에르세틴 3-람노시드가 쿠에르세틴으로 생체내 대사되기 때문이다. 플라보노이드 및 이소플라보노이드내의 헤테로 고리의 동일평면성을 결정짓는 C₂-C₃ 이중결합은 보다 높은 COX 저해 활성에 필수적이다. 이 이중결합이 포화되면, COX-1 저해 효과는 나린제닌의 경우 극적으로 감소된다(도 9). 이 결과는 기존의 보고와도 일치한다(웜 지 등의 문헌[Deutche Apotheker Zeitung 122:2062-2068(1982)]; 칼크브레너 에프 등의 문헌[Pharmacology 44:1-12(1992)]을 참조). 또한, 5,8,4'-트리하이드록시-6,7-디메톡시플라본의 활성에 의해 증명된 바와 같이, 플라보노이드의 A 고리내의 OH 및 OMe기와 같은 다중 치환체도 COX-1 저해를 거의 또는 전혀 유발시키지 못한다.

이소플라보노이드 중에서도(도 2 및 3), 제니스테인이 가장 높은 COX-1/COX-2 저해 활성을 보였다. 이 활성은 제니스테인의 A 고리내의 7-OH기가 글리코실화된 제니스틴에서 극적으로 감소하였다. 또한, 이소플라보노이드에서 C₄'에서의 하이드록실기는 COX-1/COX-2 저해 활성에 필수적이다. 제니스테인 및 다이드제인의 4'-OH기가 메틸화되면, 활성은 상당히 감소된다. 이소플라보노이드내의 5-OH기 또한 COX-1/COX-2 저해 효과에 중요하다. 이 결과를 보아 이소플라보노이드내의 C₄', C₅ 및 C₇ 하이드록실기는 COX-1 저해에 필수적임을 알 수 있다. 제니스테인을 카엠프페롤과 비교해보면 고리 B상의 치환체 및 고리 C의 C₃에서의 치환체가 COX-1/COX-2 저해 효과를 향상시킴을 알 수 있다. COX-1/COX-2 저해외에도, 이소플라보노이드 및 플라보노이드는 우수한 항산화 활성을 보여준다. 이들 화합물의 COX-1 저해 및 항산화 활성은 산미 체리가 중요한 건강상의 잇점을 인간에게 줄 수 있음을 시사한다. 바이오플라보노이드는 산미 체리가 관절염 및 통풍과 관련된 통증을 치료한다는 사실에 부분적으로 책임이 있을 수 있다.

따라서, 발라톤 산미 체리로부터 분리된 몇몇 플라보노이드 및 이소플라보노이드에 대해서, 프로스타글란딘 H 엔도퍼옥시드 신타제(PGHS-1 또는 PGHS-2) 효소 활성을 분석하였다. 제니스테인은 80nM의 IC₅₀ 값을 가져서, 연구된 이소플라보노이드중에서 가장 높은 COX-1 저해 활성을 나타내었다. 카엠프페롤은 180nM의 IC₅₀ 값을 가져서, 시험된 플라보노이드중에서 가장 높은 COX-1 저해 활성을 나타내었다. 플라보노이드와 이소플라보노이드의 구조-활성 관계를 보아, 이소플라보노이드내의 C₄', C₅ 및 C₇의 하이드록실기는 상당한 정도의 COX-1 저해 활성에 필수적이라는 것을 알 수 있다. 또한, 플라보노이드내의 C₂-C₃ 이중결합은 COX-1 저해 활성에 중요하다. 그러나, C₃' 위치에서의 하이드록실기는 플라보노이드에 의한 COX-1/COX-2 저해 활성을 감소시킨다.

실시예 6

왕 등의 문헌[J.Nat.Products 62:294-296(1999)]; 왕 등의 문헌[J. of Ag. and Food Chemistry, 47:840-844(1999)]; 및 왕 등의 문헌[J. of Nat.Products, 62:86-88(1999)] 및 실시예 4 및 5에 기술된 분석 방법에 의해 사이클로옥시게나제 1 및 2(COX-1 및 COX-2)를 사용하여 실시예 1 및 2의 조성물의 항염증 활성을 시험하였다. 그 결과, 이들 조성물은 항염증 활성, 특히 강한 COX-1 및 COX-2 저해 활성을 나타내었다.

전술된 설명은 본 발명을 단지 예시하기 위한 것이며, 본 발명은 다음에 첨부되는 청구의 범위에 의해서만 제한된다.

본 발명은 체리로부터 얻어진 하나 이상의 화합물을 사이클로옥시게나제(COX-1 및 COX-2)의 저해제로서 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 사이클로옥시게나제 효소를 저해함으로써 항염증제로서 사용하기 위한, 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 혼합물을 함유하는 천연 체리 조성물을 제공한다.

식물로부터 유래된 많은 화합물이, 반응성 산소 중간체 수준을 낮게 유지함으로써 항산화제로서 작용하거나, 프로스타글란딘 합성을 저해함으로써 항염증제로서 작용하거나, 세포 증식에 관여하는 효소의 저해제로서 작용함으로써, 중요한 긍정적인 약학적 또는 "뉴트라슈티칼(nutraceutical)/파이토슈티칼(phytoceutical)" 특성을 식품에 부여할 수 있다. 이러한 활성은 암, 관절염 및 심혈관 질환을 포함하는 만성 질환의 개선에 중요할 수 있다(킨셀라(Kinsella) 등의 문헌[Food Tech. 85-89(1993)]을 참조). 따라서, 건강보조식품/식품 산업 및 뉴트로슈티칼/파이토슈티칼 회사는 천연 물질을 사용하여 합성 항산화제와 동등하게 효과적으로 식품 안정성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 소비자에게 현저한 건강상 잇점을 줄 수 있는 화합물을 이용하는 기회를 갖게 된다.

체리는 일반적으로 건강상 잇점을 갖는 것으로 생각된다. 체리를 섭취하면, 비록 그 활성 성분이나 작용 방식은 입증된 바 없지만, 관절염 통증과 통풍이 경감되는 것으로 보고되었다(하멜 피 비(Hamel,P.B.) 등의 문헌[Cherokee Plants 28: Herald: Raleigh, N.C.(1975)]을 참조). 이 이로운 효과는 부분적으로는 시아니딘의 글리코시드인 안토시아닌이 풍부하게 들어있는 것과 관련될 수 있다.

프루누스 세라수스 엘.(Prunus Cerasus L.)(로제이시즈(Rosacease)), 재배변아종 몬트모렌시(MONTMORENCY)는 미국에서 상업적으로 재배되는 주된 산미(酸味) 체리이다. 몬트모렌시의 단일 경작에 대한 도전으로서, 신형 재배변아종인 발라톤(BALATON, 등록상표) 산미 체리(유페르베르토이 푸르토스(Ujferbertoi furtos))가 1984년 미국에 도입되었고, 미시간주, 유타주 및 위스콘신주에서 시험 경작되고 있다. 발라톤은 몬트모렌시보다 더 거무스름한 열매를 맺는다.

안토시아닌 같은 색소는 산미 체리에서 품질의 지표로서 간주되어 왔다. 가장 중요하게는, 근래의 연구 결과 시아니딘-3-글루코시드와 같은 안토시아닌이 강한 항산화 활성을 갖는다는 사실이 밝혀졌다(쓰다 티(Tsuda, T) 등의 문헌[J.Agric.Food Chem. 42:2407-2410(1994)]을 참조).

초기 연구에서는 몬트모렌시 체리가 시아니딘-3-젠티오바이오시드 및 시아니딘-3-루티노시드라는 안토시아닌을 함유한다는 것이 밝혀졌다(리 케이 씨(Li,K.C.) 등의 문헌[J.Am.Chem.Soc.78:979-980(1956)]을 참조). 시아니딘-3-글루코실루티노시드 역시 7가지의 산미 체리 변종들중 6가지에서 발견되었다(하보른 제이 비(Harborne, J.B.) 등의 문헌[Phytochemistry 3:453-463(1964)]을 참조). 데카조스(Dekazos)는 몬트모렌시 체리내의 안토시아닌 색소는 페오니딘-3-루티노시드, 페오니딘 및 시아니딘과 함께 시아니딘-3-소포로시드, 시아니딘-3-루티노시드 및 시아니딘-3-글루코시드라고 보고하였다(데카조스 이 디(Dekazos, E.D.)의 문헌[J.Food Sci. 35:237-241(1970)]을 참조). 그러나, 시아니딘-3-글루코시드, 시아니딘-3-소포로시드 및 시아니딘-3-루티노시드 뿐만 아니라 시아니딘-3-글루코실루티노시드가 산미 체리의 주된 색소인 것으로 밝혀졌다. HPLC 체류값(retention value)을 사용하여, 산드라(Chandra) 등은 시아니딘-3-소포로시드 및 시아니딘-3-글루코시드가 미시간주에서 재배되는 몬트모렌시 체리에서 각각 주된 색소 및 보조 색소라고 하였다(산드라 에이(Chandra, A) 등의 문헌[J.Agric.Food Chem. 40:967-969(1992)]을 참조). 이와 유사하게, 시아니딘-3-크실로실루티노시드는 몬트모렌시 체리에서 보조 색소라는 것이 밝혀졌다(쉬리크한드 에이 제이(Shrikhande, A.J.) 및 에프 제이 프란시스(F.J.Francis)의 문헌[J.Food Sci. 38:649-651(1973)]을 참조).

종래 기술에서, 발라톤과 몬트모렌시 체리 즙으로부터 순수한 안토시아닌(도 1의 화합물 1 내지 3)의 생산은, 우선 이 색소를 앰버라이트 XAD-2(AMBERLITE XAD-2)(시그마 케미칼스(Sigma Chemicals)) 칼럼에 흡착시킴으로써 수행되었다(산드라 에이 등의 문헌[J.Agric.Food Chem. 41:1062-1065(1993)]을 참조). 이 칼럼은 용리액이 약 7.0의 pH를 나타낼 때까지 물로 세척되었다. 흡착된 색소와 기타 페놀류는 MeOH로 용출되었다. 이렇게 얻어진 조질 안토시아닌은, 각각 스펙트럼 연구를 위한 순수 안토시아닌을 얻기 위해, 분획화되고 C-18 MPLC 및 HPLC에 의해 정제되었다. 앰버라이트 XAD-2로부터 얻어진 500㎎의 조질 몬트모렌시 안토시아닌으로부터는 60㎎의 순수 안토시아닌 1 내지 3이 얻어진 반면, 발라톤으로부터는 391.43㎎이 얻어졌다. 이 연구 결과는 XAD-2로부터 얻어진 몬트모렌시 체리의 조질 안토시아닌은 기타 유기 화합물을 높은 비율로 함유하고 있음을 말해준다. 이러한 페놀류와 안토시아닌의 조질 혼합물을 어떠한 용도로도 사용하기 위한 시도는 전혀 없었다. 가부트(Garbutt)에 허여된 미국 특허 제 5,266,685 호 및 카트자키안(Katzakian) 등에 허여된 미국 특허 제 5,665,783 호 및 모자파(Mozaffar)에 허여된 미국 특허 제 5,817,354 호에는 다양한 흡착 수지 및 이를 서로 관련이 없는 생성물들의 분리에 사용하는 용도가 기술되어 있다. 이 특허들은 흡착 수지의 용도에 대한 종래 기술의 일반적인 상황을 설명할 뿐이다.

사이클로옥시게나제(COX) 또는 프로스타글란딘 엔도퍼옥시드-H 신타제(PGHS-1, PGHS-2 또는 COX-1/COX-2) 효소는 식물성 물질의 항염증 효과를 측정하는 데 널리 사용되고 있다(베이어 티(Bayer, T.) 등의 문헌[Phytochemistry 28:2373-2378(1989); 및 고다 와이(Goda, Y.) 등의 문헌[Chem.Pharm.Bull. 40:2452-2457(1992)]을 참조). COX 효소는 비스테로이드계 항염증제의 발견을 위한 약리학적 표적(target) 부위이다(휴메스 제이(Humes,J.) 등의 문헌[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 78:2053-2056(1981)] 및 로움 엘 에이치(Rome, L.H.) 등의 문헌[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 72:4863-4865(1975)]을 참조). 프로스타글란딘 합성에 관여하는 사이클로옥시게나제의 2가지 동위효소는 각각 사이클로옥시게나제-1(COX-1) 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)이다(헤믈러 엠(Hemler,M.) 등의 문헌[J.Biol.Chem. 25:251, 5575-5579(1976)]을 참조). 특정 COX-2 저해제가 항염증 활성에서 중요한 역할을 한다는 가정이 세워졌다(마스퍼러 제이 엘(Masferrer,J.L.) 등의 문헌[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 91:3228-3232(1994)]을 참조). 플라보노이드는 현재 항염증성 물질로서 연구되고 있으며 사이클로옥시게나제(COX) 억제 활성을 위한 그의 구조적 특성도 연구되고 있다. 5.5μM의 IC₅₀을 갖는 갈란긴인 5,7-디하이드록시플라본은 가장 활성이 좋은 사이클로옥시게나제 저해 플라보노이드임이 밝혀졌다(웜 지(Wurm, G.) 등의 문헌[Deutche Apotheker Zeitung 122:2062-2068(1982)]을 참조). 고리 A 또는 B에 오르토-디하이드록시를 갖는 플라보노이드는 자유 3-OH기를 갖는 것보다 더 강한 저해제였다(웜 지 등의 문헌[Deutche Apotheker Zeitung 122:2062-2068(1982)] 및 바우만 제이(Baumann, J.) 등의 문헌[Prostaglandins 20:627-640(1980)]을 참조). 헤테로고리들의 동일평면성(coplanarity)을 결정짓는 C₂-C₃ 이중결합은 COX 활성의 주요한 결정인자로 보인다(웜 지 등의 문헌[Deutche Apotheker Zeitung 122:2062-2068(1982)]을 참조). 모루신과 같은 특정 프레닐화 플라보노이드 또한 더 높은 친유성을 갖기 때문에 활성이었다(키무라 와이(Kimura.Y.) 등의 문헌[Chem.Pharm.Bull. 34:1223-1227(1986)]을 참조). 또한, 치환되지 않은 플라본은 우수한 COX 저해제이다(모우어 알 엘(Mower,R.L.) 등의 문헌[Biochem.Pharmacol.33:357-364(1984)] 및 웰톤 에이 에프(Welton,A.F.) 등의 문헌[Prog.Clin.Biol.Res. 213:231-242(1986)]을 참조). 과거에 연구된 대부분의 플라바논은 플라바논-3-올인 실리비닌만 제외하고는 현저한 COX 저해 효과를 나타내지 않았다(칼크브레너 에프(Kalkbrenner,F.) 등의 문헌[Pharmacology 44:1-12(1992)]을 참조). 그러나, 이소플라보노이드의 구조-활성 관계는 보고되지 않았다.

사이클로옥시게나제 저해제 및 항염증제로서 사용할 천연 물질 유래 조성물에 대한 수요가 있다.

발명의 개요

본 발명은 체리로부터 얻을 수 있는 하나 이상의 화합물에, 사이클로옥시게나제와 프로스타글란딘 H 신타제 효소 중 하나 이상을 제공하여 해당 효소를 저해하는 것을 포함하는, 사이클로옥시게나제 또는 프로스타글란딘 H 신타제 효소의 저해 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 체리로부터 얻을 수 있는 하나 이상의 바이오플라보노이드 화합물에 사이클로옥시게나제 또는 프로스타글란딘 H 신타제 효소 중 하나 이상을 제공하여 해당 효소를 저해하는 것을 포함하는, 사이클로옥시게나제 또는 프로스타글란딘 H 신타제 효소의 저해 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 체리로부터 얻을 수 있는 하나 이상의 화합물을 포유동물에게 투여하여 염증을 저해함을 포함하는, 포유동물의 염증 저해 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 체리로부터 얻을 수 있는 하나 이상의 바이오플라보노이드, 안토시아닌 또는 페놀류 화합물을 포유동물에게 투여하여 염증을 저해함을 포함하는, 포유동물의 염증 저해 방법에 관한 것이다.

본 발명은 시아니딘을 포유동물에게 투여하여 염증을 저해함을 포함하는, 포유동물의 염증 저해 방법에 관한 것이다.

또한 천연 체리 열매에서 발견되는 항염증 활성보다 더 큰 항염증 활성을 갖는 체리 추출물을 포함하는 항염증성 식품 보충제도 제공된다. 또한 천연 체리 열매에서 발견되는 항염증 활성보다 더 큰 항염증 활성을 갖는 체리 열매 추출물과 세포를 접촉시킴을 포함하는, 세포내 COX-2 활성을 저해하는 방법이 제공된다. 본 발명의 특정 실시양태는 포유동물 세포에 대한 것이다. 또다른 실시양태는 인간 세포에 대한 것이다. 특정 실시양태에서는 시험관내에서 세포가 체리 열매 추출물과 접촉된다. 다른 실시양태에서는 생체내에서 세포가 체리 열매 추출물과 접촉된다. 바람직한 실시양태로, 이들 방법에서는 캡슐, 정제, 시럽, 음료, 분말 등과 같은 형태로 제공되는 식품 또는 식품 보충제가 사용된다.

본 발명의 또다른 실시양태는 천연 체리 열매에서 발견되는 항염증 활성보다 더 좋은 항염증 활성을 갖는 체리 열매 추출물 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 동물에게 투여함을 포함하는, 동물에서의 염증 반응을 치료하는 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 염증 반응은 관절염, 통증, 알러지성 발진, 염증성 장 증후군 및 천식으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 물론, 이들은 염증 질환의 예이며 본 발명은 염증 반응으로부터 초래되는 임의의 장애에 탁월한 약초 치료제를 제공할 수 있다고 생각된다. 본원에서 기술된 식품 또는 식품 보충제는 단독으로 또는 다른 항염증성 치료제와 조합되어 사용될 때 유용한 것으로 이해해야 한다.

식품 보충제를 기타 치료제와 조합하여 사용하는 실시양태에서, 본 발명에서는 살리실레이트, 글루코코르티코이드, 파라-아미노페놀 유도체, 오피오드, 인도메타신, 술린닥, 페나메이트, 프로피온산 유도체 및 옥시캄으로 이루어진 군에서 선택된 항염증제를 동물에게 추가로 투여한다. 본 발명의 보충제는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 기타 캡슐, 정제, 용액, 현탁액, 시럽, 음료 또는 분말을 포함하나 여기에만 국한되지는 않는 임의의 고체 또는 액체 제형으로 제공될 수 있다.

본 발명의 또다른 실시양태에서는, 통증을 겪는 생물에 의해 복용되거나 다른 방식으로 적용될 때 통증을 경감시키는, 체리 추출물을 포함하는 뉴트라슈티칼 조성물이 기술된다. 특히, 통증은 관절염, 월경 경련, 두통, 곤충에 물림 또는 알러지성 발진의 통증이다.

"안토시아닌"이라는 용어에는 체리에 함유된 발색 화합물이 포함된다. 본 발명의 목적을 위해서 상기 용어에는 아글리콘인 시아니딘이 포함된다.

"바이오플라보노이드"라는 용어는 체리에 함유된 이소플라보노이드 및 플라보노이드 화합물을 말한다.

"페놀류"란 용어는 페닐기 및 하나 이상의 하이드록실기를 갖는 화합물을 말한다.

체리로부터 분리된 화합물은 생물에서 가장 유용하다. 생물은 동물 또는 인간일 수 있다. 생물은 조직 배양물일 수도 있다.

따라서 본 발명의 목적은 사이클로옥시게나제 저해제 및 항염증제로서 사용될 수 있는 체리 화합물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 체리 화합물을 상업적 규모로 분리시키는 방법을 제공하는 것이다. 마지막으로, 본 발명의 목적은 제조하기에 경제적이고 사용하기 쉬운 천연산 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적, 특징 및 잇점은 하기 상세한 설명을 보면 명확하게 알 수 있을 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 본 발명의 바람직한 실시양태를 제시하기는 하지만, 예시를 위한 것일 뿐이며, 당해 분야의 숙련자라면 하기 상세한 설명 및 도면을 참조하여, 본 발명의 개념 및 범주내에서 다양한 변형 및 변경을 할 수 있다는 것을 명확히 알 수 있을 것이다.

Claims (21)

1. 체리의 열매로부터 단리된 시아니딘-3-글루코실루티노시드, 시아니딘-3-루티노시드 및 시아니딘-3-글루코시드의 혼합물을 포함하는, 포유동물에서의 염증 저해용 조성물.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 시험관내에서 사용되는 것인 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 생체내에서 사용되는 것인 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 혼합물이 프루누스(Prunus)속으로부터 얻은 것인 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 혼합물이 프루누스 아비움(Prunus avium), 프루누스 세라수스(Prunus cerasus) 및 그의 혼합물로부터 얻어지는 것인 조성물.
7. 삭제
8. 제 1 항에 있어서, 포유동물이 인간인 조성물.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
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