KR100454871B1

KR100454871B1 - 사이모신 β- 10을 고형악성종양의 유전자 치료에사용하는 용도

Info

Publication number: KR100454871B1
Application number: KR10-2001-0063524A
Authority: KR
Inventors: 이제호; 이승훈
Original assignee: 이제호; 이승훈
Priority date: 2001-10-10
Filing date: 2001-10-10
Publication date: 2004-11-05
Also published as: US7037903B2; KR20030030795A; US20030099617A1

Abstract

본 발명은 사이모신 β-10(thymosin β-10)을 고형악성종양(solid malignant tumors) 세포에 발현시켜 암을 치료하는데 사용하는 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 사이모신 β-10 유전자를 포함하는 아데노바이러스를 고형악성종양 세포에 감염시켜 사이모신 β-10을 발현시킴으로써 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 사이모신 β-10을 이용한 유전자 치료는 부작용 없이 난소암, 자궁경부암, 위암 및 폐암 등을 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

사이모신 β- 1 0을 고형악성종양의 유전자 치료에 사용하는 용도{Use of thymosin beta-10 for gene therapy of solid malignant tumors}

본 발명은 사이모신 β-10(thymosin β-10)을 고형악성종양(solid malignant tumors) 세포에 발현시켜 암을 치료하는데 사용하는 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 사이모신 β -10 유전자를 포함하는 아데노바이러스를 고형악성종양 세포에 감염시켜 사이모신 β -10을 발현시킴으로써 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

유전자 치료(gene therapy)는 유전자 이상에 의하여 유발되는 각종 유전병과 암 등을 치료하기 위하여, 질병과 관련이 있는 유전자를 환자의 체내에 직접적으로 주입하고 상기 유전자를 세포 내에서 발현시켜 그의 기능을 정상화시키는 방법이다. 이러한 유전자 치료는 특정 유전자를 체내에 주입하여 인체 내에 새로운 기능을 부여할 수 있으므로 치료 이외에 각종 질병을 예방하거나 치료 효과를 강화하는데도 널리 이용될 수 있다.

유전자 치료로 질병을 치료하는데 있어서 가장 중요한 요건은 주입된 유전자가 성공적으로 목표 세포의 핵에 전달되어 이로부터 유전자가 다량으로 발현되는 것이다. 이 때 사용된 유전자는 목표 세포에 도달하여 엔도사이토시스(endocytosis)라는 과정을 거쳐 세포 내부로 들어간 다음 핵내로 전달되어 발현된다. DNA 자체로 이루어진 유전자는 세포를 통과하는 효율이 극히 떨어지므로 리포좀(liposome)과 같은 운반체를 사용하여 유전자를 주입할 수도 있는데 이 경우에도 핵으로 전달되는 과정에 리포좀이 대부분 파괴되어 그 효율이 떨어진다.

하지만, 인체에 감염성이 있는 바이러스를 이용하면 세포 내에 외래 유전자를 효과적으로 주입할 수 있으므로 바이러스를 유전자 치료에 응용하는 것이 매우 바람직하다. 구체적으로, 치료에 사용될 수 있는 유전자를 유전자 재조합 방법으로 바이러스 DNA 에 삽입하고 이를 자신의 게놈으로 하는 바이러스를 생체 외에서 대량 생산하여 인체에 직접적으로 감염시킴으로써 세포 내에 효율적으로 원하는 유전자를 전달하여 발현시킬 수 있다. 특히, 아데노바이러스는 세포의 핵 내에 그의 유전자를 전달하는 특별한 기전을 가지고 있어 다른 바이러스 보다 그의 DNA를 핵내에 전달하는 효율이 높으므로 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

사이모신 β -4, β -10 및 β -15는 액틴 모노머-격리 인자로 역할을 한다. 사이모신 β -4는 43개의 아미노산을 갖고 있고, 사이모신 β -10과는 85%의 아미노산 상동성(homology)을 갖고 있다. 지금까지의 연구 결과, 사이모신 β -4 및 사이모신 β -10은 세포 분열 또는 분화에 관련된 메카니즘과 관련이 있다. 상기 유전자들의 구조 및 기능적 유사성에도 불구하고, 이런 유전자들은 조직에 따라 다른 발현 패턴이 관찰되었다. 예를 들어, 사이모신 β -4 및 사이모신 β -10은 태아의 뇌 및 태아의 다른 기관에서 강하게 발현된다. 그러나, 사이모신 β -10의 발현은 대부분의 성인 조직에서 감소하고, 사이모신 β -4는 콜로렉탈 종양(colorectal carcinomas)의 전이(metastatic) 세포에서 감소되어 발현된다(Hall et al.,Mol. Brain Res., 1990, 8:129-135; Hall et al.,Mol. Cell. Endocrinol., 1991, 79:37-41; Yamamoto et al.,Biochem.Biophys. Res. Commun., 1993, 193:706-710). β -사이모신 패밀리의 하나인 사이모신 β -15는 인간 전립선암에서 발현이 증가되고(Bao et al.,Naf. Med., 1996, 2:1322-28), 진전된 인간 전립선암 및 유방암뿐만 아니라 전이된 전립선암에서도 발현된다(Eadie et al.,J. Cell., Biochem., 2000, 77:277-287; Gold et al.,Mod. Pathol., 1997, 10:1106-12). 사이모신 β -15의 발현이 매우 전이된 전립선암 세포에서 유동성 및 전이(metastasis)에 관련되어 있다는 점에서 다른 β -사이모신과는 다르다.

사이모신 β -10은 작은 액틴-결합 단백질로 액틴 모노머를 격리하여 세포내 F-액틴 네트워크의 탈중합반응(depolymerization)을 유도한다(Nachmias,Curr. Opin, Cell Biol., 1993, 5:56-62; Yu et al.,J. Biol. Chem., 1993, 268:502-9, Yu et al.,Cell Motil. Cytoskeleton, 1994, 27:13-25). 액틴은 구조 단백질로서 세포에서 가장 많이 발현되는 단백질이다(Pollard and Cooper,Ann. Rev. Biochem., 1986, 55:987-1035). 종양세포에서는 액틴 모노머와 필라멘트 액틴 사이의 동적 평형이 변화된다(Hall,Ren Fail., 1994, 16:243-54). 사이모신 β -10 발현의 변화는 액틴 스트레스 섬유(stress fiber)를 변화시켜 세포 내 기본구조에 영향을 주고, 세포 성장, 세포자살, 세포 부착 및 세포 이동의 균형을 변화시킨다(Yu et al.,J. Biol. Chem., 1993, 268:502-9). 발생과정 중에서 사이모신 β -10은 매우 많이 발현되고(Carpintero et al.,FEBS Lett., 1996, 394:103-6), 이것은 세포 탈착(detachment)이 필요한 세포 이동 및 형태 변화와 항상 일치한다. 사이모신 β -10은 세포 탈착을 유도하는 데도 관여한다(Iguchi et al.,Eur. J. Biochem., 1998, 253:766-770). 또한, 사이모신 β -10은 예정된 세포자살 및 침습에도 관련되어 있다(Hall,Cell. Mol. Biol. Res., 1995, 41:167-180; Marian et al.,Int. J. Cancer, 1993, 53:278-84).

새로운 종양 마커를 찾기 위해서 또는 암 발생 및 암의 진행 상태를 알아내기 위하여, 정상 세포와 암세포에서 다르게 발현되는 유전자들이 밝혀지고 있다. cDNA 마이크로어레이(microarray)는 하나의 블럿에서 특이적인 cDNA들의 유전자 발현 패턴을 대량으로 조사하기 위하여 매우 효과적인 방법이다(DeRisi et al.,Nat. Genet., 1996, 14:457-60). 상기 방법을 이용하여 교모세포종다형태(glioblastoma multiforme)에서 IGFBP2(insulin-like growth factor binding protein 2)가 과잉발현되는 것을 확인하였고(Fuller et al.,Cancer Res., 1999, 59:4228-32), 암세포에서 선택적으로 사멸시키는 기능을 하는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)를 밝혀내었다(Huang et al.,Nature, 2000, 407:390-95). 유전자의 발현 윤곽을 알아내는 방법으로는 SAGE(serial analysis of gene expression)가 있다(Velculescu et al.,Science, 1995, 170:484-7; Zhang et al.,Science,1997, 276:1268-72; Hough et al.,Cancer Res., 2000, 60:6281-7).

이에, 본 발명자들은 고형악성종양의 유전자 치료에 사용할 유전자를 찾기 위하여, cDNA 마이크로어레이를 이용하여 고형악성종양 조직에서 정상 조직과 비교해서 비정상적으로 발현하는 유전자를 찾아내고, 그 중에서 사이모신 β -10이 난소암 조직에서 정상 조직에 비해 발현이 감소된다는 사실을 밝혀내었다. 본 발명자들은 고형악성종양 조직에 사이모신 β -10 단백질을 정상적으로 발현시키기 위하여, 사이모신 β -10 단백질을 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현벡터, 상기 아데노바이러스를 패키징 세포에 형질전환시키고 증식성 변이 바이러스를 포함하지 않는 아데노바이러스 클론을를 난소암 세포에 감염시켰을 때 상기 아데노바이러스에서 발현된 사이모신 β -10에 의해 고형악성종양 세포의 성장이 억제되거나 세포자살되는 것을 확인하여 사이모신 β -10을 난소암, 자궁경부암 및 폐암 등의 유전자치료에 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 사이모신 β -10(thymosin β -10)을 고형악성종양 세포에 발현시켜 암을 치료하는데 사용하는 용도를 제공하는 것이다.

도 1은 cDNA 어레이(array)를 이용하여 인간 정상 난소 조직 및 난소암 조직에서의 유전자의 발현을 비교한 사진이고,

인간 난소에서 항상 발현되는 유전자는 다음과 같다.

1 ; RPS19, 2 ; Mch4, 3 ; RPL6, 4 ; 인터류킨-2 수용체 a ,

5 ; 인테그린(integrin) a L, 6 ; TDGF3,

→ : 인간 정상 난소 조직 및 난소암 조직에서 다르게 발현되는 유전자의 cDNA 점(spot),

도 2의 A는 5쌍의 정상 난소 조직(N) 및 난소암 조직(T)에서 사이모신 β-10의 발현을 노던 블럿으로 분석한 사진이고,

도 2의 B는 정상 난소 조직(N) 및 난소암 조직(T)에서 사이모신 β -10의 발현을 PCR로 분석한 사진이고,

도 2의 C는 여러 인간 조직에서 사이모신 β -10의 발현을 노던 블럿으로 비교 분석한 사진이고,

도 3은 사이모신 β -10을 삽입한 아데노바이러스 발현벡터 pQBI-Ad5CMV-GFP의 유전자 지도이고,

도 4는 난소암 세포주 PA-1에 본 발명의 아데노바이러스를 감염시켰을 때 사이모신 β -10 단백질의 발현 여부를 웨스턴 블럿으로 분석한 사진이고,

도 5는 난소암 세포주 PA-1 및 SKOV3에 본 발명의 아데노바이러스 또는 Ad-GFP를 감염시켰을 때 세포의 성장을 분석한 그래프이고,

A : PA-1, B : SKOV3,

0 ; 대조군, ● : Ad-GFP, ■ : Ad-GFP-사이모신 β -10,

도 6은 난소암 세포주 PA-1에 본 발명의 아데노바이러스 또는 Ad-GFP를 감염시켰을 때 세포자살(apoptosis)을 DAPI 염색으로 분석한 사진이고,

A, B : 대조군, C, D : Av-gfp, E, F : Av-gfp-사이모신 β -10 ,

도 7은 난소암 세포주 PA-1에 본 발명의 아데노바이러스 또는 Ad-GFP를 감염시켰을 때 액틴의 구조 변화를 팔로이딘(phalloidin)-FITC 염색으로 분석한 사진이다.

A : 대조군, B : Av-gfp, C : Av-gfp-사이모신 β -10

→ : 액틴 스트레스 섬유(actin stress fiber)

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사이모신 β -10을 고형악성종양(solid malignant tumors) 세포에 발현시켜 암을 치료하는데 사용하는 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 사이모신 β -10 유전자를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 이용하여 증식성 변이 바이러스를 포함하지 않는 아데노바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아데노바이러스를 고형악성종양의 치료에 사용하는 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 사이모신 β -10을 고형악성종양 세포에 발현시켜 암을 치료하는데 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명은 고형악성종양 세포에 사이모신 β -10을 과잉발현시켜 암세포의 성장을 억제시키고, 세포자살을 유도하여 암세포를 사멸시킨다.

사이모신 β -10은 췌장, 흉선, 전립선, 고환 및 결장 등의 조직에 비해 난소에서 가장 많이 발현되는데, 난소암 조직에서는 정상 난소 조직에 비해 사이모신β -10의 발현이 감소된다(도 2 참조). 사이모신 β -10은 작은 액틴-결합 단백질로 액틴 모노머를 격리하여 세포내 F-액틴 네트워크의 탈중합반응을 유도한다. 따라서, 사이모신 β -10 발현의 변화는 액틴 스트레스 섬유를 변화시켜 세포내 기본구조에 영향을 주고, 세포 성장 및 세포자살에 영향을 준다.

이에, 본 발명에서는 고형악성종양 조직에서 특이적으로 발현이 감소되는 사이모신 β -10을 고형악성종양 세포에 발현시켰다. 상기와 같이 고형악성종양 세포에서 발현된 사이모신 β -10에 의해 액틴 스트레스 섬유가 변화되어, 고형악성종양 세포는 성장이 억제되거나 세포자살을 초래하여 결국은 암세포가 사멸하게 된다.

본 발명에서는 사이모신 β -10을 난소암, 자궁경부암, 위암, 폐암 및 간암등의 고형악성종양 세포에 발현시켜 암을 치료하는데 사용한다.

본 발명은 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)의 프로모터 부위, 다클로닝 부위(multiple cloning site), 시미언바이러스 40(Simian virus 40, SV40)의 후 아데닌다중화(late polyadenylation) 신호 부위 및 녹색 형광 단백질(Green fluorescence protein; 이하 "GFP"라 약칭한다)을 코딩하는 부위로 구성되는 발현카세트를 이용하여 사이모신 β -10 단백질을 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 녹색 형광 단백질은 상기 아데노바이러스 발현벡터를 암세포에 감염시켰을 때 녹색 형광을 나타내기 때문에, 상기 벡터가 세포에 제대로 침투되었는지 확인할 수 있다.

본 발명에서는 인간 사이토메갈로바이러스의 프로모터 부위, 다클로닝 부위, 시미언바이러스 40의 후 아데닌다중화 신호 부위 및 녹색 형광 단백질을 코딩하는 부위로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 pQBI-Ad5CMV-GFP 벡터를 사용하였다. 사이모신 β -10 유전자를 분리하기 위해서는 서열번호 1로 기재되는 프라이머와 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 사용하여 정상 조직으로부터 분리한 RNA를 주형으로하여 RT-PCR 반응을 수행하여 정상적인 인간 사이모신 β -10 cDNA를 얻었다. 상기 사이모신 β -10 cDNA를 상기 pQBI-Ad5CMV-GFP 벡터의 다클로닝 부위에 삽입하여 사이모신 β -10 단백질을 발현할 수 있는 아데노바이러스 발현벡터 "Ad-GFP-사이모신 β -10"을 제조하였다. 본 발명자들은 상기 아데노바이러스 발현벡터 "Ad-GFP-사이모신 β -10"을 2001년 10월 8일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10089BP).

아데노바이러스(Adenovirus)는 DNA 바이러스로서, 그 게놈에 바이러스가 증식하는데 필수적인 유전자인 E1A 유전자 부위와 바이러스가 패키징되는데 필수적인 유전자 등이 포함되어 있다. 이러한 아데노바이러스가 유전자 요법에 이용되기 위해서는 바이러스가 체내에서 스스로 증식하여 온몸에 감염됨으로써 또 다른 질병이 유발되지 않도록 바이러스 증식에 사용되는 유전자를 제거하여야 한다. 따라서, 아데노바이러스 게놈 중에 바이러스가 증식하는데 관여하는 E1A 유전자 부위를 제거하면 바이러스가 스스로 정상세포에서 증식할 수 없어 아데노바이러스를 유전자 요법에 이용할 수 있다.

본 발명은 상기 아데노바이러스 발현벡터를 이용하여 아데노바이러스를 대량으로 얻기 위하여, 아데노바이러스가 패키징될 수 있는 세포주를 상기 발현벡터로 형질전환(transfection)시킨다. 패키징 세포주로 293 세포를 이용하는데, 293 세포는 그의 염색체 DNA에 아데노바이러스의 E1 유전자 부위를 포함하고 있어 E1A 유전자를 계속적으로 발현하고 세포에 E1A 단백질을 제공한다.

본 발명은 상기 아데노바이러스 발현벡터 Ad-GFP-사이모신 β -10을 패키징 세포 293 세포에 아데노바이러스 모체벡터를 함께 주입하여 아데노바이러스를 증식시키고, 증식성 재조합 변이 바이러스(RCV)를 포함하지 않는 아데노바이러스 클론을 선별하여 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 고형악성종양 치료에 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명에서는 사이모신 β-10 단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 Ad-GFP-사이모신 β -10을 고형악성종양 세포에 감염시켜 난소암 세포의 성장을 억제시키고, 세포자살을 일으키게 한다.

본 발명에서는 바람직한 실시예로, Ad-GFP-사이모신 β -10을 난소암 세포에 감염시켰을 때 난소암 세포의 성장에 미치는 효과를 알아본 결과, Ad-GFP-사이모신 β -10으로 감염된 세포는 감염되지 않은 세포들에 비해 세포 성장이 둔화되었고,정상 세포에 비해 매우 감소된 세포성장을 보였다(도 5 참조).

또한, 본 발명에서는 Ad-GFP-사이모신 β -10을 고형악성종양인 난소암 세포에 감염시켰을 때 난소암 세포의 세포자살(apoptosis)에 미치는 영향을 알아본 결과, Ad-GFP-사이모신 β -10으로 감염된 세포는 세포자살이 급격히 증가하는 것으로 나타났고(도 6 참조), Ad-GFP-사이모신 β -10을 감염시킨 세포에서는 사이모신 β -10의 과잉발현으로 인하여 F-액틴 스트레스 섬유(stress fiber)가 파괴된 것으로 나타났다(도 7 참조). 상기와 같이 고형악성종양 세포에 Ad-GFP-사이모신 β -10을 감염시키면 사이모신 β -10 단백질이 발현되어 F-액틴 스트레스 섬유가 파괴되면서 세포가 세포자살을 초래하여 암세포가 사멸된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉난소암 조직과 정상 난소 조직에서 유전자들의 발현 패턴 분석

본 발명자들은 난소암 조직과 정상 난소 조직에서 유전자들의 발현패턴을 분석하기 위하여, cDNA 어레이(array) 블럿을 사용하여 난소암 조직과 정상 난소 조직에서 다르게 발현되는 유전자들을 선별하였다.

〈1-1〉 조직 및 RNA 분리

난소암 조직은 삼성의료원 산부인과의 환자로부터 얻었다. 조직 샘플의 질병단계는 국제 산부인과 협회(FIGO ; International Federation of Gynecology and Obstetrics)의 임상 단계 기준에 의하여 실시하였다. 5쌍의 정상 및 난소암 조직을사용하였다. 유두상선혈장암종(papillary serous adenocarcinoma; 단계 Ⅲc), 경계점액난소암(borderline mucinous ovarian tumor; 단계 Ic), 혈장낭선종암종(serous cystadenocarcinoma; 단계 Ⅲc) 및 2개의 투명세포암종(clear-cell carcinomas; 단계 Ic)을 사용하였다. 조직은 질소용액에서 얼려서 -70℃에서 보관하였다.

RNA를 추출하기 전에, 조직 샘플의 일부를 파라핀 절단에 의해 잘라서 헤마토실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색으로 관찰하였다. 조직 샘플은 50% 이상의 암세포를 포함하고 있다. 각각의 환자로부터 난소에 관련 없는 정상 조직을 얻어 현미경으로 관찰하여 암세포가 없는지 확인하였다.

전체 RNA는 트리졸(Trizol; Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 제조회사의 지침에 따라 수행하여 조직으로부터 추출하였다. 정상 난소 조직 및 난소암 조직을 각각 약 100 mg을 트리졸 용액 1 ㎖에서 폴리트론 호모지나이저(Polytron homogenizer; Brinkman, Switzerland)를 사용하여 파쇄하였다. 파쇄된 것을 얼음에서 10분간 방치하고, 클로로포름(chloroform)을 0.2 부피를 첨가하여 5분 동안 심하게 흔든 후에 4℃에서 12,000g로 20분간 원심분리하여 무기질 부분을 분리하였다. RNA는 같은 부피의 이소프로판올(isopropanol)에서 침전시켰다. RNA 침전은 70% 에탄올로 세척한 후 RNase가 없는 물로 녹였다. 전체 RNA 농도는 자외선 스펙트로포토미터(Biochrom LKB, UK)를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하였다.

〈1-2〉 ³² P-표지된 cDNA 합성

³²P-표지된 cDNA는 상기 실시예 〈1-1〉에서 분리한 정상 난소 및 난소암 조직으로부터 전체 RNA를 사용하여 [³²P]dCTP의 존재 하에서 역전사 반응을 수행하여 합성하였다. 구체적으로, 20 ㎍의 전체 RNA를 dT₁₅VN 혼합물 8 pmol의 존재하에서 75℃에서 10분 동안 변성시켰다. 변성 단계 후에, dNTP(500 uM, dCTP 없음), 5 ㎕ [³²P]dCTP(3000 Ci/mmol; Amersham Life Science, Cleveland, OH, USA) 및 1,600 U의 MMLV 역전사 효소(Promega, Madison, WI, USA)가 1X RT 버퍼(Promega)에 포함된 마스터 믹스에 넣어 전체 반응 부피를 40 ㎕로 하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 반응은 75℃에 10분 동안 처리하여 종결하였고, 삽입되지 않은 뉴클레오티드는 젤 정제(Chroma spin-200; clontech)으로 제거하였다. 각각의 반응에서 약 2X10⁷c.p.m.이 최종산물에 들어갔다.

〈1-3〉 cDNA 마이크로어레이(microarray) 혼성(hybridization)

상기 실시예 〈1-2〉에서 제조한³²P-표지된 cDNA는 5분간 끊여서 변성시키고, 혼성 용액(ExpressHyb hybridization solution, Clontech)에서 아틀라스(Atlas) 1인간 cDNA 어레이 블럿(Clontech; http://www.clontech.com/atlas/gene-lists/Hbroad.txt)에 혼성화시켰다. 프로브를 첨가하기 전에 블럿은 68℃에서 미리 혼성화시켰다. 혼성은 68℃에서 회전병(rolling bottle)에 넣어 하룻밤 동안 반응시켰다. 2X SSC(1X SSC; 0.15 M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0) 및 0.1% SDS로 68℃에서 20분간 두 번 세척한 후 블럿을 0.1X SSC, 0.5% SDS 및 0.1 mM EDTA로 68℃에서 잘 세척하였다. 블럿을 X-선 필름(Hyperfilm, Amersham)에 -70℃에서 하루 또는 3일 동안 노출시켰다. 상대적 유전자 발현의 대조군으로는 GAPDH 및 리보좀 단백질 S9 유전자를 사용하였다.

그 결과, 정상 난소 조직과 난소암 조직에서 588 개의 유전자들의 발현 패턴을 알아내었다. 상기 혼성화된 블럿을 도 1에 나타내었고, 정상 조직 및 난소암 조직의 혼성화된 블럿을 비교하여 발현이 변화된 유전자들을 찾아내었다. 도 1에서 비어있는 점 및 음성 대조군 점(M13 DNA, λphage DNA 및 pUC18 DNA)에서는 시그널이 없었고, 이것은 혼성화가 매우 특이적으로 되어 있는 것을 나타내었다.

특정 유전자의 증가 또는 감소하는 발현 정도는 혼성화된 시그널의 농도 스캐닝(densitometric scanning)으로 정량하였다. 정상 난소 조직 및 난소암 조직에서 유전자들의 발현을 비교할 때 발현의 변화가 2배 이상이 되는 유전자들만을 선별하여 표 1 및 표 2에 요약하였다. 표 1은 정상 난소 조직에 비해 난소암 조직에서 발현이 증가하는 유전자들이고, 표 2는 난소암 조직에서 발현이 감소하는 유전자들이다. 유전자 발현은 하우스키핑 유전자 GAPDH의 발현을 기준으로 하였다. 다른 cDNA 어레이 혼성 실험에서도 이러한 유전자들의 비슷한 발현 패턴이 나타났다.

[표 1]

표본 1 : 유두상선혈장암종(papillary serous adenocarcinoma; 단계 Ⅲc),

표본 2 : 경계점액난소암(borderline mucinous ovarian tumor; 단계 Ic),

표본 3 : 혈장낭선종암종(serous cystadenocarcinoma; 단계 Ⅲc),

표본 4, 5 : 투명세포암종(clear-cell carcinomas; 단계 Ic).

[표 2]

상기 표에서 살펴본 바와 같이, 6개의 유전자들은 난소암 조직에서 증가된발현을 보였다. Smad1(Mothers against DPP protein, 프로사이모신 알파(prothymosin alpha), Tob, C-1, 열 충격(heat shock) 27-kDa 단백질 1 및 인슐린-유사 성장 인자 IA(표 1). 그러나, 12개의 유전자들은 난소암 조직에서 감소된 발현을 보였다. 여기에는 세포자살과 관련된 단백질, DNA-결합 단백질, DNA-결합 단백질 억제자, 전사인자 및 사이모신 β -10이 포함된다(표 2). 이들 중에서 난소암 세포에서 특이적으로 감소된 발현을 보이는 사이모신 β -10을 선별하였다.

〈실시예 2〉 사이모신 β -10의 발현 패턴 분석

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 정상 난소 조직에 비해 일정하게 감소된 발현을 나타내는 사이모신 β -10의 발현 양상을 보다 정확히 규명하기 위하여 노던 블럿과 PCR 반응을 수행하였다.

〈2-1〉 노던 블럿

노던 블럿 혼성화를 위하여, 상기 실시예 〈1-1〉에서 5쌍의 정상 난소 조직 및 난소암 조직에서 분리한 전체 RNA를 사용하였다. 상기 전체 RNA(10 ㎍)를 50% 포름아미드(formamide), 2.2 M 포름알데히드(formaldehyde), 20 mM MOPS(3-[N-morpholino] propanesulfonic acid), 4 mM 아세트산 나트륨(sodium acetate) 및 0.5 mM EDTA의 존재하에서 65℃에서 10분 동안 변성시켰다. 2.2 M 포름알데히드가 포함된 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동한 후, RNA를 10X SSPE(1X SSPE; 0.18 M NaCl, 10 mM Na2HP)4 [pH 7.7] 및 1 mM EDTA)하에서 모세관 작용에 의해 나일론막(Nytran, 0.45-㎛ pore size; Schleicher and Schuell, Germany)으로 옮겼다. RNA 전달 및 로딩 효율은 0.1% 메틸렌 블루(methylene blue)로 분리된 막을 염색함으로써 측정된다. RNA가 변하지 않은 것은28S 및 18S 리보좀 RNA 밴드의 강도를 비교함으로서 측정하였다. 혼성화를 위하여, 막을 6X SSPE로 5분간 세척하고 건조시켰다. RNA는 UV를 1분간 조사하여 막에 고정시켰다. 혼성은 40 ㎖의 혼성화 버퍼(5X SSPE[pH 7.4], 5X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 0.2 mg/㎖ heat-denatured salmon sperm DNA, 50% formamide) 및 혼성 프로브를 포함하는 열-밀폐폴리에틸렌(polyethylene) 자루에서 하룻밤 동안 수행하였다. 전체 코딩 서열을 포함하는 사이모신 β -10 cDNA(178 bp) 프로브는 서열번호 1로 기재되는 프라이머와 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행하여 얻었다.³²P-표지된 cDNA 프로브는 레디프라임 cDNA 합성 킷트(Amersham)를 사용하여 합성하였다.

그 결과, 5개의 난소암 조직 중에서 4개의 샘플에서 사이모신 β -10 mRNA 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 2의 A). 도 2의 A에서 각각의 T 레인 밑에 나타난 숫자는 정상 조직에 비해 난소암 조직에서 나타나는 혼성 시그널의 비율을 나타낸 것이다.

〈2-2〉 PCR 분석

사이모신 β -10의 발현 패턴을 PCR로 확인하기 위하여, 2개의 인간 난소 cDNA 쌍(Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA)을 주형으로 사용하였다. 첫번째 쌍은 난소 혈장 낭선종암종(serous cystadeocarcinoma) 및 정상 조직의 cDNA이고, 두 번째 쌍은 난소 유두상선혈장암종(ovary papillary serous carcinoma) 및 정상 조직의 DNA이다. PCR은 제조회사의 지침에 따라 94℃에서 30초간 수행한 후,94℃에서 30초, 68℃에서 1분, 72℃에서 1분간 30회 반복하여 수행하고 72℃에서 5분간 더 반응시켰다. 사이모신 β -10은 서열번호 3으로 기재되는 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였고, 대조군으로 사용한 인간 리보좀 단백질 S9는 서열번호 5로 기재되는 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.

그 결과, 2개의 인간 난소 cDNA 쌍 중 하나의 난소암 세포에서 사이모신 β -10이 감소되어 발현되는 것으로 나타났다(도 2의 B).

〈2-3〉 사이모신 β -10의 조직별 발현 패턴 분석

본 발명자들은 정상 조직에서의 사이모신 β -10의 발현 패턴을 알아보기 위하여, 상기 실시예 〈1-1〉과 동일한 방법으로 정상적인 췌장(spleen), 흉선(thymus), 전립선(prostate), 고환(testis), 난소, 작은 창자, 결장(colon) 및 백혈구(peripheral blood leukocytes)에서 전체 RNA를 분리하여 상기 실시예 〈2-1〉과 동일한 방법으로 노던 블럿을 수행하였다.

그 결과, 사이모신 β -10 발현은 췌장(spleen), 흉선(thymus), 전립선(prostate), 고환(testis), 작은 창자, 결장(colon) 및 백혈구(peripheral blood leukocytes)와 같은 조직에 비해 난소 조직에서 가장 많이 발현되는 것으로 관찰되었다(도 2의 C). 따라서 사이모신 β -10은 정상적인 조직에서는 난소에서 가장 많이 발현되나 난소암 세포에서는 사이모신 β -10의 발현이 특이적으로 감소되었기 때문에 난소암 형성에 사이모신 β -10이 관여한다는 것을 추측할 수 있다.

〈실시예 3〉 SAGE 분석에 의한 사이모신 β -10 의 발현 분석

본 발명자들은 정상 조직 및 난소암 조직에서 사이모신 β -10 의 발현을 좀더 명확히 규명하기 위하여, NCBI 데이터베이스에서 사용할 수 있는 난소 SAGE(serial analysis of gene expression) 라이브러이에서 사이모신 β -10 의 발현을 분석하였다(Hough et al.,Cancer Res., 2000, 60:6281-87).

SAGE 분석을 위하여, 태그의 빈도수를 세포들에서 유전자의 상대적 발현으로 나타내었다. 표 3에서 보는 것과 같이 정상 난소 상피 세포주, SV40 큰 T 항원-형질전환된 난소 상피 세포주 및 10개 종양 중 3개의 종양에서 사이모신 β -10의 비슷한 발현 빈도수가 나타났다. 낮은 빈도수는 10개 종양 중에서 6개에서 나타났고, 하나의 종양에서 사이모신 β -10 발현의 빈도가 증가하였다.

상기 결과로부터, 사이모신 β -10이 난소암에서 약 60% 정도 감소하여 발현되고 암세포의 발생에서 중요한 역할을 할 것이라는 것을 추측할 수 있다.

[표 3]

〈실시예 4〉사이모신 β-10 유전자를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터의 제조

본 발명은 사이모신 β -10 유전자를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하기 위하여, 우선 사이모신 β -10 유전자를 분리하였다. 이를 위하여, 서열번호 7로 기재되는 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 프라이머를 사용하여 349 bp 크기의 인간 사이모신 β -10을 증폭하였고, 상기 증폭된 절편을 pCRⅡ-TOPO 벡터(Invitrogen 사)에 클로닝하였다.

상기 클로닝 산물은 양쪽 방향으로 염기서열을 분석하여 사이모신 β -10이 벡터에 정확하게 클로닝되었는지 확인하고, 상기 벡터를 "pCR-TOPO-사이모신 β -10"이라 명명하였다.

상기 pCR-TOPO-사이모신 β -10을 제한효소 EcoRI으로 절단한 후 사이모신 β-10을 포함하는 절편을 얻은 후, p△ACMVp(A)(Chinghai Cao 제조)를 제한효소 EcoRI으로 절단한 위치에 삽입하여 클로닝하였다. 상기 클로닝된 벡터를 다시 제한효소 BamHI으로 절단하여 이를 pQBI-Ad5CMV-GFP 벡터(Quantum, Canada)의 BglⅡ 위치에 삽입하였고, 이를 아데노바이러스 벡터 "Ad-GFP-사이모신 β -10"이라 명명하였다(도 3). pQBI-Ad5CMV-GFP 벡터는 Ad5 맵 유니트(map unit) 9.4∼15.5를 가지고 있어 아데노바이러스 백본 벡터(Adenovirus backbone vector) pJM17의 셔틀벡터(suttle vector)로 사용되며, GFP(Green Fluorescence Protein)를 포함하고 있어서 바이러스 감염시 유전자 전달의 정도를 쉽게 알아볼 수 있다.

본 발명자들은 상기 아데노바이러스 발현벡터 "Ad-GFP-사이모신 β -10"을2001년 10월 8일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10089BP).

〈실시예 5〉 증식성 재조합 변이 바이러스가 없고 사이모신 β -10 단백질을 세포내에서 생산할 수 있는 아데노바이러스의 제조

본 발명자들 세포에 감염되어 사이모신 β -10 단백질을 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론을 제조하기 위하여, 상기 실시예 4에서 제조한 발현벡터 Ad-GFP-사이모신 β -10을 아데노바이러스 모체 벡터 pJM17(McGrory et al.,Virology, 1988, 163:614-617)과 함께 패키징 세포주인 293 세포에 인산 칼슘 방법으로 형질전환(cotransfection)시켰다.

본 발명의 아데노바이러스 발현벡터를 이용하여 제조된 아데노바이러스 클론에 존재할 수 있는 증식성 재조합 변이 바이러스(replicatin competent recombinant virus; RCV)를 분석하기 위하여, 상기 아데노바이러스 클론에서 분리한 DNA에 아데노바이러스 타입 5의 E1A 유전자 부위 및 E1B 유전자 부위가 존재하는가를 확인하였다. 구체적으로, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 E1A에 대한 프라이머 및 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 E1B에 대한 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이 때 아데노바이러스 DNA는 프로티나제 K(proteinase K, 2 mg/㎖)를 0.5% SDS 존재 하에 처리한 다음 페놀 추출 및 에탄올 침전 등을 수행하여 분리하였다. 상기 E1A 프라이머 및 E1B 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해 증식성 재조합 변이 바이러스인 경우에 바이러스 DNA에 존재하는 E1 유전자 부위를 각각 752 bp 및 1818 bp 크기의 DNA 절편으로 아가로스 젤 상으로확인할 수 있다. 대조군으로는 E1 유전자 부위에 해당하지 않는 서열번호 13 및 서열번호 14로 기재되는 아데노바이러스 프라이머로 PCR을 수행하면 E1 유전자의 유무에 상관없이 816 bp 크기의 DNA 절편을 확인할 수 있었다.

또한, 증식성 재조합 변이 바이러스의 수 및 세포에서 잠재하는 바이러스 증식을 더욱 민감하게 찾아내기 위하여 짱 등의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. 증식하지 않는 다수의 바이러스에서 소수의 증식성 재조합 변이 바이러스를 증폭시키기 위하여 HeLa 세포를 사용하여 바이러스를 3번 계대배양하였다. 구체적으로 HeLa 세포를 바이러스 클론으로 감염시키고 48 시간이 경과한 다음 얼리고 녹이는 과정을 통해 이를 파쇄시켜 그 파쇄액의 상층액을 얻고 이를 다시 새로운 HeLa 세포에 가하여 배양하는 과정을 반복하였다. PCR 반응을 수행하는데 필요한 바이러스 DNA를 얻기 위하여 계대배양한 세포에서 맑은 세포 파쇄액을 얻어 프로티나제 K를 처리한 다음 페놀 추출 및 에탄올 침전을 수행하였다. 이 때 얻은 DNA 침전을 증류수에 녹여 상기와 같이 E1A 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.

본 발명의 아데노바이러스 발현벡터를 이용하여 제조한 아데노바이러스 클론에서 상기와 같은 선별과정을 통해서 얻은 증식성 재조합 변이 바이러스가 없는 아데노바이러스 클론을 150 mm 디쉬에서 자란 293 세포를 이용하여 증식시키고, 세슘 클로라이드(CsCl) 농도구배를 이용하여 2번 원심분리한 다음 10% 글리세롤, 1 mM 마그네슘 클로라이드가 포함된 인산완충용액(PBS)으로 투석시켜 유전자 요법에 사용할 아데노바이러스 클론을 제조하였다. 본 발명의 아데노바이러스 클론의 타이터는 상기 293 세포의 플라크 수를 측정하여 결정하였다.

〈실시예 6〉 Ad-GFP-사이모신 β -10을 인간 난소암 세포주에 감염

본 발명자들은 상기 실시예 5에서 제조한 증식성 변이 바이러스를 포함하지 않는 아데노바이러스를 인간 난소암 세포주 PA-1 및 SKOV3에 감염시켰다. 형질도입(transduction)의 효율은 Ad5CMV-GFP를 사용하여 측정하였고, PA-1 및 SKOV3 세포주에서 100 M.O.I.(Multipliaty of Infection)에서 90% 이상의 효율을 나타내었다. 감염(Infection)방법은 바이러스벡터 원액을 적정한 MOI에 맞게 PBS나 10% FBS-DMEM에 희석한 다음 적당한 부피로 맞추어 세포에 감염 시킨다.

본 발명자들은 상기 아데노바이러스가 감염된 세포에서 사이모신 β-10이 발현되는지 확인하기 위하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

세포를 용해하고, 세포 추출물의 동량(10 ㎍)을 15% SDS 폴리아크릴아미드 젤에 전기영동한 후, 니트로셀룰로스 막에 전기이동시키고, 토끼 항-사이모신 β -10 항체(provided by Dr Leondiadis L, Institute of Radioisotopes and Radiodiagnostic Products, NCSR Demokritos, Athens, Greece)를 프로브로 사용하였다. 검출은 ECL(enhanced chemiluminescence system; Amersham)을 사용하여 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 아데노바이러스가 감염된 세포에서 사이모신 β -10 은 강하게 발현되었다(도 4). 이는 본 발명의 아데노바이러스에 의해 감염된 세포는 사이모신 β -10 단백질을 제대로 발현시키는 것을 알 수 있다.

〈실시예 7〉사이모신 β-10이 난소암 세포성장(cell growth)에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 사이모신 β -10을 난소암 세포에 발현시켰을 때 난소암 세포의 성장에 미치는 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 5에서 제조한 아데노바이러스를 난소암 세포주에 감염시켜 상기 세포의 성장을 관찰하였다.

세포를 6-웰 플레이트에 2X 10⁵세포/웰의 농도로 3개의 복사물을 만들었다. 24시간 후 세포를 Ad-GFP-사이모신 β -10으로 감염시켰다. 감염 후 24시간부터 세포를 매일 배양하고, 트립판 블루(Trypan blue)로 염색하고 현미경으로 3일(PA-1) 또는 5일(SKOV3)까지 배양하여 세포를 계수하였다.

그 결과, 본 발명의 아데노바이러스로 감염된 PA-1 세포는 3일이 지났을 때 감염되지 않은 세포들에 비해 세포 성장이 둔화되었고, 정상 세포에 비해 20% 정도의 세포성장을 보였다. 본 발명의 아데노바이러스로 감염된 SKOV3 세포는 정상 세포에 비해 15% 정도의 세포성장을 보였다(도 5).

〈실시예 8〉사이모신 β-10이 난소암 세포의 세포자살(apoptosis)에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 사이모신 β -10을 난소암 세포에 발현시켰을 때 난소암 세포의 세포자살(apoptosis)에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 실시예 5에서 제조한 아데노바이러스를 난소암 세포주에 감염시켜 상기 세포가 세포자살 되는가를 알아보았다.

난소암 세포주인 PA-1 세포를 4-챔버 슬라이드(Nalgen Nunc, Inc., Naperville, IL, USA)에 5X 104 세포/웰의 농도로 깔고, 하루 동안 배양하였다.Ad-GFP-사이모신 β -10 및 Ad-GFP로 감염하고 2일 후, 챔버 슬라이드를 PBS(phospate-buffered saline)로 세척하고, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole; Boehringer Mannheim) 2 mg/㎖로 37℃에서 15분간 염색하고, PBS로 두 번 세척한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. DAPI는 염색체(chromosomal) DNA를 염색하며, 세포자살(Apoptosis)에 의해 DNA가 절편화(fragmentation)가 일어났을 경우 핵의 모양이 작고 여러개로 뭉쳐져 있는 것을 관찰할 수 있다. 염색 방법은 보통 1 ㎍/㎖ 농도의 DAPI 염색액으로 15∼30분간 염색한 다음 형광현미경으로 관찰한다.

그 결과, 본 발명의 아데노바이러스가 감염된 PA-1 세포는 DAPI-염색에 의해 깨끗한 DNA 절편이 보였다(도 6). 이는 본 발명의 아데노바이러스 감염에 의해 사이모신 β -10의 과잉 발현으로 인하여 세포가 세포자살하는 것을 나타낸다. GFP 발현을 관찰하여 감염시키고자 하는 벡터가 모든 세포에 제대로 침투하였는지 확인할 수 있다.

〈실시예 9〉사이모신 β-10이 난소암 세포의 액틴 구조에 미치는 영향 분석

사이모신 β -10은 액틴-결합 단백질이기 때문에 본 발명자들은 난소암 세포에서 사이모신 β -10을 과잉발현 시켰을 때 액틴의 구조가 변하는지 확인해 보았다.

상기 실시예 8과 같이 난소암 세포주 PA-1에 본 발명의 아데노바이러스 및 Ad-GFP를 발현하는 아데노바이러스로 감염을 감염시키고, 상기 세포 단일면을 상온에서 PBS에 있는 4% 파라포름알데히드로 40분 동안 고정시킨 후 팔로이딘(phalloidin)-FITC(Sigma) 25 ㎍/㎖로 어두운 곳에서 1시간 동안 염색하였다. 염색된 세포 단일면은 PBS에 있는 0.5% Triton X-100으로 두 번 세척하였다. 커버슬립을 PBS/글리신 마운턴트(mountant)를 사용하여 슬라이드 위에 올려놓고, 형광 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 대조군 세포 또는 사이모신 β -10을 발현하지 않는 아데노바이러스(Ad-GFP)로 감염시킨 세포에서는 정상적인 액틴 구조가 나타났으나, 본 발명의 아데노바이러스를 감염시킨 세포에서는 사이모신 β -10의 과잉발현으로 인하여 F-액틴 스트레스 섬유(stress fiber)가 파괴된 것으로 관찰되었다(도 7).

본 발명의 사이모신 β -10을 고형악성종양(solid malignant tumors) 세포에 발현시켜 암을 치료하는 방법은 별다른 부작용 없이 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있기 때문에 난소암, 자궁경부암, 위암, 폐암 및 간암 등의 암환자의 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> LEE, Je-Ho LEE, Seung-Hoon<120> Use of thymosin beta-10 for gene therapy of solid malignant tumors<130> 1p-09-06<160> 14<170> KopatentIn 1.71<210> 1<211> 18<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Tbeta up primer<400> 1cgggctcgga acgagagt 18<210> 2<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Tbeta down primer<400> 2cgcctcactt taaaggattc tagg 24<210> 3<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> thymosin up primer<400> 3tcggaacgag actgcacgga ttgt 24<210> 4<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> thymosin down primer<400> 4gttagcctga cggtttaaga ggcc 24<210> 5<211> 28<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> S9 up primer<400> 5gatgagaagg acccacggcg tctgttcg 28<210> 6<211> 28<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> S9 down primer<400> 6acagggagga cccgacgacc taacagag 28<210> 7<211> 18<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> thymosin full up primer<400> 7cgggctcgga acgagact 18<210> 8<211> 18<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> thymosin full down primer<400> 8ggttagcctg acggttta 18<210> 9<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> E1A up primer<400> 9agctgatcga agaggtactg 20<210> 10<211> 19<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> E1A down primer<400> 10gagtcacagc tatccgtac 19<210> 11<211> 22<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> E1B up primer<400> 11ggttacatct gacctcatgg ag 22<210> 12<211> 22<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> E1B down primer<400> 12cagtacctca atctgtatct tc 22<210> 13<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> control up primer<400> 13tcgtttctca gcagctgttg 20<210> 14<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> control down primer<400> 14catctgaact caaagcgtgg 20

Claims

사이모신 β-10 유전자를 함유하는 난소암 치료용 유전자 치료요법제.
제 1항에 있어서, 상기 사이모신 β-10 유전자는 아데노바이러스에 삽입되는 것을 특징으로 하는 유전자 치료요법제.
삭제
삭제
삭제
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 사이모신 β-10 유전자는 사이토메갈로바이러스의 프로모터 부위, 시미언바이러스 40의 후 아데닌다중화 신호 부위, 다클로닝 부위 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 부위로 구성되는 발현 카세트를 이용하여 발현되는 것을 특징으로 하는 유전자 치료요법제.
제 6항에 있어서, 다클로닝 부위에 사이모신 β-10 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 발현벡터 Ad-GFP-사이모신 β-10(수탁번호 : KCTC 10089BP)을 함유하는 유전자 치료요법제.
제 7항 기재의 아데노바이러스 발현벡터 Ad-GFP-사이모신 β-10(수탁번호 : KCTC 10089BP)를 패키징 세포에서 증식시킨 후 비증식성 변이 바이러스를 수득하는 것을 특징으로 하는, 난소암 치료용 유전자 치료요법제의 제조방법.
삭제
삭제
삭제
삭제