KR100489753B1 - 알엔에이 폴리머라제 베타-서브유닛 유전자를 이용한멀티플렉스 피씨알법에 의한 탄저균의 탐지 및 동정 - Google Patents

알엔에이 폴리머라제 베타-서브유닛 유전자를 이용한멀티플렉스 피씨알법에 의한 탄저균의 탐지 및 동정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자 (rpoB)를 이용한 멀티플렉스 PCR 법에 의한 탄저균의 탐지 및 동정에 관한 것으로, 탄저균(Bacillus anthracis)을 포함하는 바실러스(Bacillus) 균종들의 rpoB 유전자 단편, 이의 특정 부위를 증폭시키기 위한 프라이머, 이를 이용한 멀티플렉스 PCR 법에 의하면, 생물학적 테러의 수단으로도 살포될 수 있는 탄저균을 신속·정확하게 감별·탐지할 수 있을 뿐 아니라, 그것이 병원성을 갖는지 여부까지 한번의 PCR로 신속하게 판단할 수 있다.

Description

알엔에이 폴리머라제 베타-서브유닛 유전자를 이용한 멀티플렉스 피씨알법에 의한 탄저균의 탐지 및 동정{IDENTIFICATION OF BACILLUS ANTHRACIS BY MULTIPLEX PCR USING RNA POLYMERASE BETA-SUBUNIT GENE}
본 발명은 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자 (rpoB)를 이용한 멀티플렉스 PCR 법에 의한 탄저균의 탐지 및 동정에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 탄저균(Bacillus anthracis)을 포함하는 바실러스(Bacillus) 균종의 rpoB 유전자 단편, 이의 특정 부위를 증폭시키기 위한 프라이머, 그리고 이를 이용한 멀티플렉스 PCR 법에 의해 탄저균 여부 및 탄저균의 병원성 여부를 신속하고 정확하게 판별 및 동정하는 방법에 관한 것이다.
탄저균(B. anthracis)은 그람 양성이고 호기성이며 포자를 형성하는 큰 간균이다. 그 포자는 건조나 열, 자외선, 그리고 여러 소독제에 대해 저항성이 강하며 수십 년간을 그대로 존재하기도 한다. 탄저병(antrax)은 이 탄저균(B. anthracis)이 일으키는 질병으로서 인수공통 전염병이다. 사람에서는 급성으로 치명적인 상황에 이르게 하는데 피부 탄저, 장 탄저, 폐 탄저 등의 질환이 발생한다(Dixon, T. C., M. Meselson, J. Guillemin, and P. C. Hanna. 1999. Anthrax. N. Engl. J. Med. 341: 815-826; Logan, N. A. and P. C. B. Turnbull. 1999. Bacillus and recently derived genera, p. 357-369. In Murray, P. R. (ed.), Manual of clinical Microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D. C.).
이러한 탄저균(B. anthracis)은 생물학적 무기로서 사용될 수 있다는 점 때문에 오랫동안 주목을 받아왔다(Ingleby, T. V., T. O'Toole, D. A. Henderson, J. G. Barlett, M. S. Ascher, E. Eitzen, A. M. Friedlander, J. Gergerding, J. Hauer, J. McDade, M. T. Osterholm, G. Parker, T. M. Perl, P. K. Russel, and K. Tonat. 2002. Anthrax as a biological weapon, 2002. JAMA 287: 2236-2252; Jackson, P. J., M. E. Hugh-Jones, D. M. Adair, G. Green, K. K. Hill, C. R. Kuske, L. M. Grinberg, F. A. Abramova, and P. Keim. 1998. PCR analysis of tissue samples from the 1979 Sverdlovsk anthrax victims: The presence of multiple Bacillus anthracis strains in different victims. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1224-1229). 실제로, 2001년 10월 미국의 플로리다, 뉴저지, 뉴욕 및 워싱턴 디시 등지에서는 사람을 감염시킬 목적으로 탄저균의 포자를 우편물에 넣어 살포한 예가 있었기 때문에(Ingleby, T. V., et al., 2002, JAMA 287: 2236-225211) 탄저에 대한 일반인의 경각심이 높아지게 되었다.
사람에게 치명적인 질환을 일으키는 탄저균이 환경이나, 동물, 또는 인체 검체에 있는 것으로 의심되면 최종적인 동정결과를 가능하면 빨리 통보해 주는 것이 바람직하다. 더구나 생물학전 또는 생물학적 테러로 많은 사람이 탄저균에 노출되었을 것으로 의심되는 경우, 다수의 검체를 검사하는 어려움이 있지만 빠르고 정확하게 탄저균 여부를 판가름해 주는 것이 아주 중요하다. 이러한 관점에서 보면 병원의 미생물 실험실이 초기 탐지 및 동정 단계에서 중요한 역할을 할 것으로 예상한다.
탄저균은 배양에 의한 생화학적 성상검사 등 기본적인 미생물학적 동정과정에 의해 동정할 수 있다. 하지만 병원 미생물 검사실에서도 사용할 수 있는 이런 방법들은 탄저균임을 확인하기에는 다소 미흡한 점이 있다. 따라서 검체들은 좀 더 자세한 생화학적 성상검사나, 유전자형 분류 등의 결정적인 동정 결과를 확보하기 위해서 표준 실험실(reference laboratory)로 보내지게 마련이다. 그러나 일반 병원 실험실에서도 세균 배양과 더불어 PCR과 같은 분자생물학적 기술을 사용할 수 있으므로 신속하게 탄저균 DNA를 탐지하고 감별하여 그에 따른 진단이 가능하다. 특히 미국의 예처럼 생물학적 테러에 의해 많은 사람이 탄저균 포자에 노출되었다고 판단되어 환자 검체 외에 많은 환경 검체를 처리해야 하는 경우, 이 같은 PCR의 신속성은 더욱더 진가를 발휘할 수 있을 것이다.
탄저병은 환자나 동물 검체에서 전통적인 미생물학적 방법에 의해 탄저균을 분리-동정함으로서 진단한다. 이 동정 과정은 순수분리배양, 그람염색, 캡슐염색, 집락(colony) 모양, 그리고 생화학적 성상 검사 등이 포함된다(Dixon, T. C., et al., 1999. N. Engl. J. Med. 341: 815-826; Kim, K. J., G. Y. Ha, H. K. Chaong, and H. S. Lim. 1994. Isolation of Bacillus anthracis from patient blood. J. Korena Soc. Microbiol. 29: 245-248; Logan, N. A., et al., 1999. Bacillus and recently derived genera, p. 357-369. In Murray, P. R. (ed.), Manual of clinical Microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D. C.).
인위적으로 살포되는 탄저균 포자를 확인하는 과정도 배양을 거쳐 위와 같은 방법으로 수행된다. 이러한 방법은 일상적인 미생물 동정 과정을 수행하는 일반 병원검사실에서도 수행할 수 있다. 그러나 임상적인 문제보다는 사회적인 문제 때문에 의심되는 검체는 대개 공공 검사기관에 의뢰하여 보다 정확한 동정 과정을 거친다. 탄저균 동정 과정은 비단 정확성 뿐 아니라 신속성이 필요하기도 하며, 또한 중요한 것은 분리된 탄저균의 병원성 여부를 판단해야 하는 것이다. 그 이유는 병원성을 갖게 하는 캡슐 유전자(cap)가 탄저균이 갖는 pXO2 플라스미드 상에 있는데, 탄저균이 이 pXO2 플라스미드를 자연적으로 소실하는 경우 병원성이 없어지며, 또한 예방접종을 위해 pXO2 플라스미드를 제거한 비병원성의 백신 균주가 병원성 균주로 오인되어 검출될 수도 있기 때문이다.
병원성 탄저균 여부를 판단하기 위해서는 이처럼 여러 방법이 동원될 수 있지만 그 중 유전자형(genotype) 분석이 가장 정확하고 의존할 만한 방법이다. 그러나, 이 방법은 다음 몇 가지 이유로 인해 쉽게 시행하기 어렵다. 그 이유로서는 우선 유전체 내에서 탄저균에 특이적인, 즉 다른 균종들로부터 감별될 수 있도록 적당한 표적이 될 만한 유전자를 찾지 못한 것을 들 수 있다.
계통학적으로 탄저균(B. anthracis)은 B. cereus, B. thuringiensis, 및 B. mycoides 등과 함께 'B. cereus group'으로 분류되고 있다(Logan, N. A., et al., 1999. Bacillus and recently derived genera, p. 357-369. In Murray, P. R. (ed.), Manual of clinical Microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D. C.). 이들 세 균종의 유전체는 서로 매우 유사한데, 한 예로 16S rDNA 염기서열이 거의 동일하다(Ash, C., J. A. E. Farrow, M. Dorsch, E. Stackebrandt, and M. D. Collins. 1991. Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. Int. J. Syst. Bacteriol. 41: 343-346). 또한, MLEE(Mutilocus enzyme electrophoresis) 결과에 근거해서 한 균종이라고 하는 견해도 있다(Helgason, E., L. A. Фstad, D. A. Caugant, H. A. Johansen, A. Fouet, M. Mock, I. Hegna, and A.-B. KolstΦ. 2000. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis - one species on the basis of genetic evidence. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2627-2630).
따라서, 탄저균(B. anthracis)이 B. cereus나 B. thuringiensis와 유전학적으로 다른 점은 독소를 생산하게 하는 플라스미드로나 구분될 수 있을 뿐이다(Qi, Y., et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 3720-3727). 그러나 플라스미드를 이용하는 것 역시 미덥지 않은데, 그 이유는 탄저균의 플라스미드 유전자를 다른 세균에서도 발현시킬 수 있었고(Thwaite, J. E., L. W. J. Baillie, N. M. Carter, K. Stephenson, M. Rees, C. R. Harwood, and P. T. Emmerson. 2002. Optimization of the cell wall microenvironment allows increased production of recombinant Bacillus anthracis protective antigen from B. subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 68: 227-234), 다른 바실러스 균종에도 존재한다는 것이 알려진 바(Pannucci, J., R. T. Okinaka, R. Sabin, and C. R. Kuske. 2002. Bacillus anthracis pX01 plasmid sequence conservation among closely related bacterial species. J. Bacteriol. 184: 134-141) 있기 때문이다. 더 나아가, 바실러스 균종간에 플라스미드의 수평적 이동도 보고된 경우도 있다(Gonzales, J. M. J., B. S. Brown, and B. C. Carlton. 1982. Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding for δ-endotoxin among strains of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6951-6955; Sabelnikov, A. G., and L. V. Ulyashova. 1990. Plasmid transformation of Bacillus cereus on cellophane membrane. FEMS Microbiol. Lett. 72: 123-126; Wicks, A., N. Jayaswal, D. Lereclus, and L. Andrup. 1998. Characterization of plasmid pAW63, a second self-transformissible plasmid in Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD73. Microbiology, 144: 1263-1270).
이에 따라, 탄저균을 그와 가까운 다른 균종들과 감별하기 위해서는 탄저균 고유의 특이적인 염색체 표지가 필요하며(Qi, Y., et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 3720-3727), 임상 환자 검체, 동물 검체, 또는 주변 환경으로부터 탄저균을 탐지하고 동정하는 것은 그만큼 정확하고 조심스러워야 하는 작업이다.
종래의 PCR에 의한 탄저균 확인법에서는 독소를 생산하게 하는 플라스미드가 없는 비병원성인 B. anthracis 또는 B. anthracis와 유사한 여러 바실러스 균종들이 함께 탐지될 수 있다는 점이 지적되어 왔다(Ellerbrok, H., H. Nattermann, M. Ozel, L. Beutin, B. Appel, and G. Pauli. 2002. Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenic Bacillus anthracis by real-time PCR. FEMS Microbiol. Lett. 214: 51-59; Qi, Y., et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 3720-3727). 실제로, 'B. cereus group'(Logan, N. A., et al., 1999. Bacillus and recently derived genera, p. 357-369. In Murray, P. R. (ed.), Manual of clinical Microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D. C.; Qi, Y., et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 3720-3727)에 속하는 B. cereus, B. thuringiensis, 그리고 B. mycoides는 식중독이나 눈 감염, 그리고 설사를 유발할 수 있는 균들인데 (Helgason, E., et al., 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2627-2630; Logan, N. A., et al., 1999. Bacillus and recently derived genera, p. 357-369. In Murray, P. R. (ed.), Manual of clinical Microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D. C.; Ticknor, L. O., A.-B. KolstФ, K. K. Hill, P. Keim, M. T. Laker, M. Tonks, and P. J. Jackson. 2001. Flourescent amplified fragment length polymorphism analysis of Norwegian Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis soil isolates. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4863-4873), 16S rRNA 유전자 염기서열이 동일할 정도로 탄저균에 매우 가까와 감별이 어렵다. 또한 전통적으로 균종 감별이나 계통학적 분류에 사용하던 유전자인 gyrB나(Vilas-Boas, G., V. Sanchis, D. Lereclus, M. V. F. Lemos, and D. Bourguet. 2002. Genetic differentiation between sympatric populations of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1414-1424) 16S-23S ribosomal intergenic spacer(Bourque, S. N., J. R. Valero, M. C. Lavoie, and R. C. Levesque. 1995. Comparative analysis of the 16S to 23S ribosomal intergenic spacer sequences of Bacillus thuringiensis strains and subspecies and of closely related species. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1623-1626) 등으로도 감별이 어려웠다. 그리고, 가까운 바실러스 균종간에 플라스미드 전달이 있다거나, 탄저균의 플라스미드를 다른 세균에서 발현시킬 수 있었으며(Wicks, A., et al., 1998. Microbiology, 144: 1263-1270), 다른 바실러스 균종에 존재한다는 것(Pannucci, J., et al., 2002. J. Bacteriol. 184: 134-141), 그리고 pXO2 같은 경우 자연적으로 소실될 수 있다는 것(Turnbull, P. C., R. A. Huston, M. J. Ward, M. N. Jones, C. P. Quinn, N. J. Finnie, C. J. Duggleby, J. M. Kramer, and J. Melling. 1992. Bacillus anthracis but not always anthrax. J. Appl. Bacteriol. 72:21-28) 등의 요인으로 인해, 플라스미드 상의 유전자를 대상으로 하는 방법들도 역시 탄저균을 감별하기 어렵다.
그러나, 이상과 같은 PCR의 문제점은 B. anthracis 균종에 대한 특이적인 프라이머를 사용하면 극복할 수 있을 것이다. 신속·정확함을 목적으로 유전자에 기반한 분자생물학적 방법을 수행하기 위해서는 탄저균에만 특이한 표적이 될 수 있는, 플라스미드가 아닌 염색체 상의 표지 DNA가 필요한 것이다.
한편, rpoB 유전자는 RNA 폴리머라제의 β-서브유닛을 인코딩하는 것으로, 본 발명자 등이 다른 세균에서도 동정이나 계통학적 분류를 위해 사용한 바 있으며(Drancourt, M. and D. Raoult. 2002. rpoB gene sequence-based identification of Staphylococcus species. J. Clin. Microbiol. 40: 1333-1338; Kim, B.-J., S.-H. Lee, M.-A. Lyu, S.-J. Kim, G.-H. Bai, S.-S. Kim, G.-T. Chae, E.-C. Kim, C.-Y. Cha, and Y.-H. Kook. 1999. Identification of mycobacterial species by comparative sequence analysis of the RNA polymerase gene (rpoB). J. Clin. Microbiol. 37: 1714-1720; Ko, K. S., H. K. Lee, M.-Y. Park, K.-H. Lee, Y.-J. Yun, S.-Y. Woo, H. Miyamoto, and Y.-H. Kook. 2002. Application of RNA polymerase β-subunit gene (rpoB) sequences for the molecular differentiation of Legionella species. J. Clin. Microbiol. 40: 2653-2658; Lee, S.-H., B.-J. Kim, J.-H. Kim, K.-H. Park, S.-J. Kim, and Y.-Y. Kook. 2000. Differentiation of Borrelia burgdorferi sensu lato on the basis of RNA polymerase gene (rpoB) sequences. J. Clin. Microbiol. 38:2557-2562; Mollet, C. M. Drancourt, and D. Raoult. 1997. rpoB sequence analysis as a novel basis for bacterial identification. Mol. Microbiol. 26:1005-1011; Renesto, P., J. Gouvernet, M. Drancourt, V. Roux, and D. Raoult. 2001. Use of rpoB gene analysis for detection and identification of Bartonella species. J. Clin. Microbiol. 39: 430-437), 최근 탄저균을 실시간 PCR(real-time PCR)로 탐지하기 위해 rpoB 유전자를 사용한 예가 있다(Qi, Y., et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 3720-3727). 그러나, 이 경우 B. cereus와 B. megaterium 균주들 가운데 위양성이 발생한 것이 곧 확인되었다(Ellerbrok, H., et al., 2002. FEMS Microbiol. Lett. 214: 51-59).
이상에서 언급한 바와 같은 문제점을 고려하여 본 발명에서는, 생물학적 무기로 사용될 수 있는 탄저균(Bacillus anthracis)을 비슷한 바실러스 균종들 즉, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. megaterium 등으로부터 감별할 수있는 방법을 제공하고자 하였으며, 이를 위해, 바실러스 균종들의 318-bp의 rpoB DNA 염기서열을 비교-분석하여 결정된 rpoB DNA 염기서열을 제공하고, 그리고 이들 rpoB DNA 염기서열에 근거한 멀티플렉스(multiplex) PCR 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 서열 1 내지 32로 표시되는, 탄저균(Bacillus anthracis)을 포함하는 바실러스(Bacillus) 균종들의 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 서열 33 또는 34로 표시되는, 탄저균(Bacillus anthracis)을 포함하는 바실러스(Bacillus) 균종들의 탐지 및 동정을 위한 PCR용 프라이머와, 서열 33 내지 35의 어느 하나로 표시되는, 탄저균 (Bacillus anthracis)을 선택적으로 탐지 및 동정하기 위한 PCR용 프라이머를 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스(Bacillus) 균종들의 탐지 및 동정을 위한 진단용 키트는 서열 33 및 34로 표시되는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 바실러스(Bacillus) 균종들의 탐지 및 동정과 탄저균(Bacillus anthracis)의 선택적 탐지 및 동정을 위한 진단용 키트는 서열 33 내지 35로 표시되는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 바실러스(Bacillus) 균종들의 탐지 및 동정, 탄저균 (Bacillus anthracis)의 선택적 탐지 및 동정, 및 병원성 탄저균(Bacillus anthracis)의 선택적 탐지 및 동정을 위한 진단용 키트는 서열 33 내지 35로 표시되는 프라이머 및 탄저균(Bacillus anthracis)의 캡슐 유전자(cap)를 위한 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명에 따른 탄저균(Bacillus anthracis)의 선택적 탐지 및 동정 방법은, 서열 33 내지 35로 표시되는 프라이머에 대상 균주의 DNA를 혼합하고 PCR을 실시하여 탄저균(Bacillus anthracis) 특유 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편의 증폭 여부를 검사하는 단계를 포함한다.
그리고, 본 발명에 따른 병원성 탄저균(Bacillus anthracis)의 선택적 탐지 및 동정 방법은, 서열 33 내지 35로 표시되는 프라이머 및 탄저균(Bacillus anthracis)의 캡슐 유전자(cap)를 위한 프라이머에 대상 균주의 DNA를 혼합하고 PCR을 실시하여 탄저균(Bacillus anthracis) 특유 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편 및 캡슐 유전자(cap) 단편의 증폭 여부를 검사하는 단계를 포함한다.
본 발명에서는 종래의 실시간 PCR에 사용된 rpoB 유전자 부위와는 다른, 뒤쪽(downstream)에 위치한 리팜핀 내성과 관련된 부위를 포함하는 359-bp 크기의 부분에서 해결점을 찾고자 연구한 결과, 탄저균(B. anthracis)을 포함한 B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, 그리고 B. megaterium 균주들의 해당 부위 염기서열을 비교하여 탄저균을 감별할 수 있음을 발견하였으며, 그 염기서열을 근거로 탄저균 감별 탐지용으로 신속하고 정확하게 사용할 수 있는 multiplex PCR법을 개발함으로써 그 유용성을 입증하였다.
먼저, 탄저균을 그와 유전학적으로 매우 가까운 균종들로부터 감별하기 위해 본 발명에서는 rpoB 유전자 일부 염기서열을 비교하는 방법을 사용하였다. 최근 탄저균 탐지를 위해 rpoB를 실시간 PCR에 사용한 일이 있었지만(Qi, Y., et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 3720-3727), 위양성 결과가 보고되었는데 (Ellerbrok, H., et al., FEMS Microbiol. Lett. 214: 51-59), 이는 다른 바실러스 균종들의 해당부위 염기서열에 관한 정보가 부족했던 것으로 생각된다. 본 발명에서 사용한 유전자 부위는 실시간 PCR의 표적이 되었던 곳(Qi, Y., et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 3720-3727) 보다 뒤에 위치하며 탄저균을 비롯한 바실러스 균종에서는 잘 알려지지 않은 부위이다.
본 발명에서는, 균종간의 염기서열 변화를 명확히 확인하기 위해 아래 표 1에 나타낸 5 균종 34 균주 외에도 40여 종 이상의 바실러스 균종에 대하여 해당 부위를 염기서열 자료를 확보하였다(자료 비공개). 이들 염기서열들을 비교한 결과, 비록 'B. cereus group'으로 불리는 4 균종이 유전적으로는 매우 유사하여도(Helgason, E., et al., 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2627-2630), B. anthracis는 rpoB 염기서열 비교로 쉽게 구분됨을 알 수 있었다. 즉, B. cereus와 B. thuringiensis 균주들이 몇 개의 군집을 만들고 서로 섞이는 반면, 탄저균은 해당부위 염기서열이 매우 잘 보존되어 저들과는 떨어져 독립적인 집단을 만든다는 것을 확인한 것이다.
여기에서 비교한 탄저균 5 균주들의 rpoB 염기서열은 모두 동일하여, 이전에 보고된 다른 연구결과들을 보더라도 탄저균이 매우 단일한 형이라는 것, 그리고 rpoB 유전자 분석 부위가 염기서열의 변화가 크지 않고 매우 잘 보존된 부위라는 점 등으로 미루어 보면, 야생형 균주들 간의 rpoB 염기서열 변화는 거의 없으리라 추정된다. 따라서, 본 발명에서 확인한 탄저균의 특이적인 염기서열과 아미노산은 다른 바실러스 균종들로부터 감별하기 위해 사용할 수 있는 적절한 탄저균 감별-탐지 방법이라고 할 수 있을 것이다.
또한 본 발명에서는 탄저균을 신속히 감별-탐지하기 위한 또 다른 방법으로 multiplex PCR을 개발하였다. 이 방법은 검체 중에 바실러스 균종이 있는지 여부와, 있을 경우 그것이 탄저균인지 아니면 우리 주변에서 분리될 수 있는 다른 바실러스 균종인가를 감별해서 탐지할 수 있는 방법이다. 이 multiplex PCR은 한번의 PCR로 두 개의 다른 증폭산물을 보여줌으로서, 다른 바실러스 균종들로부터 탄저균을 확인-동정할 수 있는 결정적인 자료를 제시할 수 있다. 대부분 우리 주변에서 분리될 수 있는 바실러스 속에 속한 33 종(53 주)에 대해 시행한 결과, 본 발명에 따른 multiplex PCR의 높은 특이성을 확인할 수 있었다.
이와 같은 multiplex PCR의 장점은 결과에 예시한 바와 같이 병원성 여부를 결정하는 플라스미드 유전자인 pXO1과 pXO2용 PCR과 함께 사용할 수 있다는 것이다. 이 경우, multiplex PCR은 탄저균의 존재 여부에 더하여 병원성 여부를 동시에 감별할 수 있어 그 효용성이 더 높아진다. 즉, 본 발명에 따른 multiplex PCR 방법은 병원성 탄저균을 신속히 감별-탐지하는 방법으로 더 없이 좋은 방법이 될 수 있다. 본 발명에서는 이러한 방법이 단순하고 기본적인 방법으로 병원 임상 실험실에서도 사용될 수 있음을 제시한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 균주, DNA 추출 및 PCR
다음 표 1에 나타낸 5 균종(Bacillus anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides 및 B. megaterium)에 속하는 34 개 균주를 사용하였다. 이들 가운데 탄저균인 Florida isolate A2012, Ames, Kruger B, 그리고 Western NA 균주는 이미 전체 염기서열이 GenBank 또는 website인 "The Institute for Genomic Research"(www.tigr.org)에 등록되어 있는 것을 인용하여 사용하였다. B. anthracis 표준균주인 ATCC 14185, B. anthracis Sterne strain, B. anthracis Pasteur No. 2 Army strain, 그리고 국내 분리균주 또는 그 DNA들은 국내 연구자들로부터 분양받아 사용하였다.
Species Strain number a Accession number
B. anthracis Ames strainb
B. anthracis Florida strainb A2012 AAA01000000b
B. anthracis ATCC 14185
B. anthracis Korean isolate B. cereus ATCC 9634
B. cereus IMSNU 11011
B. cereus IMSNU 11012
B. cereus IMSNU 11013
B. cereus IMSNU 13043
B. cereus IMSNU 13044
B. cereus IMSNU 13045
B. cereus IMSNU 13046
B. cereus IMSNU 13047
B. cereus IMSNU 12076
B. cereus IMSNU 12077
B. cereus IMSNU 12078
B. cereus IMSNU 12079
B. cereus IMSNU 10012
B. cereus KCTC 1012
B. cereus KCTC 1014
B. thuringiensis KCTC 1507
B. thuringiensis KCTC 1509
B. thuringiensis IMSNU 12089
B. thuringiensis subsp. berliner IMSNU 12095
B. thuringiensis subsp. dendrolimus IMSNU 12096
B. thuringiensis subsp. entomocidus IMSNU 12097
B. thuringiensis subsp. finitimus IMSNU 12098
B. thuringiensis subsp. indiana IMSNU 12099
B. thuringiensis subsp. kurstaki IMSNU 10051
B. thuringiensis subsp. pakistani IMSNU 12092
B. mycoides B. megataerium KCCM 40260 KCTC 3007
aATCC, American Type Culture Collection;
IMSNU, Institute of Microbiology Seoul National University;
KCTC, Korean Collection for Type Cultures;
KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms.
b탄저균인 Florida isolate A2012 및 Ames 균주의 rpoB 서열은 각각 GenBank 및 website인 "The Institute for Genomic Research"(www.tigr.org)로부터 입수하였다.
DNA는 배양한 각 균종의 집락을 따서 bead beater-phenol법(Kim, B.-J., et al., 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1714-1720; Ko, K. S., et al., 2002. J. Clin. Microbiol. 40: 2653-2658)에 따라 추출하여 PCR용 주형 DNA로 사용하였다.
바실러스 屬 rpoB DNA 증폭용 PCR 프라이머는 전방향 프라이머로 BA-RF(5'-GAC GAT CAT YTW GGA AAC CG-3': 서열 33)와 역방향 프라이머로 BA-RR(5'-GGN GTY TCR ATY GGA CAC AT-3': 서열 34)을 사용하였다. 도 1은 본 발명에서 사용한 PCR용 프라이머 및 그 산물들을 나타내는 요약도이다.
PCR은 주형 DNA 50 ng와 각 프라이머 20 pmol씩을 1 unit의 Taq DNA 폴리머라제, 각 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트가 250 μM, 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 그리고 겔 로딩 염료(gel loading dye)가 들어있는 PCR 혼합물 튜브(AccuPower PCR PreMix; Bioneer, Daejeon, Korea)에 넣은 다음 (Ko, K. S., et al., 2002. J. Clin. Microbiol. 40), 증류수로 최종 부피가 20 ㎕로 되도록 하여 30 사이클을 시행하였다. 각 사이클은 95 ℃에서 30 초, 45 ℃에서 30 초, 그리고 72 ℃에서 1 분 동안 시행하였으며, 최종 연장(final extension)을 72 ℃에서 5 분간 시행하였다(Perkin-Elmer Cetus; model 9700 Thermocycler). 이 때 증폭된 359-bp 크기의 rpoB DNA는 rif r 부위를 포함한다. 증폭산물은 1.5% 아가로스 젤에 전기영동하여 확인한 후, 염기서열 결정을 위해 QIAEX II 겔 추출 키트(Qiagen, Hilden, Germany)로 정제하였다.
Multiplex PCR은 바실러스 속 rpoB DNA 증폭용 프라이머 BA-RF와 BA-RR에 탄저균-특이 전방향 프라이머인 Ba-SF(5'-TCG TCC TGT TAT TGC AG-3': 서열 35)를 넣어 사용하였으며, PCR 조건은 연장 시간(extension time)을 30초로 한 것 외에는 모두 위와 동일하게 시행하였다.
실시예 2: 염기서열 결정
바실러스 屬 rpoB DNA 증폭용 전방향(forward) 프라이머 BA-RF와 역방향(reverse) 프라이머 BA-RR를 그대로 이용하여 염기서열을 결정하였다.
여기에는 Applied Biosystems automated sequencer(model 377)와 BigDye Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom)를 사용하였다. 즉, 정제한 PCR 증폭산물 30 ng과 각 프라이머 2.5 pmol, 그리고 4 ㎕의 BigDye Terminator RR mix(Perkin-Elmer Applied Biosystems; part no. 4303153)를 섞고 증류수로 최종 부피가 10 ㎕로 되도록 하였다. 반응은 5%(vol/vol) 디메틸설폭시드를 포함한 상태로 30 사이클(95 ℃에서 15 초, 50 ℃에서 5 초, 그리고 60 ℃에서 4 분)을 시행하였다.
그 결과, 위 표 1에 나타낸 5 균종(Bacillus anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides 및 B. megaterium)에 속하는 34 개 균주의 rpoB 염기서열(318-bp)을 결정하여, 각각 서열 1 내지 32로 하였다.
실시예 3: 염기서열 및 아미노산 서열 분석
rpoB 염기서열의 정열 및 아미노산의 추론은 DNASTAR에 있는 MegAlign 프로그램을 사용하였다(Madison, WI).
도 2는 본 발명에서 확인한 탄저균이 포함된 'Bacillus cereus group' 5 균종에 속하는 31 균주의 rpoB 염기서열(318-bp)을 나타낸 것으로, B. cereus KCTC 1014의 염기서열(맨 윗줄)을 기준으로 하여 동일한 염기들은 점으로 표시하였다. 화살표로 탄저균-특이 전방향 프라이머 Ba-SF의 위치를 표시하였다.
도 2에서 보면, B. anthracis ATCC 14185 균주는 전체 유전체 염기서열이 밝혀진 4 개의 균주와 동일한 염기서열을 갖고 있으며, 국내에서 분리된 탄저균 균주들도(Kim, I. J., G. Y. Ha, H. K. Chaong, and H. S. Lim. 1994. Isolation of Bacillus anthracis from patient blood. J. Korena Soc. Microbiol. 29: 245-248) 동일한 것을 확인할 수 있다.
도 3은 B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides 및 B. megaterium 균주의 서열 불일치를 보여주는 도표이다. 여기에서 보면, B. cereus, B. thuringiensis 및 B. anthracis 균주들의 rpoB 염기서열(318-bp)은 95.3% 이상의 상동성(similarity)을 보임을 알 수 있다.
흥미로운 것은 탄저균이 특징적인 아미노산 A442을 갖고 있다는 것이며, 바로 이것이 S442를 갖는 B. cereus나 B. thuringiensis와 구별할 수 있는 중요한 점이다. 이러한 차이점은 균종간에 442번 아미노산 코돈의 변화(Tct→Gct)가 있기 때문이다.
한편, B. cereus와 B. thuringiensis의 아미노산 염기서열은 한 예를 제외하고 모두 동일하였으며, B. cereus IMSNU 11013가 한 곳, 즉 E487→Q487만이 다른 균주들과 달랐다. B. mycoides KCCM 40260도 역시 다른 균종들과 다른 아미노산이 있었으며(G398→R398), B. megaterium은 다른 균종들과는 5 곳의 아미노산이 달랐다.
실시예 4: 계통분류 분석(Phylogenetic analysis)
rpoB 염기서열을 근거로 하는 계통수(phylogenetic tree)는 PAUP 프로그램의 Neighbor-joining 방법(Swofford, D. L. 1999. PAUP*: phylogenetic analysis using parsimony (* and other methods), version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts)으로 만들었으며, B. mycoides와 B. megaterium를 외집단(outgroup)으로 하였다. 계통 가지의 지지도는 부트스트랩 분석(bootstrap replications)을 1000회 반복 시행한 결과이다
도 4는 탄저균이 포함된 'Bacillus cereus group'에 속하는 34 균주의 rpoB 유전자 염기서열(318-bp)로 구성한 계통수를 나타낸 도표로, B. mycoides와 B. megaterium를 외집단으로 사용한 것이다. 계통수 분지에 표시한 부트스트랩 값(bootstrap value)은 1000 회 반복 시행한 값으로 50% 미만의 값은 표시하지 않았으며, 특징적으로 나뉘는 클러스터(Cluter) A와 B는 화살표로, 그리고 B. anthracis 클레이드(clade)는 네모 안에 표시하였다.
도 4에서 보면, 'B. cereus group' 균주들은 계통수 상에서 크게 두 개의 군집을 형성하여 이들을 편의상 클러스터(Cluster) A와 B로 명명하였다. 이전에 발표된 다른 연구자들의 MLEE 결과에서도 'B. cereus group' 균주들은 역시 2 군집으로 나뉘어져 있다(Helgason, E., D. A., Caugant, I. Olsen, and A.-B. KolstФ, 2000. Genetic structure of population of Bacillus cereus and B. thuringiensis isolates associated with periodontitis and other human infections. J. Clin. Microbiol. 38: 1615-1622; Helgason, E., L. A. Фstad, D. A. Caugant, H. A. Johansen, A. Fouet, M. Mock, I. Hegna, and A.-B. KolstФ, 2000. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis - one species on the basis of genetic evidence. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2627-2630; Vilas-Boas, G., et al., 2002. Genetic differentiation between sympatric populations of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1414-1424).
탄저균 균주들은 Cluster B 내에서 특징적인 한 집단을 이루어 쉽게 감별될 수 있음을 알 수 있다. 이로서 탄저균이 B. cereus 균주들과 감별이 안되었던 MLEE 결과(Helgason, E., et al., 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2627-2630) 보다는 rpoB 염기서열 분석의 변별력이 높다는 것을 알 수 있다. 또한 rpoB 계통수에 나타난 탄저균 클레이드(clade)가 견고한 것으로 보아 탄저균은 아주 균질하고(homogeneous), 단일형의(monomorphic) 균종임 (Helgason, E., et al., 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2627-2630; Read, T. D., S. L. Salzberg, M. Pop, M. Shumway, L. Umayam, L. Jiang, E. Holtzapple, J. D. Busch, K. L. Smith, J. M. Schupp, D. Solomon, P. Keim, and C. M. Fraser. 2002. Comparative genome sequencing for discovery of novel polymorphism in Bacillus anthracis. Science 296: 2028-2033; Ticknor, L. O., et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4863-4873)을 알 수 있다.
한편, B. cereus와 B. thuringiensis 균주들 사이에는 확실한 차이점이 드러나지 않는데, 이는 MLEE나 AFLP(amplified fragment length polymorphism)를 사용한 연구자들의 보고와 일치하는 것이다(Helgason, E., et al., 2000. J. Clin. Microbiol. 38: 1615-1622; Helgason, E., et al., 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2627-2630; Ticknor, L. O., et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4863-4873; Vilas-Boas, G., et al., 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1414-1424).
rpoB 계통수에 근거하면, 탄저균은 비록 적은 수를 포함하였으나 B. cereus와 B. thuringiensis(Ticknor, L. O., et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4863-4873) 등과는 유전적으로 떨어져있는 것으로 판단된다. 다른 균종 또는 균주들 보다는 단지 두 개의 B. thuringiensis 균주가 비교적 탄저균 클레이드에 가까이 위치했을 뿐이다. 그밖에 B. cereus 4 균주는 클러스터(Cluster) B의 기저부에 위치하고, B. thuringiensis 4 균주도 클러스터 (Cluster) A에서 별개의 군을 형성하는 등 탄저균과는 떨어져 있으며, 이러한 관계들은 부트스트랩 값이 90% 이상이어서 상당히 신뢰할만한 것으로 나타났다. 그러나 B. thuringiensis 다른 3 균주는 B. cereus 균주들과 혼재하는 양상을 보였다.
실시예 5: 탄저균 감별 탐지용 multiplex PCR
도 1 및 2에 나타낸 정렬한 rpoB 염기서열들을 근거로 탄저균-특이 전방향 프라이머(Ba-SF)를 고안하여, 앞서 바실러스 屬 균종들의 rpoB DNA 증폭에 사용한 두 프라이머들(BA-RF와 BA-RR)과 동시에 사용하는 multiplex PCR을 개발하였다. 이 방법은 검체에 바실러스가 있는지의 여부와 있으면 그것이 탄저균인지 아니면 다른 바실러스 균종인지를 판단할 수 있도록 하는 방법이다.
즉, 이들 세 프라이머를 동시에 사용하면 프라이머 BA-RF와 BA-RR에 의해서는 바실러스 屬(genus Bacillus)에 속한 모든 균종들로부터 359-bp의 rpoB DNA가 증폭된다. 탄저균은 역시 바실러스 屬 균이므로 359-bp 증폭산물이 생기고, 그 외에 탄저균-특이 전방향 프라이머 Ba-SF와 BA-RR에 의해서 생기는 작은 증폭산물(208-bp)을 하나 더 얻게 된다.
염기서열 분석에 사용한 'B. cereus group' 균주들과, 본 발명자들이 보유하고 있는 바실러스 屬에 속한 총 33 種 58 株를 대상으로 하여, 본 multiplex PCR의 특이도를 측정하였다. 구체적으로, 바실러스 속 rpoB DNA 증폭용 프라이머 BA-RF와 BA-RR에 탄저균-특이 전방향 프라이머인 Ba-SF를 넣어, 앞서 실시예 1에서의 PCR 조건에서 연장 시간(extension time)을 30초로 한 것 외에는 동일하게 시행하였다.
도 5는 multiplex PCR을 이용한 탄저균 특이 PCR결과를 나타내는 사진이다. 여기에서, M은 표지 DNA(100-bp 래더); (A)의 1은 B. anthracis ATCC 14185, 2는 B. anthracis 국내 분리균주, 3은 B. thuringiensis IMSNU 12095, 4는 B. cereus IMSNU 12077, 5는 B. cereus IMSNU 13046, 6은 B. cereus IMSNU 11011, 7은 B. cereus IMSNU 11013, 8은 B. thuringiensis IMSNU 12089, 9는 B. cereus IMSNU 13043, 10은 B. mycoides KCCM 40260, 11은 B. megaterium KCTC 3007, 12는 B. licheniformis KCTC 1918, 13은 B. sphaericus KCTC 3346, 14는 B. pumilus KCTC 3348, 15는 B. subtilis KCTC 3040; (B)의 1은 B. anthracis, 2는 B. licheniformis, 3은 B. sphaericus, 4는 Bacillus sp., 5는 B. fastidiosus, 6은 B. thermoglucosidasius, 7은 B. psychrophilus, 8은 B. azotoformans, 9는 B. marinus, 10은 B. simplex, 11은 B. pasteurii, 12는 B. niacini, 13은 B. pallidus, 14는 B. halophilus, 15는 B. thermoevolans; 그리고 (C)의 1은 B. anthracis, 2는 B. cohni, 3은 B. smithii, 4는 B. firmus, 5는 B. atrophaeus, 6은 B. mojavensis, 7은 B. vallismortis, 8은 B. globisporus, 9는 B. insolitus, 10은 B. badius, 11은 B. subtilis, 12는 B. amyloliquefaciens, 13은 B. benzoevolans, 14는 B. fusiformis, 15는 B. psychrosaccharolytica이다.
도 5에서 보듯이, 예상대로 다른 바실러스 屬 균종들에서는 하나의 증폭산물 (359-bp)만 나오고, B. anthracis ATCC 14185, B. anthracis Sterne strain, B. anthracis Pasteur No. 2 Army strain, 그리고 국내 분리균주들에서는 두 개의 증폭산물(359, 208-bp)이 나오는 것을 확인할 수 있다. 이로서 본 발명에 따른 탄저균 감별탐지용 multiplex PCR의 특이도가 높다는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 병원성 탄저균 감별용 multiplex PCR
탄저균을 동정할 수 있는 rpoB PCR과 탄저균의 플라스미드 유전자인 cap을 동시에 증폭하는 multiplex PCR을 시행하였다. 이 cap 유전자는 탄저균의 병원성 인자인 캡슐을 만들게 하는 유전자이다. 또 다른 병원성 인자인 톡신을 인코딩하는 (toxin-encoding) pag 유전자가 pX01에 있는 것과는 달리, 이 cap 유전자는 탄저균의 중요한 병원성 인자인 캡슐을 만들게 하는 유전자로서 pX02라는 플라스미드에 있다. 캡슐이 있는 탄저균만이 인체나 동물을 감염시킬 수 있는 침습성 (invasiveness)이 있기 때문에 중요한 병원성 인자이지만, pX02 플라스미드는 자연적으로 소실될 수도 있고 탄저병 백신을 만들기 위해 인위적으로 제거할 수 있다. 따라서, 캡슐 유무는 병원성 탄저균 여부를 감별하는 표적이 된다.
본 multiplex PCR에서는, 바실러스 속 rpoB DNA 증폭용 프라이머 BA-RF와 BA-RR, 탄저균-특이 전방향 프라이머인 Ba-SF, 그리고 병원성 여부를 확인할 수 있는 플라스미드 유전자 cap PCR 프라이머(Ellerbrok, H., et al., 2002. FEMS Microbiol. Lett. 214: 51-59)를 넣어, 앞서 실시예 1에서의 PCR 조건에서 연장 시간(extension time)을 30 초로 한 것 외에는 동일하게 시행하였다.
도 6은 탄저균임을 확인할 수 있는 rpoB PCR과 병원성 여부를 확인할 수 있는 플라스미드 유전자 cap PCR을 동시에 수행한 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진이다. 여기에서, M은 표지 DNA(100-bp 래더), 1은 B. anthracis Stern strain, 2는 B. anthracis Pasteur No. 2 Army strain, 3 및 4는 B. anthracis 국내 분리 균주, 5는 B. cereus IMSNU 13045, 그리고 6은 음성 대조군을 나타낸다.
도 6에서 보듯이, PCR 결과 탄저균이지만 캡슐이 없는 비-병원성 균주인 Sterne strain(레인 1)은 359-bp 와 208-bp의 rpoB DNA만이 증폭되었고, cap 유전자를 갖는 B. anthracis Pasteur No. 2 Army strain(레인 2), 그리고 국내 분리균주(레인 3 및 4) 등은 탄저균임을 의미하는 두 개의 rpoB DNA(359, 208-bp) 외에, 291-bp의 cap DNA가 더 증폭되어 병원성 탄저균인 것을 알 수 있다.
이상 실시예를 통하여 확인한 바, 본 발명에서 사용한 탄저균 5주(표준균주 3주와 국내 분리균주 2주)의 rpoB 유전자 318-bp 염기서열을 확인한 결과 모두 동일하였으며, 전체 유전체가 밝혀진 Ames 등의 균주들도 동일하였다. 탄저균의 442번 아미노산 코돈 염기서열은 Gct(A442)로서 다른 바실러스 균종들의 Tct(S442)와는 특징적으로 다르기 때문에 이러한 뉴클레오타이드와 아미노산의 차이점으로 탄저균을 바실러스 균종들로부터 감별-동정할 수 있다. 이러한 균종 감별의 변별력은 rpoB 염기서열에 근거하여 작성한 계통도에서도 쉽게 알 수 있는데, 탄저균이 포함된 'B. cereus group'은 크게 두 서브 그룹으로 나뉘어지는 가운데, 탄저균 균주들은 별개의 클레이드(clade)를 형성하기 때문이다.
또한, 본 발명에서는 이와 같은 rpoB 염기서열에 근거하여 바실러스 속(屬)-특이 PCR 산물(359-bp)과 탄저균-특이 PCR 산물(208-bp)이 생산되는 multiplex PCR 방법을 개발하였다. 이 PCR 방법은 병원성을 판단할 수 있는 cap PCR(291-bp)과 동시에 시행하여 (1) 검체에 바실러스 균종이 있는지 여부, (2) 바실러스 균종이 있을 경우 그것이 탄저균인지 여부, 그리고 (3) 탄저균일 경우, 그것이 병원성을 갖는지 여부까지, 한번의 PCR로 판단할 수 있다. 이 multiplex PCR 방법을 주변 환경에서 분리된 바실러스 균종들에 적용하여 시행한 결과 병원성 탄저균만을 특이적으로 감별할 수 있다.
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따른 rpoB DNA를 이용한 염기서열 분석과 multiplex PCR 방법은 생물학적 테러의 수단으로도 살포될 수 있는 탄저균을 신속·정확하게 감별·탐지할 수 있을 뿐 아니라, 그것이 병원성을 갖는지 여부까지 한번의 PCR로 판단할 수 있는 간편한 방법임을 알 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용한 PCR용 프라이머 및 그 산물들을 나타내는 요약도.
도 2는 본 발명에서 확인한 탄저균이 포함된 'Bacillus cereus group' 5 균종에 속하는 31 균주의 rpoB 염기서열(318-bp).
도 3은 B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides 및 B. megaterium 균주의 서열 불일치를 보여주는 도표.
도 4는 탄저균이 포함된 'Bacillus cereus group'에 속하는 34 균주의 rpoB 유전자 염기서열(318-bp)로 구성한 계통수를 나타낸 도표.
도 5는 multiplex PCR을 이용한 탄저균 특이 PCR 결과를 나타내는 사진.
도 6은 탄저균임을 확인할 수 있는 rpoB PCR과 병원성 여부를 확인할 수 있는 pXO2 플라스미드 상의 캡슐 유전자(cap) PCR을 동시에 수행한 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진.
<110> KOOK, Yoon-Hoh <120> IDENTIFICATION OF BACILLUS ANTHRACIS BY MULTIPLEX PCR USING RNA POLYMERASE BETA-SUBUNIT GENE <130> 1-313 <160> 35 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus anthracis, Korean isolate <400> 1 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcagct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagattatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 2 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus anthracis, Korean isolate <400> 2 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcagct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagattatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 3 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus anthracis, Sterne strain <400> 3 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcagct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagattatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 4 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus anthracis, Pasteur No. 2 Army strain <400> 4 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcagct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagattatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 5 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus anthracis ATCC 14185 <400> 5 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcagct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagattatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 6 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSNU 12077 <400> 6 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgagagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagattatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 7 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus KCTC 1014 <400> 7 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 8 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSNU 13046 <400> 8 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 9 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSNU 12078 <400> 9 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 10 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSNU 11011 <400> 10 cgtctgcgct ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcgattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 11 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSNU 13044 <400> 11 cgtctgcgct ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcgattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 12 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus ATCC 9634 <400> 12 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcgattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 13 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSNU 13047 <400> 13 cgtctgcgtt ctgttggaga actgttacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 14 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSNU 12076 <400> 14 cgtctgcgtt ctgttggaga actgttacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 15 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSNU 11013 <400> 15 cgtctgcgtt ctgttggaga actgttacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttcaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 16 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus KCTC 1012 <400> 16 cgtctgcgtt ctgttggaga actgttacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 17 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSUN 11012 <400> 17 cgtctgcgtt ctgttggaga actgttacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 18 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSNU 13045 <400> 18 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactcccact acggtcgt 318 <210> 19 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSNU 12079 <400> 19 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcac 300 tactcccact acggtcgt 318 <210> 20 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus cereus IMSNU 13043 <400> 20 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatt caagatacaa atgcaattac accacaagcg 120 ttaattaaca ttcgcccggt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggatcaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ccggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 21 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis IMSNU 12095 <400> 21 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccgtta gcagagttaa ctcacaaacg aagattatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 22 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis IMSNU 12098 <400> 22 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccgtta gcagagttaa ctcacaaacg aagattatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 23 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis IMSNU 12099 <400> 23 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcgattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgtgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 24 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis KCTC 1507 <400> 24 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcgattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaatccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 25 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis IMSNU 12092 <400> 25 cgtctgcgtt ctgttggaga actgttacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 26 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis IMSNU 12097 <400> 26 cgtctgcgtt ctgttggaga actgttacaa aatcaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttta tggaccaaac aaacccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcat 300 tactctcact acggtcgt 318 <210> 27 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis KCTC 1509 <400> 27 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aaccaattcc gtatcggcct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcat 300 tactcccact atggtcgt 318 <210> 28 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis IMSNU 12089 <400> 28 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aaccaattcc gtatcggcct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcat 300 tactcccact atggtcgt 318 <210> 29 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis IMSNU 10051 <400> 29 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aaccaattcc gtatcggcct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ttaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcat 300 tactcccact atggtcgt 318 <210> 30 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis IMSNU 12096 <400> 30 cgtctgcgtt ctgttggaga actattacaa aaccaattcc gtatcggcct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatc caagatacaa atgcaattac accacaggca 120 ctaattaata ttcgtcctgt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggaccaaac aaatccatta gcagagttaa ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtacg tgacgttcat 300 tactcccact atggtcgt 318 <210> 31 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus mycoides KCCM 40260 <400> 31 cgtctgcgtt ctgtaagaga gttactacaa aaccaattcc gtatcggtct ttctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgagag aatgtcgatt caagatacaa atgcaattac gccgcaagcg 120 ttaattaaca ttcgtccggt tattgcatct attaaagagt tcttcggaag ttctcagtta 180 tctcagttca tggatcaaac aaacccatta gcggagttga ctcacaaacg aagactatct 240 gcattaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgcaggct ttgaagtgcg tgacgttcac 300 tactctcact atggtcgt 318 <210> 32 <211> 318 <212> DNA <213> Bacillus megaterium KCTC 3007 <400> 32 cgtctgcgtt ctgtaagtga attgttacaa aaccaattcc gtatcggttt atctcgtatg 60 gaacgtgttg ttcgtgaaag aatgtcaatt caagacacga atacaatcac acctcaacaa 120 ttaattaata ttcgcccagt tattgcggcg attaaagagt tctttggaag ttctcaatta 180 tcacagttca tggatcaaac gaatccatta ggcgaattga cgcacaaacg tcgtctttca 240 gctctaggac ctggtggttt aacgcgtgag cgcgctggtt ttgaagtgcg tgacgttcac 300 tactcccact atggccgt 318 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for amplifying rpoB DNA of genus Bacillus <400> 33 gacgatcaty twggaaaccg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for amplifying rpoB DNA of genus Bacillus <400> 34 ggngtytcra tyggacacat 20 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for amplifying Bacillus anthracis-specific rpoB DNA <400> 35 tcgtcctgtt attgcag 17

Claims (12)

  1. 서열 1 내지 5의 어느 하나로 표시되는, 탄저균(Bacillus anthracis)의 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편.
  2. 서열 6 내지 20의 어느 하나로 표시되는, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편.
  3. 서열 21 내지 30의 어느 하나로 표시되는, 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)의 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 서열 33 또는 34로 표시되는, 탄저균(Bacillus anthracis)을 포함하는 바실러스(Bacillus) 균종들의 탐지 및 동정을 위한 PCR용 프라이머.
  7. 서열 33 내지 35의 어느 하나로 표시되는, 탄저균 (Bacillus anthracis)을 선택적으로 탐지 및 동정하기 위한 PCR용 프라이머.
  8. 서열 33 및 34로 표시되는 프라이머를 포함하는, 탄저균(Bacillus anthracis)을 포함하는 바실러스(Bacillus) 균종들의 탐지 및 동정을 위한 진단용 키트.
  9. 서열 33 내지 35로 표시되는 프라이머를 포함하는, 바실러스(Bacillus) 균종들의 탐지 및 동정과 탄저균(Bacillus anthracis)의 선택적 탐지 및 동정을 위한 진단용 키트.
  10. 서열 33 내지 35로 표시되는 프라이머 및 탄저균(Bacillus anthracis)의 캡슐 유전자(cap)를 위한 프라이머를 포함하는, 바실러스(Bacillus) 균종들의 탐지 및 동정, 탄저균(Bacillus anthracis)의 선택적 탐지 및 동정, 그리고 병원성 탄저균(Bacillus anthracis)의 선택적 탐지 및 동정을 위한 진단용 키트.
  11. 서열 33 내지 35로 표시되는 프라이머에 대상 균주의 DNA를 혼합하고 PCR을 실시하여 탄저균(Bacillus anthracis) 특유 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편의 증폭 여부를 검사하는 단계를 포함하는, 탄저균(Bacillus anthracis)의 선택적 탐지 및 동정 방법.
  12. 서열 33 내지 35로 표시되는 프라이머 및 탄저균(Bacillus anthracis)의 캡슐 유전자(cap)를 위한 프라이머에 대상 균주의 DNA를 혼합하고 PCR을 실시하여 탄저균(Bacillus anthracis) 특유 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편 및 캡슐 유전자(cap) 단편의 증폭 여부를 검사하는 단계를 포함하는, 병원성 탄저균(Bacillus anthracis)의 선택적 탐지 및 동정 방법.
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