KR100494979B1 - Liquid cover slip for protection of tissue section on slide from macromolecule-degradation and for improvement of optical resolution, composit for producing of the same, structure of slide having the same and method for manufacturing the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 커버 슬립, 이를 제조하기 위한 조성물, 이를 이용하여 제조된 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 슬라이드 구조체는, 지지층, 상기 지지층의 상면 중앙부에 안착되는 조직 절편 및 상기 조직 절편의 외부 노출면을 완전히 감싸도록 형성되며, 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 제조된 액상 커버 슬립을 포함하여 구비된 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 광학해상도가 개선되어 조직 절편에 대한 미세 관찰 및 미세 영역에 대한 정밀한 선택이 가능하며, 조직 절편이 무수(non-aquous) 상태를 유지함으로써 외부와 차단되어 조직 절편 내 거대분자물질의 파괴 또는 변성 문제를 원천적으로 해결하였다.The present invention relates to a cover slip for protecting slide tissue sections and enhancing resolution, a composition for manufacturing the same, a slide structure having a cover slip manufactured using the same, and a method of manufacturing the same. The slide structure according to the present invention is formed so as to completely surround the support layer, the tissue fragments seated on the upper center portion of the support layer, and the outer exposed surface of the tissue fragments, the polyvinyl pyrrolidone polymer having a molecular weight of 10,000 to 360,000 as a main component. Characterized in that provided, including the prepared liquid cover slip. According to the present invention, the optical resolution is improved to enable fine observation of the tissue sections and precise selection of the microregions, and the tissue sections are blocked from the outside by maintaining a non-aquous state, thereby preventing macromolecules in the tissue sections. We solved the problem of destruction or denaturation of the original.
Description
본 발명은 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립, 이를 제조하기 위한 조성물, 이를 이용하여 제조된 커버슬립을 구비한 슬라이드 구조체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미세 절제 장치의 광학현미경으로 관찰되며 레이저빔에 의해 절제되는 슬라이드 기판 상부에 탑재된 조직 절편의 광학해상도를 증진시킴과 동시에 조직 절편 내의 DNA, RNA, 단백질 등의 거대분자물질(macromolecule)의 파괴를 방지하여 물질 보존성을 향상시키는 기능을 갖는 액상 커버 슬립, 이를 제조하기 위한 조성물, 이를 이용하여 제조된 커버슬립을 구비한 슬라이드 구조체 및 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a liquid cover slip for protecting slide tissue sections and enhancing resolution, a composition for manufacturing the same, a slide structure having a cover slip manufactured using the same, and a method of manufacturing the same, and more particularly, to an optical of a fine cutting device. It enhances the optical resolution of tissue sections mounted on top of the slide substrate, which is observed under a microscope and is excised by a laser beam, and at the same time prevents destruction of macromolecules such as DNA, RNA, and proteins in the tissue sections. The present invention relates to a liquid cover slip having a function of improving, a composition for producing the same, a slide structure having a cover slip manufactured using the same, and a method of manufacturing the same.
일반적으로 광학현미경으로 생물 조직의 특정 조직 절편을 관찰하기 위해서는 사전에 여러 단계를 거쳐 관찰용 슬라이드가 제작되고 있다. 구체적으로 살펴보면, 인간을 포함한 동물, 식물 및 미생물 등의 생체원으로부터 필요한 조직의 일부를 채취한 후, 조직절편을 고정시키는 단계(fixing), 조직 절편 내에 남아 있는 수분을 제거하는 탈수단계(dehydration), 상기 탈수과정에서 조직 절편 내부로 침투한 알코올을 자일렌(xylene)으로 대체시키는 투명화단계(clearing), 파라핀용액이 조직 내에 포함되도록 하여 파라핀 블록형태로 제조되는 포매단계(embedding)를 각각 거친다. 이후, 파라핀 블록을 소정 두께로 절편하는 박절단계(section)를 진행하고, 박편상태로 절편된 조직 절편을 슬라이드 상부에 탑재시킨 후, 광학현미경 관찰을 위해 소정의 염료를 이용하여 세포내 구성요소에 대한 염색을 행하는 염색단계(staining)로 진행된다. In general, in order to observe a specific tissue section of a biological tissue by an optical microscope, the slide for observation is manufactured through several steps in advance. Specifically, after extracting a portion of the necessary tissue from a biological source, such as animals, plants, and microorganisms, including humans, fixing the tissue section (dehydration) to remove the water remaining in the tissue section (dehydration) In the dehydration process, the alcohol penetrating into the tissue section is replaced by xylene, and a clearing step is performed so that the paraffin solution is included in the tissue and embedded in the paraffin block. Subsequently, a section of the paraffin block is sliced to a predetermined thickness, and the tissue sections sliced into a flake state are mounted on the upper slide, and then, a predetermined dye is used for intracellular components for optical microscope observation. The staining is performed by staining.
한편, 동결조직 절편기(crymicrotome)를 이용하여 박편의 조직 절편을 제조하는 경우에는 상기 조직 절편을 파라핀블록 상태로 제조하는 포매단계를 거치지 않고도 신속하게 현미경 관찰을 위한 조직 절편을 제조할 수 있으며, 본 발명에 따른 실시예에서 채택되는 조직 절편은 파라핀블록 상태로 준비될 수도 있음은 물론, 동결조직 절편기를 이용하여 제조된 동결절편 상태로 준비된 후 이용될 수 있다.On the other hand, when preparing a tissue section of the flakes using a cryo-tissue sectioner (crymicrotome), it is possible to quickly prepare a tissue section for microscopic observation without going through the embedding step of preparing the tissue section in a paraffin block state, Tissue sections adopted in the embodiment according to the present invention may be prepared in a paraffin block state, of course, may be used after being prepared in a frozen section prepared using a frozen tissue sectioner.
그러나, 이러한 통상적인 조직 절편의 제작과정은 형태학적인 보존성(preservation)은 양호하나 조직 내부의 거대분자물질(macromolecule)이 상기 조직 절편의 제작과정 중, 고정과정이나 파라핀(paraffin) 포매 과정 중에 손상되는 단점이 있다. 한편, 동결조직 절편기를 이용하여 동결절편을 제작하는 경우에는 조직의 고정이나 파라핀 포매 과정이 없어도 되므로 조직 내 거대분자물질들이 잘 보존되는 장점이 있기는 하나 형태학적 보존상태가 불량한 것이 단점이다. 한편, 동결절편제작 방법은 거대분자물질의 보존성이 양호한 점은 있으나, 절제 조직을 새로이 확보해야하는 단점이 있으며, 통상적인 조직제작 방법으로 제작된 파라핀 블록은 이미 각 병원이 많이 확보되어 있어 샘플 확보가 아주 용이하다는 장점을 가지고 있다. 따라서, 이상에서 살펴본 조직 절편을 준비하는 각 방법이 갖는 장단점을 충분히 고려하여 미세 절제 기술에 이용할 조직 절편의 제작 방법 중 어느 것으로 할 것인가를 결정하여야 한다.However, the fabrication process of such a conventional tissue section has good morphological preservation, but macromolecules inside the tissue are damaged during the preparation of the tissue section, during the fixation process or during the embedding of paraffin. There are disadvantages. On the other hand, in the case of producing frozen sections using a frozen tissue sectioner, there is no need to fix the tissue or embed the paraffin, so that macromolecular substances in the tissues are well preserved, but the morphological preservation state is poor. On the other hand, the cryosection method has a good preservation of macromolecules, but has the disadvantage of securing a new ablation tissue, and the paraffin block produced by the conventional tissue production method has already secured a large number of hospitals. It has the advantage of being very easy. Therefore, in consideration of the advantages and disadvantages of each method for preparing the tissue sections described above, it should be determined which of the methods of fabricating the tissue sections to be used in the microdissection technique.
광학현미경으로 관찰되는 조직 절편 내의 특정세포나 특정부위만을 선택적으로 절제하여 채취한 후, 이들 세포로부터 추출한 DNA, RNA 또는 단백질을 대상으로 유전적 변화나 후속 연구를 시행하고 있는 미세 절제 기술 분야에서는 (1)광학현미경을 통한 조직 절편에 대한 정밀한 관찰은 당연히 전제되어야 하며, (2)조직 절편 내의 특정 영역에 대한 선택이 정밀하게 진행되어야 하고, (3)상기 선택된 영역에 대해서 용이하게 절제가 이루어져야 할 것이며, (4)절제된 조직 절편의 수거가 용이하게 이루어져야 하고, (5)미세 절제가 진행되는 동안 절제된 조직 절편 내의 거대분자물질의 파괴를 방지하여 이들 세포로부터 추출한 DNA, RNA 및 단백질을 대상으로 진행하는 후속 연구에 장애가 없어야 함은 자명하다. In the field of microscopic ablation technology in which only a specific cell or a specific site in a tissue section observed by an optical microscope is selectively excised and collected, and genetic changes or subsequent studies are performed on DNA, RNA or protein extracted from these cells ( 1) Precise observation of tissue sections through optical microscopy should, of course, be premised, (2) the selection of specific areas within the tissue sections should be carried out precisely, and (3) easy ablation of the selected areas. (4) the collection of the excised tissue sections should be facilitated, and (5) the DNA, RNA and proteins extracted from these cells to prevent destruction of the macromolecules in the excised tissue sections during microdissection. Obviously, there should be no obstacles to follow-up studies.
그런데, 종래에는 슬라이드 상부에 탑재된 조직 절편에 대해 염색단계까지 완결되면, 조직절편 자체와 유사한 굴절율(refractive index)을 보이는 봉입제(mounting media)를 슬라이드 상부면에 적하시킨 후, 커버글래스(cover glass)를 덮어주어 조직절편에서 일어날 수 있는 빛의 산란 현상을 막아줌으로써 광학해상도(optical resolution)를 개선시킨 후, 광학현미경 등의 관찰도구를 이용하여 조직절편을 관찰하고 있다. 그러나, 단순한 광학적 관찰 목적 이외에도, 슬라이드 상부에 탑재된 시료의 특정부위를 현미경 시야에서 레이저빔을 이용하여 미세 절제하기 위해서는 슬라이드 상부 면에 커버글래스를 탑재시키는 종래의 방법으로는 원하는 세포를 레이저로 절제한다는 것이 불가능하기 때문에 지금까지 커버글래스나 봉입제에 의한 처리없이 염색 후 건조된 조직 절편을 현미경으로 관찰하면서 미세 절제를 행하여왔다. 그러므로 광학해상도가 전혀 보상 또는 개선되지 않은 상태에서 미세 절제를 하여왔기 때문에 전암 병변과 같은 미세 변화가 있는 병변을 현미경 시야에서 충분한 정도로 구분 또는 식별이 이루어질 수 없는 기술적 한계를 초래하고 있다.However, conventionally, when the staining step for the tissue section mounted on the upper slide is completed, a dropping medium (mounting media) showing a refractive index similar to that of the tissue section itself is dropped on the upper surface of the slide, the cover glass (cover) The optical resolution is improved by covering the glass to prevent scattering of light that may occur in the tissue sections, and then the tissue sections are observed using an observation tool such as an optical microscope. However, in addition to a simple optical observation purpose, in order to finely ablate a specific portion of a sample mounted on the slide using a laser beam in a microscope field, conventional methods of mounting a cover glass on the upper surface of the slide are used to remove desired cells with a laser. Since it is impossible to do so, microscopic resection has been carried out while observing the dried tissue sections after staining without treatment with a cover glass or an encapsulant under a microscope. Therefore, since microscopic ablation is performed at a state where the optical resolution is not compensated or improved at all, it causes a technical limitation that lesions with fine changes such as precancerous lesions cannot be distinguished or identified to a sufficient extent in the microscope field of view.
이하에서, 기존에 개발된 미세 절제 장비를 이용하여 미세 절제를 진행하는 과정에서 발생될 수 있는 문제 요인을 구체적으로 살펴보기 위해 종래의 미세 절제 장비의 원리를 개략적으로 설명하기로 한다.Hereinafter, the principle of the conventional microdissection apparatus will be described in order to examine in detail the problem factors that may occur in the process of progressing the microdissection using the conventionally developed microdissection apparatus.
레이저를 이용한 미세 절제 장비는 절제방식에 따라 크게 두가지 종류로 구분할 수 있다. 그중 하나는 레이저의 열을 이용하는 방식이며, 다른 하나는 레이저를 나이프(knife)로 이용하는 방식이다. Microscopic ablation equipment can be classified into two types according to the ablation method. One method uses the heat of the laser, and the other method uses the laser as a knife.
레이저의 열을 이용하는 방법은 미국의 A사의 미세 절제 장비에서 구현되고 있는 방식으로서, 유리판 슬라이드 위에 염색된 조직 절편을 탑재시킨 후, 조직 절편 상부를 투명한 열가소성 필름(thermoplastic film)으로 덮는다. 이어서, 광학 현미경으로 조직 절편을 관찰하면서 원하는 세포 영역 상부에서 레이저빔을 발사하면, 열가소성 필름의 아래 면이 살짝 녹으면서 점성력을 갖게 되어, 그 하부에 배치된 조직 절편의 선택된 세포 영역과 결착된다. 이후, 열가소성 필름을 들어올리면, 레이저빔이 조사된 영역 부위의 열가소성 필름 하부면에 원하는 세포만을 선택적으로 수거하게 된다.The method using the heat of the laser is a method implemented in the micro ablation apparatus of the US company A, after mounting the dyed tissue sections on the glass plate slide, and covers the top of the tissue sections with a transparent thermoplastic film (thermoplastic film). Subsequently, firing the laser beam over the desired cell area while observing the tissue section with an optical microscope, the lower surface of the thermoplastic film is slightly melted and has a viscous force, binding to the selected cell area of the tissue section disposed beneath it. Then, when the thermoplastic film is lifted up, only the desired cells are selectively collected on the lower surface of the thermoplastic film in the region where the laser beam is irradiated.
레이저빔을 자르는 도구로서, 나이프(knife)로 이용하는 방식은, 독일의 P사, L사 및 M사의 미세 절제 장비에 공통적으로 채택되고 있는 방식으로, 상기 P사 및 L사의 장비에서는 337 나노미터(㎚)의 파장을 갖는 UV 레이저빔을 사용하고 있으며, 상기 M사의 장비에서는 350 나노미터(㎚)의 파장을 갖는 UV 레이저빔을 사용하고 있으며, 이들 모두의 장비들은 레이저의 광분해(photolysis) 원리를 이용하여 얇은 막이나 조직절편을 정교하게 절제하고 있다.As a tool for cutting a laser beam, a method of using a knife is commonly adopted in micro ablation equipment of P, L and M of Germany, and 337 nanometer ( UV laser beam having a wavelength of 2 nm) is used, and the M company's equipment uses a UV laser beam having a wavelength of 350 nanometers (nm), and all of these devices use the principle of photolysis of the laser. Thin membranes or tissue sections are exquisitely excised.
상기 P사의 미세 절제 장비는 유리 슬라이드 위에 박막의 폴리에틸렌 나프탈레이트(이하, 'PEN'이라 약칭하기도 함)막을 편편하게 펴서 가장자리를 따라 접착제로 붙인다. 이후, 박막의 PEN 막 중앙 상부에 조직 절편을 탑재하고 조직 절편에 대한 염색을 행한다. 이어서, 조직 절편에 대한 현미경 관찰을 통해서 원하는 세포나 세포집단의 영역을 폐곡선으로 선택한 후, 선택된 영역에 대해 폐곡선을 따라가면서 초점이 정교하게 조절된 레이저빔을 조사한다. 레이저빔이 조사된 물질층, 즉 조직 절편을 비롯한 PEN 막 등에서 광분해가 일어나면서 정교하게 절제가 이루어진다. 절제를 위한 레이저빔의 제1단계 조사가 종결되면, 레이저 절제시의 초점과 다른 심도로 초점 심도를 조절한 후, 절제된 영역을 잔존영역으로부터 이탈시키기 위한 제2단계의 레이저빔이 조사된다. 상기 제2단계 레이저빔의 조사는 상기 제1단계 레이저빔의 조사시의 초점 심도와는 달리, 레이저빔의 초점이 절제 영역에 형성되지 않도록 초점 심도를 조절한 후 절제된 영역에 대해 이루어지도록 한다. 상기 제2단계로 조사된 레이저빔은 초점이 이탈된 상태로 조사되기 때문에 절제 영역에서는 더 이상의 광분해가 일어나지는 않으나 레이저빔이 갖는 광자흐름(photon flow)에 의해서 절제된 영역에 대해 일정한 장력(catapulting power)이 미치게 된다. 따라서, 레이저빔의 장력에 의해 절제된 영역이 잔존 영역과 분리되어 상방향으로 이탈되면, 그 상부에서 미네랄 오일(mineral oil)로 코팅되어 있는 수거 튜브(collection tube)에 부착시킴으로써 절제 영역에 대한 수거가 이루어진다. 그러나, 이 방법은 광분해되는 초점을 맞춘(focusing) 부위와 장력효과(catapulting effect)를 위해 조절된 초점을 흐리게(defocusing)한 부위 간의 거리가 너무나 가깝기 때문에 제2단계 레이저빔 조사시 부분이나마 절제 영역에서 광분해가 일어날 수 있는 단점이 있다.The fine ablation equipment of P Company flatly spreads a thin film of polyethylene naphthalate (hereinafter also referred to as 'PEN') on a glass slide and attaches it with an adhesive along an edge. Thereafter, the tissue sections are mounted on the upper center of the PEN membrane of the thin film, and the tissue sections are stained. Subsequently, the microscopic observation of the tissue sections is used to select a region of the desired cell or cell group as a closed curve, and then irradiates a laser beam with a finely adjusted focus along the closed curve for the selected region. Excision is precisely performed by photolysis in the layer of material irradiated with the laser beam, that is, in the PEN film including tissue sections. When the first stage irradiation of the laser beam for ablation is terminated, after adjusting the depth of focus to a depth different from the focal point at the time of laser ablation, the second laser beam for irradiating the abrupt area from the remaining area is irradiated. The irradiation of the second stage laser beam is performed on the cut out region after adjusting the depth of focus so that the focus of the laser beam is not formed in the ablation region, unlike the depth of focus when the first stage laser beam is irradiated. Since the laser beam irradiated in the second step is irradiated with an out-of-focus state, no further photolysis occurs in the ablation area, but a constant tension with respect to the area abated by the photon flow of the laser beam. ) Is going crazy. Therefore, when the area cut out by the tension of the laser beam is separated from the remaining area and moved upward, the collection of the cut out area is attached by attaching it to a collection tube coated with mineral oil at the top thereof. Is done. However, this method is so close that the distance between the focused and defocused areas for photocatalytic effects is so close that the partial or ablation zones are irradiated during the second stage laser beam irradiation. There is a disadvantage in that photolysis can occur.
상기 P사 미세 절제 장비가 갖는 문제점을 해결하기 위해서 L사의 미세 절제 장치에서는 장력 효과에 의해 절제된 조직 절편을 상방향으로 이탈시키기 위한 레이저빔의 제2단계 조사시 부분적인 광분해의 문제를 해결하기 위해 레이저를 이용한 조직 절편의 선택부위를 절제한 후, 절제된 영역이 자연 낙하하도록 하며, 수거용 튜브를 슬라이드 하부에 배치시키는 방법을 채택하였다. 그러나, 절제된 영역의 자연낙하 방식에 의한 수거 방법은 장비에 발생된 미세 정전기로 인하여 수거율이 저하되는 문제점을 안고 있다.In order to solve the problem of the P company microresection equipment, in order to solve the problem of partial photolysis during the second stage irradiation of the laser beam to separate the tissue section cut by the tension effect in the upward direction in the L company microresection device After ablation of the selected section of the tissue section using a laser, the section was allowed to fall naturally, and a collection tube was placed under the slide. However, the collection method by the natural dropping method of the restrained area has a problem that the collection rate is reduced due to the fine static electricity generated in the equipment.
상기 M사의 장비는 상기 L사의 장비와 유사한 원리가 채택되어 사용되고 있지만, 미세 절제된 절제 영역에 대한 수거 과정이 자연낙하 방식 대신에 상부에서 접착성 캡(cap)으로 찍어내는 방식을 택하고 있으나, 이 방법은 수거 단계를 수행하기 위한 별도의 작업과정이 필요하며, 수거된 조직 절편을 회수하여 이용하는 것에 번거로움이 수반될 수 있는 단점이 있다.The M company's equipment adopts a principle similar to that of the L company's equipment, but the method of collecting the finely excised ablation zone is selected by taking an adhesive cap from the top instead of a natural drop method. The method requires a separate work process for performing the collection step, and has the disadvantage that it may be cumbersome to recover and use the collected tissue sections.
미세 절제 장비 및 이를 이용한 관찰, 절제, 수거 등의 방법과 관련한 선행자료로는 미국특허출원번호, 09/043,093호, 국제출원공개번호 WO 99/39176호, 국제출원공개번호 WO 00/34757호, 미국특허번호 6,010,888호 등을 통해 더욱 상세하게 확인할 수 있다.Prior materials related to the microscopic ablation apparatus and methods of observation, ablation, and collection using the same include US Patent Application No. 09 / 043,093, International Application Publication No. WO 99/39176, International Application Publication No. WO 00/34757, US Patent No. 6,010,888 and the like can be found in more detail.
그러나, 전술한 종래의 모든 미세 절제 장비들은 미세 절제 과정에서 커버글래스를 덮을 수 없는 한계로 인하여 광학해상도의 개선이 이루어질 수 없으므로, 절제 영역에 대한 미세한 관찰 및 선정이 용이하지 않은 문제가 내재되어 있는 기술적 한계에 노출되고 있음은 관련업계에서는 자명하게 이해되고 있다.However, all of the above-described conventional microscopic ablation apparatuses cannot improve the optical resolution due to the limitation of not being able to cover the cover glass during the microscopic ablation process, and thus there is a problem that minute observation and selection of the ablation zone are not easy. Exposure to technical limitations is well understood in the art.
전술한 종래의 문제점에 기초하여 본 발명은, 1)현미경 관찰시 조직절편의 광학해상도를 충분한 정도로 향상시키고, 2)절제용 레이저빔에 의해 쉽게 절제가 이루어지게 하며, 3)절제 이후에는, 쉽게 제거될 수 있어서 절제된 조직 절편으로부터 RNA, DNA 및 단백질 추출 과정에 아무런 영향을 미치지 않아야 하며, 4)조직 절편의 거대분자물질(macromolecule)의 변성을 억제할 수 있어야 하며, 5)그 사용 및 취급이 간편하여야 하는 등의 여러 기술적 과제를 동시에 달성하고자 함에 있으며, 이러한 기술적 과제를 달성하기 위하여 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립, 이를 위한 조성물, 이를 이용하여 제조된 슬라이드 구조체 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.On the basis of the above-mentioned conventional problems, the present invention provides a method for improving the optical resolution of tissue sections at the time of microscopic observation, 2) making the ablation easy by means of a laser beam for ablation, and 3) easily after ablation. Can be removed so that it does not affect RNA, DNA and protein extraction processes from excised tissue sections, and 4) can inhibit the degeneration of macromolecules in tissue sections, and 5) its use and handling In order to achieve a number of technical problems such as simplicity, and to achieve this technical problem, a liquid cover slip for protecting slide tissue sections and enhancing resolution, a composition therefor, a slide structure manufactured using the same, and a manufacturing method thereof It aims to provide.
본 발명의 목적을 달성하기 위해 제시되는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립은, 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈(Polyvinyl pyrrolidone) 중합체를 주성분으로 하여 제조되는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 제조된 커버슬립 내부에 UV 흡수 증진효과를 발휘할 수 있는 미량의 콩코레드(Congo Red)가 첨가되어 균일하게 분산된 상태로 제조되면 바람직하다. The liquid cover slip for slide tissue fragment protection and resolution enhancement proposed to achieve the object of the present invention is characterized in that it is prepared based on a polyvinyl pyrrolidone polymer having a molecular weight of 10,000 to 360,000. In this case, a small amount of congo red (Congo Red) capable of exerting a UV absorption enhancing effect may be added to the inside of the cover slip made of the polyvinyl pyrrolidone polymer as a main component, and thus, the polyvinyl pyrrolidone polymer may be prepared in a uniformly dispersed state.
본 발명의 목적을 달성하기 위해 제시되는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조용 조성물은, 알코올; 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체; 및 UV 흡수 증강제로서, 콩코 레드(Congo Red);를 포함하여 조성되어, 알코올을 용매로 하여 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 하고, 미량의 콩고 레드가 포함된 용질이 용해되어 있는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 알코올 용매는 에탄올(ethanol) 또는 이소프로판올(isopropanol)을 이용하면 바람직하다. 특히, 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 알코올 용매의 기준 중량 대비 5 내지 15중량%가 포함되어 있으며, 상기 콩고 레드는 알코올 용매의 기준 중량 대비 0.0025 내지 0.025 중량%가 함유되어 있으면 더욱 바람직하다.The composition for preparing a liquid cover slip for protecting slide tissue sections and improving resolution according to the present invention comprises alcohol; Polyvinyl pyrrolidone polymers having a molecular weight of 10,000 to 360,000; And a UV absorption enhancer, Congo Red; comprising a polyvinyl pyrrolidone polymer as a main component with alcohol as a solvent, and a solute containing a small amount of Congo Red is dissolved. It is done. In this case, the alcohol solvent is preferably used ethanol or isopropanol. In particular, the polyvinyl pyrrolidone polymer is contained 5 to 15% by weight based on the reference weight of the alcohol solvent, the Congo red is more preferably contained 0.0025 to 0.025% by weight relative to the reference weight of the alcohol solvent.
본 발명의 목적을 달성하기 위해 제시되는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 슬라이드 구조체는, 지지층; 상기 지지층의 상면 중앙부에 안착되는 조직 절편; 및 상기 조직 절편의 외부 노출면을 완전히 감싸도록 형성되며, 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 제조된 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립;을 포함하여 구비된 것을 특징으로 한다. A slide structure for protecting slide tissue sections and enhancing resolution proposed to achieve the object of the present invention includes a support layer; A tissue section seated on a central portion of the upper surface of the support layer; And a liquid cover slip formed to completely cover the external exposed surface of the tissue section, the tissue cover protection and resolving power enhancement of a polyvinyl pyrrolidone polymer having a molecular weight of 10,000 to 360,000 as a main component. It is done.
이때, 상기 지지층은, 고분자필름층으로 구비되면 바람직하다. 한편, 상기 고분자필름층 하부면에 면하여 층간접착부재에 의해 부착된 슬라이드 기판을 더 구비하면 바람직하다. 또한, 층간접착부재에 의해 상기 고분자필름층 하부면에 부착된 슬라이드 기판은, 상기 고분자필름층 상부에 안착된 조직절편이 점유하는 영역을 포함하는 평면영역의 직하방으로 소정의 개구부인 윈도우가 구비되어 있는 윈도우형 슬라이드 기판인 경우에는 더욱 바람직하다. 상기 고분자필름층은, 폴리에틸렌 나프탈레이트(Polyethylene Naphthalate) 중합체 물질을 주성분으로 하여 제조된 조성물을 이용하여 형성하면 바람직하다.At this time, the support layer is preferably provided with a polymer film layer. On the other hand, it is preferable to further include a slide substrate attached to the lower surface of the polymer film layer by the interlayer adhesive member. In addition, the slide substrate attached to the lower surface of the polymer film layer by the interlayer adhesive member may include a window having a predetermined opening directly below a planar region including an area occupied by the tissue fragments seated on the polymer film layer. It is more preferable in the case of the window-type slide substrate provided. The polymer film layer is preferably formed by using a composition prepared based on a polyethylene naphthalate polymer material.
본 발명의 목적을 달성하기 위해 제시되는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 슬라이드 구조체를 제조하는 방법은, (a)윈도우 슬라이드 기판 상부면의 가장자리에 층간점착성부재를 이용하여 고분자필름층을 부착시키는 단계; (b)윈도우리드가 결합된 상태의 윈도우 슬라이드 기판 상부면에 부착된 고분자필름층의 중앙 소정부 상면에 미리 준비된 조직 절편, 바람직하게는 동결절편을 안착시키는 단계; (c)상기 윈도우리드를 슬라이드 기판으로부터 제거하고, 슬라이드 판 상부에 안착된 조직 절편의 내부 구성물질에 대한 선택적으로 염색하는 단계; 및 (d)조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물을 이용하여 상기 조직 절편의 외부 노출면을 모두 감싸는 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 형성시키는 단계;를 포함하여 진행하는 것을 특징으로 한다.In order to achieve the object of the present invention, the method for manufacturing a slide structure for protecting the fragments of a slide and improving the resolution is provided. (A) Attaching the polymer film layer to the edge of the upper surface of the window slide substrate using an interlayer adhesive member. ; (b) placing a prepared tissue section, preferably a frozen section, on the upper surface of the central predetermined portion of the polymer film layer attached to the upper surface of the window slide substrate in which the window uri is bonded; (c) removing the window lid from the slide substrate and selectively staining the internal components of the tissue sections seated on top of the slide plate; And (d) forming a tissue cover protection and resolution enhancement liquid cover slip covering all external exposed surfaces of the tissue sections using the composition for preparing tissue fragment protection and resolution enhancement liquid cover slip. Characterized in that.
이때, 상기 (a)단계의 윈도우형 슬라이드 기판은, 카보네이트 물질을 주성분으로 하고, 기능성 엔지니어링 플라스틱의 일종인 폴리에테르이미드(Polyetherimide)와 정전기방지제가 미량 첨가된 물질로 제조된 것을 이용하면 바람직하다. 한편, 상기 (a)단계의 고분자필름층은, 폴리에틸렌 나프탈레이트(Polyethylene Naphthalate) 중합체 물질을 주성분으로 하여 제조된 것을 이용하면 바람직하다.In this case, the window-type slide substrate of step (a) is preferably made of a material containing a carbonate material as a main component, a trace amount of polyetherimide and an antistatic agent, which are a kind of functional engineering plastics. On the other hand, the polymer film layer of the step (a), it is preferable to use those prepared using a polyethylene naphthalate polymer material as a main component.
상기 (d)단계의 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물은, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 알코올 용매; 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체; 및 UV 레이저빔 흡수 증강제인, 콩고레드;를 포함하여 조성된 것을 이용하면 바람직하다. 이때, 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 알코올 용매의 기준 중량 대비 5 내지 15중량%가 포함되어 있으며, 상기 콩고레드는 알코올 용매의 기준 중량 대비 0.0025 내지 0.025 중량%가 포함된 것을 이용하면 더욱바람직하다. The composition for preparing a liquid cover slip for protecting slide tissue sections and resolving power of step (d) includes an alcohol solvent such as ethanol or isopropanol; Polyvinyl pyrrolidone polymers having a molecular weight of 10,000 to 360,000; And Congo red, which is a UV laser beam absorption enhancer, is preferably used. In this case, the polyvinyl pyrrolidone polymer is contained 5 to 15% by weight based on the reference weight of the alcohol solvent, the Congo red is more preferably used that contains 0.0025 to 0.025% by weight relative to the reference weight of the alcohol solvent.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 설명하고, 발명에 대한 이해를 돕기 위해 필요한 경우에는 첨부도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어지지 않아야 한다. 본 발명의 실시예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되어지는 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, and when necessary for better understanding of the present invention, it will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, embodiments according to the present invention can be modified in many different forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the embodiments described below. Embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.
본 발명에서 사용된 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 다양한 분자량을 갖는 고분자 중합체 물질로서, 인체에 무해하며, 물과 알코올 양쪽 모두에 용해되는 성질을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 조직 절편을 감싸는 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 형성하기 위해서 무수(non-aqueous) 상태의 알코올 용매를 이용하여 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 용해시켜 사용하는 것이 바람직하다. 통상 조직 절편의 내부 구성물질들은 외기 또는 수분에 대해 쉽게 손상을 받기 때문에 알코올 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 에탄올 또는 이소프로판올이 더욱 바람직하다.The polyvinyl pyrrolidone polymer used in the present invention is a high molecular polymer material having various molecular weights, and is known to be harmless to the human body and to dissolve in both water and alcohol. It is preferable to dissolve the polyvinyl pyrrolidone polymer using an alcohol solvent in a non-aqueous state to form a liquid cover slip for protecting the tissue sections and enhancing resolution. It is generally preferred to use alcohol solvents, since the internal components of tissue sections are easily damaged by outside air or moisture, more preferably ethanol or isopropanol.
그런데, 슬라이드 구조체를 제조하는 과정에서 종래에 사용되던 봉입제 및 커버글래스를 대신하여 본 발명에 따른 폴리비닐 피롤리돈을 주성분으로 하는 슬라이드 조직 절편을 보호하기 위한 코팅층은 조직 절편이 외부 영향으로부터 보호되는 보호막 기능을 수행함은 물론, 상기 코팅층에 의해 외부에 노출된 조직 절편이 감싸여지게 되면 조직 절편에 불규칙한 표면형태(morphology)에 대한 개선이 이루어지므로, 광학 현미경 관찰시 빛의 난반사나 산란현상을 방지할 수 있으며, 폴리비닐 피롤리돈 자체의 굴절율(refractive index, 1.43)이 조직절편의 굴절율과 대차없음으로 인해, 광학 현미경 관찰시 높은 해상도를 보장하는 기능을 갖는다.By the way, the coating layer for protecting the slide tissue fragments based on the polyvinyl pyrrolidone according to the present invention in place of the encapsulant and cover glass conventionally used in the manufacture of the slide structure, the tissue sections are protected from external influences As well as performing a protective film function, the tissue layer exposed to the outside by the coating layer is wrapped to improve the irregular surface morphology (morphology) in the tissue section, so that the light reflection or scattering phenomenon during the optical microscope observation It can be prevented, and because the refractive index of the polyvinyl pyrrolidone itself (1.43) is not comparable with the refractive index of the tissue section, it has a function of ensuring a high resolution during optical microscope observation.
본 발명에 따른 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 제조하기 위해 사용된 코팅제 조성물의 구체적인 실시예는, 에탄올을 용매로 하여, 에탄올 용매 기준 중량 대비 10중량%의 분자량이 40,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체와 UV 레이저빔 흡수 증강제로서 알코올 용매 기준 중량 대비 0.002 중량%가 함유된 콩고 레드를 포함하여 조성하여 슬라이드 구조체를 제조한 후, 광학해상도의 개선내용과 조직 절편 내의 내부 구성물질의 보존성을 확인하기 위한 실험을 행하여 그 결과를 살펴보았다.Specific examples of the coating composition used to prepare a liquid cover slip for protecting tissue sections and enhancing resolution according to the present invention include a polyvinyl chloride having a molecular weight of 40,000 at a weight of 10% by weight relative to the ethanol solvent reference weight, using ethanol as a solvent. After the slide structure was prepared by the composition including the condensed red polymer and the UV laser beam absorption enhancer containing 0.002% by weight of the alcohol solvent reference weight, the optical resolution and the preservation of the internal components in the tissue sections An experiment was conducted to confirm the results.
이러한 본 발명의 광학 해상도의 개선 효과에 대해서는 구체적인 실험자료를 통해 충분히 확인할 수 있었는 바, 하기 도 1 내지 도 3을 참조하여 보다 구체적으로 설명하기로 한다.The improvement effect of the optical resolution of the present invention was sufficiently confirmed through specific experimental data, which will be described in more detail with reference to FIGS. 1 to 3.
도 1 내지 도 3은 광학해상도의 차이를 설명하기 위한 비교예와 본 발명에 따른 실시예의 비교 사진들이다. 도 1 내지 도 3에서 관찰하고 있는 조직 절편은, 임상환자의 대장암, 간암 및 위암 관찰을 위해 각각 채취된 후 동결절편으로 준비된 조직 절편에 관하여 광학현미경으로 관찰한 확대된 영상이미지들이다.1 to 3 are comparison pictures for explaining the difference between the optical resolution and the embodiment according to the present invention. The tissue sections observed in FIGS. 1 to 3 are enlarged image images observed by optical microscopy of tissue sections prepared as cryosections after being collected for observation of colorectal cancer, liver cancer and gastric cancer in clinical patients, respectively.
도 1 내지 도 3을 참조하면, 각 도면에서 중앙화살표를 기준으로 우측의 사진은 본 발명에 따른 조직 절편 보호층을 코팅한 상태에서 광학현미경을 이용하여 조직 절편을 관찰한 실시예의 사진들을 나타낸 것이며, 이에 대비되는 중앙화살표 좌측의 각 사진은 본 발명에 따른 실시예에 대응되는 비교예의 사진들이다.1 to 3, the photographs on the right of the central arrow in each of the drawings show the photographs of the embodiments of observing the tissue sections using an optical microscope in a state in which the tissue section protective layer according to the present invention is coated. On the contrary, each photograph on the left side of the central arrow is a photograph of a comparative example corresponding to an embodiment according to the present invention.
먼저, 슬라이드 상부에 탑재시킨 조직 절편에 대한 소정의 염색 과정을 거친 후, 외기에 노출된 상태를 유지하고 있는 조직 절편에 대해 광학현미경으로 관찰하여 비교예 사진을 확보하였으며, 이후 본 발명에 따른 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립으로 조직 절편을 코팅한 후, 각각의 조직 절편에 대해서 광학현미경으로 다시 관찰하여 실시예 사진을 확보하였다. First, after a predetermined staining process for the tissue section mounted on the upper slide, by using an optical microscope to observe the tissue section that is exposed to the outside air to obtain a comparative example photograph, after the tissue according to the present invention After the tissue sections were coated with liquid cover slips for protecting sections and enhancing resolution, each tissue section was observed again with an optical microscope to obtain an example photograph.
상기 도 1 내지 도 3에 나타나 있는 좌측의 비교예와 실시예의 사진을 대조해보면 광학해상도의 개선정도를 직관적으로 확인할 수 있다. 즉, 비교예의 사진들(도 1의 1A, 도 2의 2A 및 도 3의 3A)에서는 염색된 조직 절편의 표면이 평평하게 유지되지 않음으로써 빛의 산란현상이 발행하여 관찰 대상의 세포들이 검은 색으로 보여 각 세포들간의 식별이 어려운 상태임을 확인할 수 있다. 그러나, 실시예의 사진들에서는 암세포와 염증세포를 확연하게 구분된 모습(도 1의 1B)을 확인할 수 있으며, 암세포들이 선구조물을 형성하고 모습(도 2의 2B)을 명확하게 확인할 수 있으며, 미만성으로 퍼져있는 모습(도 3의 3B)까지도 분명하게 구분할 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 액상 커버 슬립이 슬라이드 상의 조직 절편에 대한 광학해상도를 증진시키는 기능층으로 작용하고 있음을 알 수 있다.By comparing the photographs of the comparative example and the example shown on the left shown in Figs. 1 to 3, the degree of improvement of the optical resolution can be intuitively confirmed. That is, in the photographs of the comparative example (1A of FIG. 1, 2A of FIG. 2, and 3A of FIG. 3), the surface of the stained tissue sections is not kept flat, so that light scattering occurs and the cells to be observed are black. It can be seen that it is difficult to identify between each cell. However, in the photographs of the embodiment, cancer cells and inflammatory cells can be clearly seen (1B of FIG. 1), cancer cells form a linear structure (2B of FIG. 2) can be clearly confirmed, diffuse It can be seen that even the appearance (3B of FIG. 3) can be clearly distinguished. Therefore, it can be seen that the liquid cover slip according to the present invention serves as a functional layer to enhance the optical resolution of the tissue sections on the slide.
한편, 본 발명에 따른 액상 커버 슬립의 또 다른 중요한 기능은 조직 절편 내의 거대분자물질의 보존성을 갖는 점이라 할 수 있으며, 특히 동결절편의 경우에는 그 효과가 배가될 수 있어 바람직하다. 즉, 고정액에 고정된 이후 파라핀에 포매되어 있는 조직은 이미 조직 속에 거대분자물질이 파괴된 상태이거나 일부 변성된 상태에 있기 때문에 거대분자물질의 보존성은 그 의미가 약하게 취급될 수 있다. 이와 달리, 동결절편 내에는 거대분자물질이 잘 보존되어 있을 뿐만 아니라 이들을 파괴시킬 수 있는 각종 파괴성 효소들, 예컨대 알엔에이즈(RNase), 디엔에이즈(DNase) 및 프로테이즈(Protease) 등까지도 보존되어 있으므로, 동결절편의 취급시 조심해서 다루지 않게 되면, 거대분자물질 들이 이들 파괴성 효소에 의하여 파괴될 수 있는 한계가 있다. 한편, 이들 파괴성 효소들은 물이라는 기질이 있을 때에만 작용한다는 점에서 동결절편에 대한 취급과정, 예컨대 다단계로 진행되는 염색과정을 무수(non-aqueous)상태에서 진행한다면, 최소한 전술한 문제를 해결할 수 있으나, 염색이 완료된 동결절편이 광학현미경의 관찰 및 레이저빔을 이용한 절제가 이루어지는 동안 외기에 노출된 상태를 유지하게 되면, 외기 내에 포함된 미량의 수증기 성분에 의해서 전술한 바와 같은 거대분자물질의 파괴를 막을 방법이 없게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 하는 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립으로 조직 절편을 감싸게 되면 동결절편의 무수 상태가 유지시키면서, 외부에 노출이 이루어지지 않도록 격리함으로써 조직 절편 내의 거대분자물질의 파괴를 방지할 수 있는 기능이 발현되는 것이다.On the other hand, another important function of the liquid cover slip according to the present invention can be said to have the preservation of the macromolecular material in the tissue section, especially in the case of frozen sections it is preferable because the effect can be doubled. That is, since the tissue embedded in the paraffin after being fixed in the fixative fluid is already in a state in which the macromolecule is destroyed or partially denatured, the preservation of the macromolecule may be weakly treated. On the other hand, not only macromolecules are well preserved in the frozen sections, but also various destructive enzymes capable of destroying them, such as RNase, DNase, and protease, are also conserved. Therefore, there is a limit that macromolecules can be destroyed by these destructive enzymes, if not handled carefully when handling the frozen section. On the other hand, since these destructive enzymes only work when there is a substrate of water, if the handling process of the frozen section, for example, the multi-step dyeing process in a non-aqueous state, at least the above-mentioned problem can be solved. However, if the frozen sections, which have been dyed, remain exposed to the outside air during observation of the optical microscope and ablation using a laser beam, destruction of the macromolecule material as described above by the trace amount of water vapor contained in the outside air. There is no way to stop it. Therefore, when the tissue sections are wrapped with a liquid cover slip for protecting the tissue sections and resolving power based on the polyvinyl pyrrolidone polymer according to the present invention, while maintaining the anhydrous state of the frozen sections, it is isolated to prevent exposure to the outside. The function to prevent the destruction of the macromolecules in the tissue section is expressed.
즉, 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 하는 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립으로 조직 절편, 특히 동결절편을 감싸는 경우에는 동결절편 내외부를 무수 상태로 유지시키면서 외부와 차단을 시키기 때문에 조직 절편 내의 거대분자물질의 보존성을 향상시키는 기능층으로 작용하고 있음을 알 수 있다. 특히, 이러한 본 발명에 따른 조직 절편 내의 거대분자물질에 대한 보존성 향상 효과는 가장 파괴가 쉽게 일어나는 것으로 알려져 있는 RNA를 대상으로 진행한 구체적인 실험을 통해 간단하고도 충분하게 확인할 수 있는 바, 하기 도 4 및 도 5를 참조하여 보다 구체적으로 설명하기로 한다.That is, when the tissue sections, especially the frozen sections, are enclosed with a liquid cover slip for protecting and enhancing the resolution of the tissue sections mainly composed of polyvinyl pyrrolidone polymer, the tissue sections are blocked because the inside and outside of the frozen sections are kept in anhydrous state. It can be seen that it acts as a functional layer to improve the preservation of the macromolecular material in the interior. In particular, the effect of improving the preservation of the macromolecules in the tissue sections according to the present invention can be confirmed simply and sufficiently through a specific experiment conducted on RNA that is known to be the most easily destroyed, the following Figure 4 And it will be described in more detail with reference to FIG.
도 4 및 도 5는 조직 절편 내에 포함된 RNA 파괴 정도를 시간 변화에 따라 관찰한 크로마토그래피의 실험결과의 비교예와 실시예의 사진들로서, 도 4는 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 형성하지 않은 상태의 조직 절편에 대한 관찰실험결과를 나타낸 사진이며, 도 5는 본 발명에 따른 조직 절편보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립으로 보호되는 조직 절편에 관한 관찰실험결과를 나타낸 사진이다.4 and 5 are photographs of comparative examples and examples of the results of chromatography experiments observed the degree of RNA destruction contained in the tissue sections with time, Figure 4 is a liquid cover slip for tissue section protection and resolution enhancement Figure 5 is a photograph showing the results of the observation experiment on the tissue sections of the state, Figure 5 is a photograph showing the results of observation experiments on the tissue sections protected by the liquid cover slip for tissue section protection and resolution enhancement according to the present invention.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 슬라이드 상에 위치시킨 후 염색과정을 진행시킨 후, 별도의 외부 코팅층을 형성하지 않은 상태에서 실온에 방치해둔 동결절편에서 시간별로 추출한 리보소말 RNA의 28S밴드(4A) 및 18S밴드(4B)로 이루어진 두쌍의 밴드중 특히 상부의 28S밴드(4A)가 시간의 경과에 따라 현저하게 약하게 표시되고 있음을 알 수 있다. 즉, RNA의 28S밴드(4A)가 초기 관찰된 밴드(0시간)에 비해, 시간 경과에 따라 현저한 정도로 약화되고 있음을 확인할 수 있다. 이는 외부에 노출된 동결절편 내부에 포함되어 있던 RNA가 외기에 포함되어 있던 수분 등에 의해 손쉽게 파괴되기 때문이다.As can be seen in Figure 4, the 28S band (4A) of ribosomal RNA extracted over time from the frozen sections left at room temperature without the formation of a separate outer coating layer after the staining process after positioning on the slide (4A It can be seen that, among the two pairs of bands composed of the < RTI ID = 0.0 > and 18S band 4B, < / RTI > That is, it can be seen that the 28S band 4A of RNA is weakened to a considerable extent over time, compared to the initially observed band (0 hours). This is because RNA contained in the frozen section exposed to the outside is easily destroyed by moisture contained in the outside air.
이와 달리, 도 5를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 액상 커버 슬립으로 조직 절편을 코팅한 경우에는 RNA 밴드인 28S밴드(5A) 및 18S밴드(5B) 모두가 24시간이 경과한 후에도 초기 관찰된 밴드(0시간)와 동일한 정도의 밴드를 유지하고 있음 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 경우 조직 절편 내의 거대분자물질에 대한 보존성이 향상됨을 알 수 있다. 이러한 조직 절편 내의 거대분자물질에 대한 보존성이 향상된다면, 슬라이드를 제작한 이후, 일정한 기간을 경과하면서, 중장기적으로 슬라이드 내의 조직 절편에 대한 관찰 및 미세 절제가 이루어지는 연구의 경우에는 특히 바람직한 효과를 발휘할 수 있음은 자명하다.On the contrary, as can be seen from FIG. 5, when the tissue sections are coated with the liquid cover slip according to the present invention, all of the RNA bands 28S band (5A) and 18S band (5B) after 24 hours have elapsed. It can be seen that the band is maintained at the same level as the initial observed band (0 hours). Therefore, according to the present invention it can be seen that the preservation of the macromolecular material in the tissue section is improved. If the preservation of macromolecules in these tissue sections is improved, the results will be particularly desirable in the case of observation and microscopic resection of tissue sections in the slide over a certain period of time after the slide is manufactured. It can be obvious.
한편, 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 UV 레이저빔의 에너지 흡수력이 약하여, UV 레이저빔을 이용하여 절제 작업을 진행하기 위해서는 고에너지의 UV 레이저빔이 필요하게 되므로, 이를 보상하기 위하여 UV 레이저빔의 에너지 흡수력을 증진시키는 첨가제를 첨가함으로써, 절제 작업의 효율성을 증진시킬 수 있다. 이를 위해서 미량의 콩고 레드를 폴리비닐 피롤리돈 중합체에 균일하게 분산된 형태로 존재하게 하면 바람직한 효과를 달성할 수 있다.On the other hand, the polyvinyl pyrrolidone polymer has a weak energy absorbing power of the UV laser beam, a high energy UV laser beam is required to perform the ablation operation using the UV laser beam, so that the energy of the UV laser beam is compensated for. By adding an additive that enhances absorption, the efficiency of the ablation operation can be enhanced. To this end, it is possible to achieve the desired effect by presenting trace amounts of Congo red in a uniformly dispersed form in the polyvinyl pyrrolidone polymer.
따라서, UV 흡수력 증강제로 사용되는 미량의 콩고 레드 및 주성분인 폴리비닐 피롤리돈을 알코올 용매에 용해시켜 준비된 액상 상태의 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물을 조직 절편이 탑재된 슬라이드 상부층에 기존에 잘 알려져 있는 다양한 방법, 코팅제를 슬라이드 일측부에 적하시킨 후 경사를 주어 흘러내리면서 코팅층을 형성하게 하거나, 코팅제를 조직 절편의 직상부면에 적하시킨 후, 일정한 회전력을 주어 원심력에 의한 코팅층을 형성하거나, 분사방식으로 슬라이드 상부면에 코팅제를 분사시키는 방법으로 코팅층을 형성하게 할 수 있다. 한편, 이러한 코팅층 형성을 위해서는 수작업으로 진행할 수도 있지만, 자동화된 시스템을 이용하여 안정적이며, 대량적으로 간이하게 진행할 수도 있다.Therefore, the tissue fragment is loaded with a composition for preparing a liquid cover slip for protecting liquid slide slide sections and enhancing resolution prepared by dissolving a small amount of Congo red and a main component polyvinyl pyrrolidone used as a UV absorption enhancer in an alcohol solvent. Various well-known methods and coatings are previously added to one side of the slide on the slide upper layer, and the surface is inclined to flow down to form a coating layer, or the coating agent is dropped onto the upper surface of the tissue section and then given a constant rotational force to give a centrifugal force. Forming a coating layer by, or by spraying the coating on the upper surface of the slide in a spray method it may be to form a coating layer. On the other hand, to form the coating layer may be carried out by hand, it is possible to proceed in a stable and large quantities using an automated system.
이상과 같은 방법으로 슬라이드 상부면에 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립이 도포된 이후, 실온에서 방치하면 휘발성을 갖는 알코올 용매의 대부분이 제거되면 콩고 레드가 균일하게 분산되어 있는 폴리비닐 피롤리돈 중합체층이 고상화된 코팅층으로 변화되어 장기간 슬라이드 내의 조직 절편이 보존됨으로써, 조직 절편 내의 거대분자물질의 파괴를 방지하는 보호층으로 기능함은 물론, 355㎚ 파장을 갖는 UV 레이저빔을 이용하여 조직 절편을 절제할 경우, UV 파장대에서 에너지 흡수력이 상대적으로 양호한 콩고 레드와 같은 UV 흡수 증강제를 포함하고 있기 때문에 콩고 레드를 첨가하지 않은 경우에 비하여 상대적으로 작은 에너지로서도 본 발명에 따른 액상 커버슬립이 용이하게 절제될 수 있는 장점을 발휘할 수 있다.After the liquid cover slip is applied to the upper surface of the slide to protect tissue fragments and enhance the resolution, the polyvinyl pyrrolye is uniformly dispersed when Congo red is removed when most of the volatile alcohol solvent is left at room temperature. The don polymer layer is changed to a solidified coating layer to preserve tissue fragments in the slide for a long time, and thus serves as a protective layer to prevent destruction of the macromolecular material in the tissue fragments, as well as using a UV laser beam having a wavelength of 355 nm. When a tissue section is excised, the liquid cover slip according to the present invention is used as a relatively small energy as compared with the case without adding Congo red because it contains a UV absorption enhancer such as Congo Red, which has a relatively good energy absorption in the UV wavelength range. It can exhibit the advantage that it can be easily ablation.
도 6은 본 발명에 따른 액상 커버 슬립 내에 첨가되는 콩고 레드의 파장대별 흡수대역도이다.6 is an absorption band diagram of wavelength bands of Congo red added in a liquid cover slip according to the present invention.
도 6에 도시된 바에 따르면, 그래프의 가로축은 파장대역을 나타내고 있으며, 그래프의 세로축은 흡수도를 나타내고 있는 바, 소정 파장에서 상대적인 흡수도를 확인 할 수 있다. 도 6에 도시된 그래프 상에는 두 개의 피크가 형성되어 있음을 확인할 수 있으며, 미세절제 장비에서 통상적으로 사용되는 350 나노미터(㎚) 주변의 파장 대역에서 두 번째 강도에 해당하는 피크(60)가 형성되어 있음을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 따른 액상 커버 슬립 내에 첨가되는 콩고 레드가 액상 커버슬립에 첨가되는 경우에는 미세 절제용 UV 레이저빔의 흡수도가 증강되어, 낮은 에너지 상태에서도 절제 작업이 원활하게 수행될 수 있는 역할이 가능해짐을 알 수 있다.As shown in FIG. 6, the horizontal axis of the graph represents a wavelength band, and the vertical axis of the graph represents an absorbance, and thus the relative absorbance at a predetermined wavelength can be confirmed. On the graph shown in FIG. 6, it can be seen that two peaks are formed, and a peak 60 corresponding to the second intensity is formed in the wavelength band around 350 nanometers (nm) which is commonly used in microablation equipment. It can be confirmed. Therefore, when the Congo red added in the liquid cover slip according to the present invention is added to the liquid cover slip, the absorption of the UV laser beam for fine ablation is enhanced, so that ablation can be performed smoothly even in a low energy state. It can be seen that the role is possible.
본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 제조하기 위해 사용되는 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 다양한 분자량을 갖는 상태로 존재할 수 있으나, 전술한 바와 같이, 10,000 내지 360,000의 범위의 분자량을 갖는 경우에 본 발명이 목적하는 바를 최고의 효과로 달성할 수 있다. 이러한 분자량에의 수치한정 범위를 초과하는 경우, 즉 분자량이 10,000 미만인 경우에는 폴리비닐 피롤리돈의 용매인 알코올 성분이 휘발된 이후 건조과정을 거치면서 갈라지는 현상(cracking)이 발생되어 바람직하지 못하며, 분자량이 360,000을 초과하는 경우에는 UV 레이저빔에 의해 절제 과정이 원활하게 진행되지 않는 문제점이 있으므로, 특히 UV 레이저빔을 미세 절제 장치에 사용되는 슬라이드의 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립으로서의 적합성은 열악하다 할 것이다.The polyvinyl pyrrolidone polymer used to prepare a liquid cover slip for protecting slide tissue sections and enhancing resolution according to the present invention may be present in a variety of molecular weights, but as described above, a molecular weight in the range of 10,000 to 360,000 In the case of having the present invention can achieve the object with the best effect. When the molecular weight exceeds the molecular weight limit, that is, when the molecular weight is less than 10,000, cracking occurs during drying after the volatilization of an alcohol component, which is a solvent of polyvinyl pyrrolidone, is undesirable. When the molecular weight exceeds 360,000, there is a problem that the ablation process does not proceed smoothly by the UV laser beam, and therefore, the UV laser beam is particularly suitable as a liquid cover slip for protecting tissue sections and enhancing resolution of slides used in the microdissection apparatus. Will be poor.
본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 제조하기 위해 사용되는 코팅제 조성물 성분은, 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 중합체 및 콩고 레드로 조성되며, 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 알코올 용매의 기준 중량 대비 5 내지 15중량%가 포함되는 것이 바람직하며, 상기 콩고 레드는 알코올 용매의 기준 중량 대비 0.0025 내지 0.025 중량%가 함유되어 있으면 더욱 바람직하다.The coating composition component used to prepare the liquid cover slip for protecting slide tissue sections and enhancing resolution according to the present invention is composed of alcohol, polyvinyl pyrrolidone polymer and Congo red, and the polyvinyl pyrrolidone polymer is an alcohol solvent. It is preferable that 5 to 15% by weight based on the reference weight of the Congo red, more preferably 0.0025 to 0.025% by weight relative to the reference weight of the alcohol solvent.
만일, 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체의 사용함량이 5 중량% 미만인 경우에는, 점도가 낮게 형성되어 조직 절편 상부에 적하시 너무 쉽게 흘러내려 너무 얇게 커버 슬립이 형성되거나, 경우에 따라서는 커버 슬립을 형성하지 않는 영역까지도 존재할 수 있어, 조직 절편의 표현 형태를 충분하게 개선시키지 못하여 바람직하지 못하며, 그 사용함량이 15중량%를 초과하는 경우에는, 점도가 너무 높게 형성되어 커버 슬립의 두께가 필요 이상으로 두껍게 형성됨으로써 절제시 고에너지의 레이저빔을 이용하여야 하므로 바람직하지 못하다. 따라서, 본 발명의 목적을 충분히 달성하기 위해서라면 상기 수치한정 범위 내에서 상기 폴리비닐 피롤리돈의 함량이 조절되어야 바람직하다.If the polyvinyl pyrrolidone polymer is used in an amount of less than 5% by weight, the viscosity is formed to be low and drips too easily upon dropping onto the tissue section so that the cover slip is too thin, or in some cases the cover slip Areas that do not form may be present, which is not desirable because it does not sufficiently improve the expression form of the tissue sections, and when the content thereof exceeds 15% by weight, the viscosity is formed so high that the thickness of the cover slip is more than necessary. It is not preferable because the high energy laser beam must be used for ablation because it is formed thick. Therefore, in order to fully achieve the object of the present invention, the content of the polyvinyl pyrrolidone is preferably controlled within the numerical limits.
또한, 상기 콩고 레드의 사용함량이 0.0025중량% 미만인 경우에는, UV 흡수 효과가 발현되지 않기 때문에 고에너지 레이저빔이 필요하게 되고, 그 사용함량이 0.025중량%를 초과하는 경우에는, 콩고 레드 자체가 갖는 붉은 색깔이 조직 절편에 과도하게 발현되어 조직 절편에 대한 형태학적 관찰에 영향을 미칠 수 있으므로 바람직하지 못하다. 따라서, 본 발명의 목적을 충분히 달성하기 위해서라면 상기 수치한정 범위 내에서 상기 콩고 레드의 사용 함량이 조절되어야 바람직하다.In addition, when the content of the Congo red is less than 0.0025% by weight, since the UV absorption effect is not expressed, a high energy laser beam is required. When the content of the Congo red exceeds 0.025% by weight, the Congo red itself is It is undesirable because the red color having is excessively expressed in the tissue sections and may affect the morphological observation of the tissue sections. Therefore, in order to fully achieve the object of the present invention, it is preferable that the use content of the Congo red is adjusted within the numerical limits.
본 발명에 따른 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립이 구비된 슬라이드 구조체의 다양한 실시예 대해 하기 도 7 및 도 8을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다.Various embodiments of the slide structure provided with a liquid cover slip for tissue section protection and resolution enhancement according to the present invention will be described in detail with reference to FIGS. 7 and 8.
도 7 및 도 8은 본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립이 구비된 슬라이드 구조체의 일실시예에 관한 단면도들이다. 7 and 8 are cross-sectional views of an embodiment of a slide structure provided with a liquid cover slip for protecting slide tissue sections and enhancing resolution according to the present invention.
도 7은 본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체의 일실시예의 단면도이다.7 is a cross-sectional view of one embodiment of a slide structure having a liquid cover slip for protecting slide tissue sections and enhancing resolution according to the present invention.
도 7에 도시된 바에 따르면, 지지층으로 기능하는 평판구조를 갖는 슬라이드 기판(70) 상부에 층간접착부재(미도시)에 의해 부착된 고분자필름층(72)을 구비하도록 하였으며, 그 상부에 조직 절편(74)과 액상 커버 슬립(76)이 적층된 슬라이드 구조체가 구성되어 있다.As shown in FIG. 7, a polymer film layer 72 attached by an interlayer adhesive member (not shown) is provided on a slide substrate 70 having a flat plate structure functioning as a support layer, and a tissue fragment is disposed thereon. The slide structure which laminated | stacked 74 and the liquid cover slip 76 is comprised.
도 7에 도시된 슬라이드 구조체는 광학현미경을 이용한 단순 관찰용으로만 사용되는 경우에는 본 발명에 따른 액상 커버 슬립(76)으로 인한 개선된 광학해상도로 인하여 조직 절편 내의 미세 구조에 대한 상세하고 정밀한 관찰이 가능함은 물론, 조직 절편 내의 거대분자물질에 대한 보존성 향상으로 인해 후속 연구에도 신뢰성이 보장된 연구가 수행될 수 있다.When the slide structure shown in FIG. 7 is used only for simple observation using an optical microscope, detailed and precise observation of the microstructure in the tissue section due to the improved optical resolution due to the liquid cover slip 76 according to the present invention. In addition to this possibility, reliability studies can be performed in subsequent studies due to improved preservation of macromolecules in tissue sections.
한편, 상기 도 7에 도시된 슬라이드 구조체를 상하 역위시키지 않은 상태로 미세 절제 장치의 절제 스테이지에 탑재시킨 후, 하방으로부터 레이저빔을 조사하고, 상방으로 절제된 조직 절편을 수거하는 방식을 이용하는 경우에도, 광학적 관찰을 위한 개선된 해상도로 인하여 절제 영역의 효율적이고 신뢰성이 있는 선택 및 절제된 조직 절편 내의 거대분자물질에 대한 보존성이 개선됨으로 인하여, 조직 절편으로부터 추출한 DNA, RNA 및 단백질을 대상으로 하는 후속 연구에서도 연구의 효율성과 신뢰성을 향상시킬 수 있는 장점을 제공한다.On the other hand, after mounting the slide structure shown in Fig. 7 in the ablation stage of the microdissection apparatus without being inverted up and down, even when using a method of irradiating a laser beam from below and collecting tissue sections excised upwards, Improved resolution for optical observation results in efficient and reliable selection of the resected area and improved preservation of macromolecules in the resected tissue sections, and subsequent studies with DNA, RNA and proteins extracted from the tissue sections are also available. It offers the advantage of improving the efficiency and reliability of research.
도 8은 본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립이 구비된 슬라이드 구조체의 다른 실시예의 단면도이다.8 is a cross-sectional view of another embodiment of a slide structure provided with a liquid cover slip for protecting slide tissue sections and enhancing resolution according to the present invention.
도 8에 도시된 바에 따르면, 윈도우를 구비한 슬라이드 기판(80) 가장자리 상부면에 층간접착부재(미도시)에 고분자필름층(82)를 부착되어 있으며, 상기 고분자필름층(82)의 중앙 상부면에 조직 절편(84)이 안착되어 있고, 상기 조직절편을 완전하게 감싸는 액상 커버 슬립(86)이 적층된 상태로 슬라이드 구조체가 구성되어 있다. 상기 액상 커버 슬립(86)이 조직 절편(84)을 견고하게 밀착시킴과 동시에 그 외부를 완전히 감싸고 있고, 조직 절편과 유사한 굴절율을 가지고 있으며 또한 공기와 접촉하는 계면이 평평하게 형성되어 있음으로서, 광학현미경을 이용한 관찰시 난반사나 산란 등을 방지함과 아울러, 조직 절편 표면 형태를 개선시킴으로써, 미세 영역에 대한 관찰시 충분한 광학해상도를 보여줄 수 있다.As shown in FIG. 8, the polymer film layer 82 is attached to an interlayer adhesive member (not shown) on the upper surface of the edge of the slide substrate 80 having the window, and the center upper portion of the polymer film layer 82 is attached. The tissue section 84 is seated on the surface, and the slide structure is constructed in a state in which the liquid cover slips 86 completely covering the tissue sections are stacked. The liquid cover slip 86 firmly adheres to the tissue sections 84 and completely surrounds the outside thereof, has a refractive index similar to that of the tissue sections, and has a flat interface with air. In addition to preventing diffuse reflection and scattering during observation using a microscope, by improving the surface morphology of the tissue section, sufficient optical resolution can be shown when observing the microscopic area.
또한, 액상 커버 슬립(86)에 의해 조직 절편(84) 내의 거대분자물질, 예컨대 DNA, RNA 및 각종 단백질 등이 시간 경과에 따라 손상 또는 손실되는 것을 방지하며, 절제된 조직 절편 또는 이들로부터 추출되는 DNA, RNA 및 단백질을 대상으로 하는 후속 연구의 신뢰성을 확보할 수 있다. In addition, the liquid cover slip 86 prevents macromolecules, such as DNA, RNA, various proteins, etc., in the tissue sections 84 from being damaged or lost over time, and excised tissue sections or DNA extracted from them. , Reliability of subsequent studies involving RNA and proteins.
한편, 슬라이드 기판(80)은 조직 절편(84)이 안착된 고분자필름층(82)의 하부 소정면은 외기에 직접 노출시키는 윈도우를 구비하고 있다. 슬라이드 기판(80)의 윈도우는 조직 절편(84), 특히 동결절편을 고분자필름층(82)에 탑재시킬 때, 고분자필름층(82)이 극저온 상태의 동결절편과 접하면서 대류 및 전도로 인한 저온 동조화현상이 발생되어, 고분자필름층(82)에 동결절편이 부착성이 저하되는 것을 방지하기 위해 슬라이드 기판(80)의 윈도우에 윈도우리드(88)가 결합된 상태에서 동결절편의 탑재를 시도하는 것이 바람직하다. 슬라이드 기판(80)에 윈도우리드(88)가 탈 부착시키는 방향을 화살표(8A)로 표시하였다.On the other hand, the slide substrate 80 is provided with a window for directly exposing the lower predetermined surface of the polymer film layer 82 on which the tissue sections 84 are seated. The window of the slide substrate 80 has a low temperature due to convection and conduction while the tissue film 84, particularly the frozen piece, is mounted on the polymer film layer 82 while the polymer film layer 82 is in contact with the cryosection in the cryogenic state. In order to prevent the deterioration of adhesion of the frozen slices to the polymer film layer 82 due to the synchronization phenomenon, the attempt to mount the frozen slices while the window lead 88 is coupled to the window of the slide substrate 80 is performed. It is preferable. The direction in which the window lid 88 detaches from the slide substrate 80 is indicated by an arrow 8A.
한편, 도 7 및 도 8에서 도시되고 있는 슬라이드 구조체의 두께는 실제와는 현격한 차이를 보이고 있으며, 수직구조 상에서 설명의 용이함을 위해 각 층의 두께가 다소 과장되게 표현되고 있음을 충분히 이해하여야 하며, 실제 축척 등을 고려하여 도시하고 있는 것이 아님은 자명하다 할 것이다. 고분자필름층(72, 82)는 1 내지 2 마이크로미터(㎛)의 두께로 형성되며, 조직 절편(74, 84)는 2 내지 6 마이크로미터(㎛)의 두께로 형성되며, 본 발명에 따른 액상 커버 슬립(76, 86)은 8 내지 22 마이크로미터(㎛)의 두께로 형성되는 것이 일반적이다. 특히, 슬라이드기판(70, 80)의 실제 두께에 비하면, 육안으로 고분자필름층, 조직 절편 및 액상 커버 슬립의 두께는 표시하기 어려울 정도의 미세한 두께를 갖는다는 것은 상술하지 않아도 당업계에서는 자명하게 이해되고 있는 사실이다.On the other hand, the thickness of the slide structure shown in Figures 7 and 8 shows a marked difference from the actual, it should be fully understood that the thickness of each layer is slightly exaggerated for ease of explanation on the vertical structure. It is obvious that the figures are not illustrated in consideration of actual scales. The polymer film layers 72 and 82 are formed to a thickness of 1 to 2 micrometers (µm), and the tissue sections 74 and 84 are formed to a thickness of 2 to 6 microns (µm), and the liquid phase according to the present invention. Cover slips 76 and 86 are typically formed to a thickness of 8 to 22 micrometers (μm). In particular, compared to the actual thickness of the slide substrate (70, 80), it is obvious to those skilled in the art that the thickness of the polymer film layer, tissue sections and the liquid cover slip has a fine thickness that is difficult to display, even if not described above. It is becoming true.
도 9는 상기 도 8에서 도시되고 설명된 슬라이드 구조체에 대한 미세 절제 및 수거를 설명하기 위한 단면도이다.FIG. 9 is a cross-sectional view illustrating fine cutting and collection of the slide structure shown and described with reference to FIG. 8.
도 9에 도시된 바에 따르면, 도 8의 슬라이드 구조체의 상하 방향을 역위시킨 상태로 미세 절제 장치의 슬라이드 스테이지부(90)에 탑채시킨 상태에서, 조직 절편(84)을 관찰수단으로 화살표(9A)의 방향으로 관찰하여, 절제 영역(미도시)을 선택한 후, 상기 역위된 상태로 탑채된 슬라이드 구조체의 직상부로부터 화살표 (9B)의 방향으로 조사되는 레이저빔에 의해 선택된 영역내의 고분자필름층(82), 조직 절편(84) 및 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립(86)이 모두 절제된 미세 절편 영역에 대해 작용하는 중력의 영향에 의해 화살표(9C)의 방향으로 그 직하부에 배치된 수거함(92)에 수거되는 것을 알 수 있다. 한편, 미세 절제 장치는 전원에 의해 구동되며, 슬라이드 구조체를 이루는 각 층상구조가 박층으로 형성되어 있으며, 조사되는 레이저빔 자체도 일정한 에너지를 갖고 있는 점 등의 이유로 윈도우 슬라이드 기판(80)에 미세한 정전기가 발생할 수 있으며, 이로 인하여 절제된 미세 절제 영역에 미치는 중력요인보다도 더 큰 정전기력이 발생하는 경우에는 수거함(92) 내부로 수거가 올바르게 이루어지지 않을 확률이 상당하다. 따라서, 절제된 미세 영역이 단순 중력 요인에 의해 낙하되어 수거되는 방법에만 의존하는 것은 바람직하지 않고, 절제 영역으로 선택된 조직 절편에 대해 레이저빔을 이용한 절제 작업이 완료되면서, 조사되고 있는 레이저빔이 갖고 있는 장력에 의하여 조직 절편의 잔존 영역으로부터 절제된 영역의 분리를 촉진시킴과 동시에 윈도우 슬라이드 기판의 재질 요소에 정전기 방지제를 포함시켜 제조함으로써, 슬라이드 구조체 내부에 발생되는 미세한 정전기력을 제거함으로써, 이로 인한 수거율 저하의 문제를 해결하였다.As shown in FIG. 9, in the state where the slide stage portion 90 of the microscopic ablation apparatus is topped with the up and down direction of the slide structure of FIG. 8 inverted, the tissue sections 84 are shown by arrows 9A as observation means. The polymer film layer 82 in the region selected by the laser beam irradiated in the direction of the arrow 9B from the upper portion of the slide structure topped in the inverted state after observing in the direction of? ), Tissue sections 84 and liquid cover slips 86 for tissue section protection and resolution enhancement are all disposed directly beneath them in the direction of arrow 9C under the influence of gravity acting on the excised microsection region. It can be seen that (92) is collected. On the other hand, the microscopic ablation apparatus is driven by a power source, each layer structure constituting the slide structure is formed in a thin layer, fine static electricity on the window slide substrate 80 due to the fact that the irradiated laser beam itself also has a certain energy. In this case, if the electrostatic force greater than the gravity factor affects the finely excised region is removed, the probability that the collection is not made correctly in the collection bin 92 is significant. Therefore, it is not desirable to rely only on the method in which the excised microregions are dropped and collected by a simple gravity factor, and the laser beam being irradiated with the laser beam on the tissue section selected as the excised region is completed. By promoting the separation of the excised area from the remaining areas of the tissue sections by tension, and by including an antistatic agent in the material element of the window slide substrate, by removing the fine electrostatic force generated inside the slide structure, thereby reducing the collection rate Solved the problem.
한편, 도 9에 도시된 바와 같은 역위된 상태가 아닌, 즉 도 8에 도시되어 있는 상태 그대로를 미세 절제 장치의 슬라이드 스테이지부에 탑재시킨 후, 상기와 같은 단계에 의해서도 조직 절편 관찰, 레이저빔에 의한 절제 및 절제된 조직 절편의 수거 작업이 진행될 수도 있다.On the other hand, after mounting the non-inverted state as shown in FIG. 9, i.e., as shown in FIG. By resection and collection of the resected tissue sections may proceed.
상기 도 7 내지 도 9에 의해 설명한 슬라이드 구조체의 각 구성부재 중 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립(76 및 86)은 전술한 바에 따라 제조된 것을 사용하면 바람직하며, 고분자필름층(72 및 82)은 폴리에틸렌 나프탈레이트 중합체 물질을 이용하여 제조된 것을 사용하면 바람직하다. 한편, 슬라이드 기판(70 및 80)은, 카보네이트 물질을 주성분으로 하고, 폴리에테르이미드와 정전기방지제가 첨가된 물질을 이용하여 제조된 것이면 바람직하며, 특히 낙하식 수거방식의 미세 절제 방법을 이용할 수 있는 윈도우를 구비한 슬라이드 기판(80)의 경우에는 정전기 방지제가 첨가됨으로써 수거율 개선에 큰 효과를 보일 수 있다.Among the constituent members of the slide structure described with reference to FIGS. 7 to 9, the liquid cover slips 76 and 86 for tissue fragment protection and resolution enhancement are preferably used as described above, and the polymer film layers 72 and 82) is preferably prepared using a polyethylene naphthalate polymer material. On the other hand, the slide substrates 70 and 80 are preferably manufactured using a material containing a carbonate material as a main component and a polyetherimide and an antistatic agent added thereto, and in particular, a microscopic ablation method of a drop collection method can be used. In the case of the slide substrate 80 having a window, the antistatic agent may be added, thereby showing a great effect in improving the collection rate.
본 발명의 목적을 달성하기 위해 제시되는 슬라이드 구조체를 제조하는 방법에 대해서 하기 도 10를 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 이때, 슬라이드 구조체에 대한 도면 부호는 도 9에 도시된 구조를 참조하여 설명하기로 한다.A method of manufacturing the slide structure proposed to achieve the object of the present invention will be described in detail with reference to FIG. In this case, reference numerals for the slide structure will be described with reference to the structure shown in FIG. 9.
도 10은 본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립이 구비된 슬라이드 구조체를 제조하는 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.10 is a flowchart illustrating a method of manufacturing a slide structure having a liquid cover slip for protecting slide tissue sections and enhancing resolution according to the present invention.
먼저, 윈도우를 구비한 슬라이드 기판(80) 상부면의 가장자리에 점착성부재(미도시)를 이용하여 고분자필름층(82)을 부착시킨다(S100). 이때, 슬라이드 기판(80)의 윈도우에 결합되는 윈도우리드(88)는 윈도우 슬라이드 기판(80)에 미리 결합된 상태에서 고분자필름층(82)을 부착시킬 수 있음은 물론, 먼저 고분자필름층(82)을 슬라이드 기판(80) 상부면에 부착시킨 이후에 윈도우리드(88)를 결합시킬 수도 있다. 한편, 슬라이드 기판(80)은, 카보네이트 물질을 주성분으로 하고, 폴리에테르이미드와 정전기방지제가 첨가된 물질로 제조된 것을 이용하고, 상기 윈도우리드는 고기능성 엔지니어링 플라스틱, 폴레에테르이미드 또는 폴리아릴레이트(Polyarylate, 통상적으로는 '아델(ardel)'이라고 불림)을 이용하여 제조되면 바람직하다. 특히, 슬라이드 기판(80)에 정전기 방지제를 첨가하여 제조함으로써, 도 9에서 설명한 바와 같이 정전기력에 의해 미세 절제된 조직 절편의 수거율이 저하되는 문제점을 해결할 수 있으므로 특히 바람직하다.First, the polymer film layer 82 is attached to the edge of the upper surface of the slide substrate 80 having the window using an adhesive member (not shown) (S100). In this case, the window lead 88 coupled to the window of the slide substrate 80 may attach the polymer film layer 82 in a state of being pre-coupled to the window slide substrate 80. ) May be attached to the top surface of the slide substrate 80. On the other hand, the slide substrate 80 is made of a material containing a carbonate material as a main component, a polyetherimide and an antistatic agent is added, and the window lead is a high functional engineering plastic, polyetherimide or polyarylate ( Polyarylate, commonly referred to as 'ardel', is preferred. In particular, by adding an antistatic agent to the slide substrate 80, it is particularly preferable because it can solve the problem that the collection rate of the tissue sections finely excised by the electrostatic force is reduced as described in FIG.
이어서, 윈도우리드(88)가 결합된 상태의 슬라이드 기판(80) 상부면에 부착된 고분자필름층(82)의 중앙 소정부 상면에 미리 준비된 조직 절편(84)을 안착시킨다(S102). 이때, 고분자필름층(82)은 폴리에틸렌 나프탈레이트(Polyethylene Naphthalate) 중합체 물질을 주성분으로 하여 제조된 것을 이용하면 바람직하다. 한편, 고분자필름층(82)의 열용량이 매우 작기 때문에, 조직 절편(84)으로 극저온상태의 동결절편을 사용하는 경우에는 동결절편을 고분자필름층(82)에 접촉시 급속한 열전달에 의해 저온동조화 현상이 진행되어, 동결절편(84)의 온도와 고분자필름층(82)이 열평형을 이루어져, 양 물질간의 접촉이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다. 이러한 문제점을 윈도우리드(88)가 해결하고 있는 바, 상기 윈도우리드(88)가 고분자필름층(82)에 밀착되면서 얇은 공기층(미도시)을 개재시키면서 열평형에 대한 일정한 완충역할을 함과 동시에 고분자필름층(82)의 노출된 다른 이면을 차단시키으로서, 고분자필름층(82)이 급속하게 저온 동조화되는 것을 억제하는 기능을 발휘하게 된다. 따라서, 고분자필름층(82)의 온도와 동결절편(84) 간의 온도가 일정 정도로 격차를 유지함으로써, 동결절편(84)이 고분자필름층(82)에 용이하게 부착 고정될 수 있도록 한다.Subsequently, the tissue sections 84 prepared in advance are seated on the upper surface of the central predetermined portion of the polymer film layer 82 attached to the upper surface of the slide substrate 80 in which the window lid 88 is coupled (S102). In this case, the polymer film layer 82 may be prepared by using a polyethylene naphthalate polymer material as a main component. On the other hand, since the heat capacity of the polymer film layer 82 is very small, in the case of using cryogenic sections in the cryogenic state as the tissue sections 84, low temperature synchronization phenomenon is caused by rapid heat transfer when the frozen sections are in contact with the polymer film layer 82. As a result, the temperature of the freezing section 84 and the polymer film layer 82 are thermally balanced, so that the contact between the two materials may not be performed smoothly. This problem is solved by the window lead 88. The window lead 88 is in close contact with the polymer film layer 82 and plays a constant buffer against thermal equilibrium while interposing a thin air layer (not shown). By blocking the other exposed back surface of the polymer film layer 82, the polymer film layer 82 exhibits a function of suppressing rapid low temperature synchronization. Therefore, the temperature between the temperature of the polymer film layer 82 and the freezing section 84 maintains a gap to a certain degree, so that the freezing section 84 can be easily attached and fixed to the polymer film layer 82.
후속단계로, 상기 윈도우리드(88)를 슬라이드 기판(80)으로부터 제거하고, 슬라이드 기판(80) 상부에 안착된 조직 절편(84)에 대해 염색을 행한다(S104). 이러한 염색과정은 종래의 알려져 있는 다양한 염료를 이용하여 다양한 방법으로 진행할 수 있으며, 당업자에게는 자명한 단계이므로, 구체적인 설명은 약하기로 한다.In a subsequent step, the window lead 88 is removed from the slide substrate 80, and stained on the tissue section 84 seated on the slide substrate 80 (S104). This dyeing process can proceed in a variety of ways using a variety of dyes known in the art, and will be apparent to those skilled in the art, the detailed description will be weak.
마지막으로, 분자량이 10,000 내지 360,000인, 바람직하게는 40,000인 폴리비닐 피롤리돈을 주성분으로 제조된 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물을 상기 조직 절편의 외부 노출면을 모두 감싸도록 도포하여 코팅층(86)을 형성시킨다(S106). 이로써 본 발명에 따른 일 실시예로서의 슬라이드 구조체의 제조 과정은 마무리된다. 이때, 상기 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립(86)을 제조하기 위한 조성물은, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 알코올 용매와, 분자량이 40,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 알코올 용매 기준 중량 대비 5 내지 15중량%, 바람직하게는 10중량%가 함유되도록 하며, UV 레이저빔 흡수증강제로서 알코올 용매의 기준 중량 대비 0.0025 내지 0.025 중량%, 바람직하게는 0.02중량%의 콩고 레드를 포함하여 조성된 것을 이용하면 바람직하다.Finally, the composition for the preparation of the liquid cover slip for the protection of slide tissue sections and resolution enhancement, which is made of polyvinyl pyrrolidone having a molecular weight of 10,000 to 360,000, preferably 40,000, Coating to wrap to form a coating layer 86 (S106). This completes the manufacturing process of the slide structure as an embodiment according to the present invention. At this time, the composition for preparing the liquid cover slip 86 for tissue fragment protection and resolution enhancement, the alcohol solvent, such as ethanol or isopropanol, and the polyvinyl pyrrolidone polymer having a molecular weight of 40,000 to 5 to the alcohol solvent reference weight 15% by weight, preferably 10% by weight, and the UV laser beam absorption enhancer using a composition comprising 0.0025 to 0.025% by weight, preferably 0.02% by weight of Congo red relative to the reference weight of the alcohol solvent desirable.
한편, 전술한 단계에 따라 제조된 슬라이드 구조체는 광학기기에 의한 단순 관찰 또는 광학기기가 탑재된 미세 절제 장치를 이용한 관찰/절제영역선택(S108), 절제/수거작업(S110)이 연속적으로 진행될 수 있으며, 상기 절제된 조직 절편을 수거하여 후속 연구의 샘플원으로 이용하는 단계(S112)로 더 진행할 수도 있음은 자명하다. 이때, 도 7에 도시된 바에 따르는 슬라이드 구조체의 상하 구조 그대로 광학기기 등의 슬라이드 스테이지부(미도시)에 탑재될 수도 있음은 물론, 그 상하방향이 역위된 상태로 탑재되어, 관찰, 절제 작업이 진행될 수도 있다. 또한, 상기 절제/수거작업(S110)은 이용된 슬라이드 구조체 및 절제수단인 레이저빔이 조사되는 방향 등을 고려하여, 레이저빔이 조사되는 방향과 동일한 방향으로 수거되거나, 그 반대방향으로 수거될 수도 있으며, 중력을 이용한 수거 방법은 물론, 중력과 반대방향의 외력을 제공하여 별도의 수거장치 등을 이용하여 수거할 수 있음은 자명하다.On the other hand, the slide structure manufactured according to the above-described steps can be carried out in the observation / ablation zone selection (S108), ablation / collection operation (S110) using a simple observation by an optical device or a microablation device equipped with an optical device In addition, it is apparent that the excised tissue sections may be further collected and used as a sample source for subsequent studies (S112). At this time, the upper and lower structures of the slide structure as shown in FIG. 7 may be mounted on a slide stage unit (not shown), such as an optical device, as well as mounted in a state in which the up and down directions are reversed. It may proceed. In addition, the cutting / collecting operation (S110) may be collected in the same direction as the laser beam is irradiated, or in the opposite direction, in consideration of the slide structure and the direction in which the laser beam is a cutting means. In addition, it is obvious that the collection method using gravity may be collected using a separate collection device by providing an external force opposite to gravity.
이상에서 설명된 본 발명의 최적 실시예들이 개시되었다. 여기서 특정한 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 당업자에게 본 발명을 상세히 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미한정이나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위해 사용된 것이 아니다. Optimal embodiments of the present invention described above have been disclosed. Although specific terms have been used herein, they are used only for the purpose of describing the present invention in detail to those skilled in the art and are not intended to limit the scope of the present invention as defined in the claims or the claims.
본 발명에 따른 액상 커버 슬립, 그 제조용 조성물, 그 조성물을 이용하여 제조된 커버슬립을 구비한 슬라이드 구조체 및 그 구조체 제조방법에 따르면, 다음과 같은 구체적인 장점을 확인할 수 있다.According to the liquid cover slip according to the present invention, a composition for manufacturing the same, a slide structure having a cover slip manufactured using the composition, and a method for manufacturing the structure, the following specific advantages can be confirmed.
첫째, 광학해상도가 개선되어 조직 절편에 대한 미세 관찰 및 미세 영역에 대한 정밀한 선택이 가능해졌다.First, the optical resolution was improved, enabling fine observation of tissue sections and precise selection of microregions.
둘째, 조직 절편 내에 포함되어 있는 거대분자물질들이 외기 노출이나 수분에 의해 손상될 수 있는 문제를 원천적으로 해결하였으며, 이러한 보호 기능은 동결절편을 이용하는 경우에 특히 바람직한 효과를 나타내고 있다. 따라서, 조직 절편 내의 각종 거대분자물질이 잘 보존됨으로써 후속 연구의 신뢰성을 확보할 수 있게 되었다. 특히, 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물은 무수 상태(non-aqueous)로 제조되므로, 조직 절편 내에 있을 수 있는 엔도지니어스 알엔에이즈(endogeneous RNase) 등의 활성화를 방지할 수 있어 바람직하다.Second, the macromolecules contained in the tissue sections were solved at the source of damage caused by exposure to air or moisture, and this protective function is particularly desirable when frozen sections are used. Therefore, various macromolecular substances in the tissue sections are well preserved, thereby ensuring the reliability of subsequent studies. In particular, since the composition for preparing the liquid cover slip is manufactured in a non-aqueous state, it is preferable because it can prevent the activation of endogeneous RNase and the like that may be in the tissue section.
셋째, 미세 절제 장치와 연계된 작업 수행시 간이한 수거절차와 증대된 수거율을 보장할 수 있다.Third, it is possible to ensure a simple collection procedure and increased collection rate when performing the work associated with the fine cutting device.
넷째, 액상 커버 슬립을 제조하기 위한 조성물은 평소에는 액상이지만, 조직 절편 상부에 도포시 상온에 알코올 용매가 쉽게 증발하면서 빠른 시간 내에 고형화되면서 박막형태를 유지하며, 사용된 용매가 휘발성 알코올 용매이므로 인체에 무해하며, 수용성이어서 조직 절편 내의 내부 구성물질(macromolecule) 추출과정이 용이하게 이루어질 수 있으므로 그 사용과 취급이 용이하다.Fourth, the composition for preparing the liquid cover slip is usually liquid, but when applied to the upper surface of the tissue section, the alcohol solvent is easily evaporated at room temperature and solidified within a short time to maintain a thin film form, and since the solvent used is a volatile alcohol solvent, It is easy to use and handle because it is water-soluble and water-soluble, so that the process of extracting macromolecules in tissue sections can be easily performed.
마지막으로, 본 발명에 따르는 경우 조직 절편 내의 거대분자물질 보존성의 향상 및 광학 관찰시 증진된 해상력에 의해 정밀하게 관찰된 확대된 영상이미지를 제3자에게 전송한 후, 원격지에 있는 자로부터 충분하고도 신뢰성 있는 의견을 접수받아, 미세 절제를 진행할 수 있는 기초적인 기술적 베이스를 마련할 수 있어 바람직하다.Finally, in accordance with the present invention, after transmitting to the third party an enlarged image image precisely observed by the enhancement of macromolecular retention in the tissue section and enhanced resolution upon optical observation, it is sufficient from the remote party. In addition, it is preferable to receive a reliable opinion and to provide a basic technical base capable of performing fine ablation.
도 1 내지 도 3은 광학해상도의 차이를 설명하기 위한 비교예와 본 발명에 따른 실시예의 비교 사진들이다.1 to 3 are comparison pictures for explaining the difference between the optical resolution and the embodiment according to the present invention.
도 4 및 도 5는 조직 절편 내에 포함된 RNA 파괴 정도를 시간 변화에 따라 관찰한 비교예와 본 발명에 따른 실시예의 크로마토그래피의 실험결과 사진들이다.4 and 5 are photographs of the experimental results of the chromatography of the comparative example and the comparative example of observing the degree of RNA destruction included in the tissue sections with time changes.
도 6은 본 발명에 따른 액상 커버 슬립 내에 첨가되는 콩고 레드의 파장대별 흡수 대역도이다.6 is an absorption band diagram of wavelength bands of Congo red added in a liquid cover slip according to the present invention.
도 7 및 도 8은 본 발명에 따른 액상 커버 슬립이 구비된 슬라이드 구조체의 실시예에 관한 단면도들이다.7 and 8 are cross-sectional views of an embodiment of a slide structure with a liquid cover slip according to the present invention.
도 9는 상기 도 8에서 도시되고 설명된 슬라이드 구조체에 대한 미세 절제 및 수거를 설명하기 위한 단면도이다.FIG. 9 is a cross-sectional view illustrating fine cutting and collection of the slide structure shown and described with reference to FIG. 8.
도 10은 본 발명에 따른 액상 커버 슬립이 구비된 슬라이드 구조체를 제조하는 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.10 is a flowchart illustrating a method of manufacturing a slide structure with a liquid cover slip according to the present invention.
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