KR100468648B1 - Ganoderma lucidum exo- and endo-biopolymer having a hypolipidemic effect and the use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 저지혈증 효과를 갖는 영지버섯 유래의 세포외다당체 및 세포내다당체에 관한 것으로, 본 발명 영지버섯의 균사체 액체배양으로부터 생산된 세포외다당체 혹은 세포내다당체를 고지혈증 흰쥐에 경구투여한 결과 대조군에 비해 저지혈증 효과가 증가하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명 세포외다당체 및 세포내다당체는 혈장 내 총 콜레스테롤, 트리글라이세라이드, 인지질, 동맥경화 지수 및 LDL 콜레스테롤의 농도를 감소시킬뿐 아니라 간의 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 인지질 농도를 감소시키는 효과가 있다.The present invention relates to extracellular polysaccharides and intracellular polysaccharides derived from Ganoderma lucidum mushroom having hypolipidemic effect, oral administration of extracellular polysaccharides or intracellular polysaccharides produced from mycelium liquid culture of Ganoderma lucidum mushroom to hyperlipidemic rats Compared to the effect of increasing hypolipidemia is excellent. In addition, the present invention extracellular and intracellular polysaccharides not only reduce the concentration of total cholesterol, triglycerides, phospholipids, arteriosclerosis index and LDL cholesterol in plasma, but also reduce the total cholesterol, triglyceride and phospholipid concentrations in the liver. There is.
Description
본 발명은 저지혈증 효과를 갖는 영지버섯 유래의 세포외다당체 및 세포내다당체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 고지혈증 흰쥐에서 저지혈증 효과를 갖는 영지버섯의 균사체 액체배양에 의해 생산된 세포외다당체와 균사체로부터 세포내다당체를 분리하고 상기 물질의 저지혈증 활성을 이용한 세포외다당체 및 세포내다당체의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an extracellular polysaccharide and an intracellular polysaccharide derived from Ganoderma lucidum having an hypolipidemic effect. More specifically, the present invention is to separate the intracellular polysaccharides from the extracellular polysaccharides and mycelium produced by the mycelium liquid culture of Ganoderma lucidum having hypolipidemic effect in hyperlipidemic rats and the extracellular polysaccharide using the hypolipidemic activity of the substance and It relates to the use of intracellular polysaccharides.
영지버섯(Ganoderma lucidum)의 자실체(Reshi)는 예로부터 한국, 중국, 일본 등을 비롯하여 동양에서는 간염, 고혈압, 고콜레스테롤혈증 및 위암과 같은 다수의 질병을 치료하는 데 사용되는 중요한 한약재로써 알려져 있었다. 또한, 최근에는 항암, 혈압저하, 간보호, 항보체, 항미생물 및 항염증 효과 등등을 포함하여 매우흥미로운 생물학적 활성들이 입증되었다.Reshi of Ganoderma lucidum has been known as an important herbal medicine used to treat a number of diseases such as hepatitis, hypertension, hypercholesterolemia and gastric cancer in Korea, China, Japan, and the East. In addition, very interesting biological activities have recently been demonstrated, including anti-cancer, hypotension, hepatoprotective, anti-complementary, antimicrobial and anti-inflammatory effects.
최근, 고지혈증을 제거하고자 하는 시도들이 생기기 시작하였다. 순환성 콜레스테롤의 농도를 저하시킴으로써 심장의 아테롬성 동맥경화증을 예방하고, 저지하며 심지어는 역전할 수 있다는 사실이 보고되었다. 현재, 혈청의 콜레스테롤을 저하시키는 데 로바스타틴과 콜레스테릴아민과 같은 몇몇 약들이 사용되었지만, 너무 비싸고 대규모로 사용하기에는 부작용이 따른다. 따라서, 상기 목적을 달성하기 위해 영양학적 연구 분야에서 천연물질에 대한 연구가 시도중이다. 이미 식용가능한 다수의 버섯들이 고섬유, 고단백, 저지방 및 미량원소의 높은 함량을 갖고 있어 고지혈증을 제어하는 중요한 천연요법임이 입증되고 있다. 그러나, 다수 버섯 종들의 저지혈증 활성이 이미 입증되었다고는 하나, 초기 대부분의 연구들에서는 단지 자실체나 배양된 균사체에서 분리한 성분들에 한하고 있다. 반면, 그러한 버섯들의 균사체 액체배양에서 생산된 세포외다당체의 효과에 대한 연구는 비교적 적다. Chung 등이 영지버섯 자실체 추출물의 저혈당 활성에 대해 보고하고 있지만, 지금까지 그것의 액체배양 침전물의 저지혈증 활성에 대해서는 보고한 연구들이 없었다.Recently, attempts have been made to eliminate hyperlipidemia. It has been reported that lowering the concentration of circulating cholesterol can prevent, arrest and even reverse atherosclerosis of the heart. Currently, some drugs such as lovastatin and cholesterylamine have been used to lower serum cholesterol, but are too expensive and have side effects for large scale use. Therefore, in the field of nutritional research, research on natural substances is attempting to achieve the above object. Many edible mushrooms already have high content of high fiber, high protein, low fat and trace elements, which has proved to be an important natural therapy to control hyperlipidemia. However, although the hypolipidemic activity of many mushroom species has already been demonstrated, most early studies are limited to components isolated from fruiting bodies or cultured mycelia. On the other hand, there is relatively little research on the effects of extracellular polysaccharides produced in mycelial liquid culture of such mushrooms. Although Chung et al. Reported the hypoglycemic activity of Ganoderma lucidum fruiting body extract, no studies have reported the hypolipidemic activity of its liquid culture precipitate.
따라서, 본 발명은 목적은 액체배양에서 생산된 배양 균사체로부터 추출한 저지혈증 효과를 갖는 영지버섯 유래의 세포외다당체와 세포내다당체 및 그것의 분리방법을 제공하고자 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide an extracellular polysaccharide and an intracellular polysaccharide derived from Ganoderma lucidum having an hypolipidemic effect extracted from cultured mycelium produced in liquid culture, and a method for separating the same.
본 발명의 상기 목적은 영지버섯을 균사체 액체배양하고 상기 배양액으로부터 세포외다당체를 그리고 균사체로부터 세포내다당체를 얻고 고지혈증 흰쥐에 상기 물질들을 경구투여하여 사육시킨 후 실험쥐로부터 혈액 및 여러 장기들을 얻고 상기 혈액을 분석하여 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, HDL(고농도의 지단백) 콜레스테롤, 인지질, LDL(저농도의 지단백) 콜레스테롤의 함량 및 동맥경화 지수를 조사하고 상기에서 얻은 실험쥐의 장기들의 무게를 측정하고 간의 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 인지질 농도를 측정하여 영지버섯 유래의 세포외다당체 및 세포내다당체의 저지혈증 효과를 조사함으로써 달성하였다.The object of the present invention is to culture the Ganoderma lucidum mycelium liquid, obtain extracellular polysaccharides from the culture medium and intracellular polysaccharides from the mycelium and orally administer the above-mentioned substances to hyperlipidemic rats to obtain blood and various organs from the mice. Blood was analyzed to examine the contents of total cholesterol, triglycerides, HDL (high concentration lipoprotein) cholesterol, phospholipids, LDL (low concentration lipoprotein) cholesterol, and arteriosclerosis index. Cholesterol, triglyceride and phospholipid concentrations were measured to investigate the hypolipidemic effect of extracellular and intracellular polysaccharides derived from Ganoderma lucidum.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described by examples.
도 1은 본 발명 영지버섯의 균사체 액체배양에서 세포외다당체와 세포내다당체를 분리하는 과정을 도식화한 것이다.1 is a diagram illustrating a process for separating extracellular and intracellular polysaccharides from mycelium liquid culture of Ganoderma lucidum of the present invention.
본 발명은 영지버섯의 균사체 액체배양 및 상기 배양액에서의 세포외다당체및 세포내다당체의 분리단계와 고지혈증 흰쥐에서의 상기 다당체들의 저지혈증 효과를 조사하는 단계로 구성된다.The present invention comprises the culture of mycelium liquid mycelium mushroom and the separation of extracellular and intracellular polysaccharide from the culture medium and the step of investigating the hypolipidemic effect of the polysaccharide in hyperlipidemic rats.
보다 상세하게는, 본 발명 영지버섯 유래의 세포외다당체는 하기의 단계들로부터 얻는다:More specifically, the extracellular polysaccharide derived from Ganoderma lucidum of the present invention is obtained from the following steps:
가) 영지버섯의 배양액을 감자/덱스트로오스 브로스(pH 4.5)에 접종하고 30℃, 120 rpm 조건의 회전식 진탕기에서 종균배양하고,A) Inoculate the Ganoderma lucidum culture in potato / dextrose broth (pH 4.5) and spawn on a rotary shaker at 30 ° C and 120 rpm.
나) 상기 배양 7일 후, 상기 50 mL의 배양액을 무균상태에서 분쇄하고나서 상기 분쇄물을 미리 제조한 배양배지(글루코오스 0.1%, 슈크로오스 0.9%, 효모 추출물 0.05%, 펩톤 0.2%, 포테이토/덱스트로오스 브로스 0.2%, NH4H2PO40.05%, DL-세린 0.05%, KH2PO40.1%, CaCl20.06%, MgSO4·7H2O 0.2%, FeSO4·7H2O 0.002%, ZnSO4·7H2O 0.002%, MnSO4·H2O 0.002%, pH 4.5)에 1%(v/v)으로 접종하고,B) After 7 days of the culture, the 50 mL of the culture solution was pulverized in a sterile state, and then the culture medium was prepared in advance (glucose 0.1%, sucrose 0.9%, yeast extract 0.05%, peptone 0.2%, potato) Dextrose broth 0.2%, NH 4 H 2 PO 4 0.05%, DL-serine 0.05%, KH 2 PO 4 0.1%, CaCl 2 0.06%, MgSO 4 7H 2 O 0.2%, FeSO 4 7H 2 O 0.002%, ZnSO 4 · 7H 2 O 0.002%, MnSO 4 · H 2 O 0.002%, pH 4.5) inoculated at 1% (v / v),
다) 상기 분쇄물을 포함한 배양액을 120 rpm, 30℃ 조건의 회전식 진탕기에서 18일 동안 균사체 액체배양하고,C) culture the mycelia liquid for 18 days in a rotary shaker at 120 rpm, 30 ℃ condition containing the pulverized,
라) 상기 균사체 액체배양액을 10,447 x g로 20분간 원심분리하여 얻은 상등액에 에탄올을 1:4의 비율로 넣고 하루동안 침전시킨 다음 원심분리하고,D) To the supernatant obtained by centrifuging the mycelium liquid culture solution at 10,447 x g for 20 minutes, ethanol was added at a ratio of 1: 4 and precipitated for one day, followed by centrifugation.
마) 상기에서 얻은 침전물을 동결건조하고 증류수를 10 mg/mL의 비율로 넣어 녹인 다음 10,447 x g, 20분 동안 원심분리하고,E) freeze-dried the precipitate obtained above, dissolve in distilled water at a rate of 10 mg / mL and centrifuged for 10,447 x g, 20 minutes,
바) 원심분리하여 얻은 상등액을 3일 간 투석한 다음 동결건조하여 얻음.F) obtained by dialysis of the supernatant obtained by centrifugation for 3 days and then lyophilization.
또한, 본 발명 영지버섯 유래의 세포내다당체는 하기의 단계들로부터 얻는다:In addition, the intracellular polysaccharide derived from Ganoderma lucidum of the present invention is obtained from the following steps:
가) 영지버섯의 배양액을 감자/덱스트로오스 브로스(pH 4.5)에 접종하고 30℃, 120 rpm 조건의 회전식 진탕기에서 종균배양하고,A) Inoculate the Ganoderma lucidum culture in potato / dextrose broth (pH 4.5) and spawn on a rotary shaker at 30 ° C and 120 rpm.
나) 상기 배양 7일 후, 상기 50 mL의 배양액을 무균상태에서 분쇄하고나서 상기 분쇄물을 미리 제조한 배양배지(글루코오스 0.1%, 슈크로오스 0.9%, 효모 추출물 0.05%, 펩톤 0.2%, 포테이토/덱스트로오스 브로스 0.2%, NH4H2PO40.05%, DL-세린 0.05%, KH2PO40.1%, CaCl20.06%, MgSO4·7H2O 0.2%, FeSO4·7H2O 0.002%,ZnSO4·7H2O 0.002%, MnSO4·H2O 0.002%, pH 4.5)에 1%(v/v)으로 접종하고,B) After 7 days of the culture, the 50 mL of the culture solution was pulverized in a sterile state, and then the culture medium was prepared in advance (glucose 0.1%, sucrose 0.9%, yeast extract 0.05%, peptone 0.2%, potato) Dextrose broth 0.2%, NH 4 H 2 PO 4 0.05%, DL-serine 0.05%, KH 2 PO 4 0.1%, CaCl 2 0.06%, MgSO 4 7H 2 O 0.2%, FeSO 4 7H 2 O 0.002%, ZnSO 4 · 7H 2 O 0.002%, MnSO 4 · H 2 O 0.002%, pH 4.5) inoculated at 1% (v / v),
다) 상기 분쇄물을 포함한 배양액을 120 rpm, 30℃ 조건의 회전식 진탕기에서 18일 동안 균사체 액체배양하고,C) culture the mycelia liquid for 18 days in a rotary shaker at 120 rpm, 30 ℃ condition containing the pulverized,
라) 상기 균사체 액체배양액을 10,447 x g로 20분간 원심분리하여 얻은 균사체를 증류수로 3번 세척하고 2시간 동안 열수추출을 3번 한 다음 10,447 x g로 20분간 원심분리하고,D) The mycelium liquid culture solution was centrifuged at 10,447 x g for 20 minutes, and the mycelium obtained was washed three times with distilled water, followed by three times of hot water extraction for 2 hours, followed by centrifugation at 10,447 x g for 20 minutes.
마) 상기에서 얻은 침전물을 동결건조하고 증류수를 10 mg/mL의 비율로 넣어 녹인 다음 10,447 x g, 20분 동안 원심분리하고,E) freeze-dried the precipitate obtained above, dissolve in distilled water at a rate of 10 mg / mL and centrifuged for 10,447 x g, 20 minutes,
바) 원심분리하여 얻은 상등액을 3일 간 투석한 다음 동결건조하여 얻음.F) obtained by dialysis of the supernatant obtained by centrifugation for 3 days and then lyophilization.
상기의 분리방법으로부터 얻은 본 발명 영지버섯 유래의 세포외다당체 및 세포내다당체의 저지혈증 효과를 조사하기 위해서는, 식이 유도성 고지혈증 흰쥐에 상기 세포외다당체 혹은 세포내다당체를 경구투여하여 사육시킨 후 실험쥐로부터 혈액 및 여러 장기들을 얻고 상기 혈액을 분석하여 혈장 내 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, HDL(고농도의 지단백) 콜레스테롤, 인지질, LDL(저농도의 지단백) 콜레스테롤의 함량 및 동맥경화 지수를 조사하고 상기에서 얻은 실험쥐의 장기의 무게를 측정하고 간의 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 인지질 농도를 측정하여 영지버섯 유래의 세포외다당체 및 세포내다당체의 저지혈증 효과를 조사하였다.In order to investigate the hypolipemia effect of the present invention Ganoderma lucidum-derived extracellular polysaccharide and intracellular polysaccharide obtained from the above separation method, experiments after oral administration of the extracellular polysaccharide or intracellular polysaccharide to diet-induced hyperlipidemic rats Obtaining blood and various organs from rats and analyzing the blood to investigate the contents of total cholesterol, triglycerides, HDL (high concentration lipoprotein) cholesterol, phospholipids, LDL (low concentration lipoprotein) cholesterol and atherosclerosis in plasma The weight of organs in mice and the total cholesterol, triglyceride, and phospholipid concentrations of livers were measured to investigate the hypolipidemic effect of extracellular and intracellular polysaccharides derived from Ganoderma lucidum.
본 발명은 영지버섯 유래의 세포외다당체뿐만 아니라 세포내다당체도 분리하여 이들 물질들의 저지혈증 효과를 비교하였다.The present invention isolates the intracellular polysaccharides as well as the extracellular polysaccharide derived from Ganoderma lucidum mushroom and compared the hypotensive effects of these substances.
본 발명 영지버섯 유래의 저지혈증 효과를 갖는 세포외다당체 혹은 세포내다당체를 유효성분으로 하는 고지혈증 치료용 조성물과 약제학적으로 허용되는 담체를 혼합하여 약학 조성물을 제조할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 항미제등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 경구투여용 제제 또는 비경구투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 본 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구투여하거나 경구투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 kg당 영지버섯 유래의 세포외다당체는 0.05 ~ 0.2 g을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.The pharmaceutical composition may be prepared by mixing a composition for treating hyperlipidemia having an extracellular polysaccharide or an intracellular polysaccharide having an hypolipidemic effect derived from Ganoderma lucidum and an pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition of the present invention may further include conventionally used excipients, disintegrants, sweeteners, glidants, anti-esthetics, etc., unit administration such as oral or parenteral formulations by conventional methods It may be formulated in a pharmaceutical form or in multiple dosage forms. The composition may be parenterally or orally administered as desired, and the extracellular polysaccharide derived from Ganoderma lucidum per kg body weight per day may be administered by dividing 0.05 to 0.2 g in 1 to several times. Dosage levels for a particular patient may vary depending on the particular compound to be used, body weight, patient's age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion, severity of disease, and the like.
각 실시예에 나타난 각 데이터 값은 평균±표준편차로 표현하여 표에 나타내었다. 각 군의 평균은 단일 변이 분석 및 던칸의 멀티플 레인지 테스트(Duncan's multiple-range test)로 비교하였다. 통계적 차이는 p<0.05를 유의한 값으로 간주하였다.Each data value shown in each example is shown in the table expressed as the average ± standard deviation. The mean of each group was compared by single variance analysis and Duncan's multiple-range test. Statistical difference considered p <0.05 as a significant value.
또한, 실시예 및 청구항에 기재된 배지구성성분의 비율은 중량 당 퍼센트를 의미한다.In addition, the ratio of the media component described in an Example and a claim means a percentage by weight.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the specific method of the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited only to these Examples.
[실시예]EXAMPLE
실시예 1: 영지버섯의 균사체 액체배양으로부터 세포외다당체 및 세포내다당체의 분리 Example 1 Isolation of Extracellular and Intracellular Polysaccharides from Mycelium Liquid Culture of Ganoderma Lucidum Mushroom
본 발명 영지버섯의 저지혈증 활성을 갖는 물질을 분리하기 위해, 우선 영지버섯은 주로 대한민국 경북지역에서 채취하고 분리하였으며, 이를 30℃, 120 rpm의 조건으로 회전식 진탕기에서 포테이토/덱스트로오스 브로스(pH 4.5)에서 배양하였다. 7일 후, 50 mL의 배양액을 무균상태에서 분쇄하고 배양 배지(갈락토오스 0.1%, 슈크로오스 0.9%, 효모 추출물 0.05%, 펩톤 0.2%, 포테이토 덱스트로오스 브로스 0.2%, NH4H2PO40.05%, DL-세린 0.05%, KH2PO40.1%, CaCl20.06%, MgSO4·7H2O 0.2%, FeSO4·7H2O 0.002%, ZnSO4·7H2O 0.002%, MnSO4·H2O 0.002%, pH 4.5)에 1%(v/v)으로 접종하였다. 상기 배지를 200 mL 포함하고 있는 500-mL 플라스크를 30℃, 120 rpm 조건의 회전식 진탕기에 놓고 18일 동안 균사체 액체배양을 실시하였다. 액체배양에서 세포외다당체를 분리하는 과정은 도 1에 나타내었다.In order to separate the substance having hypolipidemic activity of the Ganoderma lucidum of the present invention, first, Ganoderma lucidum was mainly collected and separated from Gyeongbuk, South Korea, and the potato / dextrose broth in a rotary shaker at 30 ℃, 120 rpm conditions incubated at pH 4.5). After 7 days, 50 mL of the culture was crushed under sterile conditions and culture medium (galactose 0.1%, sucrose 0.9%, yeast extract 0.05%, peptone 0.2%, potato dextrose broth 0.2%, NH 4 H 2 PO 4 0.05%, DL-serine 0.05%, KH 2 PO 4 0.1%, CaCl 2 0.06%, MgSO 4 · 7H 2 O 0.2%, FeSO 4 · 7H 2 O 0.002%, ZnSO 4 · 7H 2 O 0.002%, MnSO 4 H 2 O 0.002%, pH 4.5) at 1% (v / v). A 500-mL flask containing 200 mL of the medium was placed in a rotary shaker at 30 ° C. and 120 rpm and subjected to mycelial liquid culture for 18 days. The process of separating the extracellular polysaccharide from the liquid culture is shown in FIG.
도 1에 따르면, 영지버섯 유래의 세포외다당체를 분리하기 위해, 18일 동안 배양한 균사체 액체배양액을 10,447 x g로 20분간 원심분리하여 얻은 상등액에 에탄올을 1:4의 비율로 넣고 하루동안 침전시킨 다음 원심분리하였다. 그 후, 상기에서 얻은 침전물을 동결건조하고 증류수를 10 mg/mL의 비율로 넣어 녹인 다음 10,447 x g, 20분 동안 원심분리한 다음, 이로부터 얻은 상등액을 3일 간 투석한 다음 동결건조하여 영지버섯 유래의 세포외다당체를 얻었다.According to Figure 1, in order to separate the extracellular polysaccharide derived from Ganoderma lucidum mushroom, the supernatant obtained by centrifuging the mycelium liquid culture medium cultured for 18 days at 10,447 xg for 20 minutes in a ratio of 1: 4 and precipitated for one day Then centrifuged. Thereafter, the precipitate obtained above was lyophilized and dissolved in distilled water at a rate of 10 mg / mL, followed by centrifugation for 10,447 xg for 20 minutes, and the supernatant obtained therefrom was dialyzed for 3 days, and then lyophilized. The derived extracellular polysaccharide was obtained.
본 발명 영지버섯 유래의 세포외다당체뿐만 아니라 세포내다당체의 저지혈증 활성을 비교하기 위해 영지버섯을 액체배양한 후 균사체로부터 세포내다당체를 분리하였다. 우선, 18일 동안 배양한 균사체 액체배양액을 10,447 x g로 20분간 원심분리하여 얻은 균사체를 증류수로 3번 세척하고 2시간 동안 3번 열수추출한 다음 10,447 x g로 20분간 원심분리하였다. 이로부터 얻은 상등액에 에탄올 1:4의 비율로 넣고 하루동안 침전시킨 다음 원심분리하고 침전물을 동결건조한 다음 다시 증류수를 10 mg/mL의 비율로 넣어 녹인 다음 10,447 x g로 20분간 원심분리하였다. 원심분리 후 얻은 상등액을 3일 간 투석시키고 나서 동결건조하여 영지버섯 유래의 세포내다당체를 얻었다.In order to compare the hypolipidemic activity of the intracellular polysaccharides as well as the extracellular polysaccharides derived from Ganoderma lucidum of the present invention, the intracellular polysaccharides were isolated from mycelium after liquid culture of Ganoderma lucidum. First, the mycelium liquid culture medium cultured for 18 days was centrifuged at 10,447 x g for 20 minutes, and the mycelium obtained was washed three times with distilled water, extracted three times with hot water for 2 hours, and then centrifuged at 10,447 x g for 20 minutes. The supernatant obtained therefrom was added ethanol in a ratio of 1: 4, precipitated for one day, centrifuged, and the precipitate was lyophilized, and dissolved in distilled water at a rate of 10 mg / mL, followed by centrifugation at 10,447 x g for 20 minutes. The supernatant obtained after centrifugation was dialyzed for 3 days and then lyophilized to obtain intracellular polysaccharides derived from Ganoderma lucidum.
실시예 2: 영지버섯 유래의 세포외다당체 및 세포내다당체의 저지혈증 효과Example 2: Hypoglycemic Effects of Extracellular and Intracellular Polysaccharides from Ganoderma lucidum Mushroom
상기 실시예 1에서 얻은 본 발명 영지버섯 유래의 세포외다당체 혹은 세포내다당체를 식이로 유도된 고지혈증 흰쥐에 경구투여하여 흰쥐의 생장반응 및 저지혈증 효과를 알아보았다. 우선, 한국화학기술원에서 얻은 스프라규-달리 수컷 흰쥐(약 100-120 g)를 각각 스테인레스 스틸 케이지에 넣고 일정 온도(22±2℃)로 습도(55±5℃)로 유지되고 12시간 주기로 명암이 조절되는 사육실에서 사육하였다. 6주 동안 변형된 AIN-76 식이를 흰쥐에 먹였다. 상기 식이는 무게 당 55.5%의 탄수화물(40.5%의 슈크로오스를 포함함), 14.5%의 지방(총 에너지의 30%), 20%의 카제인으로 구성되어 있으며, 표 1에 구성성분을 나타내었다. 그 후, 2주 동안 고지방 식이를 제공하여 고지혈증 상태를 유도한 다음, 체중에 따라 4군 중 3군을 처리실험군으로 분류하였다. 각 실험군에 식염수(대조군), 체중 1 kg 당 100 mg의 농도로 영지버섯의 균사체 액체배양에서 생산된 세포외다당체 혹은 세포내다당체를 4주 동안 흰쥐에 매일 경구투여하였다. 식이 섭취 및 체중은 매일 기록하였으며 이를 표 3에 나타내었다. 상기 경구투여 말기에, 14시간 동안 흰쥐를 절식시키고 나서 약하게 에테르 마취시켜 복부를 절개하여 즉시 희생시켰다. 그 후 대동맥에서 혈액을 얻었다.The extracellular polysaccharide or intracellular polysaccharide derived from Ganoderma lucidum of the present invention obtained in Example 1 was orally administered to diet-induced hyperlipidemic rats to examine the growth reaction and hypolipidemic effect of rats. First, Sprague-Dalley male rats (approximately 100-120 g) obtained from the Korea Advanced Institute of Chemical Technology were placed in stainless steel cages and kept at a constant temperature (22 ± 2 ℃) at a humidity (55 ± 5 ℃) and then cycled for 12 hours It was raised in a room with controlled contrast. A modified AIN-76 diet was fed to rats for 6 weeks. The diet consists of 55.5% carbohydrates (including 40.5% sucrose), 14.5% fat (30% of total energy) and 20% casein per weight, the components of which are shown in Table 1 . Subsequently, hyperlipidemia was induced by providing a high fat diet for 2 weeks, and then, according to the body weight, three of the four groups were classified as treatment groups. In each experimental group, extracellular or intracellular polysaccharides produced in mycelium liquid culture of Ganoderma lucidum mushroom were administered orally to rats daily for 4 weeks at a concentration of 100 mg / kg of saline (control) and 1 kg of body weight. Dietary intake and body weight were recorded daily and are shown in Table 3. At the end of the oral administration, the rats were fasted for 14 hours, followed by mild ether anesthesia, incised abdomen, and sacrificed immediately. After that, blood was obtained from the aorta.
상기 실험쥐에서 혈장 및 장기를 분리하기 위해, 상기에서 얻은 혈액 샘플을 헤파린처리된 튜브에 넣고 1,100 x g, 10분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 각 기관은 0.9% NaCl로 세척한 후 분리하고 무게를 측정하였다. 간에 냉식염수를 살포하고, 절단한 다음 -70℃에서 냉동시켰다.In order to separate plasma and organs from the mice, the blood samples obtained above were placed in heparinized tubes and centrifuged for 1,100 × g, 10 minutes to separate plasma. Each organ was washed with 0.9% NaCl, separated and weighed. Cold saline was sparged in the liver, cut and frozen at -70 ° C.
상기에서 얻은 혈장 및 간에 대해 화학적 분석을 실시하였다. 혈장 내 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 인지질, 고농도지단백(HDL) 콜레스테롤은 각각 콜레스테롤 산화효소-DAOS 방법, 글리세롤 키나아제를 이용한 Bucolo 방법, 콜린 산화효소 방법 및 인산텅스텐산-Mg 침전법을 사용하여 측정하였다. 저농도 지단백(LDL) 콜레스테롤, 동맥경화 지수 및 총 콜레스테롤에 대한 HDL 콜레스테롤의 비(HTR)는 다음의 식에 따라 계산하였다:Chemical analysis was performed on the plasma and liver obtained above. Plasma total cholesterol, triglycerides, phospholipids, and HDL cholesterol were measured using cholesterol oxidase-DAOS method, Bucolo method using glycerol kinase, choline oxidase method and tungstate phosphate-Mg precipitation method, respectively. Low concentration lipoprotein (LDL) cholesterol, arteriosclerosis index, and ratio of HDL cholesterol to total cholesterol (HTR) were calculated according to the following formula:
LDL 콜레스테롤 = 총 콜레스테롤 - HDL 콜레스테롤 - (트리글리세라이드/5),LDL cholesterol = total cholesterol-HDL cholesterol-(triglyceride / 5),
동맥경화 지수 = (총 콜레스테롤 - HDL 콜레스테롤)/HDL 콜레스테롤,Arteriosclerosis index = (total cholesterol-HDL cholesterol) / HDL cholesterol,
HTR = HDL 콜레스테롤/총 콜레스테롤.HTR = HDL cholesterol / total cholesterol.
간 지질은 Folch 등의 방법에 따라 추출하였다. 간의 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 인지질 농도는 트리톤 X-100을 처리한 후 혈장의 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 인지질 측정방법과 동일한 방법에 따라 분석하였다.Liver lipids were extracted according to the method of Folch et al. Liver total cholesterol, triglyceride and phospholipid concentrations were analyzed according to the same method as plasma total cholesterol, triglycerides and phospholipids after treatment with Triton X-100.
1)8 마리의 정상 흰쥐군 1) 8 normal rats
2)8 마리의 고지혈증 흰쥐군. 각 실험군에 식염수(대조군), 세포외다당체 혹은 세포내다당체를 100 mg/kg 체중의 농도로 4주 동안 매일 경구투여하였다. 2) Group of 8 hyperlipidemic rats. Each group was orally administered saline (control), extracellular or intracellular polysaccharides at a concentration of 100 mg / kg body weight for 4 weeks every day.
영지버섯의 균사체 액체배양에서 얻은 세포내다당체와 세포외다당체의 체중 증가, 식이섭취 및 식이 효율에 대한 효과를 표 3에 나타내었다.Table 3 shows the effects of intracellular and extracellular polysaccharides on weight gain, dietary intake and dietary efficiency of the mycelium liquid cultures of Ganoderma lucidum.
1)표 2와 동일 1) Same as Table 2
2)체중 증가/식이 섭취 2) weight gain / dietary intake
NS: 유의성 없음NS: no significance
각 값은 8 마리에 대한 평균±표준편차를 나타낸 것이다.Each value represents the mean ± standard deviation for 8 animals.
표 3에 나타난 바와 같이, 4주 동안, 모든 실험군은 건강상태를 유지하였으며 정상 무게를 나타내었다. 영지버섯의 세포외다당체 혹은 세포내다당체를 투여한 실험군의 경우, 체중 증가 혹은 식이 섭취에 대한 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 유사하게, 식이 효율에 있어서도 실험군 간의 유의한 차이는 없었다.As shown in Table 3, for 4 weeks, all experimental groups remained healthy and showed normal weight. No significant difference in weight gain or dietary intake was observed in the experimental group administered extracellular or intracellular polysaccharides of Ganoderma lucidum. Similarly, there was no significant difference between the experimental groups in dietary efficiency.
실험군의 여러 장기들의 무게에 대한 세포내다당체와 세포외다당체의 영향은 표 4에 나타내었다.The effects of intracellular and extracellular polysaccharides on the weight of various organs in the experimental group are shown in Table 4.
1)표 2와 동일 1) Same as Table 2
NS: 유의성 없음 NS : no significance
각 값은 8 마리에 대한 평균±표준편차를 나타낸 것이다.Each value represents the mean ± standard deviation for 8 animals.
a, b, c: 각 실험군 간의 p<0.05의 유의한 차이를 나타낸 것이다. a, b, c : p <0.05 was significantly different between the experimental groups.
표 4에 나타난 바와 같이, 심장, 신장 및 비장의 무게는 실험군들 간에 유의한 차이는 없었다. 그러나, 세포외다당체를 섭취한 군에서 간 무게는 대조군과 비교하여 매우 낮았다. 고지혈증 흰쥐에서 간 무게의 증가는 간조직에서 지질 함량의 축적 때문이다. Shen 등 과 Dietschy 등은 식이유도성 고지혈증 동물에서 혈장 내 LDL 콜레스테롤의 농도가 감소하여 결과적으로 간의 아세틸 CoA의 농도를 향상시키는 부적절한 지질 대사가 발생하고 결국 지방형성(lipogenesis)에 참여하게 되어 간 조직에서 지질로 축적된다고 보고하였다.As shown in Table 4, the weights of heart, kidney and spleen were not significantly different among the experimental groups. However, liver weights were very low in the group receiving extracellular polysaccharides compared to the control group. The increase in liver weight in hyperlipidemic rats is due to the accumulation of lipid content in liver tissue. Shen et al. And Dietschy et al. Have shown that in dietary hyperlipidemic animals, the concentration of LDL cholesterol in plasma decreases, resulting in inappropriate lipid metabolism that improves the concentration of acetyl CoA in the liver and eventually participates in lipogenesis. It is reported to accumulate in lipids.
본 실시예에서, 세포내다당체와 세포외다당체의 경구투여는 동물들의 전반적인 행동에 대해 어떠한 변화도 일으키지 않았으며 죽은 동물도 없었다. 그리하여, 영지버섯의 세포내다당체와 세포외다당체를 경구투여한 후에도 흰쥐에서는 어떠한 부작용도 나타나지 않았다.In this example, oral administration of intracellular and extracellular polysaccharides did not cause any changes to the overall behavior of the animals and there were no dead animals. Thus, even after oral administration of intracellular and extracellular polysaccharides of Ganoderma lucidum, no adverse effects were observed in rats.
1)표 2와 동일함. 1) Same as Table 2.
2)총 콜레스테롤 - HDL 콜레스테롤-(트리글리세라이드/5) 2) Total Cholesterol-HDL Cholesterol- (Triglycerides / 5)
각 값은 8 마리에 대한 평균±표준편차를 나타낸 것이다.Each value represents the mean ± standard deviation for 8 animals.
a, b, c, d: 각 실험군 간의 p<0.05의 유의한 차이를 나타낸 것이다. a, b, c, d : It showed a significant difference of p <0.05 between each experimental group.
표 5에 나타난 바와 같이, 혈장 내 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 인지질 농도는 세포외다당체 혹은 세포내다당체를 투여한 흰쥐에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 그러나, 세포외다당체가 세포내다당체보다 저지혈증 활성이 보다 강하였으며, 혈장의 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 인지질 농도를 각각 31.0, 39.0, 35.4 및 28.1%으로 낮추었다.As shown in Table 5, plasma total cholesterol, LDL cholesterol, triglyceride and phospholipid concentrations were significantly reduced compared to the control group in rats treated with extracellular or intracellular polysaccharides. However, extracellular polysaccharides had stronger hypolipidemic activity than intracellular polysaccharides and lowered the total cholesterol, LDL cholesterol, triglyceride and phospholipid concentrations of plasma to 31.0, 39.0, 35.4 and 28.1%, respectively.
1)표 2와 동일함. 1) Same as Table 2.
2)(총 콜레스테롤 - HDL 콜레스테롤)/HDL 콜레스테롤 2) (Total Cholesterol-HDL Cholesterol) / HDL Cholesterol
3)HDL 콜레스테롤/총 콜레스테롤 3) HDL cholesterol / total cholesterol
각 값은 8 마리에 대한 평균±표준편차를 나타낸 것이다.Each value represents the mean ± standard deviation for 8 animals.
a, b, c, d: 각 실험군 간의 p<0.05의 유의한 차이를 나타낸 것이다. a, b, c, d : It showed a significant difference of p <0.05 between each experimental group.
표 6에 나타난 바와 같이, 혈장 내 HDL 콜레스테롤 농도, 동맥경화 지수 및 HTR은 세포외다당체나 혹은 세포내다당체를 투여한 실험군에서 유의하게 증가하였으며 또한 세포외다당체가 보다 효과적임이 입증되었다. 세포외다당체는 실제로 혈장의 HDL 콜레스테롤과 HTR을 24.2% 와 47.6%으로 증가시켰으며 동맥경화 지수를 대조군에 비해 53.5%로 감소시켰다.As shown in Table 6, HDL cholesterol concentration, arteriosclerosis index and HTR in plasma were significantly increased in the experimental group administered with extracellular or intracellular polysaccharides, and the extracellular polysaccharides proved more effective. Extracellular polysaccharides actually increased plasma HDL cholesterol and HTR to 24.2% and 47.6% and decreased arteriosclerosis index to 53.5% compared to the control group.
간 지질에 대한 영지버섯의 세포외다당체와 세포내다당체의 효과는 표 7에 나타내었다.The effects of extracellular and intracellular polysaccharides of Ganoderma lucidum on hepatic lipids are shown in Table 7.
1)표 2와 동일함. 1) Same as Table 2.
NS: 유의성 없음 NS : no significance
각 값은 8 마리에 대한 표준±표준편차를 나타낸 것이다.Each value represents the standard ± standard deviation for 8 animals.
a, b, c: 각 실험군 간의 p<0.05의 유의한 차이를 나타낸 것이다. a, b, c : p <0.05 was significantly different between the experimental groups.
표 7에 나타난 바와 같이, 간의 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 인지질의 농도는 세포외다당체를 투여한 실험군에서 대조군에 비해 22.4%, 23.1% 및 12.9%으로 유의하게 감소되었으며, 세포내다당체를 처리한 군에서는 15.3%, 8.4% 및 7.0%로 감소되었다.As shown in Table 7, the total cholesterol, triglyceride, and phospholipid concentrations of the liver were significantly reduced to 22.4%, 23.1%, and 12.9% in the experimental group to which the extracellular polysaccharide was administered. In 15.3%, 8.4% and 7.0%.
현재 알려진 바에 따르면, 아테롬성 동맥경화증의 위험은 신체 내 총 콜레스테롤 농도 보다는 혈장의 LDL 농도에 보다 더 의존적이다. 최근 흥미로운 한 피부학적 발견에서 HDL의 농도는 아테롬성 동맥경화증의 위험에 역비례함을 입증하였다. 즉, 혈장 내 LDL과 총 콜레스테롤의 상당한 감소는 간 조직의 총 콜레스테롤의 생산을 감소시키며, 여러 조직에서 차후의 재생없이 LDL 콜레스테롤을 효과적으로 제거할 수 있다는 것이다. 따라서, 이는 본 실시예에서 세포외다당체와 세포내다당체를 투여한 경우 간 조직의 지질 농도가 감소한 결과는 상기의 제안과 일치하는 것이다. 예상컨대, 세포외다당체와 세포내다당체에 의해, 간 조직에서 지질 대사를 제어함으로써 달성되었을 것이다.As is currently known, the risk of atherosclerosis is more dependent on the LDL concentration of plasma than on the total cholesterol concentration in the body. One interesting dermatological finding recently demonstrated that the concentration of HDL is inversely proportional to the risk of atherosclerosis. In other words, a significant reduction in LDL and total cholesterol in plasma reduces the production of total cholesterol in liver tissue and can effectively remove LDL cholesterol without subsequent regeneration in various tissues. Therefore, this results in a decrease in the lipid concentration of liver tissue when the extracellular polysaccharide and the intracellular polysaccharide in this embodiment is in agreement with the above proposal. Presumably, extracellular and intracellular polysaccharides would have been achieved by controlling lipid metabolism in liver tissue.
본 실시예를 통해, 비록 영지버섯의 세포외다당체의 저지혈증 효과의 정확한 메카니즘은 여전히 불명확하지만, 콜레스테롤의 흡수 및 생합성 억제, LDL 전구체인 초저농도 지단백의 생합성 억제 및 LDL 전환율의 촉진 및 담즙산의 분비 증가와 같이 고지혈증에 대해 세포외다당체의 연합효과의 가능성을 배제할 수는 없다. 따라서, 앞으로 저지혈증 효과의 정확한 메카니즘을 설명하고 고지혈증 상태를 완화시킴에 있어 예방적 치료적 목적에 유용하도록 활성원을 분리하기 위한 화학적 약학적 조사가 필요하리라 사료된다.Through this example, although the exact mechanism of the hypolipidemic effect of extracellular polysaccharide of Ganoderma lucidum is still unclear, inhibition of absorption and biosynthesis of cholesterol, inhibition of biosynthesis of LDL precursor ultra low concentration lipoprotein, promotion of LDL conversion and secretion of bile acids Likewise, the possibility of the associated effect of extracellular polysaccharides on hyperlipidemia cannot be ruled out. Therefore, it would be necessary to investigate the exact mechanism of the hypolipidemic effect and to investigate the chemical and pharmaceutical investigation to separate the active source to be useful for prophylactic therapeutic purposes in alleviating hyperlipidemia.
이상과 같이 본 발명은 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명 영지버섯의 균사체 액체배양으로부터 생산된 세포외다당체 혹은 세포내다당체를 고지혈증 흰쥐에 경구투여한 결과 대조군에 비해 저지혈증 효과가 증가하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명 세포외다당체 및 세포내다당체는 혈장 내 총 콜레스테롤, 트리글라이세라이드, 인지질, 동맥경화 지수 및 LDL 콜레스테롤의 농도를 감소시킬뿐 아니라 간의 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 인지질 농도를 감소시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명 영지버섯 유래의 세포외다당체 혹은 세포내다당체는 저지혈증 효과가 있으므로 상기 다당체를 유효성분으로하는 고지혈증 치료용 조성물을 제공할 수 있어 약학산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described above, the present invention, as described through the examples, the extracellular polysaccharide or intracellular polysaccharide produced from the mycelium liquid culture of the Ganoderma lucidum mushroom of the present invention orally administered to hyperlipidemic rats excellent effect that the hypolipemia effect compared to the control group It works. In addition, the present invention extracellular and intracellular polysaccharides not only reduce the concentration of total cholesterol, triglycerides, phospholipids, arteriosclerosis index and LDL cholesterol in plasma, but also reduce the total cholesterol, triglyceride and phospholipid concentrations in the liver. There is. Therefore, the extracellular polysaccharide or intracellular polysaccharide derived from Ganoderma lucidum of the present invention has a hypolipemia effect, and therefore, it is possible to provide a composition for treating hyperlipidemia using the polysaccharide as an active ingredient, which is a very useful invention in the pharmaceutical industry.
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