KR100469481B1

KR100469481B1 - 유류분해능을 가진 아시네토박터 속 균주

Info

Publication number: KR100469481B1
Application number: KR10-2003-0034068A
Authority: KR
Inventors: 이우범; 박종천; 김종오; 임은태; 이원준
Original assignee: 임은태; 이우범; 박종천; 이원준; 김종오
Priority date: 2003-05-28
Filing date: 2003-05-28
Publication date: 2005-01-31
Also published as: KR20040102555A

Abstract

본 발명은 유류오염 토양에서 분리한 균주들을 농화배양시켜 DCPIP 시험을 거쳐 유류분해 균주를 일차 선별한 다음, 상기 유류분해 균주 중에서 유류를 유일한 탄소원으로 하는 조건에서 빠른 성장을 보이는 것을 특징으로 하는 유류분해 균주 균주 아시네토박터 바우마니/칼코아세티커스 N(Acinetobacter baumanii/calcoaceticusN)에 관한 것으로, 본 발명 균주는 다양한 종류의 유류에 오염된 토양을 안정적이고 환경친화적으로 정화하는데 현저한 효과가 있다.

Description

유류분해능을 가진 아시네토박터 속 균주 {Acinetobacter baumanii/calcoaceticus N being able to decompose oil}

본 발명은 유류분해능을 가진 새로운 아시네토박터 속 균주에 관한 것으로,더욱 자세하게는 석유화학공단 및 주변 토양에서 분리된 유류분해능이 우수한 아시네토박터 바우마니/칼코아세티쿠스(Acinetobacter baumanii/calcoaceticus) N 균주에 관한 것이다.

각종 유해물질에 의한 토양오염은 대기나 수질오염에 비하여 확산속도는 낮은 반면, 오염지역과 인근 지역에 미치는 영향은 다양하고 지속적이어서 그 심각성은 날로 커지고 있다. 더욱이, 대부분의 토양오염은 지하수 오염과 연계되므로 예상보다 광범위한 지역에 영향을 미칠 수 있다. 또한 유체상태의 가스나 액체와는 달리 고체상태의 토양은 공학적으로 다루기가 복잡하기 때문에, 일단 오염된 토양을 정화하기 위해서는 많은 시간과 비용이 요구되며 정화기술면에서도 대기오염이나 수질오염과는 다른 접근 방법이 필요하다.

특히 원유는 여러가지 탄화수소 화합물(방향족 및 지방족)을 포함하고 있는데 그 중 방향족 탄화수소(벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 스틸렌, 벤조피렌 등)는 미국 환경청에서 규정한 유해 독성화합물질로서 검출빈도가 높은 주요 오염물질로 분류되는 휘발성 유기화합물(volatile organic compounds, 이하 VOC라 칭한다)에 속한다. 실제로 1989년 미국 알래스카주에서 발생한 원유 유출사고를 보면, 미국 정유회사인 엑손(Exxon)의 유조선이 천백만 갤론의 원유를 유출시켰는데 그 중 25%가 방향족 탄화수소였다. 이러한 방향족 탄화수소는 독성이 높고 분해속도가 느린 특징을 가지고 있다.

실험실 연구에서 방향족 화합물의 생분해에 대한 생화학적 연구결과를 보면, 기존에 개발된 대부분의 균주들은 실험실 조건에서만 유류분해 능력을 인정받은 것이 대부분이며 또한 한 종의 미생물이 단일 화합물만을 분해하는 특성을 지니고 있다. 그러나 실제로 유류에는 여러가지 방향족 화합물이 혼합되어 있고, 유류에 의한 오염은 실험실 환경과는 달리 고농도의 유류에 의해 지속적으로 나타나는 경우가 많다. 또한 이러한 미생물의 유류 분해를 촉진하기 위해서는 영양물질(fertilizer) 및 생육조건(pH, 산소, 온도) 등이 조절되어야 하며, 현장의 환경요건도 고려되어야 한다.

현재, 미국 등지에서는 이러한 문제의 해결방안으로 미생물 생육조건의 확립 및 방향족 화합물의 생화학적 대사과정 규명과 더불어 여러가지 화합물을 동시에 처리하는 유전공학적 기법을 이용한 균종개발, 영양물질의 2차 오염에 의한 영향 조사 및 적절한 영양물질의 개발이 진행되고 있으나, 결과에 대한 성과는 미지수로 남아 있는 실정이다.

유류오염에 대한 생물학적정화(bioremediation) 방법은 1989년 발생한 엑손사의 기름 유출사고를 계기로 1990년부터 급속도로 발전하였다. 당시 엑손사는 많은 인원을 동원하여 1,000 마일에 이르는 해안선을 덮고 있던 기름을 흡착포, 유화제, 고압물대포 등을 사용하는 방법으로 제거하고자 시도하였다. 그러나 엄청난 비용과 시간을 낭비하면서도 이러한 방법들로는 다양한 양상을 나타내는 유류 오염을 효율적으로 정화할 수 없었다. 이에 따라 엑손은 토착미생물을 유류오염제거에 활용하기로 결정하고, 영양염류액을 오염지역에 살포하여 탄화수소를 분해하는 토착미생물을 활성화시킴으로써 약 2년 만에 오염된 해안선을 정화하는데 성공하였다. 이 같은 생물학적정화 방법을 적용함으로써 오염정화에 소요된 기간은 다른 물리·화학적 방법과 비교해 1/5로 줄어들었고 비용도 대폭 절감되었다.

그 후 생물학적정화법은 급속도로 발전해 2000년대에는 750억 달러 규모의 시장으로 성장하였다. 하지만, 현재 유류오염 정화를 위한 많은 미생물 관련 제제가 생산되고는 있으나 다양한 유류오염 형태와 복잡한 오염 양상으로 인해 완벽한 미생물 관련 제제의 개발이 이루어졌다고는 볼 수 없다. 더구나, 국내에는 그 동안 토양환경 기준이 마련되어 있지 않았고 토양오염에 대한 사회적 관심도 대기나 수질오염에 비하여 저조하였던 관계로 토양오염을 처리할 수 있는 기술의 연구·개발이 미미한 실정이다.

한편, 종래에는 토양을 오염시킨 유류성분을 제거하기 위해서 적절한 계면활성제를 사용하여 토양입자에 결합되어 있는 유해 유기물질의 표면장력을 약화시켜 유류성분을 세척하는 토양세척(soil washing) 방법을 사용하기도 하였다. 하지만, 유류는 토양 내에서 물에 용해되지 않은 NAPL(Non Aqueous Phase Liquid)로 존재하기 때문에 단순한 토양세척 방법으로는 제거하기 어렵다. 더욱이 유류 중 오염정도가 상대적으로 심하다고 알려진 경유의 경우에는 휘발성이 낮아 증기추출(vapor extraction) 방법을 사용하기도 어렵다.

이외에도, 기름의 누출로 인한 토양오염 문제를 해결하기 위해서 외국의 기술들을 도입 활용하고 있으나 외국과 환경 및 조건이 다르기 때문에 경제성이나 효율성 면에서 기대지 미치지 못하고 있는 실정이다. 더욱이, 이들 대부분의 도입 기술들은 물리·화학적인 방법에 의한 토양 정화와 관련된 것인데 이들 물리·화학적인 방법은 정화 처리에 따른 이차오염을 유발하여 비용이 많이 든다는 문제가있다.

이러한 추세에 따라 유류분해능을 가진 미생물과 관련한 연구가 국내에서도 활발하게 진행되어 왔다. 1990년대부터는 이 분야가 환경공학의 새로운 한 분야로 정착되었고, 과학기술처 주관으로 한국해양연구소 등에서 많은 연구가 이루어졌다. 또한 과학기술원을 포함한 대학, 연구소, 기업체 등에서도 유류분해 미생물의 분리 동정, 효소제 개발, 유전공학적 기법의 도입 등을 통해 우수한 유류오염제거 미생물제제의 개발을 추진해 왔다. 최근에는 수많은 벤처기업과 대기업이 가세하면서 비교적 활발한 연구가 진행되고 있으며 가시적인 결과물들이 생산·시판되고 있다. 그러나 아직 이들 미생물 제제는 대부분 국지적인 효과만을 가질 뿐이며, 다양한 오염 유형과 토양특성 등을 충분히 고려한 우수한 미생물 제제의 개발은 여전히 미진한 것으로 보인다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 토양 시료를 채취하여 유류분해능을 가진 균주를 분리한 후 상기 균주를 동정한 다음 분리된 균주들 중에서 다양한 유류를 분해하는 효과가 우수한 균주를 선별함으로써, 다양한 환경에 적용 가능하고 이차 오염이 없으며 안전하고 경제적인 생물학적 토양정화법에 이용할 수 있는 유류분해 미생물을 제공함에 본 발명의 목적이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 유류분해 균주인 아시네토박터 바우마니/칼코아세티커스 N의 형태를 보여주는 사진.

도 2는 다양한 pH에서 아시네토박터 바우마니/칼코아세티커스 N의 성장곡선을 보여주는 그래프.

도 3은 다양한 유류에서 아시네토박터 바우마니/칼코아세티커스 N의 성장곡선을 보여주는 그래프.

도 4는 아시네토박터 바우마니/칼코아세티커스 N이 첨가되지 않은 오염토양의 10일 경과 후의 크로마토그램.

도 5는 아시네토박터 바우마니/칼코아세티커스 N이 첨가된 오염토양의 10일 경과 후의 크로마토그램.

본 발명의 상기 목적은 유류에 오염된 지역의 토양으로부터 유류분해능이 있는 균주를 분리한 후 유류분해 효과가 큰 균주를 선발하여 동정한 아시네토박터 바우마니/칼코아세티커스 N에 의해 달성된다.

본 발명의 유류분해 균주 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N의 분리 추출방법은

(1) 유류에 오염된 토양 채취 단계;

(2) 유류분해 균주 분리단계;

(3) 우수 유류분해 균주 선발단계;

(4) 선발된 균주의 동정단계로 이루어진다.

상기 (1)단계에서는 유류분해 효율이 높은 미생물을 분리하기 위하여 석유화학공단 주변 및 하천, 산림지역, 주유소 및 세차장 주변, 상시 유류 유출 지역 등에서 토양을 채취한 후, 실험실로 운반한 다음 유류분해 미생물 분리용 시료로 사용한다.

상기 (2)단계에서는 (1)단계에서 채취한 각각의 토양으로부터 3개의 샘플을 만든 후 인산완충용액(phosphte buffer solution, 이하 PBS라 칭한다)으로 이들 토양 샘플을 균질화 하고, 초음파 탈착하여 LB 또는 트립티케이스 콩 육즙(trypticase soy broth, 이하 TSB라 칭한다)배지에 희석하여 진탕 배양한다. 준비된 증식배양액은 농화배양을 위한 접종원으로 이용한다. 농화배양을 위한 배지는 글루코스-MM2(glucose-MM2) 최소배지에 유일한 탄소원으로 10% 원유(crudeoil)(Abudabi)와 2% 노르말 헥사데칸(n-hexadecane)을 첨가한 액체배지를 각각 사용한다. 전 처리한 상기 액체배지에 증식배양액을 접종하여 진탕 배양한 후 이들 중 탁도가 현저하게 증가하는 플라스크를 선별하여, 이들을 고체 배지에 도말하고 배양하여 1차로 단일 집락(colony)을 분리한다. 이어서 선발된 단일 집락을 각각 TSA 사면배지 (TSB + 1.5% 한천)와 TSB 배지에 접종하여 배양한다. 배양된 사면배지는 4℃에서, 그리고 액체 배양한 균액은 글리세롤(40%)과 혼합한 다음 -70℃에서 보관하여 필요할 때 사용한다. 179 개체의 균주 중에서 유류분해세균을 재선별하기 위하여 2,6-DCPIP(2,6-dichlorophenol-indophenol) 시험을 실시한다. 분리된 유류분해 균주의 유류분해능은 2,6-DCPIP의 환원반응에 의해 나타나는 색깔변화로 확인한다. 2,6-DCPIP는 초기에는 파란색을 띄고 있으나, 기질의 산화로 인하여 환원되면 무색으로 변화하는 특성을 가지고 있다. 따라서, 초기 파란색의 반응액이 무색이 되는 균을 유류분해 세균으로 분리한다.

상기 (3)단계에서는 우수 유류분해 균주를 선별하기 위해 유류분해 균으로 확인된 75개체의 균종들을 TSB 액체배지에 배양한다. 이어서 이들 배양된 균종들을 다양한 종류의 유류 및 탄화수소 화합물이 첨가된 MM2 최소배지에 접종한 후 7∼15일간 진탕 배양하면서 유화현상과 탁도의 변화를 관찰하여 증식 및 각 탄화수소의 분해 여부를 확인한다. 이 같은 과정을 거쳐서, 다양한 유류가 첨가된 MM2 최소배지에서 활발하게 증식할 뿐만 아니라 유화 현상이 뚜렷하게 나타난 4개체를 분리하여 NW-6, NW-7, YC(2)-19, YC-19라 명명하였다.

상기 (4) 단계에서는 이들 4개 균종 중에서 특히 상기 다양한 유류들(경유,원유, 중유)을 모두 분해하는 NW-7을 고체배지에 배양한 후 군체의 형태학적 특성을 파악하고 그람 염색을 수행한 결과, 상기 NW-7은 그람 음성균으로서 단간균인 것으로 밝혀졌다. 또한, 상기 NW-7의 생리적 특성 및 생화학적 특성을 고찰하고 동정한 결과, NW-7은 아시네토박터 속으로 대부분의 탄화수소에서 활발하게 증식하며, 원유를 3일 안에, 경유와 중유(벙커 A유와 벙커 C유)를 5일 안에 거의 90% 이상 분해하는 것으로 나타났다. 이에 따라, 상기 NW-7 균주를 유류 오염 토양의 정화에 사용할 수 있도록 이를 아시네토박터 바우마니/칼코아세티커스(Acinetobacter baumanii/calcoaceticus) N 균주로 명명하고 2002년 5월 16일 자로 한국 미생물 보존센터에 기탁번호 KCCM 10376으로 기탁하였다. 이상과 같이 제조되는 본 발명의 아시네토박터 바우마니/칼코아세티커스 N 균주의 특성을 조사한 결과, 중성과 알칼리 pH에서 생육 가능한 것으로 나타났으며, 통성혐기성균으로서 산소의 존재 유무와는 관계없이 유류로 오염된 토양에 작 적응하는 것으로 확인되었다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1 : 토양채취 및 균주 분리>

석유화학공단 주변(18곳) 및 하천(3곳), 산림지역(10곳), 주유소 및 세차장 주변(10곳), 상시 유류 누출 지역(10곳) 등으로부터 토양 500g 또는 물 1ℓ를 채취하여 각각 비닐 백과 2ℓ 용량의 폴리에틸렌 용기에 담은 후, 4℃로 유지하여 실험실로 운반한 다음 유류분해 미생물 분리용 시료로 사용하였다. 이들 채취된 각 토양 500g 중에서 1g씩 3개의 샘플을 만든 다음, pH 7.0의 멸균된 PBS[Na₂HPO₄(5.447g/ℓ)+KH₂PO₄(4.752g/ℓ)]와 상기 각 토양 샘플을 2:1로 섞은 후 균질화하였다. 상기 균질화된 샘플을 4℃에서 1분씩 15분간 초음파 탈착하고, LB 또는 TSB 50㎖에 희석하여 25℃에서 24시간 동안 150rpm으로 진탕 배양하였다. 준비된 증식 배양약은 농화배양시의 접종원으로 사용하였다.

<실시예 2 : 유류분해균주의 분리>

유류분해 미생물 분리를 위한 농화배양 배지는 글루코스-MM2 최소배지로 된 액체배지와 상기 글루코스-MM2 최소배지에 유일한 탄소원으로 10% 원유(crude oil) 및 2% 노르말 헥사데칸을 각각 첨가한 고체배지를 사용하였다(표 1 및 표 2 참조). 액체배지는 250㎖ 용량의 삼각 플라스크에 글루코스-MM2 최소배지를 50㎖ 정도 채우고 이를 121℃에서 10분 동안 오토클레이브로 가압멸균한 후 여기에 증식배양액 0.5㎖를 접종하여 25℃에서 7∼15일 동안 150rpm으로 진탕 배양하였다. 이들 중 탁도가 현저하게 증가하는 플라스크를 선별한 후 선발된 배양액을 1.5% 한천과 유일한 탄소원으로 유류(원유 및 노르말 헥사데칸)를 함유한 고체 배지에 도말하여 25℃에서 24시간 배양한 다음 1차로 179개체의 단일 집락(colony)을 분리하였다. 분리된 179 개체는 TSA 사면배지(TSB + 1.5% 한천)와 TSB 배지에 각각 접종하여 25℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 사면배지는 4℃에서, 그리고 액체 배양한 균액은 글리세롤(40%)과 혼합한 다음 -70℃에서 보관하여 필요할 때 사용하였다.

[표 1]

배 지	조 성	함유량(per litter)
LB	Yeast extract	5 g
	Pancreatic digest casein	10 g
	NaCl	10 g
	pH 7.0
TSB	Bacto tryptone	17 g
	Bacto soytone	3 g
	NaCl	5 g
	Dextrose	2.5 g
	Dipotassium phosphate	2.5 g
MM2-글루코스	MM2 + 10mM 글루코스	1.8 g
MM2	(NH₄)₂SO₄	2.376 g
	FeSO₄·7H₂O 1mM stock	1 ㎖
	CaCl₂·2H₂O 100mM stock	1 ㎖
	MgSO₄·7H₂O 1M stock	1 ㎖
	NaCl	0.467 g
	10mM Na₂HPO₄-KH₂PO₄buffer, pH7.0

[표 2]

구 분	배 지	배지의 조성
1차 분리용 배지	MM2-GC	MM2-글루코스 + 10% 원유(crude oil)
1차 분리용 배지	MM2-GH	MM2-글루코스 + 2% 헥사데칸
2차 분리용 배지	MM2-C	MM2 + 1% 원유
	MM2-BA	MM2 + 1% 벙커A유
	MM2-BC	MM2 + 1% 벙커C유
	MM2-D	MM2 + 1% 경유(diesel)
	MM2-H	MM2 + 1% 헥사데칸
	MM2-PA	MM2 + 1% 안트라센
	MM2-PN	MM2 + 1% 나프탈렌
	MM2-PP	MM2 + 1% 페난트렌
	MM2-BX	MM2 + 1,000 ppm BTEX
고체 배지	각각의 배지에 1.5% 한천 첨가

상기 179 개체의 균주 중에서 유류분해세균을 재선별하기 위하여 2,6-DCPIP 시험을 실시하였다. 분리된 유류분해 균주의 유류분해능을 2,6-DCPIP의 환원반응에 의해 나타나는 색깔의 변화로 확인하였다. 2,6-DCPIP는 초기에는 파란색을 띄고 있으나 기질의 산화로 인하여 환원되면 무색으로 변한다. 이러한 2,6-DCPIP의 특성을 이용하여, 초기에 파란색이었던 반응액을 무색으로 변화시키는 균을 유류분해 세균으로 분리하였다. 상기 DCPIP 시험을 통해서 유류분해능을 가지는 것으로 분리된 균주는 75개체였다.

<실시예 3: 우수 유류분해 균주 선발 및 동정>

상기 실시예 3에서 유류분해 균으로 확인된 75개체의 균종들을 5㎖의 TSB 액체배지에 24시간 동안 배양한 후, 이들을 원유, 벙커C유, 경유, 노르말 헥사데칸, 페놀, 안트라센, 나프탈렌 및 페난트렌(특히, 마지막 3가지 화합물은 발암가능물질인 다중고리 방향족 탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons, 이하 PAH라 칭한다)에 속한다)이 각각 1% 첨가된 MM2 최소배지와 1,000 ppm/day의 BTEX(벤젠, 톨루엔, 에틸렌, 크실렌)가 첨가된 MM2 최소배지 5㎖에 각각 0.1 ㎖씩 접종하여 25℃에서 7∼15일간 150rpm으로 진탕 배양하였다.

상기 배양액의 유화현상과 탁도의 변화를 관찰하여 유류분해 균의 증식 및 각 탄화수소의 분해여부를 확인한 후, 경유, 노르말 헥사데칸, 원유 및 벙커C유에서 3일 만에 활발하게 증식할 뿐만 아니라 유화 현상이 뚜렷하게 나타난 4개체를 분리하여 NW-6, NW-7, YC(2)-19, YC-19라 명명하였다. 이어서 이들 4개체 중에서성장 상태가 양호한 NW-7을 YEPD(yeast extract peptone dextrose), TSA 및 맥콩키(MacCongkey) 고체배지에 배양한 후 군체의 형태학적 특성을 파악하고 그람 염색을 수행한 결과, 상기 NW-7은 그람 음성균으로서 단간균인 것으로 밝혀졌다(도 1 참조). 또한, Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology 와 API kit 등을 이용하여 NW-7 균주의 생리화학적인 특성을 고찰하고 동정한 결과, 상기 NW-7은 아시네토박터 속으로 대부분의 탄화수소에서 활발하게 증식하며 원유는 3일 만에, 경유와 중유는 5일 만에 거의 90% 이상 분해하는 것으로 밝혀졌다. 이 균종을 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N으로 명명하여 한국균주보관센터에 기탁번호 KCCM 10376으로 기탁하였다.

<실시예 4 : 유류분해 균종의 생장 특성>

대부분의 토양은 특성에 따라 pH가 5∼9의 범위를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 분리된 유류분해 균종인 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N이 활동 가능한 pH 범위를 확인하기 위하여, PBS로 pH를 3, 5, 7, 9로 각각 조절하고 탄소원으로 1% 경유를 첨가한 배양배지를 이용하여 상기 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N 균종의 pH에 따른 유류분해능 및 증식 정도를 분석하였다. 분석 결과, 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N 균주는 산성인 pH 3∼5에서는 성장하지 않았으나, pH 7과 pH 9에서는 증식율이 우수하였다(도 2 참조). 따라서 상기 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N 균주는 오염 토양 중 증성과 알칼리 pH 특성을 갖는 환경에서 효율적으로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

한편, 토양 조건에 따른 상기 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N의 적응 가능성도 조사하였다. 우선, 산소의 유무에 따른 균주의 증식정도를 파악하기 위해 상기 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N 균주를 2개의 TSA 배지에 각각 도말하여 한 개는 혐기성 상태의 배양기에서, 나머지 한 개는 일반 배양기에서 각각 25℃에서 배양하였다. 그 결과, 혐기성 상태와 호기적 상태에서 모두 증식함으로써 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N 균주는 산소의 존재 유무에 관계없이 넓은 범위의 토양환경에서 잘 적응하는 것으로 확인되었다.

또한, 온도에 따른 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N의 증식 정도를 살펴보기 위해, 상기 균주를 4℃에서 20일 동안 배양한 결과 증식하지 않았으나, 10℃, 25℃ 및 35℃에서는 잘 증식하는 것으로 나타나 상기 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N 균주는 중온성 환경에서 잘 성장하는 것으로 확인되었다.

<실시예 5 : 유류분해능 측정>

상기 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N 균주의 유류분해능은 성장세포분석(Growing cell assay) 방법으로 분석하였다. 우선, 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N 균주를 TSA 배양액에서 24시간 동안 전 배양한 다음, 전 배양된 상기 균주를 인산칼륨완충용액으로 세척하였다. 이어서, MM2 배지 50㎖에 원유, 벙커A유, 벙커C유 및 경유를 각각 10,000ppm(1%)씩 첨가하고, 여기에 상기 세척된 전 배양액을 0.5㎖씩 접종하였다. 최종적으로, 이들을 25℃에서 168시간 동안 150 rpm으로 진탕배양하여 증식곡선을 작성하였다. 그 결과 본 발명의 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N 균주는 전체적으로 모든 유류에서 성장상태가 우수하였고, 특히 중유에서 성장정도가 우수한 특성을 나타내었다(도 3 참조).

한편, 실제로 유류에 오염된 토양을 사용하여 본 발명의 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N의 유류분해 효과를 실험하였다. 우선, 전남 여천지역 야산의 토양을 채취하여 미국 ASTM 방법에 따라 강열감량, 함수율, 비중, 공극율, pH, 입도, 중금속 함량 등을 조사하여 토양의 특성을 분석하였다. 실험 결과, 상기 토양의 공극률은 0.76이고, 비중은 2.68 이며, pH는 4.9로 약산성이고, 강열감량은 6.83%이며 함수율은 16.2%로 측정되었다. 또한 상기 토양은 세립토가 거의 없고 입도분포가 고르지 못한 상태의 사질토인 것으로 조사되었다. 이어서, 본 발명의 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N의 유류분해능을 분석하기 위하여 아래와 같이 구성된 실험실 규모(lab scale)의 바이오파일 유닛(biopile unit) 3개를 제작하였다.

BP-1 : 5,000ppm의 벙커A유로 오염된 채취 토양 18㎏만 채움(대조구).

BP-2 : 5,000ppm의 벙커A유로 오염된 채취 토양 18㎏을 채우고 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N 1.8×10⁶cfu/kg과 영양제(nutrient)를 첨가함(시험구).

BP-3 : 5,000ppm의 벙커A유로 오염된 채취 토양 18㎏을 채우고 영양제만 일주일에 500㎖씩 첨가함(대조구).

상기 시험구와 대조구들을 제작하고 10일 경과 후, 각각의 바이오파일 유닛에서의 미생물 개체수의 변화와 석유계 총탄화수소(total petroleum hydrocarbon, 이하 TPH라 칭한다)의 양의 변화를 분석하였다. 그 결과, 시험구 BP-2에서는 대조구 BP-1 및 BP-3과 비교하여 미생물의 개체 밀도가 100배 이상 높게 나타나고 접종된 미생물종의 우점도도 25% 이상 증가한 것으로 조사되었다. 또한 각 바이오파일 유닛의 토양 속에 남아있는 유류의 양을 분석하기 위하여, 미국의 EPA method 8015 B에 의거하여 가스 크로마토그래피 GC-FID(HP-6890)로 토양 속의 TPH 함량을 정량 분석하였다. 10일 경과 후, BP-1에서는 약 2,210 ppm의 TPH가, BP-2에서는 980ppm의 TPH가 검출되었다. 결론적으로, BP-2에서는 10일 동안 약 55%의 유류 분해율을 보여 전반적으로 미생물에 의해 벙커A유의 분해가 높은 효율로 이루어지고 있음을 확인시켜 주었다. 도 4와 도 5는 BP-1과 BP-2의 GC 크로마토그램으로 10일 동안 탄화수소가 상당히 감소되었음을 보여 주고 있다.

이상 발명의 상세한 설명에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 아시네토박터 바우마니/칼코아세티커스 N 균주는 산업체 저유소의 지하 유류저장탱크 등의 저유시설에서의 누출로 인해 오염된 토양 정화에 사용할 경우, 종래의 물리·화학적인 토양정화 방법과는 달리 2차적 오염을 유발하지 않기 때문에 안정적이고 환경친화적인 토양정화방법을 제공할 수 있다. 또한 본 발명의 아시네토박터 바우마니/칼코아세티커스 N 균주는 다양한 유류 종류 및 토양 환경에 잘 적응하는 특징이 있어 다양한 환경 조건에서 효율적으로 이용할 수 있다.

Claims

석유계 탄화수소 화합물에서 증식하며 원유, 중유(벙커A유와 벙커C유) 및 경유를 분해 할 수 있는 특징을 가진 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N(기탁번호 : KCCM 10376).
제 1 항에 있어서,

원유는 3일 내에, 경유 또는 중유는 5일 내에 90% 이상까지 분해할 수 있는 특징을 가진 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N.
제 1 항에 있어서,

pH 7∼9, 온도 10∼35℃의 조건에서 산소의 존재 유무에 관계없이 증식하는 특징을 가진 아시네토박터 속 바우마니/칼코아세티커스 N.