KR100475305B1 - Method for constructing chimeric dna library using exonuclease ⅶ - Google Patents

Method for constructing chimeric dna library using exonuclease ⅶ Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일가닥 특이적인 DNA 절단효소 엑소뉴클리아제 Ⅶ (exonuclease Ⅶ)을 이용하여 키메라 DNA 라이브러리를 만드는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 주형과 상보적인 단일가닥 DNA를 엑소뉴클리아제 Ⅶ로 절단하여 생성된 올리고뉴클레오티드가 내부 프라이머 및 DNA 중합반응의 방해자로 작용하여 변성화, 혼성화, 중합반응의 연쇄반응 동안 전체 길이의 이종 DNA 염기서열간의 주형교환을 일으켜 키메라 DNA 라이브러리 (chimeric DNA library)를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 유용한 특성을 갖는 유전자를 얻는 효율을 증진시키는 방향 진화 방법 (directed mutagenesis)에 관한 것이다. The present invention relates to a method for making a chimeric DNA library using a single strand specific DNA cleavage enzyme exonuclease ,, specifically, by cleaving a single strand DNA complementary to a template with exonuclease 아제. The resulting oligonucleotides act as internal primers and interferers of DNA polymerization, resulting in template exchange between full-length heterologous DNA sequences during denaturation, hybridization, and chain reaction of polymerization to produce chimeric DNA libraries. A method and directed mutagenesis for enhancing the efficiency of obtaining a gene with useful properties using the same.

Description

단일가닥 특이적인 ＤＮＡ 절단효소 엑소뉴클리아제 Ⅶ을 이용하여 키메라 ＤＮＡ 라이브러리를 만드는 방법{METHOD FOR CONSTRUCTING CHIMERIC DNA LIBRARY USING EXONUCLEASE Ⅶ} METHODE FOR CONSTRUCTING CHIMERIC DNA LIBRARY USING EXONUCLEASE Ⅶ Using single strand specific DNA cleavage exonuclease {

본 발명은 단일가닥 특이적인 DNA 절단효소 엑소뉴클리아제 Ⅶ에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 서로 다른 기원을 갖는 이종 DNA 염기서열 간의 재조립을 유발시킴으로써 키메라 DNA 라이브러리를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 유용한 특성을 갖는 유전자를 얻는 효율을 증진시키는 방향 진화 방법에 관한 것이다.The present invention provides a method for preparing a chimeric DNA library by inducing reassembly between heterologous DNA sequences having different origins using an oligonucleotide prepared by a single strand specific DNA cleavage enzyme exonuclease VII and using the same. A method of directional evolution that enhances the efficiency of obtaining genes with useful properties.

생물체 내에 존재하는 수천 종의 효소는 생명체의 기능을 유지하기 위해 필요한 복잡하고 다양한 반응을 매우 효율적으로 진행시키도록 진화되어 왔다. 따라서, 이러한 효소를 실제 산업적으로 활용하기 위해서는 반응 조건이나 목적에 맞게 효소의 기능을 개량하여야 한다. 효소의 특성을 개량하기 위하여 현재까지 다양한 연구가 진행되어 왔는데, 주로 무작위로 효소의 유전자에 변이를 유도하는 방법이나 효소의 구조 또는 기능과 구조와의 관련성 등 이미 알려진 정보를 기반으로 하는 단백질 공학 (protein engineering)에 의존하여 왔다. 그러나, 이러한 방법은 효소의 기능을 산업적 이용이 가능한 수준까지 효율적으로 개량하는데 한계가 있다. 최근에는 기존의 방법보다 매우 빠르게 효소의 기능을 개량할 수 있는 방법으로서 효소 유전자 뿐 아니라 프로모터, 바이러스 등 각종 DNA 염기서열간의 재조립을 유발시킴으로써 유용한 특성을 가지는 유전자를 얻기 위한 생체 내 진화 혹은 방향 진화 (directed mutagenesis) 기술이 개발되어 이의 활용에 관한 연구가 급속도로 증가하고 있다.Thousands of enzymes in living organisms have evolved very efficiently to carry out the complex and varied reactions necessary to maintain life's functions. Therefore, in order to utilize such enzymes industrially, it is necessary to improve the function of the enzymes according to the reaction conditions or purposes. Various studies have been conducted to improve the characteristics of enzymes. Protein engineering based on known information, such as how to induce mutations in the genes of enzymes randomly or the structure or function of enzymes and their association with structure, protein engineering). However, this method is limited in efficiently improving the function of the enzyme to the level of industrial use. Recently, in vivo or directional evolution to obtain genes with useful properties by inducing reassembly between various DNA sequences such as promoters and viruses as well as enzyme genes. (directed mutagenesis) technology has been developed and research on its use is rapidly increasing.

이러한 방향 진화는 각종 유용 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이를 가하여 돌연변이 라이브러리 (mutant library)를 구축하는 것으로부터 시작되는데, 돌연변이 라이브러리를 구축하여 다양한 유용 단백질을 창출하는 방법을 기술하면 하기와 같다.This directional evolution begins by constructing a mutant library by mutating genes encoding various useful proteins. The method of constructing a mutant library to generate various useful proteins is as follows.

1) 화학적 돌연변이화 (chemical mutagenesis)1) chemical mutagenesis

화학적 돌연변이 유도방법은 핵산에 손상을 줌으로써 시험관 내 DNA 합성 또는 생체 내 DNA 복제 동안에 잘못된 염기 삽입 (misincorporation)을 유발하는 방법이다. 상기 방법은 유전자 내 적은 수의 돌연변이를 유발시킬 때 많이 이용되어 온 방법으로 주로 EMS (methylsulfonate ethylester), NTG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine) 등의 화학물질이 돌연변이원 (mutagen)으로 이용되고 있다. Chemical mutagenesis is a method of damaging nucleic acids, causing misincorporation during in vitro DNA synthesis or in vivo DNA replication. This method has been widely used to induce a small number of mutations in a gene. Chemicals such as EMS (methylsulfonate ethylester) and NTG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine) are mainly used as mutagens. It is used.

2) 오류-경향 PCR (Error-prone PCR, mutagenic PCR)2) Error-prone PCR (mutagenic PCR)

PCR 방법에 일반적으로 사용되는 Taq 중합효소 (Taq polymerase)는 핵산 중합반응을 수행하는 동안 뉴클레오티드 당 0.1 ~ 2 ×10-4의 빈도로 잘못된 염기를 삽입할 가능성이 있는데, 높은 농도의 염을 첨가해주면 이러한 돌연변이 빈도가 더욱 높아진다. 이를 이용한 방법이 오류-경향 PCR로서 돌연변이 빈도를 높이기 위하여 MgCl2의 농도를 7 mmol/ℓ까지 증가시키거나, 0.05 mmol/ℓ의 MnCl2를 첨가하거나, dCTP와 dTTP의 농도를 1 mmol/ℓ로 올려주고 Taq 중합효소를 5 단위 (units) 정도 첨가함으로써 중합과정 중에 돌연변이 발생 빈도를 증가시켜 돌연변이 라이브러리를 구축하게 된다. 그러나, 오류-경향 PCR에 사용되는 중합효소의 낮은 DNA 합성 능력 (processability)으로 인해 평균 크기 1.0 kb 이상 되는 유전자를 무작위적으로 돌연변이화 시키기에는 그 효율성이 매우 떨어지며, 유전자의 정보 함량이 증가할수록 기능이 저하된 돌연변이의 비율이 높아져 기능이 향상된 클론의 선별이 어려울 뿐 아니라 돌연변이가 완전히 무작위적으로 일어나지 않기 때문에 특정부위에만 돌연변이가 편중될 가능성이 크다.Taq polymerase, which is commonly used in PCR methods, can insert the wrong base at a frequency of 0.1 to 2 × 10 -4 per nucleotide during the nucleic acid polymerization reaction. This mutation frequency is even higher. The method using the error-prone PCR increases the concentration of MgCl 2 to 7 mmol / L, adds 0.05 mmol / L of MnCl 2 , or increases the concentration of dCTP and dTTP to 1 mmol / L in order to increase the mutation frequency. By raising and adding 5 units of Taq polymerase, the mutation frequency is increased during the polymerization process to build a mutation library. However, due to the low DNA processability of polymerases used in error-prone PCR, the efficiency of random mutation of genes with an average size of 1.0 kb or more is very inefficient and functions as the information content of the gene increases. The increased proportion of these degraded mutations makes it difficult to select clones with improved functionality and because mutations do not occur completely randomly, the mutations are likely to be biased only at specific sites.

3) 무작위적 올리고뉴클레오티드를 이용한 돌연변이성 PCR (Mutagenic PCR)3) Mutagenic PCR using random oligonucleotides

특정위치에 4가지 뉴클레오티드의 무작위적 조합을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 효소를 코딩하는 유전자 부분을 바꾸는 방법으로 유전자 다양성 (diversity)을 얻는데 매우 유용하다. 상기 방법에 의하면 원하는 위치의 염기 (base)가 무작위적으로 바뀐 재조립 플라스미드 라이브러리를 구축할 수 있다.Oligonucleotides with random combinations of four nucleotides at specific positions can be used to achieve genetic diversity by altering the portion of the gene encoding the enzyme. According to this method, a reassembled plasmid library having a randomly changed base at a desired position can be constructed.

이와 같이 올리고뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 유발 방법은 미리 합성한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 짧은 염기서열을 치환하는 방법으로 주로 3차원 구조 분석이나 기타 방법을 통하여 단백질의 구조를 알고 있는 상태에서 계획된 치환을 얻고자 할 때 사용할 수 있다. 그러나, 상기 방법은 염기서열 상 멀리 떨어진 위치에 동시에 돌연변이를 도입하는 것이 불가능하며 이것을 얻기 위해서는 돌연변이 유발, 클로닝, 염기서열 확인의 과정을 여러 번 반복해야 하기 때문에 시간, 비용 및 노동력이 많이 들어가는 단점을 가지고 있다. As such, the mutagenesis method using oligonucleotides is a method of substituting short nucleotide sequences using oligonucleotides synthesized in advance, and is intended to obtain a planned substitution in a state in which the structure of the protein is known through three-dimensional structural analysis or other methods. Can be used when However, the method cannot simultaneously introduce mutations at distant positions on the nucleotide sequence, and it takes time, cost, and labor because it requires multiple repetitions of mutagenesis, cloning, and sequencing. Have.

4) 포화 돌연변이화 (saturation mutagenesis)4) saturation mutagenesis

유전자의 특정 아미노산을 가능한 모든 아미노산으로 치환하여 변이를 유발시키는 방법으로, 가장 직접적인 방법은 특정 부위 치환법 (site-directed mutagenesis)을 통하여 모든 아미노산에 치환될 뉴클레오티드 변형 (exchange)을 도입하는 것이다.The substitution of a specific amino acid of a gene with all possible amino acids causes mutations. The most direct method is to introduce nucleotide changes to be substituted for all amino acids through site-directed mutagenesis.

5) 카세트 돌연변이화 (Cassette mutagenesis)5) Cassette mutagenesis

일반적으로 카세트는 한 개에서 수백 개의 아미노산을 코딩하는 3개에서 수백 개의 뉴클레오티드로 정의된다. 이를 이용한 카세트 돌연변이 방법은 먼저 순열식 카세트 돌연변이화 (combinatorial cassette mutagenesis, CCM)를 통해 이미 알려진 3차원적 구조의 정보를 이용하여 유전자의 특정 부위를 치환하는 것으로, CCM은 무작위적 코돈 (randomized codon)을 함유한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 유전자의 특정 부위에 돌연변이성 카세트 (mutagenic cassette)를 도입함으로써 돌연변이를 유발시킨다. 그러나, 카세트 돌연변이 방법의 경우 무작위적 서열 블록의 크기와 개수의 한계로 인하여 다른 중요한 부분을 놓칠 가능성이 많다는 한계가 지적되고 있다.Generally cassettes are defined as three to hundreds of nucleotides encoding one to several hundred amino acids. The cassette mutation method using the same method first replaces a specific region of a gene using information of a three-dimensional structure known through combinatorial cassette mutagenesis (CCM), which is a randomized codon Mutations are induced by introducing a mutagenic cassette into a specific region of a gene using an oligonucleotide containing. However, it is pointed out that the cassette mutation method is likely to miss other important parts due to the limitation of the size and number of random sequence blocks.

6) 증량성 절단 (Incremental truncation)6) Incremental truncation

하나의 유전자 (ORF1)를 파지미드 (phagemid) 벡터에 클로닝하고 동일한 방법으로 다른 유전자 (ORF2)를 같은 복제 기원 (replication origin)을 갖는 벡터에 클로닝한다. 이때 용이한 선별을 위해 각각의 벡터는 서로 다른 항생제 내성을 갖도록 구축한다. 상기 벡터의 제한 효소 절단부위를 이용하여 3'말단으로부터 내부 절단 (internal truncation)을 수행한 ORF1과 5' 말단으로부터 내부 절단을 수행한 ORF2를 확보한 후 이로부터 하나의 라이브러리 유전자 단편을 분리하여 다른 라이브러리 유전자에 융합시켜 돌연변이 라이브러리를 구축하는 것이다.One gene (ORF1) is cloned into a phagemid vector and the other gene (ORF2) is cloned into a vector with the same replication origin in the same way. In order to facilitate selection, each vector is constructed to have different antibiotic resistance. Using the restriction enzyme cleavage site of the vector, ORF1 having internal truncation from the 3 'end and ORF2 having internal cleavage from the 5' end were obtained, and then one library gene fragment was separated from the other. The fusion library is constructed to construct a mutant library.

7) 동종 재조합 (Homologous recombination)7) Homologous recombination

먼저 대상이 되는 하나의 유전자 (ORF1)를 특정한 벡터에 클로닝한다. 동종 재조합을 유도하기 위하여 다른 하나의 유전자 (ORF2) 자체를 이용하여 두개의 유전자를 전기-형질전환 (electro-transformation)을 통해 동시에 하나의 숙주세포에서 발현시킴으로써 돌연변이 라이브러리를 구축하는 방법이다. 이때 숙주세포로는 동종 재조합에 필요한 효소가 발현되는 시스템을 이용하여야 한다.First, one gene of interest (ORF1) is cloned into a specific vector. In order to induce homologous recombination, a mutation library is constructed by expressing two genes in one host cell simultaneously through electro-transformation using another gene (ORF2) itself. At this time, the host cell should be a system expressing the enzyme required for homologous recombination.

8) 세균성 돌연변이 균주 (Bacterial mutator strain)8) Bacterial mutator strain

DNA 회복 시스템 (DNA repair system)을 차단시킨 숙주 내에서 유전자의 돌연변이를 유발하는 방법으로 생체 내 돌연변이 (in vitro mutation), 형질전환 과정 등을 생략할 수 있다는 장점이 있다.The method of inducing mutation of genes in a host that blocks the DNA repair system has the advantage of eliminating in vitro mutations and transformation processes.

9) DNA 재조립 (DNA reassembly)9) DNA reassembly

최근에는 상기와 같은 통상적인 방법의 문제점을 해결하기 위하여 스테머 (Stemmer W. P. C., Nature 370:389-391, 1994)에 의해서 DNA 재조립 방법 (DNA shuffling)이 개발되었으며, 상기 방법은 현재 돌연변이 라이브러리를 구축하는데 가장 효율적인 방법으로 알려져 있다. 스테머의 DNA 재조립 방법은 임의로 유발된 돌연변이간에 재조립을 일으킴으로써 기존의 방법에 비하여 훨씬 다양한 DNA 라이브러리를 구축할 수 있는 방법으로, 먼저 DNase I 효소를 사용하여 두 가지 이상의 DNA를 임의로 절단한 후 일부분이 혼성화된 DNA 단편들이 서로에 대해 각각 주형인 동시에 프라이머로서 작용하게 하여 PCR을 실시할 수 있도록 함으로써 다양한 재조립 DNA를 얻는 방법이다. 상기 DNA 재조립 방법은 시험관 내에서 여러 종의 기원으로부터 유래한 서열들 뿐 아니라 한 서열의 무작위적 돌연변이까지 다양한 조합을 만들 수 있기 때문에 유전자의 방향 진화에 매우 효과적이다. 무작위적 돌연변이를 가진 다양한 재조립 DNA 단편을 포함한 라이브러리는 적당한 선별과정을 거쳐서 다음 단계의 뒤섞임 (shuffling)에 이용된다 (USP 6,165,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; 5,837,458). 스테머는 상기 방법을 이용하여 베타-락타메이즈 (beta-lactamase)를 방향 진화시켰으며 이를 통하여 세포탁심 (cefotaxime)에 대한 내성을 32,000배 향상시킬 수 있었다.Recently, DNA shuffling has been developed by Stemer (Stemmer WPC, Nature 370: 389-391, 1994) to solve the problems of the conventional method, and the method currently uses a mutation library. It is known as the most efficient way to build. Stemer's DNA reassembly method is a method of constructing a much more diverse DNA library than conventional methods by reassembling between randomly induced mutations. First, two or more DNAs are randomly cut using a DNase I enzyme. It is a method of obtaining various reassembled DNAs by allowing the hybridized DNA fragments to be subjected to PCR as a template and a primer at the same time. The DNA reassembly method is very effective for directional evolution of genes because it can make various combinations in vitro as well as sequences derived from various species origins, as well as random mutations of one sequence. Libraries containing various reassembled DNA fragments with random mutations are used for shuffling to the next stage after appropriate selection (USP 6,165,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; 5,837,458). Stemer directionally evolved beta-lactamase using this method, which allowed for 32,000-fold improvement in cefotaxime resistance.

한편, USP 5,965,408에는 UV, 부가물 (adduct) 또는 돌연변이 유발 화학물질 등을 이용하여 DNA 합성을 중지시킴으로써 다양한 길이의 단일가닥 DNA를 생성시킨 후 이들 사이의 재조립을 유도하는 방법이 개시되어 있다.US Pat. No. 5,965,408, on the other hand, discloses a method of generating single stranded DNA of various lengths by inducing DNA synthesis using UV, adducts or mutagenesis chemicals, and the like and inducing reassembly therebetween.

이외에도 PCR 반응시간, 반응온도 등의 반응조건을 조절하여 한 사이클 동안 짧은 조각의 DNA를 합성한 후 주형 교환 (template switching)을 통하여 재조립을 유도하는 StEP 방법 (Zhao et al., Nature Biotechnol. 16:258-261, 1998)과 무작위적 헥사머 (Random hexamer)를 사용하여 주형 DNA로부터 짧은 DNA 조각을 만들어 PCR 반응을 통해서 재조립을 유발하는 RPR 방법 (Shao et al., Nucl. Acids Res. 26:681-683, 1998) 등이 개발되었다.In addition, the StEP method (Zhao et al ., Nature Biotechnol . 16) induces reassembly through template switching after synthesizing short fragments of DNA for one cycle by controlling reaction conditions such as PCR reaction time and reaction temperature. : 258-261, 1998) and the RPR method (Shao et al ., Nucl. Acids Res . 26), which uses a random hexamer to generate short DNA fragments from template DNA and induces reassembly through PCR reactions. : 681-683, 1998).

이중 StEP 방법과 RPR 방법은 DNA 재조립이 일어나는 부위가 양쪽 말단을 포함하여 편중되지 않는다는 장점을 가지고 있다. 그러나, StEP 방법의 경우 PCR 조건을 조절하는 것이 매우 까다롭다는 단점이 있으며 RPR 방법의 경우 인공적으로 무작위적 헥사머 (hexamer)를 합성하여 첨가하기 때문에 프라이머와 주형간의 상보성이 떨어질 가능성이 크다.The StEP and RPR methods have the advantage that the site where DNA reassembly occurs is not biased, including both ends. However, the StEP method has a disadvantage in that it is very difficult to control PCR conditions, and in the case of the RPR method, the complementarity between the primer and the template is likely to be inferior because the artificial random hexamer is synthesized and added.

이에 본 발명자들은 이러한 문제점을 극복하기 위하여 예의 노력한 결과, 이종 DNA를 단일가닥으로 만든 후 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 생성시키고 이를 내부 프라이머 및 DNA 중합반응의 방해자로 이용하여 재조립 DNA 라이브러리를 제조하는 방법을 개발하였고 이를 통해 염기서열 위치간에 재조립 편향성이 크지 않으면서 매우 높은 빈도로 재조립이 일어날 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have made diligent efforts to overcome these problems. As a result, single-stranded heterologous DNA was used to generate oligonucleotides using DNA exonucleases Ⅶ and reassembled using internal primers and interferers of DNA polymerization. A method of preparing a DNA library was developed and the present invention was completed by confirming that reassembly can occur at a very high frequency without large reassembly bias between sequence positions.

본 발명의 목적은 효소 유전자, 프로모터, 바이러스 등 각종 DNA 염기서열간의 재조립을 유발시켜 산업적으로 유용한 단백질, DNA 또는 RNA를 얻기 위한 키메라 DNA 라이브러리를 형성하는 방향 진화 방법을 제공하는 것이다. SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a method for directional evolution in which chimeric DNA libraries are formed to obtain industrially useful proteins, DNAs or RNAs by causing reassembly between various DNA sequences such as enzyme genes, promoters, viruses, and the like.

본 발명에서 "재조립 (reassembly)"이라 함은 서로 다른 종류의 유전자로부터 기원하는 DNA 조각들이 연결되어 하나의 유전자를 이루는 것을 의미하며, 상기와 같이 이종 DNA가 교차적으로 연결된 형태로 재조립된 DNA를 "키메라 DNA (chimeric DNA)"라 한다.In the present invention, "reassembly" means that DNA fragments originating from different kinds of genes are linked to form a single gene. As described above, heterologous DNA is reassembled into a cross-linked form. DNA is referred to as "chimeric DNA".

또한, "내부 프라이머"라 함은 이종 DNA 간에 재조립을 유발하기 위하여 사용하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드로서, 이종 DNA 단일가닥을 DNA 절단효소 Ⅶ로 절단하여 생산할 수 있으며 이종 DNA 단일가닥을 주형으로 PCR을 통해 증폭함에 있어 프라이머 및 DNA 중합반응의 방해자로 사용될 수 있는 것을 말한다.In addition, "internal primer" is a single-stranded oligonucleotide used to induce reassembly between heterologous DNA, and can be produced by cleaving a heterologous DNA single strand with DNA cleavage enzyme and PCR using a heterologous DNA single strand as a template. It can be used as a primer and primer of DNA polymerization in amplification.

본 발명에서 "말단 프라이머"라 함은 재조립시키고자 하는 목적 유전자의 양 말단 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로서, 본 발명의 DNA 재조립 과정 중에 1차 PCR 반응에서는 키메라 DNA를 생성하는 용도로 사용되며, 2차 PCR 반응에서는 생성된 키메라 DNA를 증폭하는 목적으로 사용된다.In the present invention, the term "terminal primer" is an oligonucleotide having the nucleotide sequences of both ends of the target gene to be reassembled, and is used for generating chimeric DNA in the first PCR reaction during the DNA reassembly process of the present invention. In the second PCR reaction, the resulting chimeric DNA is used for amplification.

한편, 본 발명에서 "키메라 DNA 라이브러리"란 이종 DNA간에 재조립이 일어난 다양한 DNA들을 총칭하며, 상기 재조립 DNA를 벡터에 삽입하여 형질전환시킨 대장균 등의 숙주세포 집단을 가리킬 수도 있다.Meanwhile, in the present invention, the "chimeric DNA library" refers to a variety of DNAs that have been reassembled between heterologous DNAs, and may refer to a host cell population such as E. coli transformed by inserting the reassembled DNA into a vector.

본 발명에서 "방향 진화 (directed mutagenesis)"란 돌연변이 등을 통해 보다 나은 특성을 갖는 유전자를 만드는 것을 말하는데, 여기서 돌연변이란 본 발명의 방법을 통해 유사한 특성을 갖는 단백질을 생성하는 이종 DNA를 재조립하여 키메라 DNA 라이브러리를 제작함으로써 이루어지며, 상기 키메라 DNA 라이브러리로부터 목적하는 특성을 나타내는 유전자를 선별하는 과정을 통해 기능이 향상되거나 유리한 특성을 갖는 유전자를 얻는 과정을 의미한다.In the present invention, "directed mutagenesis" refers to making genes having better properties through mutations, etc., wherein the mutations are reassembled heterologous DNA to produce proteins having similar properties through the method of the present invention. It is made by preparing a chimeric DNA library, and means a process of obtaining a gene having improved or advantageous properties by selecting a gene having a desired characteristic from the chimeric DNA library.

또한, 본 발명에서 "이종 DNA (heterologous DNA)"라 함은 재조립시키고자 하는 유전자를 포함하는 DNA로서 서로 다른 세포로부터 유래한 것 또는 같은 종류의 세포로부터 분리된 서로 다른 종류의 DNA 또는 오류-경향 PCR 등을 통해서 동일한 유전자에 돌연변이가 도입되어 서로 다른 염기서열을 갖게 된 DNA를 의미한다. 상기 "이종 DNA"로 바람직하게는 방향 진화시키고자 하는 서로 다른 세포의 동일한 유전자를 이용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 유사한 활성을 갖는 동종 세포의 단백질을 만드는 유전자 또는 유사한 활성을 갖는 단백질을 암호화하되 다른 종류의 세포에서 유래하는 유전자를 이용할 수도 있다. 나아가 완전히 다른 활성을 나타내는 단백질이라도 그들의 특성을 혼합하여 새로운 활성을 나타내는 유전자를 얻고자 할 때에는 전혀 무관한 단백질을 암호화하는 유전자를 이용할 수도 있다. 단, 이 경우에도 DNA 상호간에 혼성화가 일어나기 위해서 최소한의 공통 서열은 존재하여야 하므로, 최소한 50% 이상의 염기서열 유사도를 나타내는 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.In addition, in the present invention, "heterologous DNA" refers to a DNA containing a gene to be reassembled, which is derived from different cells or different types of DNA or errors separated from the same kind of cells. By DNA PCR, mutations are introduced into the same gene, which means that they have different sequences. The "heterologous DNA" may preferably use the same gene of different cells to be directionally evolved, but is not limited thereto, and encodes a gene or protein having a similar activity that makes a protein of a homologous cell with similar activity. However, genes derived from other cell types can also be used. Furthermore, even if a protein exhibiting completely different activity can be mixed with their properties to obtain a gene showing a new activity, a gene encoding an unrelated protein can be used. However, even in this case, in order for hybridization to occur between DNAs, a minimum consensus sequence must exist, so it is preferable to use a gene that exhibits at least 50% or more nucleotide sequence similarity.

한편, 본 발명에서 "단일가닥 (특이적인) DNA 절단효소"란 단일가닥 폴리뉴클레오티드 또는 이중가닥 폴리뉴클레오티드의 단일가닥 부분에 선택적으로 작용하는 DNA 절단효소를 말한다. 특히, 5 내지 25 bp 길이의 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있는 것으로서, 엑소뉴클리아제 Ⅶ 등이 본 발명에 유용하게 사용될 수 있다.Meanwhile, in the present invention, "single-strand (specific) DNA cleavage enzyme" refers to a DNA cleavage enzyme that selectively acts on the single stranded portion of a single stranded polynucleotide or a double stranded polynucleotide. In particular, as it is possible to form oligonucleotides of 5 to 25 bp in length, exonuclease VII and the like can be usefully used in the present invention.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단일가닥 특이적인 DNA 절단효소를 이용하여 각종 DNA 염기서열간의 재조립을 유발시킴으로써 기원이 다른 DNA로부터 키메라 DNA 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing a chimeric DNA library from DNA of different origin by causing reassembly between various DNA sequences using a single strand specific DNA cleavage enzyme.

본 발명의 키메라 DNA 라이브러리 제조 방법은 둘 이상의 이종 DNA를 주형으로 하고 이에 상보적인 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄반응에 의해 키메라 DNA 라이브러리를 제조하는 방법에 있어서, 주형 DNA와 상보적인 염기서열을 가진 단일가닥 DNA의 절단에 의해서 생성된 올리고뉴클레오티드가 말단 프라이머로부터 시작된 DNA 중합반응의 방해자로 작용하여 변성화, 혼성화, 중합반응의 연쇄반응 동안 전체 길이의 이종 DNA간에 주형교환을 하면서 DNA 중합반응을 일으키는 방법이다.The method for preparing a chimeric DNA library of the present invention is a method of preparing a chimeric DNA library by polymerase chain reaction using two or more heterologous DNAs as a template and using complementary primers. Oligonucleotides produced by cleavage of stranded DNA act as interferers of DNA polymerization initiated from terminal primers to cause DNA polymerization by template exchange between full-length heterologous DNA during denaturation, hybridization, and polymerase chain reaction to be.

보다 바람직하게는, 상기 키메라 DNA 라이브러리의 제조방법은More preferably, the method for producing the chimeric DNA library

1) 둘 이상의 이종 DNA 이중가닥으로부터 단일가닥 DNA를 각각 제조하는 단계; 1) preparing single-stranded DNA from two or more heterologous DNA double strands, respectively;

2) 단일가닥으로 만들어진 이종 DNA 중 동일한 한쪽방향을 갖는 DNA들을 단일가닥 특이적인 DNA 절단효소로 절단하여 올리고뉴클레오티드를 생산하는 단계;2) producing oligonucleotides by cutting DNAs having the same one direction among heterologous DNAs made of single strands with a single strand specific DNA cleavage enzyme;

3) 상기 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 내부 프라이머 및 DNA 중합반응의 방해자로 하고, 단계 1)에서 제조된 상보적인 방향을 갖는 이종 DNA 단일가닥들을 주형으로 하며 말단 프라이머를 첨가하여 변성화, 혼성화, 중합반응을 반복함으로써 말단 프라이머로부터 합성된 DNA가 프라이머로 작용하여 매 싸이클마다 이종 DNA간에 주형교환이 이루어져 길이가 신장된 재조립 DNA 가닥을 만드는 단계;3) Degenerate, hybridize, and polymerize the single-stranded oligonucleotide as an interrupter of the internal primer and the DNA polymerization, and the heterologous DNA single-strands having the complementary orientation prepared in step 1) as a template, and by adding the terminal primer. By repeating the DNA synthesized from the terminal primer acts as a primer to exchange the template between the heterologous DNA every cycle to create a reassembled DNA strand lengthened;

4) DNA 리가아제 (DNA ligase)를 처리함으로써 부분적인 염기서열을 가지는 DNA를 접합시켜 길이가 신장된 재조립 DNA 가닥을 만드는 단계; 및4) conjugating DNA having partial sequencing by treating DNA ligase to form reassembled DNA strands of extended length; And

5) 재조립하고자 하는 유전자의 양쪽 말단 부분의 염기서열에 해당하는 말단 프라이머를 첨가하여 PCR로 재조립 DNA를 증폭하는 단계를 포함한다.5) amplifying the reassembled DNA by PCR by adding terminal primers corresponding to the base sequences of both terminal portions of the gene to be reassembled.

상기와 같이, 본 발명의 키메라 DNA 라이브러리 제조 방법은, 단일가닥 특이적인 DNA 절단효소를 사용하여 주형에 정확하게 부착할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 생산하고, 이를 PCR 증폭을 위한 내부 프라이머 및 DNA 중합반응의 방해자로 사용하며, 말단 프라이머로부터 이종 DNA간에 주형교환을 하면서 길이가 신장된 재조립 DNA를 생산하는 것을 특징으로 한다. As described above, the method for preparing chimeric DNA library of the present invention uses single-strand specific DNA cleavage enzymes to produce oligonucleotides that can be attached to the template accurately, and internal primers for PCR amplification and interferers of DNA polymerization. It is used as, characterized in that to produce a reassembled DNA of elongated length while performing template exchange between heterologous DNA from the terminal primer.

본 발명에서는 말단 프라이머로부터 길이가 신장된 단일가닥 DNA가 긴 부분에 걸쳐서 주형과 상보적인 결합을 이룸으로써 염기서열 차이가 큰 이종 DNA 간에 혼성화를 이루는 비율을 높이는 특징을 가지고 있다. 따라서, 상대적으로 짧은 부분에 대한 상보적인 결합을 이용하는 기존의 방법에 비해서 재조립을 일으킬 확률을 높일 수 있다는 특징이 있다. In the present invention, the single-stranded DNA extended in length from the terminal primer forms a complementary bond with the template over a long portion, thereby increasing the rate of hybridization between heterologous DNA having a large difference in nucleotide sequence. Therefore, there is a feature that can increase the probability of reassembly compared to the conventional method using a complementary coupling to a relatively short portion.

또한, 본 발명의 제조방법은 부분적인 염기서열을 가진 단일가닥 DNA를 접합시켜 길이가 신장된 재조립 DNA의 생산수율을 높이는 단계를 포함함으로써 재조립 DNA의 생산비율을 높이는 특징이 있다. 아울러, 본 발명의 제조방법은 주형으로 사용하는 단일가닥 DNA와 내부 프라이머 및 DNA 중합반응의 방해자로 작용하는 올리고뉴클레오티드의 비율을 조절함으로써 재조립 빈도를 조절할 수 있으며, 재조립하고자 하는 전체 DNA 염기서열 내에서 재조립이 일어나는 위치에 대한 편향성이 크지 않아서 다양한 키메라 DNA 라이브러리를 생성시키는데 매우 유리하다.In addition, the production method of the present invention is characterized by increasing the production rate of reassembled DNA by including a step of increasing the production yield of the reassembled DNA is elongated by joining a single-stranded DNA having a partial base sequence. In addition, the production method of the present invention can control the reassembly frequency by controlling the ratio of the single-stranded DNA used as a template and the oligonucleotide acting as an interference primer of the internal primer and DNA polymerization reaction, the total DNA sequence to be reassembled The bias towards where reassembly occurs in the interior is not so great, which is very advantageous for generating various chimeric DNA libraries.

본 발명의 키메라 DNA 라이브러리 제조 및 이를 이용한 방향 진화 방법을 상세히 살펴보면 다음과 같다.Looking at the chimera DNA library of the present invention and a direction evolution method using the same in detail.

제 1 과정: 내부 프라이머의 제조First Step: Preparation of Internal Primer

단계 1: 단일가닥 이종 DNA의 생산Step 1: Production of single stranded heterologous DNA

이종 DNA를 단일가닥으로 만드는 방법으로는 DNA의 한쪽 끝은 DNA 절단부위에 3' 돌출부 (protruding)를 갖게 하는 제한효소로 절단하고 다른 한쪽 끝은 DNA 절단부위에 5' 돌출부를 갖게 하는 제한효소 또는 DNA 절단부위를 평활말단 (blunt end)으로 만드는 제한효소로 절단한 후 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅲ (Exonuclease Ⅲ)를 이용하여 이중가닥 DNA를 절단함으로써 단일가닥으로 만드는 방법을 사용할 수 있다. DNA 절단부위에 3' 돌출부를 갖게 하는 제한효소로는 ApaⅠ, KpnⅠ, NsiI, PstⅠ, SacⅠ, SacⅡ, SphI 등이 사용될 수 있고, DNA 절단부위에 5' 돌출부를 갖게 하는 제한효소로는 BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, NcoI, SpeI 또는 Xba Ⅰ 등이 사용될 수 있으며, DNA 절단부위를 평활말단으로 만드는 제한효소로는 EcoRⅤ 또는 SmaⅠ 등이 사용될 수 있다. DNA 엑소뉴클리아제 Ⅲ는 3'→5' 엑소뉴클리아제로서 이중가닥 DNA 또는 DNA-RNA 혼성체 (hybrids)를 특이적으로 인식하여 절단한다. 상기 효소는 평활 말단 (blunt end), 5'-돌출부 (5'-overhang) 또는 틈 (nick)을 갖는 이중가닥 DNA를 절단할 수 있으나, 단일가닥 DNA 또는 적어도 2 염기의 3'-돌출부를 갖는 이중가닥 DNA는 절단할 수 없는 특징을 갖는다.Single-stranded heterologous DNA can be digested with a restriction enzyme that has a 3 'protruding portion at the DNA cleavage site and a restriction enzyme that has a 5' protrusion at the DNA cleavage site. The DNA cleavage site may be cut into a single strand by cutting the double stranded DNA using DNA exonuclease III after cutting with restriction enzymes that make the blunt end. 3 the DNA cleavage site for "limited to enzymes that have the projections Apa Ⅰ, Kpn Ⅰ, Nsi I, Pst Ⅰ, Sac Ⅰ, Sac Ⅱ, may be used a Sph I, etc., 5 on the DNA cleavage site" has a protrusion As restriction enzymes, Bam H I, Eco R I, Hin d III, Nco I, Spe I or Xba I and the like can be used. As restriction enzymes that make the DNA cleavage site smooth, Eco R V or Sma I can be used. DNA exonuclease III is a 3 '→ 5' exonuclease that specifically recognizes and cleaves double-stranded DNA or DNA-RNA hybrids. The enzyme can cleave double stranded DNA with blunt ends, 5'-overhangs or nicks, but with single stranded DNA or at least 2 bases 3'-projections Double stranded DNA has a feature that is not cleavable.

또한, PCR 증폭시 첨가하는 프라이머의 양을 다르게 함으로써 단일 가닥의 DNA를 생산하는 비대칭 PCR (assymetric PCR) (Innis, Gelfand, Sninsky and White eds. PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, Inc. pp76~83, 1989) 또는 변성화 PAGE 젤 (denaturing PAGE gel)을 이용하여 단일가닥을 선별하는 방법 (Sambrook and Russell, Molecular cloning: a laboratory manual 3rd ed. CSHL press. pp5.40, 12.74~12.80, 2001) 등 다양한 방법을 사용할 수 있다. 이외에도, 이중가닥 DNA를 높은 온도에서 가열한 후 급격하게 냉각시킴으로써 변성화된 단일가닥 DNA를 생산하는 방법을 사용할 수도 있다. 그러나, 급격한 냉각에 의한 변성화 방법에서는 양쪽 방향의 단일가닥이 함께 존재하게 된다는 단점이 있다.In addition, assymetric PCR (Innis, Gelfand, Sninsky and White eds. PCR protocols: a guide to methods and applications.Academic Press, Inc.) produces a single strand of DNA by varying the amount of primer added during PCR amplification. pp76 ~ 83, 1989) or single strand selection using denaturing PAGE gel (Sambrook and Russell, Molecular cloning: a laboratory manual 3rd ed.CSHL press.pp5.40, 12.74 ~ 12.80) , 2001). In addition, a method of producing denatured single-stranded DNA may be used by heating the double-stranded DNA at a high temperature and then rapidly cooling it. However, the denaturation method by rapid cooling has the disadvantage that the single strands in both directions are present together.

상기에서 혼성화시키는 DNA로는 일반적으로 방향 진화를 이루고자 목적하는 유전자를 사용하는데, 예를 들어 보다 높은 키틴 (chitin) 분해활성을 갖는 키티나아제를 만들고자 할 때에는 다양한 종류의 세포에서 키티나아제 유전자를 분리하여 이들을 키메라 DNA 라이브러리 제작의 출발물질로 사용할 수 있다. As the hybridizing DNA, a gene of interest is generally used to achieve directional evolution. For example, to make a chitinase having higher chitin degrading activity, a chitinase gene is separated from various kinds of cells. These can be used as starting materials for chimeric DNA library construction.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 에어로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila, KCTC 2358) 및 판토에아 글로메란스 (Pantoea glomerans, KCTC 2578)의 두 종류 균주에서 분리한 키티나아제 유전자를 이용하여 재조립 실험을 수행한다.In a preferred embodiment of the present invention , reassembly experiments were carried out using chitinase genes isolated from two strains, Aeromonas hydrophila ( KCTC 2358) and Pantoea glomerans ( KCTC 2578). To perform.

단계 2: DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ를 이용한 올리고뉴클레오티드 생산Step 2: Oligonucleotide Production Using DNA Exonucleases Ⅶ

상기와 같이 생성된 단일가닥 DNA는 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ의 기질로 이용되는데 이 효소는 단일가닥 DNA를 바깥쪽부터 절단하여 2 내지 25 bp 크기의 올리고뉴클레오티드를 생성하는 특징을 가지고 있다. 따라서, 상기 효소에 의해서 생산된 올리고뉴클레오티드는 DNA 재조립을 위한 내부 프라이머 및 DNA 중합반응의 방해자로 이용될 수 있다.The single-stranded DNA produced as described above is used as a substrate for DNA exonuclease 되는데, and this enzyme has a characteristic of generating oligonucleotides of 2 to 25 bp by cutting single-stranded DNA from the outside. Thus, oligonucleotides produced by the enzyme can be used as internal primers for DNA reassembly and as interferers of DNA polymerization.

DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ에 의한 절단은 단일가닥 DNA 50 ng당 0.01 내지 10 단위 (unit), 바람직하게는 1 단위의 효소를 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응한 후 90℃에서 5분간 가열함으로써 효소활성을 제거하는 것으로 이루어질 수 있다.Cleavage by DNA exonuclease Ⅶ was performed by adding 0.01 to 10 units, preferably 1 unit of enzyme per 50 ng of single-stranded DNA, and then reacting at 37 ° C. for 30 minutes and then heating at 90 ° C. for 5 minutes. It may consist of removing enzymatic activity.

또한, 단계 1) 및 단계 2)의 과정에 의해서 생성되는 내부 프라이머는 주형과 상보적인 염기서열을 갖도록 인공적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로 대체 사용될 수 있다. In addition, the internal primer generated by the process of step 1) and step 2) can be replaced by oligonucleotides artificially synthesized to have a nucleotide sequence complementary to the template.

제 2 과정: 내부 프라이머를 이용한 DNA 재조립 (1차 PCR 반응)Second Step: DNA Reassembly Using Internal Primer (Primary PCR Reaction)

제 2 과정은 상기에서 제조된 내부 프라이머를 이용하여 중합반응을 수행함으로써 DNA간의 재조립을 유발하고 전체 길이의 재조립 DNA를 제조하는 과정이다.The second process is a process of inducing reassembly between DNAs by performing a polymerization reaction using the prepared internal primers and preparing reassembled DNA of full length.

단계 1: PCR 반응에 의한 DNA 재조립Step 1: DNA Reassembly by PCR Reaction

주형으로는 내부 프라이머 제조를 위해 최초에 사용되었던 이종 DNA 단일가닥과 상보적인 단일가닥 DNA를 사용하고, 단일가닥 특이적인 DNA 절단효소에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드 및 주형과 상보적인 염기서열을 갖는 말단 프라이머를 첨가하여 반응시킨다. 내부 프라이머를 과량으로 첨가할 경우 변성화 반응과 혼성화 반응에 의해서 한 분자의 주형에 대하여 말단 프라이머를 포함하여 여러 분자의 내부 프라이머가 혼성화를 일으키게 된다. 하나의 주형에 여러 개의 프라이머가 부착되어 있을 경우 5' 쪽에 부착된 프라이머로부터 시작된 DNA 중합반응은 다른 프라이머와 만나는 부분에서 중지하게 됨으로써 일부 염기서열만 가진 단일가닥 염기서열이 생성된다. 이렇게 생성된 단일가닥 DNA는 변성화, 혼성화, 중합반응을 반복하면서 계속해서 DNA 중합반응의 프라이머로 작용할 수 있다. 이 과정에서 이종 단일가닥 DNA에 교차하여 혼성화될 경우 5' 쪽 말단 프라이머로부터 합성된 DNA는 서로 기원이 다른 염기서열을 한 분자 내에 보유하는 재조립된 DNA로 생성된다.As a template, a single-stranded DNA complementary to a heterologous DNA single strand originally used for internal primer preparation, and an oligonucleotide prepared by a single-strand specific DNA cleavage enzyme and a terminal primer having a base sequence complementary to the template It is added and reacted. When an excess amount of the internal primer is added, the internal primer of several molecules including the terminal primer for the template of one molecule causes hybridization by the denaturation reaction and the hybridization reaction. When multiple primers are attached to one template, the DNA polymerization reaction started from the primer attached to the 5 'side is stopped at the encounter with other primers, thereby generating a single-stranded sequence having only some sequences. The single-stranded DNA thus produced can continue to act as a primer for DNA polymerization while repeating denaturation, hybridization and polymerization. In this process, when hybridized to heterologous single-stranded DNA, DNA synthesized from the 5 'end primer is produced as reassembled DNA having base sequences of different origins in one molecule.

이때, 말단 프라이머는 정방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머 모두를 사용할 수도 있는데, 이 경우에는 DNA 재조립을 위한 1차 PCR 과정 중에 재조립 DNA의 증폭이 일어나므로 재조립이 일어나지 않은 주형 DNA에 비해서 재조립 DNA의 양이 상대적으로 높아지는 장점을 가지고 있는 반면에 초기에 생성된 재조립 DNA가 증폭되어서 후기에 생성된 재조립 DNA에 비해서 상대적으로 많은 양이 존재하게 됨으로써 재조립 DNA의 분포가 편향되는 단점이 있다.In this case, both the forward and reverse primers may be used as terminal primers. In this case, amplification of the reassembled DNA occurs during the first PCR process for DNA reassembly. While the amount of reassembled DNA is relatively high, the reassembled DNA is amplified and a relatively large amount of reassembled DNA is generated compared to the later generated reassembled DNA, so that the distribution of the reassembled DNA is biased. There is a disadvantage.

주형으로 사용되는 단일가닥 DNA로는 이중가닥 DNA를 변성화시켜서 사용할 수도 있는데, 이와 같이 양쪽 방향의 단일가닥 DNA가 모두 포함된 반응에서는 초기단계부터 재조립이 일어나지 않은 DNA의 증폭이 일어날 수 있기 때문에 상대적으로 재조립이 일어난 DNA의 비율이 낮아지는 단점이 있다. As single-stranded DNA used as a template, double-stranded DNA can be denatured and used. In this reaction, the single-stranded DNA in both directions can be amplified without reassembly from the initial stage. As a result, the ratio of DNA reassembled is lowered.

PCR 조건은 일반적인 방법을 그대로 사용할 수 있는데, 예를 들어 본 발명의 일 실시예에서는 94℃에서 3분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 37℃ 또는 42℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 반응을 10 내지 40회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 추가로 반응시키는 방법을 사용한다. 이때, 주형 DNA와 내부 프라이머의 비율은 9:1 내지 1:9가 바람직하다.PCR conditions can be used as it is, for example, in one embodiment of the present invention after denatured at 94 ℃ 3 minutes, 30 seconds at 94 ℃, 30 seconds at 37 ℃ or 42 ℃ and 30 seconds at 72 ℃ The reaction is repeated 10 to 40 times and finally a method of further reacting at 72 ° C. is used. In this case, the ratio of the template DNA and the internal primer is preferably 9: 1 to 1: 9.

단계 2: DNA 리가아제 처리에 의한 전체 크기의 재조립 DNA 생성Step 2: full size reassembled DNA generation by DNA ligase treatment

단계 1의 PCR 반응에 의해서 말단 프라이머로부터 시작된 DNA 중합반응의 반복으로 전체 길이의 재조립된 DNA가 생성된다. 그러나, 반응용액 중에는 전체 DNA 중 일부의 염기서열만 가진 단일가닥 DNA도 존재하고 있다. 특히, 마지막 중합반응에서 하나의 주형에 대하여 여러 개의 프라이머가 부착할 경우 전체 길이의 주형에 대하여 일부의 염기서열만 가진 단일가닥 DNA가 여러 개 부착되어 있는 상태가 되는데, DNA 리가아제의 처리에 의해서 일부 길이의 단일가닥 DNA가 서로 연결되어 전체 길이의 DNA가 생성된다. 이 반응에 의해서 재조립된 DNA의 빈도를 높일 수 있다.The PCR reaction of step 1 results in the repetition of the DNA polymerization initiated from the terminal primer to produce reassembled DNA of full length. However, there is also a single-stranded DNA having only a nucleotide sequence of a part of the entire DNA in the reaction solution. In particular, when several primers are attached to one template in the last polymerization reaction, several single-stranded DNAs having only a few nucleotide sequences are attached to the full-length template. Some lengths of single-stranded DNA are linked together to produce full-length DNA. This reaction can increase the frequency of reassembled DNA.

제 3 과정: 과량의 말단 프라이머를 이용한 재조립 DNA 증폭 (2차 PCR 반응)Third Step: Reassembly DNA Amplification Using Excess Terminal Primer (Secondary PCR Reaction)

제 3 과정은 과량의 말단 프라이머를 첨가하여 제 2 과정에서 재조립된 전체 길이의 DNA를 증폭하는 과정이다. The third step is to amplify the full length DNA reassembled in the second step by adding an excess terminal primer.

상기 1차 PCR 반응에서 생성된 다양한 재조립 DNA가 말단 프라이머를 이용하여 증폭되는데, 첨가되는 말단 프라이머의 양은 반응액 50 ㎕ 당 10 pmole 내지 40 pmole이 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 25 pmole이다. PCR 조건은 일반적인 방법을 그대로 사용할 수 있는데, 예를 들어 본 발명의 일 실시예에서는 94℃에서 3분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 반응을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 추가로 반응시키는 방법을 사용한다. Various reassembled DNAs generated in the first PCR reaction are amplified using terminal primers. The amount of terminal primers added is preferably 10 pmole to 40 pmole per 50 µl of the reaction solution, and more preferably about 25 pmole. PCR conditions can be used as it is, for example, in an embodiment of the present invention after denatured for 3 minutes at 94 ℃, 30 seconds at 94 ℃, 30 seconds at 50 ℃ and 30 seconds at 72 ℃ 30 Repeated this time, and finally, a method of further reacting at 72 캜 is used.

상기와 같은 방법으로 제조된 다양한 재조립 DNA 절편들은 적당한 벡터에 도입된 후 대장균 등에 형질전환시켜 이용할 수 있다. 상기 키메라 DNA 라이브러리는 목적에 따라 효소 단백질 유전자, 프로모터, 바이러스 유전자 등 다양한 종류의 유전자에 대해 적용할 수 있다. 궁극적으로 상기 키메라 DNA 라이브러리는 원하는 특성을 갖는 유전자를 탐색하는 방향 진화 방법의 재료로서 이용된다. 즉, 다양하게 재조립된 DNA 라이브러리로부터 목적하는 특성을 갖는 유전자를 스크리닝할 수 있으며, 스크리닝 방법은 목적하는 특성에 따라 공지된 방법을 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기와 같이 제조된 키메라 DNA 라이브러리를 검색하여 목적하는 성질을 갖는 재조립 DNA를 선별하는 것을 특징으로 하는 방향 진화 (directed mutagenesis) 방법을 제공한다.Various reassembled DNA fragments prepared by the above method can be used by transforming E. coli and the like after being introduced into a suitable vector. The chimeric DNA library can be applied to various kinds of genes such as enzyme protein genes, promoters, viral genes, etc. according to the purpose. Ultimately, the chimeric DNA library is used as a material for directional evolution methods to search for genes with desired properties. That is, a gene having a desired characteristic can be screened from variously reassembled DNA libraries, and the screening method can use a known method according to the desired characteristic. Accordingly, the present invention provides a directed mutagenesis method characterized in that the reassembled DNA having the desired properties is selected by searching the chimeric DNA library prepared as described above.

한편, 이와 같이 구축된 키메라 DNA 라이브러리를 다시 출발물질로 하여 이들 키메라 DNA로부터 앞서 설명한 방법으로 새로운 키메라 DNA 라이브러리를 제작할 수도 있으며, 이러한 과정은 목적하는 특성의 유전자를 찾을 때까지 반복될 수 있다. On the other hand, using the chimeric DNA library thus constructed as a starting material, a new chimeric DNA library can also be produced from the chimeric DNA by the above-described method, and this process can be repeated until a gene of a desired characteristic is found.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> DNA 재조립을 위한 유전자 클로닝Example 1 Gene Cloning for DNA Reassembly

서로 다른 생물체에서 분리한 DNA로부터 키메라 DNA 라이브러리가 효율적으로 만들어지는지 확인하기 위하여 키티나아제 (chitinase) 유전자를 대상으로 하기와 같이 재조립 실험을 수행하였다.Reassembly experiments were performed on chitinase genes to determine whether chimeric DNA libraries are efficiently made from DNA isolated from different organisms.

먼저, 에어로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila, KCTC 2358) 및 판토에아 글로메란스 (Pantoea glomerans, KCTC 2578)로부터 게놈 DNA 프렙 킷트 (DNA prep kit, Promega사)를 이용하여 전체 핵산을 분리하였다. 키티나아제 유전자를 증폭하기 위하여 전체 50 ㎕ 용액에 대하여 주형으로서 상기에서 분리한 핵산 100 ng, 서열번호 1의 Chi600f 프라이머 25 pmole, 서열번호 2의 Chi1200r 프라이머 25 pmole, 벤트 중합효소 (Vent polymerase, NEB사) 0.005 단위 (unit), Taq 중합효소 (Bioneer사) 1 단위, dNTP 10 nmole를 혼합한 반응액을 사용하여 94℃에서 3분 동안 변성시킨 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 30초의 과정을 30회 반복하고 72℃에서 30분 동안 더 반응시켰다. PCR 증폭에 사용한 서열번호 1의 Chi600f 프라이머와 서열번호 2의 Chi1200r 프라이머는 장내세균의 키티나아제 유전자 중 염기서열이 보존된 부분을 바탕으로 설계된 것이다. 위자드 PCR 프렙 킷트 (Wizard PCR prep kit, Promega사)를 이용하여 PCR 반응물로부터 증폭된 유전자를 분리하고, 이를 T-벡터 (Promega사)에 삽입한 후 위자드 플라스미드 프렙 킷트 (Wizard PCR prep kit, Promega사)를 이용하여 정제하여 염기서열을 결정하였다.First, the whole nucleic acid was isolated from the Aeromonas hydrophila ( KCTC 2358) and Pantoea glomerans ( KCTC 2578) using a genomic DNA prep kit (DNA prep kit, Promega). To amplify the chitinase gene, 100 ng of the nucleic acid isolated above as a template for a total of 50 µl solution, 25 pmole of Chi600f primer of SEQ ID NO: 1 , 25 pmole of Chi1200r primer of SEQ ID NO: 2 , Vent polymerase (NEB) G) Denatured at 94 ° C for 3 minutes using a reaction solution containing 0.005 unit, 1 unit of Taq polymerase (Bioneer) and 10 nmole of dNTP, followed by 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 50 ° C, The procedure of 30 seconds at 72 ° C. was repeated 30 times and further reacted at 72 ° C. for 30 minutes. The Chi600f primer of SEQ ID NO: 1 and the Chi1200r primer of SEQ ID NO: 2 used for PCR amplification are designed based on the conserved portion of the chitinase gene of the intestinal bacteria. Using the Wizard PCR prep kit (Promega), the amplified gene was isolated from the PCR reaction product, inserted into the T-vector (Promega), and then the wizard plasmid prep kit (Wizard PCR prep kit, Promega) ) To determine the base sequence.

염기서열 결정 결과, 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358) 및 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578) 각각으로부터 분리된 키티나아제 DNA는 각각 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 구성되어 있음을 확인하였다. 이들 간의 염기서열 유사성을 조사한 결과 94.65% (31 bp 차이/579 bp)의 유사도를 가지고 있는 것으로 나타났다.As a result of sequencing, chitinase DNA isolated from each of Aeromonas hydrophila (KCTC 2358) and Pantoea glomerans (KCTC 2578) consists of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 , respectively. It was confirmed. The sequence similarity between them was found to have a similarity of 94.65% (31 bp difference / 579 bp).

<실시예 2> 재조립 실험 1: DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ의 적정량 조사Example 2 Reassembly Experiment 1: Investigation of Proper Amount of DNA Exonucleases VII

(2-1) 단일가닥 DNA의 생산(2-1) Production of single stranded DNA

상기 실시예 1에서 얻은 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 키티나아제 유전자를 각각 포함하는 플라스미드를 주형으로 하고 서열번호 5 및 서열번호 6의 pGTf 및 pGTr 프라이머 쌍을 이용하여 실시예 1과 동일한 PCR 반응조건에서 증폭한 후 위자드 PCR 프렙 킷트 (Wizard PCR prep kit, Promega사)로 정제하여 키티나아제 DNA를 준비하였다. pGTf 및 pGTr 프라이머는 pGEM T-벡터 (Promega사)의 다중 클로닝 부위 (multiple cloning site) 바깥쪽 부위에 대해 상보적인 염기서열을 가지고 있어서 SphI, NcoI, SpeI, NsiI을 포함하여 벡터에 포함되어 있는 다양한 제한효소 인식부위를 함께 증폭하게 된다. 에어로모나스 히드로필라와 판토에아 글로메란스로부터 각각 증폭된 키티나아제 유전자를 동량으로 합쳐서 DNA 재조립을 위한 주형 및 내부 프라이머를 만드는 재료로 이용하였다. 재조립 실험에서 주형으로 사용할 DNA는 DNA 2 ㎍당 제한효소 SphI 및 SpeI를 각각 20 단위씩 첨가하여 37℃에서 5시간 동안 처리한 후 아가로스 겔로부터 분리하였다. 분리된 DNA 0.5 ㎍당 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅲ (USB사)를 100 단위 첨가하여 30분간 처리한 후 이로부터 생성된 단일가닥 DNA는 에탄올로 침전시켜 회수하였다. 내부 프라이머로 사용할 DNA는 각 키티나아제 DNA를 제한효소 NcoⅠ 및 NsiⅠ으로 절단한 후 주형 DNA와 동일한 방법으로 처리하여 단일가닥 DNA로 만들었다 (도 3).The plasmids containing the chitinase genes of Aeromonas hydrophila (KCTC 2358) and Pantoea glomerans (KCTC 2578) obtained in Example 1 were used as templates, respectively, and pGTf and pGTr of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 Amplified under the same PCR reaction conditions as in Example 1 using a primer pair was purified by Wizard PCR prep kit (Promega, Inc.) to prepare a chitinase DNA. The pGTf and pGTr primers have base sequences complementary to the sites outside the multiple cloning site of the pGEM T-vector (Promega), and thus include Sph I, Nco I, Spe I, and Nsi I. Various restriction enzyme recognition sites included are amplified together. The same amount of chitinase genes amplified from Aeromonas hydrophila and Pantoea glomerans were combined to form a template and an internal primer for DNA reassembly. The DNA to be used as a template in the reassembly experiment was added to each of 20 units of restriction enzymes Sph I and Spe I per 2 μg of DNA and treated at 37 ° C. for 5 hours and then separated from the agarose gel. After processing for 30 minutes by adding 100 units of DNA exonuclease III (USB) per 0.5 μg of isolated DNA, single-stranded DNA was recovered by precipitation with ethanol. The DNA to be used as the internal primer was cut into each chitinase DNA with restriction enzymes Nco I and Nsi I and treated in the same manner as template DNA to make single-stranded DNA ( FIG. 3 ).

(2-2) 내부 프라이머의 제조(2-2) Preparation of Internal Primer

적정량의 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ의 양을 조사하기 위하여, 상기 (2-1)에서 제조된 내부 프라이머 제조용 단일가닥 DNA 50 ng당 1, 0.1 및 0.01 단위의 효소를 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 용액은 효소의 활성을 제거하기 위하여 90℃에서 5분간 가열하였다. In order to investigate the appropriate amount of DNA exonuclease 의, 1, 0.1 and 0.01 units of enzyme were added per 50 ng of single-stranded DNA for internal primer preparation prepared in (2-1) and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. I was. The reaction solution was heated for 5 minutes at 90 ℃ to remove the activity of the enzyme.

(2-3) 내부 프라이머를 이용한 DNA 재조립(2-3) DNA Reassembly Using Internal Primer

두 종류의 키티나아제 유전자 각각 10 ng, 말단 프라이머로서 서열번호 1의 Chi600f 프라이머와 서열번호 2의 Chi1200r 프라이머 각각 25 pmole, 상기 (2-2)에서 서로 다른 농도의 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ에 의해 생산된 각각의 내부 프라이머 5 ng을 첨가하여 PCR 반응을 실시하였다. 1차 PCR 반응은 94℃에서 30초간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 37℃ 또는 42℃에서 30초, 72℃에서 30초의 반응을 10회 반복 실시한 후 72℃에서 10분간 추가로 반응시켰다. DNA 재조립에서 DNA 연결 (ligation) 효과를 조사하기 위해서 반응액을 나누어서 DNA 리가아제 (Rapid ligation kit, Roche사)를 상온에서 5분간 처리한 실험군과 처리하지 않은 실험군을 조사하였다. DNA 재조립 실험의 실험군을 하기 표 1에 정리하였다.10 ng each of the two kinds of chitinase genes, 25 pmole of the Chi600f primer of SEQ ID NO: 1 and the Chi1200r primer of SEQ ID NO: 2 as terminal primers, respectively, by different concentrations of DNA exonuclease VII in (2-2) PCR reaction was performed by adding 5 ng of each internal primer produced. The first PCR reaction was denatured at 94 ° C. for 30 seconds and then repeated 10 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 37 ° C. or at 42 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 10 seconds, followed by further reaction at 72 ° C. for 10 minutes. In order to investigate the DNA ligation effect in DNA reassembly, the reaction solution was divided and the experimental and non-treated groups treated with DNA ligase (Rapid ligation kit, Roche) at room temperature for 5 minutes. The experimental group of the DNA reassembly experiments are summarized in Table 1 below.

실험군Experimental group 엑소뉴클리아제 Ⅶ (단위)Exonucleases Ⅶ (unit) 어닐링 온도Annealing temperature DNA 리가아제 처리DNA Ligase Treatment A1A1 1One 37℃37 ℃ ○○ A2A2 1One 37℃37 ℃ ×× A3A3 1One 42℃42 ℃ ○○ A4A4 1One 42℃42 ℃ ×× B1B1 0.10.1 37℃37 ℃ ○○ B2B2 0.10.1 37℃37 ℃ ×× B3B3 0.10.1 42℃42 ℃ ○○ B4B4 0.10.1 42℃42 ℃ ×× C1C1 0.010.01 37℃37 ℃ ○○ C2C2 0.010.01 37℃37 ℃ ×× C3C3 0.010.01 42℃42 ℃ ○○ C4C4 0.010.01 42℃42 ℃ ××

(2-4) 말단 프라이머를 이용한 재조립 DNA의 증폭(2-4) Amplification of Reassembled DNA Using Terminal Primers

상기 반응액에 서열번호 1의 Chi600f 프라이머와 서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 각각 25 pmole 추가하여 2차 PCR 증폭반응을 실시하였다. PCR 증폭은 94℃에서 3분간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 30초의 반응을 30회 반복 실시한 후 72℃에서 30분간 추가로 반응시켰다. 상기 두 단계의 PCR 반응에 의해서 생성된 약 600 bp의 DNA를 1% 아가로스 겔로부터 추출하여 T-벡터 (Promega사)에 삽입한 후 대장균 (DH5α)에 형질전환시켰다.A second PCR amplification reaction was performed by adding 25 pmole of Chi600f primer of SEQ ID NO: 1 and Chi1200r primer of SEQ ID NO: 2 to the reaction solution. PCR amplification was carried out for 30 minutes at 94 ℃, 30 seconds at 50 ℃, 30 seconds at 30 ℃, 30 seconds at 72 ℃ 30 times at 94 ℃ and then further reacted at 72 ℃ 30 minutes. About 600 bp of DNA generated by the two-step PCR reaction was extracted from a 1% agarose gel, inserted into a T-vector (Promega), and transformed into E. coli (DH5α).

(2-5) 재조립 DNA의 확인(2-5) Identification of Reassembled DNA

형질전환된 콜로니 중 각 실험군에서 임의로 4개씩을 선택하여 이들로부터 서열번호 1의 Chi600f 및 서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 이용하여 키티나아제 유전자를 증폭하였으며 증폭된 DNA를 서열번호 1의 Chi600f 및 서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열과 비교하여 DNA 재조립이 일어난 횟수를 조사하였다. 이중 DNA 재조립이 확인된 재조립 DNA 클론 중 하나인 CL1-1의 염기서열을 도 4에 나타내었다.Four randomly selected colonies from each of the transformed colonies were amplified from the Chi600f primers of SEQ ID NO: 1 and Chi1200r primers of SEQ ID NO: 2 , and the amplified DNA was subjected to Chi600f and SEQ ID NO: The base sequence was determined using the Chi1200r primer of 2 . The number of DNA reassembly occurred by comparing the determined nucleotide sequence with the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 . Duplex DNA reassembly is shown the nucleotide sequence of one of the reassembled DNA clones confirmed CL1-1 in FIG.

도 4에 나타낸 염기서열에서 점으로 표시한 것은 기준으로 사용한 클론의 염기서열과 동일한 염기서열을 의미한다. CL1-1의 경우 79번째 자리 (A→G)와 528번째 자리 (C→T)에서 단일자리 돌연변이가 일어났다. 그리고 36번째 염기와 51번째 염기 사이, 72번째 염기와 147번째 염기 사이 및 399번째 염기와 405번째 염기 사이 등 3군데에서 주형 교환이 일어나서 DNA가 재조립된 것을 확인하였다.Marked with dots in the base sequence shown in Figure 4 means the same base sequence as the base sequence of the clone used as a reference. In CL1-1, single-site mutations occurred at the 79th position (A → G) and the 528th position (C → T). And it was confirmed that the DNA was reassembled by the exchange of templates in three places, between the 36th base and the 51st base, between the 72th base and the 147th base, and between the 399th base and the 405th base.

DNA 재조립이 일어나는 효율을 알아보기 위해 각각의 실험군에서 재조립이 일어난 빈도를 조사한 결과는 다음과 같다.In order to determine the efficiency of DNA reassembly, the results of the reassembly in each experimental group were examined.

DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ의 사용량에 의한 재조립 효율 (단위: 재조립 횟수/1,000 bp)은 1 단위 사용한 경우에 1.94, 0.1 단위 사용한 경우에 0.67, 0.01 단위 사용한 경우에 0.97이었다.The reassembly efficiency (unit: number of reassembly / 1,000 bp) by the usage amount of DNA exonuclease 이었다 was 1.94 for 1 unit, 0.67 for 0.1 unit, and 0.97 for 0.01 unit.

또한, 1차 PCR 반응에서 어닐링 (annealing) 온도에 의한 재조립 효율 (단위: 재조립 횟수/1,000 bp)은 37℃에서 1.74, 42℃에서 0.39로 37℃에서 어닐링 하는 것이 재조립 빈도가 더 높았다. 1차 PCR 반응 후 연결반응 유무에 의한 재조립 효율 (단위: 재조립 횟수/1,000 bp)은 DNA 리가아제 처리시 1.37, 무처리시 1.08로 리가아제를 처리한 경우에 재조립 빈도가 더 높았다. 이는 재조립을 위한 PCR 반응이 끝난 후 한 분자의 주형 DNA에 대하여 부분적인 염기서열만 가진 여러 분자의 단일가닥 DNA가 부착되어 있으며 DNA 리가아제에 의하여 서로 연결될 수 있음을 나타낸다.In the first PCR reaction, the reassembly efficiency by the annealing temperature (unit: number of reassembly / 1,000 bp) was 1.74 at 37 ° C, 0.39 at 42 ° C, and annealing at 37 ° C was more frequent. . Reassembly efficiency (unit: number of reassembly / 1,000 bp) with or without ligation after the first PCR reaction was 1.37 when the DNA ligase treatment and 1.08 when the ligase treatment was more frequent when the ligase treatment. This indicates that after completion of the PCR reaction for reassembly, several molecules of single-stranded DNA having only a partial sequence are attached to one template DNA and can be linked to each other by DNA ligase.

이상의 결과에서 단일가닥 DNA 50 ng에 대하여 적정량의 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ은 1 단위이며 재조립을 위한 1차 PCR 반응의 어닐링 온도는 37℃가 적당하다는 것을 확인하였다. 또한, 1차 PCR 반응 후 연결반응을 수행함으로써 DNA 재조립 빈도를 높일 수 있다는 것을 확인하였다. In the above results, it was confirmed that an appropriate amount of DNA exonuclease Ⅶ is 1 unit for 50 ng of single-stranded DNA, and that the annealing temperature of the primary PCR reaction for reassembly is 37 ° C. In addition, it was confirmed that the frequency of DNA reassembly can be increased by performing the ligation reaction after the first PCR reaction.

<실시예 3> 재조립 실험 2: PCR 증폭시 적정 반응 횟수 조사Example 3 Reassembly Experiment 2: Investigation of the Number of Titration Reactions in PCR Amplification

(3-1) 주형 DNA 및 내부 프라이머의 제조(3-1) Preparation of template DNA and internal primer

주형 DNA 및 내부 프라이머의 제조는 상기 실시예 2에서 기술된 방법과 동일하게 실시하였다. 단, DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ는 1 단위/50 ng DNA로 사용하였다. Preparation of template DNA and internal primers was carried out in the same manner as described in Example 2 above. However, DNA exonuclease Ⅶ was used as 1 unit / 50 ng DNA.

(3-2) 내부 프라이머에 의한 DNA 재조립 및 과량의 말단 프라이머를 이용한 재조립 DNA 증폭(3-2) DNA Reassembly by Internal Primer and Reassembly DNA Amplification Using Excess Terminal Primer

위의 과정에서 준비된 주형 DNA 1 ng과 내부 프라이머 3 ng 및 서열번호 1의 Chi600f 프라이머 25 ng을 사용하여 DNA 재조립 반응을 수행하였다. 실시예 2에서는 DNA 재조립을 위하여 서열번호 1의 Chi600f 프라이머와 서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 모두 첨가하였으나 양쪽 말단 프라이머가 모두 첨가될 경우 초기에 생성된 재조립 DNA가 증폭되어 재조립된 DNA간에 양적 편향성이 발생할 우려가 있으므로 본 실시예에서는 서열번호 1의 Chi600f 프라이머만 첨가하여 재조립 실험을 실시하였다. 재조립 반응 및 재조립 DNA의 증폭은 실시예 2와 동일하게 수행하였다. 단, 1차 PCR 반응의 어닐링 온도는 37℃에서만 수행하였으며 재조립 반응이 끝난 용액은 DNA 리가아제를 처리하였다. 재조립 빈도에 미치는 PCR 반응 횟수의 영향을 평가하기 위하여 PCR 횟수는 10, 20 및 40회로 나누어 수행하였다.DNA reassembly was performed using 1 ng of template DNA prepared in the above process, 3 ng of internal primer and 25 ng of Chi600f primer of SEQ ID NO: 1 . In Example 2, both the Chi600f primer of SEQ ID NO: 1 and the Chi1200r primer of SEQ ID NO: 2 were added for DNA reassembly, but when both terminal primers were added, the initially generated reassembled DNA was amplified to quantitatively reassemble the DNA. Since there is a possibility that bias occurs, in this example, only the Chi600f primer of SEQ ID NO: 1 was added to perform a reassembly experiment. The reassembly reaction and amplification of the reassembled DNA were performed in the same manner as in Example 2. However, the annealing temperature of the first PCR reaction was performed only at 37 ℃ and the solution after the reassembly reaction was treated with DNA ligase. In order to evaluate the effect of the number of PCR reactions on the frequency of reassembly, PCR was performed in 10, 20 and 40 times.

(3-3) 재조립 DNA의 확인(3-3) Confirmation of Reassembled DNA

형질전환된 콜로니 중 임의로 5개를 선택하여 DNA 재조립을 확인하였으며 실험방법은 실시예 2와 동일하다. 횟수에 따른 재조립 빈도를 조사한 결과, 재조립 효율 (단위: 재조립 횟수/1,000 bp)은 10회 반응시 0.73, 20회 반응시 1.83, 40회 반응시 1.84이었다.DNA reassembly was confirmed by selecting five randomly selected transformed colonies and the experimental method is the same as in Example 2. As a result of examining the reassembly frequency according to the number of times, the reassembly efficiency (unit: number of reassembly / 1,000 bp) was 0.73 for 10 reactions, 1.83 for 20 reactions and 1.84 for 40 reactions.

위의 결과로부터 반응 횟수를 늘이면 DNA의 재조립 빈도가 높아짐을 알 수 있다. 그러나, 20회와 40회에서 큰 차이가 나지 않은 것으로 보아 반응 횟수가 20회를 넘으면 재조립에 미치는 효과가 크게 증가하지 않는 것으로 판단된다. 그러나, PCR 횟수가 재조립 빈도에 미치는 영향은 재조립 실험에 사용된 주형과 프라이머의 농도와 상호 작용하여 나타나므로 모든 조건에서 20회 반응으로 충분하다고 말할 수는 없다. 따라서, 이후의 실험에서는 재조립을 위한 PCR은 40회로 정하여서 실시하였다.From the above results, it can be seen that increasing the number of reactions increases the frequency of DNA reassembly. However, since there was no significant difference between 20 and 40 times, if the number of reactions exceeds 20, the effect on reassembly does not increase significantly. However, the effect of PCR times on the frequency of reassembly interacts with the concentrations of the template and primers used in the reassembly experiments, so that 20 reactions may not be sufficient under all conditions. Therefore, in subsequent experiments, PCR for reassembly was performed by setting 40 cycles.

<실시예 4> 재조립 실험 3: 주형과 프라이머의 적정 비율 조사Example 4 Reassembly Experiment 3: Investigation of Proper Ratio of Template and Primer

(4-1) 주형 DNA 및 내부 프라이머의 제조(4-1) Preparation of template DNA and internal primer

주형 DNA 및 내부 프라이머의 제조는 실시예 2에서 기술된 방법과 동일하게 실시하였다. 단, DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ는 1 단위/50 ng DNA로 사용하였다.Preparation of template DNA and internal primers was carried out in the same manner as described in Example 2. However, DNA exonuclease Ⅶ was used as 1 unit / 50 ng DNA.

(4-2) 내부 프라이머에 의한 DNA 재조립 및 과량의 말단 프라이머를 이용한 재조립 DNA 증폭(4-2) DNA Reassembly by Internal Primer and Reassembly DNA Amplification Using Excess Terminal Primer

DNA 재조립을 위한 1차 PCR은 실시예 3과 동일하게 수행하였다. 단, 반응 횟수는 40회로 고정하였으며 주형과 내부 프라이머의 양이 재조립 효율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 주형과 프라이머의 양을 90 ng/10 ng, 30 ng/10 ng, 10 ng/10 ng, 10 ng/30 ng, 10 ng/90 ng으로 구분하여 1차 PCR 반응을 수행하였다.Primary PCR for DNA reassembly was performed in the same manner as in Example 3. However, the number of reactions was fixed at 40 times, and the amount of template and primer was changed to 90 ng / 10 ng, 30 ng / 10 ng, 10 ng / 10 ng, to investigate the effect of template and internal primer on reassembly efficiency. The first PCR reaction was performed by dividing into 10 ng / 30 ng and 10 ng / 90 ng.

(4-3) 재조립 DNA의 확인(4-3) Confirmation of Reassembled DNA

형질전환된 콜로니 중 임의로 5개를 선택하여 DNA 재조립을 확인하였으며 실험방법은 실시예 2와 동일하다. 주형과 내부 프라이머의 양에 따른 재조립 빈도 (단위: 재조립 횟수/1,000 bp)를 조사한 결과, 주형 90 ng/프라이머 10 ng의 경우에는 1.86, 주형 30 ng/프라이머 10 ng의 경우에는 2.98, 주형 10 ng/프라이머 10 ng의 경우에는 1.49, 주형 10 ng/프라이머 30 ng의 경우에는 5.52이었고, 주형 10 ng/프라이머 90 ng의 경우에는 2차 PCR 반응에서 원래 크기의 DNA가 합성되지 않았다.DNA reassembly was confirmed by selecting five randomly selected transformed colonies and the experimental method is the same as in Example 2. The reassembly frequency (unit: number of reassembly / 1,000 bp) according to the amount of template and internal primers was determined, 1.86 for template 90 ng / primer 10 ng, 2.98 for template 30 ng / primer 10 ng, 10 ng / primer 10 ng was 1.49, template 10 ng / primer 30 ng was 5.52, and template 10 ng / primer 90 ng did not synthesize DNA of the original size in the second PCR reaction.

위의 결과로부터 주형 DNA의 양이 10 ng이고 프라이머의 양이 30 ng일 경우에 재조립 빈도가 가장 높음을 확인할 수 있다. 또한, 조사한 모든 클론이 재조립 클론으로서 이종 DNA간에 주형교환이 매우 원활하게 이루어짐을 알 수 있다. 이러한 결과는 기존의 DNA 재조립 방법들이 매우 짧은 부분에서 이루어지는 상보성 결합에 의존하는 반면, 본 발명의 재조립 방법에서는 말단 프라이머로부터 합성되기 시작한 단일가닥 DNA가 전체적으로 주형 DNA와 상보적 결합을 이루어 이종 DNA와 결합할 가능성이 높기 때문이라고 판단된다. From the above results, it can be seen that the reassembly frequency is highest when the amount of template DNA is 10 ng and the amount of primer is 30 ng. In addition, it can be seen that all of the clones examined were reassembled clones and the template exchange between heterologous DNAs was very smooth. These results rely on the complementary binding of the existing DNA reassembly methods in a very short part, whereas in the reassembly method of the present invention, single-stranded DNA, which has been synthesized from the terminal primers, is complementary to the template DNA as a whole and is heterologous DNA. This is because it is highly likely to combine with.

본 실시예를 통해 주형 DNA당 내부 프라이머의 비율이 높아질수록 재조립 빈도가 높아지는 것을 알 수 있는데, 이는 주형 DNA와 프라이머의 비율을 조절하면 재조합이 일어나는 빈도를 조절할 수 있음을 나타내는 것이다. 주형 대 프라이머가 1:9인 실험에서는 마지막 단계에서 유전자가 증폭되지 않았는데, 이는 재조립 단계에서 내부 프라이머의 방해로 인하여 전체 크기를 가진 재조립 DNA가 생성되지 않았기 때문이라고 판단된다. 그러나, 반복 실험을 통해서 1:9의 비율에서 전체 크기의 DNA가 생성되는 경우도 있기 때문에 이 비율이 최대 비율의 프라이머 양이라고 판단된다.In this example, it can be seen that as the ratio of the internal primer per template DNA increases, the reassembly frequency increases, indicating that the recombination can be controlled by adjusting the ratio of the template DNA and the primer. In the experiment with template versus primer 1: 9, the gene was not amplified at the last stage, because the reassembly stage did not produce the full sized reassembled DNA due to internal primer interference. However, it is judged that this ratio is the maximum ratio of primer amount because the DNA of full size may be produced at a ratio of 1: 9 through repeated experiments.

<실시예 5> 재조립 실험 4: 이중가닥 DNA의 변성화로 주형과 내부 프라이머 제조Example 5 Reassembly Experiment 4: Preparation of Template and Internal Primer by Denatured Double-stranded DNA

상기 실시예 1 내지 4에서는 주형 DNA를 한쪽 방향성의 단일가닥으로 제조하였고 내부 프라이머는 이와 상보적인 염기서열을 가진 단일가닥 DNA를 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ로 절단하여 준비하였다. 이 경우 1차 PCR 반응에서 내부 프라이머와 같은 방향의 말단 프라이머만 첨가하게 되면 재조립이 일어나지 않은 DNA의 생성이 억제된다는 장점이 있다. 그러나, 주형과 내부 프라이머를 준비하는 단계가 복잡하기 때문에 이를 단순화시키기 위하여 이중가닥 DNA를 가열한 후 급격히 냉각시켜 변성시킨 후 이를 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ로 절단하여 내부 프라이머를 준비하는 방법에 대해서 조사하였다.In Examples 1 to 4, the template DNA was prepared in one unidirectional single strand, and the internal primer was prepared by cutting single-stranded DNA having a nucleotide sequence complementary thereto with DNA exonuclease Ⅶ. In this case, the addition of only the terminal primer in the same direction as the inner primer in the first PCR reaction has the advantage that the generation of DNA without reassembly is suppressed. However, since the steps for preparing the template and the internal primer are complicated, the method for preparing the internal primer by heating the double-stranded DNA, rapidly cooling the denaturation, and cutting it with DNA exonuclease 위하여 for the sake of simplicity is investigated. It was.

(5-1) 주형 DNA 및 내부 프라이머의 제조(5-1) Preparation of template DNA and internal primer

상기 실시예 1에서 얻은 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 키티나아제 유전자를 각각 포함하는 플라스미드를 주형으로 하고 서열번호 5 및 서열번호 6의 pGTf 및 pGTr 프라이머 쌍을 이용하여 실시예 1과 동일한 PCR 반응조건에서 증폭한 후 위자드 PCR 프렙 킷트 (Wizard PCR prep kit, Promega사)로 정제하여 키티나아제 DNA를 준비하였다. 내부 프라이머는 동일하게 준비된 DNA를 95℃에서 10분간 가열한 후 얼음으로 급격하게 냉각시켜 변성화시킨 후 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ를 처리하여 준비하였다.The plasmids containing the chitinase genes of Aeromonas hydrophila (KCTC 2358) and Pantoea glomerans (KCTC 2578) obtained in Example 1 were used as templates, respectively, and pGTf and pGTr of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 Amplified under the same PCR reaction conditions as in Example 1 using a primer pair was purified by Wizard PCR prep kit (Promega, Inc.) to prepare a chitinase DNA. Internal primers were prepared by heating DNA for 10 minutes at 95 ° C. for 10 minutes and then denaturing by rapidly cooling with ice, followed by treatment with DNA exonuclease Ⅶ.

(5-2) 내부 프라이머에 의한 DNA 재조립 및 과량의 말단 프라이머를 이용한 재조립 DNA 증폭(5-2) DNA Reassembly by Internal Primer and Reassembly DNA Amplification Using Excess Terminal Primer

DNA 재조립 및 재조립된 DNA의 증폭은 실시예 4와 동일하게 수행하였다. 단, 주형과 내부 프라이머의 비율은 0 ng/10 ng, 1 ng/10 ng, 4 ng/10 ng, 10 ng/10 ng으로 조정하였으며 1차 PCR 반응에서 서열번호 1의 Chi600f 프라이머와 서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 모두 첨가하였다.DNA reassembly and amplification of the reassembled DNA were performed in the same manner as in Example 4. However, the ratio of template to internal primers was adjusted to 0 ng / 10 ng, 1 ng / 10 ng, 4 ng / 10 ng, 10 ng / 10 ng, and the Chi600f primer of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the first PCR reaction. All Chi1200r primers were added.

(5-3) 재조립 DNA의 확인(5-3) Confirmation of Reassembled DNA

형질전환된 콜로니 중 임의로 5개를 선택하여 DNA 재조립을 확인하였으며 실험방법은 실시예 2와 동일하다. 주형과 내부 프라이머의 양에 따른 재조립 빈도 (단위: 재조립 횟수/1,000 bp)를 조사한 결과, 주형 0 ng/프라이머 10 ng인 경우에는 3.85, 주형 1 ng/프라이머 10 ng인 경우에는 2.20, 주형 4 ng/프라이머 10 ng인 경우에는 1.11, 주형 10 ng/프라이머 10 ng인 경우에는 2.33이었다.DNA reassembly was confirmed by selecting five randomly selected transformed colonies and the experimental method is the same as in Example 2. The reassembly frequency (unit: number of reassembly / 1,000 bp) according to the amount of template and internal primer was examined.The result was 3.85 for template 0 ng / primer 10 ng, 2.20 for template 1 ng / primer 10 ng, and It was 1.11 for 4 ng / primer 10 ng and 2.33 for 10 ng template / primer 10 ng.

위의 결과로부터 주형 DNA와 내부 프라이머를 단일가닥으로 분리하지 않은 상태에서도 DNA 재조립이 일어난다는 것을 확인할 수 있으며 주형의 양이 늘어날수록 재조립 빈도가 낮아진다는 것을 알 수 있다. 주형을 첨가하지 않은 상태에서 재조립이 일어나는 이유는 이중가닥 DNA를 변성화시키는 과정에서 일부의 DNA는 이중가닥을 유지하기 때문이라고 판단된다. 이는 이중가닥 DNA만 검출하는 형광검출기 (fluorometer) 검측에서 상당량의 흡광도를 나타내는 것으로부터 확인할 수 있다.From the above results, it can be seen that DNA reassembly occurs even when the template DNA and the internal primer are not separated into single strands, and as the amount of the template increases, the frequency of reassembly decreases. The reason for the reassembly without the addition of the template is that some DNA retains the double strand in the process of denatured double stranded DNA. This can be confirmed by showing a considerable amount of absorbance in the detection of a fluorometer detecting only double stranded DNA.

전체 염기서열 중 재조립이 일어난 위치에 대한 편향성이 있는지 조사하기 위하여, 두 종류의 유전자간에 염기서열이 다른 위치를 기준으로 각 구간에서 재조립이 발생한 횟수를 조사하고 이를 각 구간의 염기서열 갯수로 나눈 값을 구하여 이를 도 5에 표시하였다. 각 염기서열 구간마다 재조립이 일어나는 빈도에 있어서 차이는 있으나 전체 구간에 대해서 비교적 일정한 수준으로 재조립이 발생한 것으로 나타났으며, 이는 서로 다른 염기서열을 가진 DNA간 재조립 라이브러리를 작성하는데 있어서 매우 큰 장점이 된다.In order to investigate whether there is a bias toward the position where reassembly occurred among the entire nucleotide sequences, the number of reassembly occurred in each section based on the positions of the different nucleotide sequences between the two types of genes is determined and the number of nucleotide sequences in each section is determined. The divided value was obtained and shown in FIG. 5 . Although there was a difference in the frequency of reassembly in each nucleotide sequence, the reassembly occurred at a relatively constant level for the entire interval, which is very large in preparing a DNA reassembly library having different nucleotide sequences. It is an advantage.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 재조립 DNA 라이브러리 제조방법은 매우 간편한 방법으로 내부 프라이머를 제조하고 이를 이용하여 높은 효율로 재조립을 발생시키는 장점을 가지고 있다. 따라서, 효소 유전자, 프로모터, 바이러스 등 각종 DNA 염기서열간의 재조립을 유발하여 유용한 특성을 가지는 유전자를 얻는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the reassembled DNA library manufacturing method of the present invention has an advantage of producing an internal primer in a very simple manner and generating reassembly with high efficiency using the same. Therefore, it can be very useful for obtaining genes having useful properties by causing reassembly between various DNA sequences such as enzyme genes, promoters, viruses, and the like.

도 1은 본 발명의 재조립 DNA 형성 방법에 있어서, 단일가닥으로 만들어진 이종 DNA에 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ (Exonuclease Ⅶ)을 처리하여 25 bp 이하의 올리고뉴클레오티드를 제조하는 단계 (단계 1) 및 이를 프라이머 및 DNA 중합반응의 방해자로 하고 이종 DNA 단일가닥을 주형으로 하며 주형에 상보적인 말단 프라이머를 이용하여 중합효소 반응을 통해 재조립 DNA 가닥을 생성시키는 단계 (단계 2)를 나타낸 것이고, 1 is a method for forming a reassembled DNA of the present invention, a method for preparing oligonucleotides of 25 bp or less by treating DNA exonucleases 에 (Exonuclease 에) on heterologous DNA made of single strands (step 1) and the same A step of generating reassembled DNA strands through a polymerase reaction using a primer primer and a heterologous DNA single strand as a template and a terminal primer complementary to the template.

도 2는 도 1의 단계 2)를 보다 상세히 나타낸 것으로, 이종 DNA를 주형으로 하고 내부 프라이머 및 말단 프라이머를 이용하여 재조립 DNA가 생성되는 과정을 나타낸 것이고, 2 is of FIG. 1 Step 2) is shown in more detail, which shows a process in which heterologous DNA is used as a template and reassembled DNA is generated using internal primers and terminal primers.

도 3은 본 발명의 재조립 DNA 형성방법에 의해 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 키티나아제 유전자로부터 재조립 DNA를 제조하는 과정을 나타낸 것이고, FIG. 3 shows a process for preparing reassembled DNA from chitinase genes of aeromonas hydrophila (KCTC 2358) and pantoea glomerans (KCTC 2578) by a method for forming reassembled DNA of the present invention.

도 4는 도 3의 과정에 의해 제조된 재조립 DNA로 대장균을 형질전환시킨 후 재조립이 일어난 클론 CL1-1을 선별하여 재조립 키티나아제 DNA와 천연형 키티나아제 유전자의 염기서열을 비교한 결과이고, Figure 4 shows the comparison of the nucleotide sequence of the reassembled chitinase DNA and the natural type chitinase gene by selecting the clone CL1-1 that has been reassembled after transforming Escherichia coli with the reassembled DNA prepared by the process of FIG. One result,

도 5는 두 종류의 유전자간에 염기서열이 다른 위치를 기준으로 각 구간에서 재조립이 발생한 횟수를 조사하고 이를 각 구간의 염기서열 갯수로 나눈 값을 도표로 표시한 것이다. FIG. 5 is a graph showing the number of reassembly occurrences in each section based on the positions of different sequences between two types of genes, and the values divided by the number of sequences in each section.

<110> HONG, Soon Gyu MicroID Co., Ltd <120> METHOD FOR CONSTRUCTING A CHIMERIC DNA LIBRARY USING EXONUECLEASE VII <130> FPD/200111/0083 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Chi600f <400> 1 ggcatcaacg acagcntnaa ag 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Chi1200r <400> 2 gtcntagctc atcaggaaga tg 22 <210> 3 <211> 579 <212> DNA <213> Aeromonas hydrophila <400> 3 ggcatcaacg acagcctcaa agagatctca ggcagtttcg aggcgctgca acgctcctgc 60 gccgggcgcg aagacttcaa ggtctccatc cacgatccct gggccgccat ccagatgggg 120 cagggcaatc tcaccgccta tgacgagccc tacaagggca acttcggcaa cctgatggcg 180 ctcaagaagg cctatccgga cctgaaaatt ctcccctcca tcggcggttg gaccctctcc 240 gaccccttct tcttcttcgg tgacaagacc aagcgcgaca ccttcgtcgc ctcggtgaag 300 gagtacctgc agacctggaa attcttcgac ggggtggaca tcgactggga gttcccgggc 360 ggtctggggg ccaaccccaa cctcggcagc gcctccgatg gcgagaccta tgtgcccctg 420 atgaaggagt tgcgcgccat gctcgacgag ctgagcgcag agacgggtcg cacctacgag 480 ctcacctccg ccatcagcgc cggcggtgac aagattgcca aggtggacta tcgcgccgcc 540 cagcaataca tgaatcacat cttcctgatg agctaagaa 579 <210> 4 <211> 579 <212> DNA <213> Pantoea glomerans <400> 4 ggcatcaacg acagcgttaa agagatctcc ggcagcttcg aggcgctgca gcgctcctgt 60 gccggccgcg aggacttcaa ggtctccatc cacgatccct gggccgccat ccagatgggg 120 cagggcaatc tcaccgccta tgacgaaccc tacaagggca acttcggcaa cctgatggcg 180 ctcaagaagg cctatccgga cctgaagatc ctcccctcca tcggtggctg gaccccctcc 240 gatcccttct tcttcttcgg tgacaagacc aaacgcgaca ccttcgtcgc ctcggtgaag 300 gagtatctgc aaacctggaa attcttcgac ggggtggaca tcgactggga attcccgggt 360 ggcctggggg ccaaccccaa cctcggcagc gcctccgacg gcgaaaccta tgtgctgctg 420 atgaaggagc tgcgcgccat gctcgacgaa ctgagcgcag agaccggccg cacctacgag 480 ctcacctccg ccatcagcgc tggcggtgac aagattgcca aggtggacta tcgcgccgcc 540 cagcaataca tgaatcacat cttcctgatg agctaagac 579 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pGTf <400> 5 tacgactcac tatagggcga 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pGTr <400> 6 ctcaagctat gcatccaacg c 21 <210> 7 <211> 545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reassembly DNA clone CL1-1 <400> 7 ccggcagctt cgaggcgctg caacgctcct gcgccgggcg cgaagacttc gaggtctcca 60 tccacgatcc ctgggccgcc atccagatgg ggcagggcaa tctcaccgcc tatgacgaac 120 cctacaaggg caacttcggc aacctgatgg cgctcaagaa ggcctatccg gacctgaaga 180 tcctcccctc catcggtggc tggaccccct ccgatccctt cttcttcttc ggtgacaaga 240 ccaaacgcga caccttcgtc gcctcggtga aggagtatct gcaaacctgg aaattcttcg 300 acggggtgga catcgactgg gaattcccgg gtggcctggg ggccaacccc aacctcggca 360 gcgcctccga cggcgagacc tatgtgcccc tgatgaagga gttgcgcgcc atgctcgacg 420 agctgagcgc agagacgggt cgcacctacg agctcacctc cgccatcagc gccggcggtg 480 acaagattgc caaggtggat tatcgcgccg cccagcaata catgaatcac atcttcctga 540 tgagc 545<110> HONG, Soon Gyu MicroID Co., Ltd <120> METHOD FOR CONSTRUCTING A CHIMERIC DNA LIBRARY USING EXONUECLEASE VII <130> FPD / 200111/0083 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Chi600f <400> 1 ggcatcaacg acagcntnaa ag 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Chi1200r <400> 2 gtcntagctc atcaggaaga tg 22 <210> 3 <211> 579 <212> DNA <213> Aeromonas hydrophila <400> 3 ggcatcaacg acagcctcaa agagatctca ggcagtttcg aggcgctgca acgctcctgc 60 gccgggcgcg aagacttcaa ggtctccatc cacgatccct gggccgccat ccagatgggg 120 cagggcaatc tcaccgccta tgacgagccc tacaagggca acttcggcaa cctgatggcg 180 ctcaagaagg cctatccgga cctgaaaatt ctcccctcca tcggcggttg gaccctctcc 240 gaccccttct tcttcttcgg tgacaagacc aagcgcgaca ccttcgtcgc ctcggtgaag 300 gagtacctgc agacctggaa attcttcgac ggggtggaca tcgactggga gttcccgggc 360 ggtctggggg ccaaccccaa cctcggcagc gcctccgatg gcgagaccta tgtgcccctg 420 atgaaggagt tgcgcgccat gctcgacgag ctgagcgcag agacgggtcg cacctacgag 480 ctcacctccg ccatcagcgc cggcggtgac aagattgcca aggtggacta tcgcgccgcc 540 cagcaataca tgaatcacat cttcctgatg agctaagaa 579 <210> 4 <211> 579 <212> DNA <213> Pantoea glomerans <400> 4 ggcatcaacg acagcgttaa agagatctcc ggcagcttcg aggcgctgca gcgctcctgt 60 gccggccgcg aggacttcaa ggtctccatc cacgatccct gggccgccat ccagatgggg 120 cagggcaatc tcaccgccta tgacgaaccc tacaagggca acttcggcaa cctgatggcg 180 ctcaagaagg cctatccgga cctgaagatc ctcccctcca tcggtggctg gaccccctcc 240 gatcccttct tcttcttcgg tgacaagacc aaacgcgaca ccttcgtcgc ctcggtgaag 300 gagtatctgc aaacctggaa attcttcgac ggggtggaca tcgactggga attcccgggt 360 ggcctggggg ccaaccccaa cctcggcagc gcctccgacg gcgaaaccta tgtgctgctg 420 atgaaggagc tgcgcgccat gctcgacgaa ctgagcgcag agaccggccg cacctacgag 480 ctcacctccg ccatcagcgc tggcggtgac aagattgcca aggtggacta tcgcgccgcc 540 cagcaataca tgaatcacat cttcctgatg agctaagac 579 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pGTf <400> 5 tacgactcac tatagggcga 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pGTr <400> 6 ctcaagctat gcatccaacg c 21 <210> 7 <211> 545 <212> DNA <213> Artificial 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Claims (15)

둘 이상의 이종 DNA를 주형으로 하고 이에 상보적인 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄반응에 의해 키메라 DNA 라이브러리를 제조하는 방법에 있어서, 주형 DNA와 상보적인 염기서열을 가진 단일가닥 DNA의 절단에 의해서 생성된 올리고뉴클레오티드가 내부 프라이머로 작용함과 동시에 말단 프라이머로부터 시작된 DNA 중합반응의 방해자로 작용하여 변성화, 혼성화, 중합반응의 연쇄반응 동안 전체 길이의 이종 DNA간에 주형교환을 하면서 DNA 중합반응을 일으키는, 키메라 DNA 라이브러리의 제조방법.In a method for preparing a chimeric DNA library by polymerase chain reaction using two or more heterologous DNA as templates and using complementary primers, oligos produced by cleavage of single-stranded DNA having complementary sequences with template DNA. Chimeric DNA, which acts as an internal primer and at the same time acts as a blocker of DNA polymerization initiated from terminal primers, causing DNA polymerization by exchanging templates between heterologous DNA of full length during denaturation, hybridization, and chain reaction of polymerization. Method of Making Library. 제 1항에 있어서,The method of claim 1, 1) 둘 이상의 이종 DNA 이중가닥으로부터 단일가닥 DNA를 각각 제조하는 단계; 1) preparing single-stranded DNA from two or more heterologous DNA double strands, respectively; 2) 단일가닥으로 만들어진 이종 DNA 중 동일한 한쪽 방향을 갖는 DNA들을 단일가닥 특이적인 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅶ로 절단하여 올리고뉴클레오티드를 생산하는 단계; 2) producing oligonucleotides by cleaving DNAs having the same one direction among single stranded heterologous DNA with single strand specific DNA exonuclease 아제; 3) 상기 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 내부 프라이머 및 DNA 중합반응의 방해자로 하고, 단계 1)에서 제조된 상보적인 방향을 갖는 이종 DNA 단일가닥들을 주형으로 하며 말단 프라이머를 첨가하여 변성화, 혼성화, 중합반응을 반복함으로써 말단 프라이머로부터 합성된 DNA가 프라이머로 작용하여 매 사이클마다 이종 DNA간에 주형을 교환하여 길이가 신장된 재조립 DNA 가닥을 만드는 단계; 및3) Degenerate, hybridize, and polymerize the single-stranded oligonucleotide as an interrupter of the internal primer and the DNA polymerization, and the heterologous DNA single-strands having the complementary orientation prepared in step 1) as a template, and by adding the terminal primer. Repeating the above, wherein the DNA synthesized from the terminal primer acts as a primer, exchanging the template between heterologous DNA every cycle, thereby making the reassembled DNA strand elongated; And 4) 재조립하고자 하는 유전자의 양쪽말단 부분의 염기서열에 해당하는 말단 프라이머를 첨가하여 PCR로 재조립 DNA를 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.4) A method for producing a method comprising the step of amplifying the reassembled DNA by PCR by adding a terminal primer corresponding to the nucleotide sequence of both ends of the gene to be reassembled. 제 2항에 있어서, The method of claim 2, 단계 1)에서 DNA 단일가닥이 DNA 이중가닥의 한쪽 말단에는 5' 돌출부 (overhang)를 만드는 제한효소로 절단하고 다른 한쪽 말단에는 3' 돌출부를 만드는 제한효소로 절단한 후 DNA 엑소뉴클리아제 Ⅲ로 절단하여 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법.In step 1), the DNA single strand is cut with a restriction enzyme that creates a 5 'overhang at one end of the DNA double strand and a restriction enzyme that produces a 3' overhang at the other end, followed by DNA exonuclease III. Manufacturing method characterized in that it is produced by cutting. 제 2항에 있어서, The method of claim 2, 단계 1)에서 DNA 단일가닥이 PCR 증폭시 첨가하는 프라이머의 양을 다르게 하여 단일 가닥의 DNA를 생산하는 비대칭 PCR을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법.The method of claim 1, wherein the DNA single strand is prepared by asymmetric PCR to produce a single strand of DNA by varying the amount of primer added during PCR amplification. 제 2항에 있어서, The method of claim 2, 단계 1)에서 DNA 단일가닥이 이중가닥 DNA를 가열한 후 급격한 냉각에 의해서 변성시켜서 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법.In step 1) the DNA single strand is prepared by heating the double-stranded DNA and then denaturing by rapid cooling. 제 2항에 있어서, The method of claim 2, 단계 2)에서 DNA 절단효소가 0.01 내지 10 단위/50 ng DNA의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.In step 2), the DNA cleavage enzyme is used, characterized in that used at a concentration of 0.01 to 10 units / 50 ng DNA. 제 2항에 있어서, The method of claim 2, 단계 3)의 PCR 반응시 37℃ 내지 42℃에서 어닐링 (annealing)하는 것을 특징으로 하는 제조방법.Method of annealing (annealing) at 37 ℃ to 42 ℃ during the PCR reaction of step 3). 제 2항에 있어서, The method of claim 2, 단계 3)에서 PCR 반응을 10 내지 40회 반복하는 것을 특징으로 하는 제조방법.Method 3, characterized in that repeating the PCR reaction 10 to 40 times in step 3). 제 2항에 있어서, The method of claim 2, 단계 3)의 PCR 반응에서 주형과 내부 프라이머의 비율이 9:1 내지 1:9인 것을 특징으로 하는 제조방법.In the PCR reaction of step 3), the ratio of the template and the internal primer is 9: 1 to 1: 9 characterized in that the production method. 제 2항에 있어서, The method of claim 2, 단계 4)에서 말단 프라이머를 PCR 반응액 50 ㎕당 10 내지 40 pmole 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.In step 4), the terminal primer is added at a concentration of 10 to 40 pmole per 50 μl PCR reaction solution. 제 2항에 있어서, The method of claim 2, 단계 3) 이후에 DNA 리가아제를 처리하여 부분적인 염기서열을 가지는 DNA를 접합시켜 길이가 신장된 재조립 DNA 가닥을 만드는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.And after step 3) treating the DNA ligase to conjugate DNA having a partial nucleotide sequence to form an extended reassembled DNA strand. 제 2항에 있어서, The method of claim 2, 단계 4) 이후에 증폭된 재조립 DNA로 원핵생물 또는 진핵세포를 형질전환시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.And step 4) further comprising transforming prokaryotic or eukaryotic cells with the amplified reassembled DNA. 제 2항에 있어서, The method of claim 2, 단계 1) 및 2)의 과정에 의해서 생성되는 내부 프라이머 대신 주형과 상보적인 염기서열을 갖도록 인공적으로 합성된 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.Production method characterized in that to use a primer artificially synthesized to have a base sequence complementary to the template instead of the internal primer produced by the process of steps 1) and 2). 제 1항의 방법으로 만들어진 키메라 DNA 라이브러리를 검색하여 목적하는 성질을 갖는 재조립 DNA를 선별하는 것을 특징으로 하는 방향 진화 (directed mutagenesis) 방법.Directed mutagenesis method characterized in that to search for a chimeric DNA library made by the method of claim 1 to reassemble the DNA having the desired properties. 제 14항에 있어서, The method of claim 14, 키메라 DNA 라이브러리로부터 선별되는 서로 다른 재조립 DNA를 출발물질로 하여 제 1항의 단계들을 반복하는 것을 특징으로 하는 방향 진화 방법.A method of directional evolution comprising repeating the steps of claim 1 using different reassembled DNAs selected from chimeric DNA libraries as starting materials.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014123293A1 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 주식회사 엔지노믹스 Method for adjusting length of single strand at end of double-stranded dna

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101587884B1 (en) * 2014-06-11 2016-01-28 순천향대학교 산학협력단 NbO Method for Preparing of Etched NbO as Negative Electrode Material for Lithium-ion Secondary Battery
CN113337487B (en) * 2021-02-09 2022-07-01 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 Enzyme composition for nucleic acid fragmentation and application thereof
WO2022177273A1 (en) * 2021-02-18 2022-08-25 서울대학교산학협력단 Method for purifying nucleic acid library

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5830721A (en) * 1994-02-17 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. DNA mutagenesis by random fragmentation and reassembly
US6153410A (en) * 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
KR20020089638A (en) * 2001-05-23 2002-11-30 홍순규 Method for constructing a chimeric dna library using a single strand specific dnase

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5830721A (en) * 1994-02-17 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. DNA mutagenesis by random fragmentation and reassembly
US6153410A (en) * 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
KR20020089638A (en) * 2001-05-23 2002-11-30 홍순규 Method for constructing a chimeric dna library using a single strand specific dnase

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Curr Opin Chem Biol. 1999 Jun;3(3):284-90.요약,Fig.1,Fig.2 *
Exonuclease VII of Escherichia coli.,Basic Life Sci. 1975;5A:225-34 *
Nature. 1994 Aug 4;370(6488):389-91 *
Nucleic Acids Res. 1997 Mar 15;25(6):1307-8.,Dnase I로 절편을 만들고 이를 PCR방법을 통해 다시 결합시키는 과정의 DNA shuffling *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014123293A1 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 주식회사 엔지노믹스 Method for adjusting length of single strand at end of double-stranded dna

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