KR100454913B1 - Methods for identification of Korean wild mountain ginseng - Google Patents
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Abstract
본 발명은 한국산 산삼의 판별방법에 관한 것으로, 적은 양의 한국산 산삼과 중국산 산삼 시료를 이용하여 형태학적 특성 분석, 유전학적 특성 분석, 단백체학적 특성 분석 및 생리활성물질 분석을 차례로 수행하고 그 결과를 비교함으로서 한국산 산삼과 중국산 산삼을 정확히 판별하는 뛰어난 효과가 있다.The present invention relates to a method for discriminating Korean wild ginseng, using a small amount of Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng samples to perform morphological characterization, genetic characterization, proteomic characterization, and bioactive substance analysis. By comparing, it has an excellent effect of accurately discriminating Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng.
Description
본 발명은 한국산 산삼의 판별방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 한국산 산삼의 형태학적 특성, 유전학적 특성, 단백체학적 특성 및 함유된 생리학적 활성물질을 분석하여 한국산 산삼을 판별하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for discriminating Korean wild ginseng. More specifically, the present invention relates to a method for determining Korean wild ginseng by analyzing the morphological characteristics, genetic characteristics, proteomic properties, and contained physiologically active substances of Korean wild ginseng.
한국산 산삼이란 국내의 심산유곡에서 야생상태로 자생하고 있는Panax ginsengC.A. Meyer라는 종에 속하는 인삼이라고 정의할 수 있다. 또한 한국산 산삼에는 그 파종 기원에 따라 천연산삼과 산양삼(山養蔘) 두 부류로 크게 나눌 수 있다. 한편, 산양삼이라 함은 심산에서 야생적으로 재배가 되었으므로 일반 재배인삼과 구분되고, 최초 파종이 사람의 손에 의해 이루어지므로 천연산삼과 또한 구분이 되고 있다. 이와 같은 의미의 산양삼에는 최초 파종방식에 따라 여러 종류로 분류할 수 있다. 첫째, 천연산삼의 종자를 산중에 파종하여 가꾸는 것, 둘째, 천연산삼의 유근을 심산중에서 채취하여 적당한 위치의 산림 중에 재이식하여 가꾸는 것, 셋째, 재배인삼의 종자를 산림 중에 파종하여 가꾸는 것 등으로 분류가 되는데, 현재 유통되는 대부분의 산양삼은 세번째의 경우에서 기원 되었음을 알 수 있다. 그리고 산양삼은 일반 대중에게 장뇌삼(長腦蔘) 이라고도 알려져 있는데, 형태학적으로 볼 때 뇌두 부분이 길다고 하여 붙여진 일반 명칭이다. 그러나 본 발명에서 산삼이라 함은 천연산삼 및 산양삼을 모두 일컫는 일반 명칭으로 정의한다.Korean wild ginseng is a native of Panax ginseng C.A. It can be defined as ginseng belonging to a species called Meyer. Also, Korean wild ginseng can be divided into two types, wild ginseng and mountain ginseng. On the other hand, goats are classified as wild ginseng because they were cultivated wild in the mountains, and is also distinguished from wild ginseng because the first sowing is made by human hands. Goats ginseng in this sense can be classified into several types according to the initial seeding method. First, sowing seeds of wild ginseng in the mountains, second, harvesting the roots of wild ginseng from deep mountains, and transplanting them in the forest at the appropriate location; Most goat ginseng in circulation is originated in the third case. And goats are known to the general public as long brain ginseng (長 腦 蔘), morphologically in view of the general name given to the long brain part. However, in the present invention, the wild ginseng is defined by a general name referring to both natural wild ginseng and wild ginseng.
오래전부터 천연산삼은 민간인들에 의한 경험으로 개발되어 약용으로 이용되면서 과다한 채굴로 점차적으로 고갈되기 사작하면서 인삼의 재배법이 발달하기 시작하였고, 조선시대의 숙종 영종대에는 더욱 문제가 심각해져서 재배인삼과 산삼의 재배가 본격화되기 시작하여 현재에 이르고 있다. 그리고 현재 정부차원에서는 식물자원의 보호라는 명목으로 재배삼 씨앗을 전국 산악지역에 매년 공중 파종하고 있고, 특히 민간차원에서는 산삼 재배법을 개발하고 활성화시키고 있다.Since ancient times, wild ginseng has been developed by the experience of civilians and used for medicinal purposes and gradually depleted by excessive mining, and the growing method of ginseng began to develop. Cultivation of wild ginseng has begun to reach full scale. At the current government level, cultivated ginseng seeds are sown annually in mountainous areas across the country in the name of protecting plant resources. Especially, the private level is developing and activating cultivated wild ginseng.
산삼 재배의 근본 목적은 약초식물로서 매우 중요한 천연산삼의 희귀성 문제를 극복하면서 약리효능 및 사람들의 심리효과는 천연산삼에 훨씬 못 미치지만 미흡하게나마 대용으로서의 가치를 인정 받고 있다. 그러나 일부 산삼 재배자들은 속성재배의 욕심으로 일반 재배인삼과 똑같이 비료와 농약처리에 의한 일반 인삼 재배 관리법을 그대로 적용하여 산삼으로서의 가치를 떨어뜨리고 있다. 상기와 같이 재배된 산삼은 자연적인 조건 하에서 최소 10년 이상 성장한 산삼과는 약초로서의 품질등급이 구분되어야 할 필요가 있다.The primary purpose of wild ginseng cultivation is to overcome the rare problem of wild ginseng, which is very important as a herbaceous plant, and its pharmacological efficacy and people's psychological effects are far less than natural wild ginseng, but they are recognized as a substitute. However, some wild ginseng growers are declining their value as wild ginseng by applying the general ginseng cultivation management method by fertilizer and pesticide treatment just like common ginseng. The wild ginseng cultivated as described above needs to be distinguished from the wild ginseng, which has grown for at least 10 years under natural conditions.
근간에는 중국산 산삼이 대량으로 국내로 밀반입 되면서 우리나라 산삼과 혼동되어 고가의 가격으로 불법 유통되고 있어 새로운 사회적 문제로서 대두되고 있다. 근래에 들어와서 중국산 산삼의 근원이 우리나라 지역에서 유래한 재배 인삼 씨앗일 가능성이 높다는 견해가 있고, 재배기술이나 지리적 조건이 뒤쳐지지 않고 오히려 더 넓은 재배입지조건이 조성되어 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 조건에서 재배인삼과 같이 대량으로 재배된 중국산 산삼들은 밀수입자들에 의해 국내의 산삼 가격보다 훨씬 낮은 가격으로 손쉽게 구입이 가능하고, 국내로 밀반입 되어국내산으로 유통될 경우 상당한 가격차에 의한 부당 이득을 발생시키고 있다. 또한 보다 더 큰 문제는 국내산으로 불법 유통될 경우 과학적이고 신뢰성 있게 산지를 판별할 방법이 지금까지는 거의 없었다. 특히 유전학적으로도 같은 근원을 갖을 경우, 최근에 기술이 발달되고 있는 유전자 클로닝(gene cloning)에 의한 조사방법도 단독으로는 산지 판별에 한계성이 있다.In recent years, as Chinese wild ginseng is smuggled into Korea in large quantities, it is confused with wild ginseng in Korea and is illegally distributed at a high price, which is emerging as a new social problem. Recently, there is a view that the origin of Chinese ginseng is likely to be cultivated ginseng seeds originating from Korea, and it is known that wider cultivation conditions are established without falling behind in cultivation technology or geographical condition. Under these conditions, Chinese wild ginseng grown in large quantities, such as cultivated ginseng, can be easily purchased by smugglers at a price much lower than domestic wild ginseng. It is occurring. The bigger problem is that until now, there has been little way to determine scientifically and reliably if it is illegally distributed in Korea. In particular, when genetically having the same source, a method of investigating by gene cloning, which has been recently developed, has a limit in determining a mountain.
이상과 같이 산삼은 생육환경 및 그 산지에 따라서 많은 종류로 분류될 수 있지만 이것들은 자연상태에서 또는 유통과정에서 매우 혼재되어 있으므로 우리나라 자생의 최고 품질등급을 갖는 산삼을 소비자들에게 정확하게 보급하지 못하고 있는 것이 현실이다. 따라서 이러한 현안 문제에 봉착하여 과학적이고 신뢰성 있게 산삼들간에 등급을 설정하고, 소비자들에게 유통되기 전에 산지를 판별하는 과정은 필수적으로 선행되어야 할 필요성이 있다.As mentioned above, wild ginseng can be classified into many kinds according to the growing environment and its place of origin. However, since these are very mixed in the natural state or in the distribution process, wild ginseng having the highest quality grade of Korea's native is not accurately distributed to consumers. Is the reality. Therefore, in the face of these problems, the process of setting the grade between wild ginseng and scientifically and reliably, and determining the place of birth before being distributed to consumers is necessary.
지금까지 수행되어온 산삼의 판별 방법은 시료에 전혀 손상을 입히지 않는 형태학적인 분석이 주를 이루었다. 이것은 산삼이 매우 희귀하여 고가의 약초라는데 이유가 있다. 그러나 형태학적인 분석에는 과학적이고 신뢰성있는 분석결과를 기대하는데 곤란한 점이 많다. 따라서 최근에는 비교적 소량의 시료 부분으로부터 DNA 추출을 하여 보다 과학화된 유전학적 분석방법으로 재배인삼의 산지 판별을 시도한 예가 있다. 하지만 종자의 기원이 같고 단지 생육환경만 다른 경우 유전학적인 판별방법은 또한 그 한계성이 있다. 그러므로 단백질 또는 기타 생리활성 물질의 분석에 의한 산삼의 등급 및 산지 판별은 보다 정확하고 신뢰성 있는 판별방법으로서 필수적이라 할 수 있다. 그러나 현재의 분석기술로는 이와 같은 다양한 분석방법들을 동시에 수행할 경우 많은 시료를 사용하여야 한다는 난점이 있다.The determination method of wild ginseng, which has been performed so far, has been mainly morphological analysis that does not damage the sample at all. This is because wild ginseng is very rare and is an expensive herb. However, morphological analysis has many difficulties in expecting scientific and reliable analysis results. Therefore, in recent years, there has been an example of extracting DNA from a relatively small amount of sample and attempting to determine the origin of cultivated ginseng by more scientific genetic analysis. However, if the seeds are of the same origin and differ only in their growing environment, genetic discrimination is also limited. Therefore, grading of wild ginseng by grading protein or other biologically active substance and production of mountain ginseng is essential as a more accurate and reliable determination method. However, current analytical techniques have a problem that many samples should be used when these various analytical methods are performed simultaneously.
본 발명자들은 상기와 같은 점에 착안하여 판별 대상인 산삼 시료의 극히 일부만을 절취하여 다양한 분석방법들을 동시에 수행하여 한국산 산삼과 중국산 산삼을 구별할 수 있는 방법을 개발하고자 연구한 결과, 최대 50 mg 또는 그 이하의 산삼 건조중량을 사용하여 한국산 산삼과 중국산 산삼의 형태적 특성, 유전학적 특성, 단백체학적 특성을 조사하고 각각에 함유된 생리활성 물질을 분석하여 비교함으로서 한국산 산삼과 중국산 산삼을 구별하는 판별방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.In view of the above, the present inventors cut only a small portion of wild ginseng samples to be discriminated and performed various analytical methods simultaneously to develop a method for distinguishing Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng, up to 50 mg or the like. Determination method to distinguish Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng by examining the morphological, genetic and proteomic properties of Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng using the following dry weights and analyzing and comparing the bioactive substances in each It was developed to complete the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 적은 양의 산삼 시료를 사용하여 분자생물학적, 이화학적 특성을 조사하고 비교함으로서 한국산 산삼을 판별하는 방법을 제공함에 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for determining Korean wild ginseng by examining and comparing molecular biological and physicochemical properties using a small amount of wild ginseng samples.
본 발명의 상기 목적은 한국산 산삼과 중국산 산삼을 디지털 카메라와 육안으로 관찰하고 무게를 측정하여 형태학적 특징을 조사하여 비교하고, 한국산 산삼과 중국산 산삼에서 DNA를 추출하여 RAPD 방법에 의해 유전학적으로 분석하여 비교하고, 한국산 산삼과 중국산 산삼으로부터 단백질을 추출하여 SDS-PAGE 및 2D 전기영동하여 단백체학적 특징을 조사하여 비교하고, 한국산 산삼과 중국산 산삼내 함유된 생리활성 물질을 조사하여 비교함으로서 달성하였다.The object of the present invention is to observe Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng with a digital camera and the naked eye and to weigh and compare the morphological characteristics, and to extract DNA from Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng and genetically analyze it by RAPD method. Comparing by comparing the protein from Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng, SDS-PAGE and 2D electrophoresis to examine the proteomic characteristics, and by comparing the bioactive substances contained in Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng.
이하, 본 발명의 구성을 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described.
도 1a은 본 발명에서 시료로 사용된 한국산 산삼의 전체, 동체부분, 뇌두부분, 세미부분의 모습을 나타낸 사진도이다.Figure 1a is a photograph showing the appearance of the whole, fuselage, brain head, semi-section of Korean wild ginseng used as a sample in the present invention.
도 1b는 본 발명에서 시료로 사용된 중국산 산삼의 전체, 동체부분, 뇌두부분, 세미부분의 모습을 나타낸 사진도이다.Figure 1b is a photograph showing the appearance of the whole, fuselage, brain head, semi-section of Chinese wild ginseng used as a sample in the present invention.
도 2는 본 발명에서 시료로 사용된 한국산 산삼(KM)과 중국산 산삼(CM)의 DNA를 추출하고 정제한 후 프라이머를 사용해 PCR 증폭하여 RAPD 분석한 결과를 나타낸다.Figure 2 shows the results of RAPD analysis by PCR amplification using a primer after extracting and purifying the DNA of Korean wild ginseng (KM) and Chinese wild ginseng (CM) used as a sample in the present invention.
도 3은 본 발명에서 시료로 사용된 한국산 산삼과 중국산 산삼의 메탄올 추출물을 가스크로마토그래피 분석한 패턴과 파낙시놀과 파낙시돌의 함량비를 비교한 결과를 나타낸다.Figure 3 shows the results of comparing the content ratio of the panaxinol and panaxidol pattern and gas chromatography analysis of the methanol extract of Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng used as a sample in the present invention.
도 4는 본 발명에서 시료로 사용된 한국산 산삼과 중국산 산삼의 지방산을 가스크로마토그래피 분석한 결과를 나타낸다.Figure 4 shows the results of gas chromatography analysis of fatty acids of Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng used as samples in the present invention.
도 5는 본 발명에서 시료로 사용된 한국산 산삼과 중국산 산삼의 아미노산을 HPLC 분석한 결과를 나타낸다.Figure 5 shows the results of HPLC analysis of amino acids of Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng used as samples in the present invention.
본 발명은 한국산 산삼과 중국산 산삼의 형태를 디지털 카메라에 의해 전체 및 세부를 촬영하고 육안으로도 관찰한 후 무게 및 길이를 측정하여 중국산 산삼과 한국산 산삼이 구별되는 특징을 분석하는 단계; 한국산 산삼과 중국산 산삼으로부터 DNA를 추출하여 PCR 증폭시킨 후 전기영동하여 DNA 밴드 차이를 분석하는 RAPD 방법으로 중국산 산삼과 구별되는 한국산 산삼의 특징을 분석하는 단계; 한국산 산삼과 중국산 산삼으로부터 단백질을 추출하여 정량하고 상기 추출한 단백질을 SDS-PAGE 및 2D 겔 전기영동하여 단백질 패턴을 비교함으로서 중국산 산삼과 한국산 산삼의 특징을 분석하는 단계 및; 한국산 산삼과 중국산 산삼의 메탄올 추출물을 가스크로마토그래피 분석하여 피크(peak)의 패턴을 비교하고, 또 가스크로마토그래피 분석 결과에 의해 항암 기능성이 있는 파나시돌(panaxydol)과 파낙시놀(panaxynol)의 함량을 분석하여 비교하고, 가스-리퀴드 크로마토그래피 분석하여 각각의 산삼 메탄올 추출물에 함유된 지방산들을 정성 및 정량하여 비교하고, HPLC를 실시하여 아미노산을 분석하여 비교하고, carbazole 발색 후 흡광도 측정에 의한 산성다당체의 함량을 비교하고, 가스-리퀴드 크로마토그래피에 의해 페놀성분을 분석하여 비교하는 단계로 구성된다.The present invention comprises the steps of analyzing the characteristics of the Chinese wild ginseng and Korean wild ginseng by measuring the weight and length after photographing the whole and the details of the Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng by digital camera and observing the naked eye; Extracting DNA from Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng, PCR amplifying and electrophoresis to analyze the characteristics of the Korean wild ginseng distinguished from Chinese wild ginseng by RAPD method to analyze DNA band differences; Extracting and quantifying proteins from Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng, and analyzing the characteristics of Chinese wild ginseng and Korean wild ginseng by comparing protein patterns by SDS-PAGE and 2D gel electrophoresis; Methanol extracts of Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng were analyzed by gas chromatography to compare peak patterns, and gas chromatography analysis of panaxydol and panaxynol showed anticancer activity. Analyze and compare the contents, gas-liquid chromatography analysis, qualitative and quantitative comparison of fatty acids contained in each wild ginseng methanol extract, HPLC and amino acid analysis by comparison, acidity by measurement of absorbance after carbazole color development Comparing the content of the polysaccharide, and analyzing and comparing the phenol component by gas-liquid chromatography.
본 발명에서 사용한 산삼시료 중 한국산 산삼은 정확히 말하면 한국산 장뇌삼(KM1: Korean mountain ginseng No.1∼KM14)이며 강원도 인제 지역에서 채취한 것이고, 중국산 산삼도 정확히 말하면 중국산 장뇌삼(CM1: Chinese mountainginseng No.1∼CM7)으로 연변 지역에서 채취된 것으로 두 종류 모두 약 15년의 수령을 갖는다.Among the wild ginseng samples used in the present invention, Korean wild ginseng is exactly Korean Korean ginseng No. 1 to KM14, which is taken from Inje, Gangwon-do, and Chinese wild ginseng is also known as Chinese mountain ginseng No. 1 CM7) were collected in Yanbian, both of which have a age of about 15 years.
본 발명은 한국산 산삼과 외국 산삼을 보다 과학적이고 신뢰성 있게 판별하기위해 기존에 수행되어 왔던 형태학적인 판별방법이나 또는 최근에 보다 과학적인 방법으로서 유전자 분석에 의한 판별방법을 적용하기에는 모호성과 한계성이 존재하는 문제점을 단백질 패턴 분석과 여러 종류의 생리활성 물질 분석을 추가로 실시하여 해결한 장점이 있고 형태적, 유전학적, 단백체학적, 생리활성물질 분석의 총 4단계 분석과정을 거쳐 산삼의 산지 판별에 정밀도를 극대화시키므로 산지의 판별은 물론 품질 등급까지도 정확히 판별할 수 있는 장점이 있다.The present invention has ambiguity and limitations in applying the morphological discrimination method that has been performed in the past for the scientific and reliable discrimination between Korean wild ginseng and foreign wild ginseng, or the discrimination method by genetic analysis as a more scientific method. The problem is solved by further analyzing the protein pattern and analyzing various kinds of bioactive substances, and the precision of wild ginseng is determined through the four steps analysis of morphological, genetic, proteomic and bioactive substances. Maximizing the quality of the mountain, as well as the determination of the mountain has the advantage that can be accurately determined.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the specific method of the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited only to these Examples.
실시예 1: 형태학적 분석에 의한 한국산 산삼의 판별Example 1 Discrimination of Korean Wild Ginseng by Morphological Analysis
본 실시예에서는 먼저 디지털 카메라를 사용하여 한국산 산삼과 중국산 산삼의 전체사진, 동체사진, 동체의 주름 사진, 세미의 사진, 뇌두의 사진등을 전후좌우 방향에서 각각 촬영하였고 육안으로 세미의 마디/방향/수, 전체 모습, 동체의 주름 정도, 뿌리의 색감, 뇌두의 전체 형태 및 마디 형태, 턱수의 수를 관찰하였다. 또 길이 및 지름 측정 도구를 이용하여 전체 길이, 동체의 길이 및 지름, 세미의 길이(가장 긴 것), 뇌두의 길이 및 지름을 측정하였고 생체 중량을 측정하였다.In the present embodiment, first, the whole photograph, fuselage photo, fuselage photo, semi photo and brain photo of Korean ginseng and Chinese ginseng are photographed from the front, rear, left and right directions using a digital camera. / Number, overall appearance, the degree of wrinkles of the fuselage, the color of the root, the overall and nodal form of the brain head, the number of the number of head. The length and diameter measurement tools were used to measure the overall length, the length and diameter of the fuselage, the length of the semi (the longest), the length and the diameter of the brain head, and the biomass.
실험결과, 한국산 산삼은 도 1a에 나타낸 바와 같고, 중국산 산삼은 도 1b에나타낸 바와 같이, 여러가지 분석항목 중 동체의 최대지름에 대한 동체의 길이 비율의 비교 분석 결과는 국내 산삼 표본 모집단에서는 평균값 6.8, 최소 5.0 이상 이였고, 반면에 중국산 산삼 표본 모집단에서는 평균값 2.6, 최대 3.7로 더 낮은 수준으로 조사되었다. 따라서 동체의 최대지름에 대한 동체의 길이 비율에 따른 국내 산삼으로의 판단 기준은 최소 5.0 이상 일 때로 정할 수 있었다. 한편 세미의 수 비교에 있어서도 두 표본 집단간에 차이가 있었는데, 국내 산삼 표본 모집단의 경우 평균 7개, 최대 10개인 반면, 중국산 산삼 표본 모집단에서는 평균 18개, 최소 12개로 조사되었다. 따라서 세미의 수가 10개 이하로 존재하는 경우 국내 산삼일 가능성이 크다고 할 수 있다.As a result, Korean wild ginseng is shown in FIG. 1A, and Chinese wild ginseng is shown in FIG. 1B. Among the various analysis items, a comparative analysis result of the length ratio of the body to the maximum diameter of the body was 6.8, At least 5.0 and above, while the Chinese wild ginseng sample population was lower than the average value of 2.6 and the maximum of 3.7. Therefore, the criterion for domestic wild ginseng according to the ratio of the length of the fuselage to the maximum diameter of the fuselage could be determined at least 5.0. On the other hand, there was also a difference between the two sample groups in the number of semis. On the other hand, the domestic wild ginseng sample population averaged 7 and a maximum of 10, while the Chinese wild ginseng sample population averaged 18 and at least 12. Therefore, if the number of semi is less than 10, it can be said that the domestic wild ginseng.
실시예 2: RAPD 분석에 의한 한국산 산삼 판별Example 2: Korean wild ginseng determination by RAPD analysis
본 실시예에서는 산삼시료로부터 DNA를 추출 및 정제하여 RAPD 분석을 실시하기 위해, Draper and Scott의 방법을 변형시킨 DNA 추출법을 사용하였다. 동결 건조된 시료 10 mg을 sand와 함께 분쇄 후 2×CTAB buffer로 전체 DNA를 추출하였다. 원심분리 후 DNA가 포함된 상등액은 동량의 페놀/클로로포름 용액 (phenol/chloroform solution)으로 3-4회 정제하였다. 정제된 DNA 추출액에서 에탄올 침전과 원심분리에 의해 순수 DNA 입자만을 얻었다. 이것은 0.1 × TE buffer에 용해 시키고 RNase 처리하였다. 최종 DNA 농도와 순도는 분광광도계 (spectrophotometer)에 의해 측정되었다. PCR에 의한 DNA의 증폭 조건 및 전기영동은 먼저, PCR에 사용된 랜덤 프라이머(random primer)는 ㈜서린생명과학연구소(SRILS)에서 자체 개발한 12종류의 20mer로 이루어진 프라이머 셋(primer set)을 이용하였다. 이것은 55 ℃ 이상에서의 어닐링(annealing)으로 높은 재현성을 나타내고, 다양한 생물종에 적용 가능한 다범위성이 있는 것이 특징이다. 본 실험에서는 100 ng의 프라이머(primer)와 50내지 200 ng의 게놈 DNA(genomic DNA)를 이용하여 초기 94 ℃에서 4분 반응 후, 94 ℃에서 1분, 57 ℃에서 1분, 72 ℃에서 2분의 순환을 35회 반복한 후 최후에 72 ℃에서 7분가 추가 반응시켰다. 반응이 끝난 산물(product)은 1.5 % 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동 후 EtBr로 염색하여 image analyzer(Biorad사)로 DNA band 차이를 분석하였다.In this example, in order to perform RAPD analysis by extracting and purifying DNA from wild ginseng sample, a DNA extraction method modified from Draper and Scott's method was used. 10 mg of the lyophilized sample was ground with sand, and total DNA was extracted with 2 × CTAB buffer. After centrifugation, the supernatant containing DNA was purified 3-4 times with the same amount of phenol / chloroform solution. Only pure DNA particles were obtained by ethanol precipitation and centrifugation from the purified DNA extract. It was dissolved in 0.1 × TE buffer and RNase treated. Final DNA concentration and purity were measured by spectrophotometer. DNA amplification conditions and electrophoresis by PCR first, random primers used in PCR using a primer set consisting of 12 kinds of 20mers developed by SRILS (SRILS) It was. It is characterized by high reproducibility by annealing at 55 ° C. or higher and having a wide range applicable to various species. In this experiment, using 100 ng of primer and 50 to 200 ng of genomic DNA, the reaction was performed at 94 ° C for 4 minutes, 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 57 ° C, and 2 at 72 ° C. The minute cycle was repeated 35 times, and then 7 minutes were further reacted at 72 ° C. After completion of the reaction, the product was electrophoresed on 1.5% agarose gel and stained with EtBr, and the DNA band difference was analyzed by an image analyzer (Biorad).
실험결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 12종류의 프라이머(primer) 중에서 5'-ATgTgTgCgATCAgTTgCTg-3'의 염기서열을 갖는 프라이머(primer)를 사용하여 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)를 실시했을 때 국내 산삼과 중국산 산삼을 구별할 수 있는 DNA polymorphism 가 나왔다. 570 bp와 960 bp는 국내 산삼에서만 나타나는 DNA band 였고, 1050 bp는 중국산 산삼에서만 나타나는 DNA band 였다.As a result, as shown in FIG. 2, domestic wild ginseng when RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) was performed using a primer having a nucleotide sequence of 5'-ATgTgTgCgATCAgTTgCTg-3 'among 12 kinds of primers DNA polymorphism has been identified to distinguish Chinese wild ginseng. 570 bp and 960 bp were DNA bands found only in Korean wild ginseng, and 1050 bp were DNA bands only found in Chinese wild ginseng.
상기 결과에 따르면 기존의 RAPD 방법은 많은 수의 랜덤 프라이머를 사용하여 통계처리가 가능한 수준 이상의 DNA polymorphism 결과를 얻어야만 그 과학적 가치성을 인정 받았으나 이 방법은 일반적으로 8개 내지 10개의 염기서열로 이루어진 프라이머를 사용하고, PCR 반응시 어닐링 온도를 35 ℃ 부근에서 수행함으로써 재현성에 큰 문제점을 갖고 있었고 산삼의 산지 구별에 위의 방법을 응용함에 있어서 매번 많은 종류의 프라이머(primer)에 대한 PCR 반응과 그 결과들을 분석하고통계처리 해야 한다는 번거로움이 있었다. 따라서, 본 발명에서 사용된 프라이머(primer)는 20개의 염기서열로 구성되어 있으며, 어닐링(annealing) 온도는 55 내지 60 ℃ 부근에서 수행되므로 재현성이 매우 높았다. 비록 한 종류의 프라이머에 대한 RAPD 분석이지만 위의 사실을 고찰해 볼 때, 국내 산삼과 중국산 산삼을 구분할 수 있는 DNA band들은 RAPD marker로 사용될 수 있다.According to the above results, the conventional RAPD method was recognized scientific value only by obtaining a DNA polymorphism result that can be statistically processed using a large number of random primers, but this method is generally a primer consisting of 8 to 10 nucleotide sequences. And the annealing temperature in the PCR reaction near 35 ℃ has a big problem in the reproducibility, and in the application of the above method to the distinction of wild ginseng, PCR reactions for many kinds of primers and the result There was the hassle of analyzing and statistics. Therefore, the primer (primer) used in the present invention is composed of 20 base sequences, the annealing (annealing) temperature is performed in the vicinity of 55 to 60 ℃ was very high reproducibility. Although RAPD analysis of one type of primer, considering the above facts, DNA bands that can distinguish domestic wild ginseng and Chinese wild ginseng can be used as RAPD markers.
실시예 3: 2차원 전기영동의 단백체학적 분석에 의한 한국산 산삼 판별Example 3: Korean Ginseng Discrimination by Proteomic Analysis of Two-Dimensional Electrophoresis
본 실시예에서는 시약으로 TCA 용액 A(TCA solution A)는 0.07% 2-메캡토에탄올을 함유하는 아세톤 내 10% 트리클로로아세트산(10% trichloroacetic acid in acetone containing 0.07% 2-mercaptoethanol), 용액 B는 1mM PMSF와 2mM EDTA를 포함하는 아세톤내 0.07% 2-머캡토에탄올(0.07% 2-mercaptoethanol in acetone containing 1 mM PMSF and 2 mM EDTA)을 준비하였고 산삼시료로부터 총 단백질의 추출은 먼저 동결건조 후 분쇄된 시료 10 mg에 TCA solution A 100 ㎕를 첨가하여 현탁시키고 45분 동안 20 ℃에서 방치하였다가 35000 g, 15분간 원심분리하고 침전물을 용액 B 100 ㎕로 현탁하고 1시간 동안 20℃에서 방치하였다가 원심분리하여 얻은 침전물을 동결건조 한 후 등점초점화 용매(electrofocusing solvent)로 현탁하고 1시간 동안 37 ℃에서 교반(stirring)하고 19000 g, 10분간 원심분리한 후 상등액은 단백질 정량 및 2D 겔 전기영동(2D gel electrophoresis)을 위해 사용하였다.In this example, TCA solution A as a reagent is 10% trichloroacetic acid in acetone containing 0.07% 2-mercaptoethanol, and solution B is 0.07% 2-mecaptoethanol. 0.07% 2-mercaptoethanol in acetone containing 1 mM PMSF and 2 mM EDTA (0.07% 2-mercaptoethanol in acetone containing 1 mM PMSF and 2 mM EDTA) was prepared and extraction of total protein from wild ginseng sample was first lyophilized and then milled To 100 mg of the prepared sample, 100 µl of TCA solution A was added and suspended. The mixture was left at 45 DEG C for 45 minutes, centrifuged for 15 minutes, and the precipitate was suspended with 100 µl of solution B and left at 20 DEG C for 1 hour. The precipitate obtained by centrifugation was lyophilized, suspended in an electrofocusing solvent, stirred at 37 ° C. for 1 hour, centrifuged at 19000 g for 10 minutes, and the supernatant was subjected to protein quantification and 2D gel electrolysis. It was used for copper (2D gel electrophoresis).
단백질 정량은 변형된 브래드포드 단백질 분석(Modified Bradford proteinassay) 방법을 이용하였다. 쿠마시 블리이언트 블루 G-250(Coomassie brilliant blue G-250)을 첨가하고 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정 후, 측정값을 표준(standard) 단백질로 사용된 오브알부민(ovalbumin)과 글로블린(globulin)에 대한 농도 표준선에 비교하여 추출시료의 단백질량을 측정하였다. SDS-PAGE는 단백질의 분자량차이에 의한 분리시 사용하는 방법으로 상기 단백질 추출방법에 의해 추출된 시료 추출물을 완충용액(10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 현탁시키고 SDS 2.5%, β-머캡토에탄올(β-mercaptoethanol) 5.0% 처리하고 100°C 에서 5분간 가열 후, 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 0.01% 첨가하고 원심분리로 불용성물질 제거한 다음 높은 염농도와 낮은 pH는 결과에 좋지 않은 영향을 미치기 때문에 희석 혹은 탈염하고 pH보정 (NaCl 0.75 M 이하, pH 7-10, NaAc 0.35 M 이상일 경우)을 수행하였다. 이어서, 8 ∼ 25 %의 폴리아크릴 아마이드 겔(bisacrylamide:acrylamide = 1:29)을 사용하여(단백질 분리능, 6-150 kDa) 전기영동 하였으며, 한국산 산삼과 중국산 산삼의 단백질 패턴을 비교하였다.Protein quantification was performed using a modified Bradford proteinassay method. After adding Coomassie brilliant blue G-250 and measuring the absorbance at 595 nm using a spectrophotometer, the measured value was used as a standard protein (ovalbumin). ) And the amount of protein in the sample was measured compared to the concentration standard line for globulin (globulin). SDS-PAGE is a method used for separation by molecular weight difference of proteins. The sample extract extracted by the protein extraction method is suspended in a buffer solution (10 mM Tris / HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0), SDS 2.5%, After treatment with 5.0% β-mercaptoethanol and heating at 100 ° C. for 5 minutes, bromophenol blue was added 0.01%, insolubles were removed by centrifugation, and high salt concentration and low pH were good for the result. Dilution or desalting was performed and pH correction (below NaCl 0.75 M, pH 7-10, NaAc 0.35 M or more) was performed because of no adverse effect. Subsequently, electrophoresis was performed using 8-25% polyacrylamide gel (bisacrylamide: acrylamide = 1:29) (protein resolution, 6-150 kDa), and protein patterns of Korean ginseng and Chinese ginseng were compared.
2D 겔 전기영동은 단백질의 분자량 차이 및 등전점 차이에 의한 이차원적 분리시 사용하는 것으로 상기 시료로부터 단백질 추출방법 후, 염농도가 0.25 M이 되도록 희석 혹은 탈염과정을 수행하고 단백질 정량으로 농도 조정 (0.3-0.5 ng/ul)한 후, 5 %의 IEF용 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여(단백질 분리능, 3-9 pI) 등전초점화(Isoelectrofocusing)를 실시하였다. 등전초점화된 겔에서 한 개의 라인(line)을 가위로 절단 후, SDS-PAGE용 Gel위에 가로방향으로 놓고 SDS-PAGE 실시하고 결과분석은 은염색(Sliver Staining) 방법으로 실시한 후 국내 산삼과 중국산 산삼의 단백질 패턴을 비교하였다.2D gel electrophoresis is used for two-dimensional separation by protein molecular weight difference and isoelectric point difference. After protein extraction method, dilution or desalting is performed so that the salt concentration is 0.25 M and the concentration is adjusted by protein quantification (0.3- 0.5 ng / ul), followed by isoelectrofocusing using 5% polyacrylamide gel for IEF (protein resolution, 3-9 pI). After cutting one line with isoelectric focusing gel with scissors, place SDS-PAGE on the gel for SDS-PAGE horizontally and analyze the result by silver staining method. The protein pattern of was compared.
실험결과, SDS-PAGE의 경우, 한국산 산삼 시료에서는 23 kDa의 band가 뚜렷이 나타나나 중국산 산삼 시료에서는 나타나지 않았다. 2D-PAGE의 경우, 국내 산삼에서는 43 kDa, 5.6 pI에서 확연한 스팟(spot)을 보이나, 중국산 산삼에서는 나타나지 않는다. 따라서 보다 정확하게 한국산 산삼과 중국산 산삼을 구분할 수 있었다. 따라서, 43 kDa, 5.6 pI 단백질을 국내 산삼의 판정 척도 단백질로 삼았다.As a result, SDS-PAGE showed a clear band of 23 kDa in Korean wild ginseng samples, but not in Chinese wild ginseng samples. In case of 2D-PAGE, domestic wild ginseng showed a clear spot at 43 kDa and 5.6 pI, but not in Chinese wild ginseng. Therefore, Korean ginseng and Chinese ginseng could be distinguished more accurately. Therefore, 43 kDa, 5.6 pI protein was used as the determination scale protein of wild ginseng.
실시예 4: 생리활성 물질 분석에 의한 한국산 산삼 판별Example 4: Korean wild ginseng determination by physiologically active substance analysis
제 1 공정: GC 크로마토그램 패턴 비교Process 1: Comparing GC Chromatogram Patterns
산삼 시료를 동결건조 후 분쇄시킨 30 mg을 0.6 mL MeOH로 60분간 초음파 파쇄(sonication )하고 원심분리 후 상등액(메탄올 추출물) 약 0.5 mL을 회수하고 메탄올 추출물 100 ㎕을 취하여 질소기류하에서 완전히 건조시킨 후 20 ㎕ BSA(N,O- bis(trimethylsilyl)-acetamide)를 첨가하여 85 ℃ 에서 60 분 동안 GC 분석을 위한 TMS 유도체화 반응을 실시하였다. GC 분석조건을 보면 컬럼은 SE-54 capillary (30 m length × 0.25 mm I.D., Alltech), 검출온도는 300 ℃, 주입온도는 260℃, 컬럼온도 및 조건은 100℃→ 4℃/min→ 290℃(20 min)이고 유속은 0.7 mL/min이며 분배비(Split Ratio)는 1:50, 주입량은 2 ㎕이였다.After freeze-drying the wild ginseng sample, 30 mg of crushed 30 mg was sonicated for 60 minutes with 0.6 mL MeOH, and after centrifugation, about 0.5 mL of the supernatant (methanol extract) was recovered, 100 μl of methanol extract was taken, and dried completely under nitrogen stream. 20 μl BSA (N, O-bis (trimethylsilyl) -acetamide) was added to perform TMS derivatization for GC analysis at 85 ° C. for 60 minutes. In the GC analysis conditions, the column is SE-54 capillary (30 m length × 0.25 mm ID, Alltech), detection temperature is 300 ℃, injection temperature is 260 ℃, column temperature and conditions from 100 ℃ → 4 ℃ / min → 290 ℃ (20 min), flow rate was 0.7 mL / min, split ratio was 1:50, and injection volume was 2 μl.
실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 메탄올 추출물의 GC 분석결과 가스 크로마토그램(gas chromatogram) 상의 유효성분 피크(peak)는 총 10개 였고, 국내 산삼과 중국산 산삼 간에 차이를 나타내는 것은 피크 10 이였다. 국내 산삼 표본 모집단의 분석결과 피크 10의 평균 면적 퍼센트는 0.027 % 였고, 최소 0.014 % 이였다. 반면 중국산 산삼 표본 모집단에서는 평균 면적 퍼센트가 0.015 %, 최대 0.022 % 이였다. 따라서 GC 패턴 분석에 의한 국내 산삼으로 판단기준은 피크 10의 면적 퍼센트가 최소 0.022 % 이상일 때로 정하였다.As a result, as shown in FIG. 3, the GC analysis of the methanol extract showed a total of 10 active ingredient peaks on a gas chromatogram, and a peak of 10 indicates a difference between domestic wild ginseng and Chinese wild ginseng. The average area percentage of peak 10 was 0.027%, which was at least 0.014%. On the other hand, in the Chinese wild ginseng sample population, the average area percentage was 0.015% and the maximum was 0.022%. Therefore, the criteria for the determination of domestic wild ginseng by GC pattern analysis was determined when the area percentage of peak 10 was at least 0.022%.
제 2 공정: 폴리아세틸렌계 성분인 파낙시놀과 파낙시돌의 함량비 분석2nd process: content ratio analysis of panaxinol and panaxidol which are polyacetylene-type components
상기 제 1 공정에서 실시한 메탄올 추출물의 GC 패턴 비교와 동시에 파낙시놀(panaxynol)과 파낙시돌(panaxydol)을 동시에 분석하였다.Panaxynol and panaxydol were simultaneously analyzed while comparing the GC patterns of the methanol extracts carried out in the first step.
실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 파낙시돌(panaxydol)에 대한 파낙시놀(panaxynol)의 함량비는 한국산 산삼과 중국산 산삼을 구분할 수 있는 기준으로 나타났다. 한국산 산삼 표본 모집단의 분석결과 평균 함량비는 1.9, 최소 1.4 이상 이였고, 반면에 중국산 산삼 표본 모집단의 경우 평균 함량비는 1.0, 최대 1.3으로 조사 되었다. 따라서 파낙시돌(panaxydol)에 대한 파낙시놀(panaxynol)의 함량비에 따른 국내 산삼으로 판단기준은 최소 1.4 이상일 때로 정하였다.As a result, as shown in FIG. 3, the content ratio of panaxynol to panaxydol was shown as a standard for distinguishing Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng. The average content ratio of Korean wild ginseng sample population was 1.9 and at least 1.4, while the average content ratio of Chinese wild ginseng sample population was 1.0 and 1.3, respectively. Therefore, domestic wild ginseng according to the content ratio of panaxynol to panaxydol was determined to be at least 1.4.
제 3 공정: 지방산 성분 분석Third Process: Fatty Acid Analysis
산삼시료로부터 얻은 메탄올 추출물 30 ㎕ 를 취하여 질소기류하에서 완전히 건조시키고 BF3-MeOH 10 ㎕와 혼합 후 끓는 물에서 30초간 메틸레이션 (methylation) 유도체화 반응을 시켰다. GLC 분석을 위해 컬럼은 EC-WAX capillary (30 m length × 0.32 mm I.D., Alltech)를 사용하였고, 검출온도는 300 ℃, 주입온도 250 ℃, 컬럼온도 조건은 100 ℃ →7 ℃/min→ 220 ℃ (15 min)이였고, 유속은 1.8 mL/min으로 하였고 분배비는 1:20으로 하였다.30 µl of methanol extract obtained from wild ginseng sample was taken, dried completely under nitrogen stream, mixed with 10 µl of BF3-MeOH, and subjected to methylation derivatization for 30 seconds in boiling water. EC-WAX capillary (30 m length × 0.32 mm ID, Alltech) was used for the GLC analysis.The detection temperature was 300 ° C, injection temperature 250 ° C, and column temperature was 100 ° C → 7 ° C / min → 220 ° C. (15 min), the flow rate was 1.8 mL / min and the partition ratio was 1:20.
실험결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 메탄올 추출물의 지방산 분석 결과 총 4종류를 동정할 수 있었다. 불포화지방산인 올레산(oleic acid)과 리놀레산 (linoleic acid)에 대한 포화지방산인 팔미트산(palmitic acid)과 스테아르산 (stearic acid)의 함량비는 국내 산삼 표본 모집단의 경우 평균값 4.32, 표준편차 2.89 이였고, 중국산 산삼 표본모집단의 경우 평균값 5.1, 표준편차 1.6 으로 분석되었는데 약간의 차이는 있으나 서로 구분할 수 있을 정도의 차이는 아닌 것으로 조사되었다. 함량비 값이 낮을수록 지방산의 불포화도가 높다는 것으로서 약리활성 측면에서 유리한 조건이 될 수 있다. 따라서 함량비가 4.32 이하일 경우 산삼으로서의 우수성을 간접적으로 인정할 수 있는 기준이 되었다.As a result, as shown in Figure 4, a total of four types of fatty acid analysis of the methanol extract was identified. The ratio of saturated fatty acid palmitic acid and stearic acid to unsaturated fatty acid oleic acid and linoleic acid was 4.32 and standard deviation 2.89 for Korean wild ginseng sample population. In the case of Chinese wild ginseng sample population, the mean value was 5.1 and the standard deviation was 1.6. There were some differences, but they were not distinguishable. The lower the content ratio value, the higher the degree of unsaturation of fatty acids, which may be advantageous conditions in terms of pharmacological activity. Therefore, when the content ratio was 4.32 or less, it became a criterion to indirectly recognize the superiority as wild ginseng.
제 4 공정: 아미노산 성분 함량 분석Fourth Process: Amino Acid Content Analysis
산삼시료로부터 메탄올 추출 후, 남은 잔기(residue)에 H2O 1 mL을 첨가 후 1시간 동안 초음파 파쇄(sonication)한 후 원심분리 후 상등액 약 0.5 mL을 여과(filtration)하여 분석에 이용하였다. MeOH 추출물과 물 추출물을 각각 50 ㎕씩 취하여(1:1, v/v) 혼합하고 OPA 유초체화 용액 100 ㎕ 첨가 후, 1분간 상온에서 반응시키고 0.1 M 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer) 100 ㎕ 첨가 후 분석에 이용하였다. 컬럼은 CUROSIL PFP (4.6(250 mm, 5 micron, phenomenex)를이용하였고 용매 조건은 A 용매는 MeOH:THF:0.02M sodium acetate(pH5.9) = 20:2.5:77.5, v/v이고 B 용매는 MeOH:THF:0.02M sodium acetate(pH5.9) = 80:2.5:17.5, v/v로 하였다. 검출시간과 A 용매, B 용매, 유속은 표 1에 정리하였다. 주입량은 10㎕이고, 형광검출기는 Exitation λ = 360, Emission λ = 450 이였고 컬럼온도는 40 ℃이였다.After extracting methanol from wild ginseng sample, 1 mL of H 2 O was added to the remaining residue, and then ultrasonically crushed for 1 hour. After centrifugation, about 0.5 mL of the supernatant was filtered and used for analysis. 50 μl of MeOH extract and water extract (1: 1, v / v) were mixed and 100 μl of OPA emulsification solution was added, followed by reaction at room temperature for 1 minute and 100 μl of 0.1 M sodium acetate buffer. It was used for later analysis. The column used CUROSIL PFP (4.6 (250 mm, 5 micron, phenomenex) and the solvent condition was A solvent MeOH: THF: 0.02M sodium acetate (pH5.9) = 20: 2.5: 77.5, v / v and B solvent MeOH: THF: 0.02M sodium acetate (pH5.9) = 80: 2.5: 17.5, v / v The detection time, solvent A, solvent B and flow rate are summarized in Table 1. Injection amount was 10 μl, The fluorescence detector had Exitation λ = 360, Emission λ = 450 and the column temperature was 40 ° C.
실험결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 아스파레이트(Aspartate), 글루타메이트 (Glutamate), 세린(Serine), 히스티딘(Histidine), 스레오닌(Threonine), 글루신 (Glysine), 아르기닌(Arginine), 알라닌(Alanine), 메티오닌(Methionine), 발린 (Valine), 이소로이신(Isoleusine), 로이신(Leucine), 리신(Lysine) 등의 총 13종류 유리아미노산을 분석할 수 있었다. 메티오닌(methionine)의 경우 한국산 산삼 표본 모집단에서는 평균함량 0.27 ug/mg-dry weight, 최소 0.07 ug/mg-dry weight 이였고, 중국산 산삼 표본 모집단에서는 평균함량 0.08 ug/mg-dry weight, 최대 0.14 ug/mg-dry weight 로 조사되었고, 이소로이신(isoleucine)의 경우 국내 산삼 표본 모집단에서는 평균함량 0.84 ug/mg-dry weight, 최소 0.24 ug/mg-dry weight이였고, 중국산 산삼 표본 모집단에서는 평균함량 0.2 ug/mg-dry weight, 최대 0.25 ug/mg-dry weight 으로 조사되었는데 두 표본 집단을 구분할 수 있는 결과였다. 따라서 유리아미노산의 함량에 따른 한국산 산삼으로의 판단 기준은 메티오닌 (methionine)의 경우 0.14 ug/mg-dry weight 이상일 때, 이소로이신(isoleucine)의 경우 0.25 ug/mg-dry weight 이상일 때를 기준으로 정할 수 있었다.As a result, aspartate, glutamate, serine, histidine, threonine, glycine, glycine, arginine, alanine, as shown in FIG. ), 13 kinds of free amino acids such as Methionine, Valine, Isoleusine, Leucine, and Lysine were analyzed. Methionine had a mean content of 0.27 ug / mg-dry weight and a minimum of 0.07 ug / mg-dry weight in Korean wild ginseng sample population, and an average content of 0.08 ug / mg-dry weight and a maximum of 0.14 ug in Chinese wild ginseng sample population. Isoleucine was 0.84 ug / mg-dry weight and at least 0.24 ug / mg-dry weight in Korean wild ginseng sample population and 0.2 in the wild ginseng sample population. The ug / mg-dry weight and the maximum 0.25 ug / mg-dry weight were investigated to distinguish the two sample groups. Therefore, the criteria for determination of Korean wild ginseng according to the content of free amino acid should be determined based on the case of more than 0.14 ug / mg-dry weight for methionine and more than 0.25 ug / mg-dry weight for isoleucine. Could.
제 5 공정: 산성 폴리사카라이드 함량 분석Process 5: Acidic Polysaccharide Content Analysis
산삼시료로부터 메탄올 추출 후, 남은 잔기(residue)에 H2O 1 mL을 첨가 후 1시간 동안 초음파 파쇄하고 원심분리한 후 상등액 약 0.5 mL을 여과하여 아미노산분석에 이용하였다. 나머지 잔기 및 상등액에 H2O 1 mL을 첨가 후 95 ℃에서 6시간 동안 추출하고 원심분리한 후 얻은 상등액 1 mL을 EtOH 4 mL과 혼합하여 폴리사카라이드(polysaccharide) 침전물을 얻었다. 원심분리 후 상등액은 제거하고 H2O 1 mL에 재용해(resolution) 시켰다. 정량방법은 샘플 0.2 mL(원액의 2 - 10 배 희석)에 c-H2SO4- 3 mL을 첨가 후 끓는 물에서 20분동안 반응시키고 상온으로 식힌 후 0.2 mL carbazole sol'n (0.15% in ethanol)을 첨가하여 완전히 혼합 후 상온, 암조건에서 2시간 동안 반응시킨 다음 530 nm에서 흡광도 측정하였다.After extracting methanol from wild ginseng sample, 1 mL of H 2 O was added to the remaining residue, followed by sonication for 1 hour, centrifugation, and about 0.5 mL of the supernatant was filtered and used for amino acid analysis. 1 mL of H 2 O was added to the remaining residues and the supernatant, followed by extraction at 95 ° C. for 6 hours, and centrifugation. 1 mL of the supernatant obtained was mixed with 4 mL of EtOH to obtain a polysaccharide precipitate. After centrifugation, the supernatant was removed and re-dissolved in 1 mL of H 2 O. Quantitative method after the sample 0.2 mL after the addition of 3 mL reaction in boiling water for 20 minutes and cooled to room temperature, 0.2 mL carbazole sol'n (0.15% in ethanol) - - cH 2 SO 4 (2-fold dilution of the stock solution 10) After the addition was completely mixed and reacted for 2 hours at room temperature and dark conditions, the absorbance was measured at 530 nm.
실험결과, 한국산 산삼 표본 모집단에서는 평균 함량이 87 mg/g-dry weight, 최소 70 mg/g-dry weight 이였고, 반면에 중국산 산삼 표본 모집단에서는 평균 함량이 62 mg/g-dry weight, 최대 79 mg/g-dry weight 으로 조사되었다. 따라서 산성다당체의 함량에 따른 국내 산삼으로의 판단 기준은 그 함량이 최소 70 mg/g-dry weight 이상 일 때로 정할 수 있었다.The results showed that the Korean wild ginseng sample population had an average content of 87 mg / g-dry weight and a minimum of 70 mg / g-dry weight, whereas the Chinese wild ginseng sample population had an average content of 62 mg / g-dry weight and a maximum of 79 The mg / g-dry weight was investigated. Therefore, the criteria for juvenile wild ginseng according to the content of acidic polysaccharides could be determined when the content is at least 70 mg / g-dry weight.
제 6 공정: 페놀산 성분 함량 분석6th step: phenolic acid content analysis
유리 상태의 페놀성 성분들과 다당체등에 에스테르 형태로 결합되어 있는 페놀성 성분들은 Krygier 등의 방법에 준하여 개별적으로 추출하였다. 분석방법은 추출된 페놀성 분획물은 질소 기류 하에서 완전히 건조 시킨 후, BSA 100 ㎕를 첨가하여 80 ℃ 반응조에서 15 분간 반응시켜 TMS 유도체를 제조하였다. TMS 유도체화된 페놀성 성분들은 FID 검출기(FID detector)를 이용한 가스-리퀴드 크로마토그래피(gas-liquid chromatography)로 측정되었고, 분석용 컬럼은 SE-54 capillary (30 m length × 0.25 mm I.D., Alltech)을 사용하였다. 분석조건은 주입기(injector)와 검출기(detector) 온도를 각각 260℃와 290℃로 하였고, 오븐 온도는 100℃에서 260℃까지 4℃/min의 승온조건을 유지하는 온도 프로그램을 사용하였다. 이동 가스로 질소를 사용하였고, 분배비(split ratio)는 1: 10으로 고정하여 분석하였다.Phenolic components bound to the free phenolic components and polysaccharides in the form of esters were individually extracted according to Krygier et al. In the analysis method, the extracted phenolic fraction was completely dried under a stream of nitrogen, and then 100 μl of BSA was added and reacted for 15 minutes in an 80 ° C. reactor to prepare a TMS derivative. TMS derivatized phenolic components were measured by gas-liquid chromatography using a FID detector, and the analytical column was SE-54 capillary (30 m length × 0.25 mm ID, Alltech). Was used. As the analysis conditions, the temperature of the injector and the detector was 260 ° C and 290 ° C, respectively, and the oven temperature was used to maintain a temperature of 4 ° C / min from 100 ° C to 260 ° C. Nitrogen was used as the moving gas and the split ratio was fixed at 1: 10 for analysis.
실험결과, 재배인삼에서 그 존재가 확인된 페놀성 성분들 중 살리실산(salicylic acid), 시남산(cinnamic acid), p-하이드로옥시벤조산(p-hydroxybenzoic), 바닐리산(vanillic acid), 젠티스산(gentisic acid), 프로코카테큐산(protocatechuic acid), 시린그산(syringic acid), p-코우마르산(p-coumaric acid), 에스큐레틴(esculetin), 페룰산(ferulic acid), 카페산(caffeic acid) 등이분석되었다. 상기 성분들 중 에스큐레틴(esculetin)의 함량 분석결과 한국산 산삼과 중국산 산삼을 구분할 수 있는 기준 성분으로 조사 되었다. 한국산 산삼의 경우 47.2 ug/g-dry weight 인 반면 중국산 산삼의 경우 30 ug/g-dry weight 으로서 국내 산삼에서 더 높은 수준을 나타내었다.Experimental results showed that salicylic acid, cinnamic acid, p-hydroxybenzoic acid, vanillic acid, and gentis among the phenolic compounds identified in cultivated ginseng. Acid (gentisic), protocatechuic acid, syringic acid, p-coumaric acid, esculetin, ferulic acid, caffeic acid (caffeic acid) and the like were analyzed. As a result of analyzing the content of esculetin among the components, it was investigated as a reference component that can distinguish Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng. Korean wild ginseng showed 47.2 ug / g-dry weight, while Chinese wild ginseng showed 30 ug / g-dry weight, which was higher in Korean wild ginseng.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 적은 양의 한국산 산삼과 중국산 산삼 시료의 형태학적 특성 분석, 유전학적 특성 분석, 단백체학적 특성 분석 및 생리활성물질 분석을 수행하여 그 결과를 비교함으로서 한국산 산삼과 중국산 산삼을 정확히 판별하는 뛰어난 효과가 있으므로 산삼유통업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described above, the present invention compares the results of morphological characterization, genetic characterization, proteomic characterization and bioactive substance analysis of small amounts of Korean wild ginseng and Chinese wild ginseng samples. It is a very useful invention for the wild ginseng distribution industry because it has an excellent effect of accurately discriminating Korean ginseng and Chinese ginseng.
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