KR100454867B1

KR100454867B1 - Divalent vaccine against hepatitis B and hepatitis D and a preparing method thereof

Info

Publication number: KR100454867B1
Application number: KR10-2001-0008424A
Authority: KR
Inventors: 황순봉; 정용호; 유제만; 이경재; 정숙희; 성승규
Original assignee: 동화약품공업주식회사
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2001-02-20
Publication date: 2004-11-03
Also published as: KR20020068148A

Abstract

본 발명은 B형 간염 백신과 D형 간염 백신을 융합한 2가 혼합백신 (divalent vaccine) 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus, HBV)의 표면항원 (surface antigen)을 암호화하는 유전자 및 D형 간염 바이러스 (hepatitis D virus, HDV)의 델타항원 (delta antigen)을 암호화하는 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 전이벡터 (baculovirus transfer vector); 상기 베큘로바이러스 전이벡터 DNA가 형질감염된 재조합 베큘로바이러스 (recombinant baculovirus); 및 상기 재조합 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포로부터 발현된 B형 및 D형 2가 혼합백신 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의해 높은 수율로 생산된 B형 및 D형 2가 혼합백신은 두 종류의 다른 간염 바이러스를 동시에 예방할 수 있는 차세대 백신으로서 B형 간염의 예방 뿐 아니라 동반감염 또는 중복감염에 의한 D형 간염의 예방에도 효과적으로 사용될 수 있다.The present invention relates to a divalent vaccine combining a hepatitis B vaccine and a hepatitis D vaccine, and a method for preparing the same, and specifically, to the surface antigen of hepatitis B virus (HBV). Baculovirus transfer vector comprising a gene encoding a gene) and a gene encoding a delta antigen of hepatitis D virus (HDV); Recombinant baculovirus transfected with the baculovirus transfer vector DNA; And it relates to a type B and D type bivalent mixed vaccine expressed from the insect cells infected with the recombinant baculovirus and a method for producing the same. Produced in high yield by the production method of the present invention type B and D divalent mixed vaccine is a next-generation vaccine that can prevent two different types of hepatitis virus at the same time as well as the prevention of hepatitis B as well as by co-infection or overlapping infection It can also be used effectively for the prevention of hepatitis D.

Description

Divalent vaccine against hepatitis V type and D type and its preparation method {Divalent vaccine against hepatitis B and hepatitis D and a preparing method}

본 발명은 B형 간염 백신과 D형 간염 백신을 융합한 2가 혼합백신 (divalent vaccine) 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus, HBV)의 표면항원을 암호화하는 유전자 및 D형 간염 바이러스 (hepatitis D virus, HDV)의 델타항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 전이벡터 (baculovirus transfer vector); 상기 베큘로바이러스 전이벡터 DNA가 형질감염된 재조합 베큘로바이러스 (recombinant baculovirus); 및 상기 재조합 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포로부터 발현된 B형 및 D형 2가 혼합백신 및 그의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a divalent vaccine fused with a hepatitis B vaccine and a hepatitis D vaccine, and a method for preparing the same. Specifically, the present invention encodes a surface antigen of hepatitis B virus (HBV). Baculovirus transfer vectors comprising genes and genes encoding the delta antigen of hepatitis D virus (HDV); Recombinant baculovirus transfected with the baculovirus transfer vector DNA; And it relates to a type B and D type bivalent mixed vaccine expressed from the insect cells infected with the recombinant baculovirus and a method for producing the same.

B형 간염 바이러스는 인체에 침입하여 만성 및 급성 간염을 일으키며, 악화될 경우 간경화와 간암의 원인이 되는 병원체로, 전세계적으로 환자가 3억명에 이르는 것으로 추산하고 있다 (Tiollais and Buendia,Sci. Am., 264, 48, 1991). HBV의 피막은 3개의 단백질로 구성되는데, 구체적으로 S 항원을 포함하는 주 단백질, S 항원과 프리-S2 항원을 포함하는 중 단백질 및 S 항원, 프리-S2 항원과 프리-S1 항원을 포함하는 대 단백질로 구성된다. (Neurath, A.R. and Kent, S.B.H.,Adv. Virus Res.,34: 65-142, 1988). 이 모든 표면항원 단백질들은 HBV를 중화시키고 무력화하는 항체를 유도하며, 특히 프리-S 부위에 의해 유도되는 항체는 바이러스의 제거 및 급성 HBV 감염에서의 회복과 관련이 있고 S항원에 대한 무면역반응 (Non-responsiveness)을 극복할 수 있다 (Iwarson et al.,J. Med. Virol., 16: 89-96, 1985; Itoh et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:9174-9178, 1986; Neurath et al.,Vaccine, 7: 234-236, 1989; Budkowska et al.,J. Med. Virol., 20: 111-125, 1986; Milich et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82: 8168-8172, 1985; Milich et al.,J. Immunol., 137. 315-322, 1986).Hepatitis B virus enters the human body and causes chronic and acute hepatitis, and when worsened, it causes liver cirrhosis and liver cancer. It is estimated that there are 300 million patients worldwide (Tiollais and Buendia, Sci. Am). ., 264, 48, 1991). The coat of HBV consists of three proteins, specifically, a major protein containing S antigen, a heavy protein containing S antigen and a pre-S2 antigen, and a protein containing S antigen, pre-S2 antigen and pre-S1 antigen Consists of protein. (Neurath, AR and Kent, SBH, Adv. Virus Res., 34: 65-142, 1988). All of these surface antigen proteins induce antibodies that neutralize and neutralize HBV, in particular antibodies induced by the free-S site are associated with the removal of the virus and recovery from acute HBV infection and the immune response to S antigen ( Non-responsiveness) (Iwarson et al., J. Med. Virol. , 16: 89-96, 1985; Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 84: 9174-9178 , 1986; Neurath et al., Vaccine , 7: 234-236, 1989; Budkowska et al., J. Med. Virol. , 20: 111-125, 1986; Milich et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82: 8168-8172, 1985; Milich et al., J. Immunol. , 137.315-322, 1986).

HBV에 감염된 경우, 예를 들어 HBV 양성인 모친으로부터 태어나는 신생아나HBV에 노출된 의료기관 종사자들 또는 HBV 관련 간질환으로 인한 간이식 수술환자 등의 HBV 감염을 방지하기 위해 현재까지는 HB 면역글로불린 (hepatitis B immunoglobulin)을 사용하였다 (Beasley et al.,Lancet, 2, 1099, 1983; Todo et al.,Hepatol., 13, 619, 1991). 그러나 현재 사용되고 있는 HB 면역글로불린은 혈장으로부터 추출되기 때문에, 항원에 대한 특이성 (specificity)이 낮고 제조과정 중 오염원에 노출될 우려가 있으며 사람의 혈액을 계속 공급해야 한다는 문제점이 있다.HBV infection is currently used to prevent HBV infections, such as newborns born from HBV-positive mothers, health care workers exposed to HBV, or liver transplant patients with HBV-related liver disease. immunoglobulin) (Beasley et al., Lancet , 2, 1099, 1983; Todo et al . , Hepatol. , 13, 619, 1991). However, currently used HB immunoglobulin is extracted from the plasma, there is a problem that the specificity of the antigen (specificity) is low, there is a risk of exposure to contaminants during the manufacturing process and the human blood must continue to supply.

상기 문제점을 해결하기 위하여 생쥐의 HBV 표면항원에 대한 단일클론 항체를 사용하는 방법이 개발되었다. 그러나 생쥐 단일클론 항체는 일반적으로 항원에 대한 친화도가 높고 대량생산이 가능하지만, 인간에게 주사하였을 때 체내에서 면역반응을 유발한다는 단점이 있었다 (Shawler et al.,J. Immunol.,135, 1530, 1985).In order to solve the above problem, a method of using a monoclonal antibody against HBV surface antigen of a mouse has been developed. Mouse monoclonal antibodies, however, generally have high antigen affinity and mass production, but have the disadvantage of inducing an immune response in the body when injected into humans (Shawler et al., J. Immunol., 135, 1530). , 1985).

이에 상기 문제점을 해결하고자 인간의 단일클론 항체를 사용하는 기술이 보고되었으나, 친화도가 높은 인간 단일클론 항체의 생산기술은 실용화되어 있지 않다.In order to solve the above problems, a technique using a human monoclonal antibody has been reported, but a production technology of a high affinity human monoclonal antibody has not been put to practical use.

대신 생쥐 유래 단일클론 항체의 높은 친화도와 특이성을 유지한 채 인체 내에서의 면역유발능을 최대한 줄일 수 있는 방법으로 "인간화 항체"가 개발되었다. 인간화 항체는 생쥐항체의 항원결합부위 (CDRs)를 인간항체에 이식시킨 것으로, 유전공학적으로 대량생산이 가능하고, 유전자의 대부분을 인간화하였으므로 인체 내에서의 면역반응을 대폭 줄일수 있는 장점이 있다 (Riechmann et al.,Nature,332, 323, 1988; Nakatani et al.,Protein Engineering, 7,435, 1994).Instead, "humanized antibodies" have been developed as a way of minimizing immune induction in humans while maintaining the high affinity and specificity of mouse-derived monoclonal antibodies. Humanized antibodies are implanted mouse antigen-binding sites (CDRs) into human antibodies, which can be mass-produced genetically and humanized most of the genes, greatly reducing the immune response in the human body. Riechmann et al., Nature , 332, 323, 1988; Nakatani et al., Protein Engineering , 7,435, 1994).

HBV 백신은 1979년 Krugman 등에 의하여 HBV 감염자의 혈장을 열처리한 백신이 최초로 개발된 후 (Krugman et al.,N. Eng. J. Med., 72:111-124, 1979) 1980년대에 들어서서 효모인 싸카로마이쎄스 세레비지에 (Sacchromyces cerevisiae)를 이용한 재조합 단백질이 생산되기 시작하였다 (Emini et al.,J. Infect., 13:3-9, 1986). 이와 같이 효모를 이용한 생산의 경우 HBV에 대한 재조합 단백질은 총 효모 단백질의 5%를 차지하였다 (Holland et al.,J. Biol. Chem., 255:2596-2605, 1980). 또한, 1989년 들어 포유동물 세포인 CHO (Chines Hamster ovary) 세포를 이용하여 재조합 백신을 생산하는 방법이 개발되었고 (Tron et al.,J. Infect. Dis., 160:199-204, 1989) 이때부터 표면항원 뿐 아니라 프리-S2까지 포함한 재조합 백신을 생산하게 되었다. 최근 들어서는 효모 보다 진핵세포에 근접하면서 대량생산에 유용한 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 재조합 백신을 생산하는 연구가 활발히 진행중이며, T175 플라스크를 이용하는 경우 5∼8 ㎍의 생산수율로 재조합 백신을 생산할 수 있음이 보고되었다 (Eberhard et al.,Hepatology, 24:502-507, 1996).The HBV vaccine was first developed in 1979 by Krugman et al. After a vaccine was first heat-treated for HBV infected plasma (Krugman et al., N. Eng. J. Med. , 72: 111-124, 1979). Recombinant proteins using Sacchromyces cerevisiae began to be produced (Emini et al., J. Infect ., 13: 3-9, 1986). As such, in the case of production using yeast, the recombinant protein for HBV accounted for 5% of the total yeast protein (Holland et al., J. Biol. Chem. , 255: 2596-2605, 1980). In addition, in 1989, a method of producing recombinant vaccines using mammalian cells, CHO (Chines Hamster ovary) cells, was developed (Tron et al., J. Infect. Dis ., 160: 199-204, 1989). To produce a recombinant vaccine including pre-S2 as well as surface antigen. In recent years, research has been actively conducted to produce recombinant vaccines using a baculovirus expression system, which is closer to eukaryotic cells than yeast, and is useful for mass production. In the case of using T175 flasks, recombinant vaccines can be produced at a yield of 5 to 8 μg. Has been reported (Eberhard et al., Hepatology , 24: 502-507, 1996).

한편, D형 간염 바이러스는 작은 구형의 RNA 바이러스로서 1977년 이탈리아의 Mario Rizzettoe 박사와 그의 동료들에 의하여 처음 발견되었다 (Gut., 18:997-1003, 1977). HDV는 1636개의 염기로 구성된 단일가닥 구형 RNA (single strandedcircular RNA)가 상기 바이러스로부터 유일하게 발현되는 델타항원 및 HBV 유래 외피 단백질 (envelop protein)에 둘러싸인 직경 36 ㎚의 불완전한 바이러스 형태를 갖고 있다. 상기 델타항원은 바이러스 게놈이 복제되는 과정에서 RNA-편집 (RNA-editing)에 의하여 C-말단에 19개의 아미노산이 첨가된 동위형태 (isoform)가 생성되는데, 이를 P27 델타 혹은 대 간염 델타항원 (Large hepatitis delta antigen, LHDAg)이라 하고 원래의 항원을 P24 델타 혹은 소 간염 델타항원 (Small hepatitis delta antigen, SHDAg)이라 한다.Hepatitis D virus, on the other hand, is a small spherical RNA virus that was first discovered in 1977 by Dr. Mario Rizzettoe of Italy and his colleagues ( Gut. , 18: 997-1003, 1977). HDV has an incomplete viral form with a diameter of 36 nm surrounded by delta antigens and HBV derived envelope proteins in which single stranded circular RNAs consisting of 1636 bases are uniquely expressed from the virus. The delta antigen is an isoform in which 19 amino acids are added to the C-terminus by RNA-editing during the replication of the viral genome, which is called P27 delta or hepatitis delta antigen (Large). hepatitis delta antigen (LHDAg) and the original antigen is called P24 delta or small hepatitis delta antigen (SHDAg).

이러한 HDV는 1985년 최초로 HBV와 공존하는 것이 확인되었는데 (Smedile et al.,Biomed. Pharmacother., 39:460-461, 1985), 상기 바이러스는 자체 증식을 위하여 HBV 유래의 표면항원을 요구하기 때문에 반드시 HBV와 동반감염 (coinfection)되거나 이미 HBV에 감염된 환자에 중복감염 (superinfection) 되어야만 한다. 이 과정에서 동반감염의 경우는 감염자의 약 2.4∼4.7%가, 중복감염의 경우는 감염자의 약 50∼70%가 급성간염으로 발전하며, 이들 중 90% 이상이 만성 보균자가 된다. 이와 같이 HDV 및 HBV의 동반감염 또는 중복감염은 B형 간염만을 갖는 경우보다 상당히 높은 치사율을 보이는 심각한 바이러스성 간염으로, 특히 3억명 이상으로 추정되는 B형 간염 보균자 중 적어도 1,500만명 정도의 감염자가 HDV에 중복 또는 동반감염된 것으로 추정된다. 일반적으로, HDV는 상당한 지역적 편중성을 가지고 있어서, 특히 그리스를 포함한 서아시아 지역, 아마존 지역, 중앙아프리카 및 서부아메리카 지역에서 주로 발견되고 있다. 그러나, 비록 HDV가 이러한 지역적 편중성을 나타낸다 하더라도 B형 간염 백신만으로는 이미 감염된 B형간염 보균자의 중복 또는 동반감염에 의한 D형 간염 유도를 예방할 수 없기 때문에 D형 간염 백신의 개발이 절실히 요구되고 있다.This HDV was first identified as coexisting with HBV in 1985 (Smedile et al., Biomed. Pharmacother ., 39: 460-461, 1985), and since the virus requires HBV-derived surface antigen for its own proliferation, Coinfection with HBV or superinfection in patients already infected with HBV. In this process, about 2.4-4.7% of the infected people develop concomitant infections, and about 50-70% of the infected people develop acute hepatitis, and more than 90% of them become chronic carriers. As a result, the co-infection or overlapping infection of HDV and HBV is a serious viral hepatitis with a significantly higher mortality rate than hepatitis B alone, especially at least 15 million infected hepatitis B carriers estimated to be more than 300 million. Is suspected of being duplicated or co-infected. In general, HDV has considerable regional bias, and is mainly found in the West Asia region, including Greece, the Amazon region, Central Africa, and West America. However, although HDV shows such regional bias, the development of hepatitis D vaccine is urgently needed because hepatitis B vaccine alone cannot prevent the induction of hepatitis D by duplication or co-infection of already infected hepatitis B carriers.

이러한 요구를 충족시키기 위하여, 1991년에는 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 HDV의 델타항원을 발현하는데 성공하였으며 (Kos et al.,J. Gen. Vir., 72:833-842, 1991), 상기 발현 시스템으로부터 생산된 재조합 백신에 대한 생체내 활성 (in vivo efficacy)을 WHV-감염 우드척 (WHV-infected woodchuck)에서 확인하였다 (Karayiami et al.,J. Med. Virology, 41:221-226). 그러나, B형 및 D형 2가 백신의 개발 및 생산은 아직까지 시도된 적이 없다.To meet this need, in 1991, the baculovirus expression system was used to express delta antigen of HDV (Kos et al., J. Gen. Vir. , 72: 833-842, 1991). In vivo efficacy against recombinant vaccines produced from expression systems was confirmed on a WHV-infected woodchuck (Karayiami et al., J. Med. Virology , 41: 221-226). . However, the development and production of type B and type D bivalent vaccines have not been attempted yet.

일반적으로, 백신생산에 있어서 고려해야할 가장 중요한 기능은 항원 단백질에 대한 높은 결합능과 특이성을 갖는 우수한 항체를 생산하도록 유도하는 것인데, 이러한 항원 단백질의 기능은 항원성과 분자량 등의 특성에 의존한다. 따라서 항원의 분자량이 적은 경우에는 다양한 수용체 단백질을 항원에 결합시켜 면역원으로 이용하여야 하는 문제점이 지적되고 있다.In general, the most important function to consider in vaccine production is to induce the production of good antibodies with high binding capacity and specificity for antigenic proteins, the function of which depends on characteristics such as antigenicity and molecular weight. Therefore, when the molecular weight of the antigen is low, it is pointed out that a problem that should be used as an immunogen by binding various receptor proteins to the antigen.

한편, 베큘로바이러스는 곤충에게만 한정적으로 감염을 일으키는 바이러스로 약 80-200 Kbp 크기의 이중가닥 DNA가 막대형의 뉴클레오캡시드 외피에 둘러싸여 있다. 최근에 베큘로바이러스가 곤충세포에 감염되면 폴리히드린 (polyhedrin)이라는 단백질이 총단백질양의 25% 이상에 달할 정도로 발현되는 사실이 보고되면서 상기 폴리히드린 프로모터가 외래 단백질의 대량생산에 유용하게 이용되어 각광을받기 시작하였다. 이러한 베큘로바이러스를 이용한 발현 시스템은 대장균 발현 시스템에서와 동등 이상으로 외래 단백질의 대량생산이 가능하며, 당의 부가 (glycosylation), 인단백화 (phosphorylation) 및 지질단백화 (isoprenylation) 등의 번역후 수식 (post-translational modification)이 효과적으로 이루어져 외래 단백질을 생물학적 활성이 있는 천연형 단백질과 유사한 당단백질의 형태로 생산할 수 있다는 장점이 있다.On the other hand, baculovirus is a virus that infects only insects only, and double-stranded DNA of about 80-200 Kbp is surrounded by rod-shaped nucleocapsid envelope. Recently, when the baculovirus is infected with insect cells, it has been reported that a protein called polyhedrin is expressed to over 25% of the total protein amount, and the polyhydrin promoter is useful for mass production of foreign proteins. It started to get the spotlight. This baculovirus expression system is capable of mass production of foreign proteins more than or equal to that of E. coli expression systems, and post-translational modifications such as glycosylation, phosphorylation, and lipoproteinization (isoprenylation). The effective post-translational modification allows the production of foreign proteins in the form of glycoproteins that are similar to naturally occurring proteins with biological activity.

이에, 본 발명자들은 서로 다른 과 (family, 科)에 속하는 두 종류의 항원을 융합시켜 발현함으로써 두 종류의 간염 바이러스를 효과적으로 예방할 수 있고 보다 우수한 면역원성을 갖는 차세대 백신을 개발하고자 연구한 결과, B형 간염 바이러스의 표면항원과 D형 간염 바이러스의 델타항원을 동시에 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 제조하였고 이를 곤충세포에 감염시켜 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 B형 및 D형 2가 혼합백신을 대량생산함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have studied to develop a next-generation vaccine that can effectively prevent two types of hepatitis virus and express better immunogenicity by fusion and expression of two types of antigens belonging to different families (family, 科). Recombinant baculoviruses expressing the surface antigens of hepatitis virus and the delta antigens of hepatitis D virus were prepared at the same time, and then infected with insect cells, using a baculovirus expression system. The production completed the present invention.

본 발명의 목적은 B형 간염 바이러스에 의한 감염 예방 및 D형 간염 바이러스에 의한 중복 또는 동반감염을 예방하기 위하여, B형 간염 백신과 D형 간염 백신을 혼합하여 하나의 백신으로 제조함으로써 상기 두 종의 서로 다른 바이러스 모두에 대한 면역성을 갖는 2가 혼합백신을 개발하는 것이다.An object of the present invention is to prepare a vaccine by mixing the hepatitis B vaccine and hepatitis D vaccine in order to prevent infection by hepatitis B virus and to prevent duplication or concomitant infection by hepatitis D virus. To develop a bivalent vaccine combined with immunity against all of the different viruses.

도 1은 본 발명의 B형 간염 바이러스의 야생형 표면항원과 D형 간염 바이러스의 델타항원의 2가 혼합백신 SHDAg-HBsAg(WT)을 발현하는 베큘로바이러스 전이벡터 pAcHBs(WT)-HDs의 유전자 지도를 나타낸 것이고, 1 is a genetic map of the baculovirus transfer vector pAcHBs (WT) -HDs expressing the bivalent mixed vaccine SHDAg-HBsAg (WT) of the wild type surface antigen of the hepatitis B virus and the delta antigen of the hepatitis D virus of the present invention. To represent

도 2는 본 발명의 B형 간염 바이러스 표면항원의 에피토프 부분과 D형 간염 바이러스의 델타항원의 2가 혼합백신 SHDAg-HBsAg(EP)을 발현하는 베큘로바이러스 전이벡터 pAcHBs(EP)-HDs의 유전자 지도를 나타낸 것이고, Figure 2 is a gene of the baculovirus transfer vector pAcHBs (EP) -HDs expressing the epitope portion of the hepatitis B virus surface antigen of the present invention and the divalent mixed vaccine SHDAg-HBsAg (EP) of the delta antigen of hepatitis D virus Is a map,

도 3은 본 발명의 B형 및 D형 2가 혼합백신 SHDAg-HBsAg(WT)와 SHDAg-HBsAg(EP)가 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(WT)-HDsS와 pVL-HBs(EP)-HDs를 감염시킨 곤충세포로부터 발현되는지 확인하기 위하여 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과이고, Figure 3 shows the B and D type bivalent mixed vaccine SHDAg-HBsAg (WT) and SHDAg-HBsAg (EP) of the present invention is recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDsS and pVL-HBs (EP) -HDs SDS-PAGE analysis is performed to confirm that the expression is from the infected insect cells,

레인 1; 크기마커, 레인 2; 대조군,Lane 1; Size marker, lane 2; Control,

레인 3; HBsAg(WT), 레인 4; SHDAg-HBsAg(EP),Lane 3; HBsAg (WT), lane 4; SHDAg-HBsAg (EP),

레인 5; SHDAg-HBsAg(WT), 레인 6; AcNPVLane 5; SHDAg-HBsAg (WT), lane 6; AcNPV

도 4는 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(WT)-HDsS와 pVL-HBs(EP)-HDs가 감염된 곤충세포로부터 발현된 본 발명의 B형 및 D형 2가 혼합백신 SHDAg-HBsAg(WT)와SHDAg-HBsAg(EP)에 대한 항원의 진위를 확인하기 위하여 항-HBsAg 항체를 이용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과이고, Figure 4 shows the recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDsS and pVL-HBs (EP) -HDs of the B and D type bivalent mixed vaccine SHDAg-HBsAg (WT) of the present invention, Western blot analysis using anti-HBsAg antibody to confirm the authenticity of the antigen against SHDAg-HBsAg (EP),

레인 1; 대조군, 레인 2; HBsAg(WT),Lane 1; Control, lane 2; HBsAg (WT),

레인 3; SHDAg-HBsAg(EP), 레인 4; SHDAg-HBsAg(WT)Lane 3; SHDAg-HBsAg (EP), lane 4; SHDAg-HBsAg (WT)

레인 5; AcNPVLane 5; AcNPV

도 5는 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(WT)-HDsS와 pVL-HBs(EP)-HDs가 감염된 곤충세포로부터 발현된 본 발명의 B형 및 D형 2가 혼합백신 SHDAg-HBsAg(WT)와 SHDAg-HBsAg(EP)에 대한 항원의 진위를 확인하기 위하여 항-HDAg 항체를 이용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과이다. Figure 5 shows the recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDsS and pVL-HBs (EP) -HDs of the present invention B and D type bivalent mixed vaccine SHDAg-HBsAg (WT) and Western blot analysis using anti-HDAg antibody to confirm the authenticity of the antigen against SHDAg-HBsAg (EP).

레인 1; 대조군, 레인 2; SHDAg(WT)Lane 1; Control, lane 2; SHDAg (WT)

레인 5; AcNPVLane 5; AcNPV

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 B형 및 D형 간염 바이러스에 대한 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 동시에 포함하는 베큘로바이러스 전이벡터; 상기 베큘로바이러스 전이벡터 DNA가 형질감염된 재조합 베큘로바이러스; 및 상기 재조합 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포로부터 발현된 B형 및 D형 2가 혼합백신 및 그의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is a baculovirus transfer vector comprising a gene encoding the antigenic protein for hepatitis B and D virus; Recombinant baculovirus transfected with the baculovirus transfer vector DNA; And it provides a type B and D type bivalent mixed vaccine expressed from the insect cells infected with the recombinant baculovirus and a method of manufacturing the same.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

우선, 본 발명은 B형 및 D형 간염 바이러스에 대한 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 동시에 포함하는 베큘로바이러스 전이벡터를 제공한다.First, the present invention provides a baculovirus transfer vector comprising a gene encoding the antigenic proteins for hepatitis B and D viruses.

본 발명자들은 B형 간염 바이러스 및 D형 간염 바이러스의 전체 유전자 중에서 항원성이 가장 우수한 표면항원 및 델타항원 단백질에 대한 2가 혼합백신을 개발하기 위하여, 우선 B형 간염 바이러스의 표면항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 전이벡터 및 D형 간염 바이러스의 델타항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 전이벡터를 제조하였다 (도 1및도 2참조).In order to develop a bivalent mixed vaccine for the surface antigen and the delta antigen protein having the best antigenicity among all genes of the hepatitis B virus and the hepatitis D virus, the present inventors first encode a gene encoding the surface antigen of the hepatitis B virus. A baculovirus transition vector comprising a baculovirus transition vector comprising a gene encoding a delta antigen of hepatitis D virus was prepared (see FIGS . 1 and 2 ).

일차적으로 B형 간염 바이러스의 표면항원을 클로닝하기 위하여, PCR로 표면항원 전체 유전자 중서열번호 1로 기재되는 158-836 nt 부위를 증폭한 후 이로부터 얻은 PCR 산물을 베큘로바이러스 전이벡터 pVLHIS에 삽입하여 B형 간염 바이러스의 표면항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 전이벡터 pVLHBsAg(WT)를 제조하였다. 또한 본 발명에서는 B형 간염 바이러스 표면항원의 발현율을 높이기 위하여,B형 간염 바이러스 표면항원 중 에피토프 (epitope)를 암호화하는서열번호 4로 기재되는 425-682 nt 부위를 PCR로 증폭한 후 이로부터 얻은 PCR 산물을 상기와 동일한 베큘로바이러스 전이벡터에 삽입하여 B형 간염 바이러스 표면항원 중 에피토프 부분만을 암호화하는 유전자를 포함하는 전이벡터 pVLHBsAg(Ep)를 제조하였다.In order to clone the surface antigen of the hepatitis B virus primarily, PCR amplifies the 158-836 nt site of SEQ ID NO: 1 of the entire surface antigen gene, and then inserts the PCR product obtained from the baculovirus transfer vector pVLHIS. To prepare a transition vector pVLHBsAg (WT) containing a gene encoding the surface antigen of hepatitis B virus. In addition, in the present invention, in order to increase the expression rate of hepatitis B virus surface antigen, 425-682 nt site of SEQ ID NO: 4 encoding the epitope among the hepatitis B virus surface antigen was obtained by PCR amplification. The PCR product was inserted into the same baculovirus transition vector to prepare a transition vector pVLHBsAg (Ep) containing a gene encoding only the epitope portion of the hepatitis B virus surface antigen.

아울러 D형 간염 바이러스의 델타항원을 클로닝하기 위하여, PCR로 델타항원을 암호화하는 전체 유전자 중서열번호 7로 기재되는 1601-1016 nt 부위를 증폭한 후 이로부터 얻은 PCR 산물을 앞서 제조한 B형 간염 바이러스의 표면항원 유전자를 포함하는 전이벡터 pVLHBsAg(WT)와 pVLHBsAg(Ep)에 삽입하여 각각의 재조합 베큘로바이러스 전이벡터 pVLHBs(WT)-HDs와 pVLHBs(Ep)-HDs를 제조하였다. 상기 각각의 베큘로바이러스 전이벡터는 제한효소 처리에 의하여 목적하는 유전자가 올바르게 삽입되었음을 확인하였다.In addition, in order to clone the delta antigen of the hepatitis D virus, amplified 1601-1016 nt site of SEQ ID NO: 7 of the entire gene encoding the delta antigen by PCR, and then obtained the PCR product obtained from the hepatitis B prepared previously Recombinant baculovirus transition vectors pVLHBs (WT) -HDs and pVLHBs (Ep) -HDs were prepared by inserting them into the transition vectors pVLHBsAg (WT) and pVLHBsAg (Ep) containing the surface antigen gene of the virus. Each baculovirus transfer vector was confirmed that the desired gene was correctly inserted by restriction enzyme treatment.

상기와 같이 제조된 본 발명의 베큘로바이러스 전이벡터는 인간 및 동물에는 감염되지 않고 곤충세포에만 감염되어 외래 유전자를 발현하는 베큘로바이러스 발현 시스템 (Baculoviirus expression system)을 이용한다. 베큘로바이러스 전이벡터에 삽입된 B형 간염 바이러스의 표면항원 유전자 및 D형 간염 바이러스의 델타항원 유전자는 베큘로바이러스의 폴리히드린 프로모터 (Polyhedrin promotor)의 조절하에 발현되도록 제조되었다.The baculovirus transfer vector of the present invention prepared as described above uses a baculovirus expression system (Baculoviirus expression system) that infects only insect cells without expressing humans and animals and expresses foreign genes. The surface antigen gene of hepatitis B virus and the delta antigen gene of hepatitis D virus inserted into the baculovirus transfer vector were prepared to be expressed under the control of the polyhedrin promotor of baculovirus.

또한, 본 발명은 상기 베큘로바이러스 전이벡터 DNA를 곤충세포에 형질감염시켜 얻은 재조합 베큘로바이러스를 제공한다.The present invention also provides a recombinant baculovirus obtained by transfecting the baculovirus transfer vector DNA into insect cells.

상기와 같이 제조된 각각의 베큘로바이러스 전이벡터를 야생형 베큘로바이러스 DNA인 AcNPV와 함께 곤충세포에 형질감염시켜 각각의 2가 혼합백신을 발현하는 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(WT)-HDs와 pVL-HBs(EP)-HDs를 완성하였다. 세포주는 일반적으로 가장 많이 사용되는 스포돕프테라 푸르기페다 (Spodoptera frugiperda, Sf) 곤충세포를 사용하였다. 형질감염은 베큘로바이러스 전이벡터를 베큘로바이러스 DNA와 함께 양이온의 리포좀 (liposome) 중재방법을 이용하여 곤충세포주에 동시형질감염 (cotransfection)시킨 후 플라크 분석 방법 (plaque assay)을 이용하여 재조합 바이러스를 선별하였다.Recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDs expressing each bivalent mixed vaccine by transfecting each baculovirus transfer vector prepared as described above with insect cells with AcNPV, a wild type baculovirus DNA pVL-HBs (EP) -HDs were completed. Cell lines generally used the most commonly used Spodoptera frugiperda (Sf) insect cells. Transfection was carried out by cotransfection of insect cell lines using baculovirus transfer vectors with baculovirus DNA using a cationic liposome mediation method followed by recombinant virus analysis using plaque assay. Screened.

본 발명의 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(WT)-HDs는 B형 간염 바이러스의 표면항원과 D형 간염 바이러스의 델타항원을 동시에 발현하여 B형 및 D형 2가 혼합백신을 생산할 수 있으며, 한국미생물보존센터에 2000년 11월 27일자로 기탁되었다 (수탁번호 : KCCM-10229). 또한, 본 발명의 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(EP)-HDs는 B형 간염 바이러스 표면항원의 에피토프 부분과 D형 간염 바이러스의 델타항원을 동시에 발현하여 B형 및 D형 2가 혼합백신을 생산할 수 있으며, 역시 한국미생물보존센터에 2000년 11월 27일자로 기탁되었다 (수탁번호 : KCCM-10228).Recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDs of the present invention can simultaneously express the surface antigen of hepatitis B virus and the delta antigen of hepatitis D virus to produce hepatitis B and D bivalent vaccines, Korea It was deposited on November 27, 2000 with the Center for Microbial Conservation (Accession No .: KCCM-10229). In addition, the recombinant baculovirus pVL-HBs (EP) -HDs of the present invention simultaneously express the epitope portion of the hepatitis B virus surface antigen and the delta antigen of the hepatitis D virus to produce hepatitis B and D bivalent mixed vaccines. It was also deposited with the Korea Microorganism Conservation Center on 27 November 2000 (Accession No .: KCCM-10228).

아울러, 본 발명은 상기 재조합 베큘로바이러스가 형질감염된 곤충세포로부터 발현된 B형 및 D형 2가 혼합백신의 융합 단백질 및 그의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a fusion protein of type B and D type bivalent mixed vaccines expressed from insect cells transfected with the recombinant baculovirus and a method of preparing the same.

상기 B형 및 D형 2가 혼합백신의 융합 단백질의 제조방법은Method for producing a fusion protein of the type B and D divalent mixed vaccine

1) 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시키는 단계;1) infecting the recombinant baculovirus with insect cells;

2) 곤충세포에서 B형 및 D형 2가 혼합백신의 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 선별하는 단계; 및2) selecting a recombinant virus expressing a fusion protein of type B and type D bivalent mixed vaccines in insect cells; And

3) 곤충세포로부터 상기 융합 단백질을 분리·정제하는 단계에 의해 제공된다.3) isolating and purifying the fusion protein from insect cells.

상기 단계 3에서 B형 및 D형 2가 혼합백신 융합 단백질을 정제하는 방법은 용해 완충용액 및 초음파 분쇄 등을 이용하여 곤충세포를 파쇄하여 파쇄 침전물을 얻은 후, 사용한 발현벡터에 따라 적당한 크로마토그래피법으로 상기 세포파쇄 침전물을 정제하는 것으로 구성된다. 본 발명에서는 재조합 베큘로바이러스로부터 발현된 B형 및 D형 2가 혼합백신 융합 단백질의 아미노 말단에 존재하는 6개의 히스티딘 (histidine) 잔기를 이용하여 양이온을 띄는 Ni-NTA 레진을 이용한 친화크로마토그래피와 이미다졸 (imidazole) 농도구배 용액을 이용하여 융합 단백질을 용출시켜 세포유래 단백질이나 비특이적으로 결합된 베큘로바이러스 유래 단백질이 제거된 순수한 B형 및 D형 2가 혼합백신의 융합 단백질을 분리·정제하였다In the step 3, the method for purifying the B- and D-type bivalent mixed vaccine fusion proteins is obtained by crushing insect cells using a lysis buffer and ultrasonic crushing to obtain a crushed precipitate, followed by appropriate chromatography according to the expression vector used. It consists of purifying the cell disruption precipitate. In the present invention, affinity chromatography using Ni-NTA resin having a cation using six histidine residues at the amino terminus of the type B and D bivalent mixed vaccine fusion proteins expressed from recombinant baculovirus and A fusion protein was eluted using an imidazole concentration gradient solution to isolate and purify a fusion protein of pure type B and D bivalent mixed vaccines from which cell-derived proteins or nonspecifically bound baculovirus-derived proteins were removed.

본 발명자들은 B형 및 D형 2가 혼합백신을 발현하는 각각의 재조합 베큘로바이러스로부터 상기 단백질이 실제로 발현되는지 확인하기 위하여 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과, 본 발명의 재조합 베큘로바이러스가 감염되지 않은 곤충세포의 상등액 (도 3의 레인 2 참조)에서는 B형 및 D형 2가 혼합백신의 융합 단백질이 검출되지 않은 반면, 상기 재조합 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포의 상등액 (도 3의 레인 5 참조)에서는 43 kDa 크기의 융합 단백질이 대량 발현됨을 확인하였다. 일반적으로, B형 간염 바이러스의 표면항원은 발현율이 극도로 미약하기 때문에, 본 발명에서는 백신으로서의 기본 기능을 유지하는 한도 내에서 발현율을 극대화하기 위하여 델타항원 뒤에 표면항원의 주요 에피토프만을 융합시킨 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(EP)-HDs를 제조하였다. 상기 재조합 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포의 상등액을 SDS-PAGE 겔에 걸어 각 단백질 밴드의 밀도 차이를 영상분석장치로 비교 분석한 결과, B형 및 D형 2가 혼합백신의 융합 단백질은 전체 세포 단백질의 약 30% 정도로 대량생산됨을 확인하였다 (도 3참조)The present inventors conducted an SDS-PAGE analysis to confirm that the protein is actually expressed from each recombinant baculovirus expressing a mixed vaccine of type B and D type 2. As a result, the recombinant baculovirus of the present invention was not infected. Supernatant of Insect Cells (3of In lane 2), the fusion proteins of the mixed vaccines of type B and D 2 were not detected, whereas the supernatants of insect cells infected with the recombinant baculovirus (3Lane 5), it was confirmed that the fusion protein of 43 kDa size was expressed in large quantities. In general, since the surface antigen of hepatitis B virus is extremely low in expression rate, in the present invention, the recombinant bacul fused only the main epitope of the surface antigen after the delta antigen to maximize the expression rate within the limit of maintaining the basic function as a vaccine. Rovir pVL-HBs (EP) -HDs were prepared. The supernatant of the insect cells infected with the recombinant baculovirus was placed on an SDS-PAGE gel, and the difference in density of each protein band was analyzed using an image analysis device. About 30% of the mass production was confirmed (3Reference)

또한, 본 발명자들은 상기와 같이 재조합 베큘로바이러스로부터 발현된 각각의 융합 단백질이 항원으로서의 기능을 갖는지를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 웨스턴 블럿 분석은 발현된 융합 단백질이 D형 간염 바이러스의 델타항원을 포함하고 있는지를 확인하기 위하여 델타항원에 대한 항체로 토끼 항-HDAg 다중클론성 항체 (rabbit anti-HDAg polyclonal antibody, S. B. Hwang et al.,Virology, 190:413-422, 1992)를 이용하였고, B형 간염 바이러스의 표면항원을 포함하고 있는지를 확인하기 위하여 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 항체로 토끼 항-HBsAg 다중클론성 항체 (rabbit anti-HBsAg polyclonal antibody, American Qualex사)를 이용하여 수행하였다.In addition, the inventors performed a Western blot analysis to confirm that each fusion protein expressed from the recombinant baculovirus has a function as an antigen as described above. Western blot analysis showed that rabbit anti-HDAg polyclonal antibody (SB Hwang et al.) Was used as an antibody against delta antigen to confirm that the expressed fusion protein contained the delta antigen of hepatitis D virus. , Virology , 190: 413-422, 1992) and rabbit anti-HBsAg polyclonal antibodies as antibodies against the surface antigens of hepatitis B virus to determine whether they contain surface antigens of hepatitis B virus. (rabbit anti-HBsAg polyclonal antibody, American Qualex).

그 결과, 항-HBsAg 항체와 반응시킨 경우에는 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(WT)-HDs가 감염된 곤충세포의 상등액에서 43 kD의 밴드가 검출되었고 (도 4참조), 항-HDAg 항체와 반응시킨 경우에도 역시 상기와 동일한 위치에서의 밴드가 검출되었다 (도 5참조). 이들 항체는 거짓-감염 (mock-infection)된 대조군 (도 4및도 5의 레인 1 참조)이나 야생형 베큘로바이러스 DNA (AcNPV)에 감염된 세포 (도 4및도 5의 레인 5 참조)의 어떠한 단백질과도 반응하지 않아 본 발명의 재조합 베큘로바이러스로부터 발현된 융합 단백질이 B형 간염 바이러스의 표면항원과 D형 간염 바이러스의 델타항원이 융합된 2가 혼합백신임을 확인하였다.As a result, when reacted with an anti-HBsAg antibody, a band of 43 kD was detected in the supernatant of insect cells infected with recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDs (4When reacted with an anti-HDAg antibody, a band at the same position was also detected (see above).5Reference). These antibodies are mock-infected controls (4And5of Cells infected with wild type baculovirus DNA (AcNPV) (see lane 1).4And5of It did not react with any of the proteins of Ref. 5) to confirm that the fusion protein expressed from the recombinant baculovirus of the present invention was a bivalent mixed vaccine in which the surface antigen of hepatitis B virus and the delta antigen of hepatitis D virus were fused. .

상기와 같은 확인 단계를 거쳐 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(WT)-HDs가 감염된 곤충세포로부터 분리·정제된 융합 단백질은 공지의 B형 간염 바이러스 유래의 표면항원 유전자 (158-836 nt)와 D형 간염 바이러스 유래의 델타항원 유전자 (1016-1601 nt)를 포함하는,서열번호 10으로 기재되는 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 암호화하고 있으며, 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(EP)-HDs가 감염된 곤충세포로부터 분리·정제된 융합 단백질은 공지의 B형 간염 바이러스 유래의 표면항원 중 에피토프 유전자 (425-682 nt)와 D형 간염바이러스 유래의 델타항원 유전자 (1016-1601 nt)를 포함하는,서열번호 11로 기재되는 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 암호화하고 있다.The fusion protein isolated and purified from insect cells infected with recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDs through the above-described identification step is a surface antigen gene (158-836 nt) and D derived from a known hepatitis B virus. Insect cells infected with recombinant baculovirus pVL-HBs (EP) -HDs encoding a polypeptide consisting of the amino acid set forth in SEQ ID NO: 10 , including a delta antigen gene (1016-1601 nt) derived from hepatitis virus The fusion protein isolated and purified from SEQ ID NO: 11 comprising an epitope gene (425-682 nt) and a delta antigen gene (1016-1601 nt) derived from hepatitis D virus among surface antigens derived from a known hepatitis B virus. It encodes a polypeptide consisting of an amino acid described by.

본 발명의 B형 및 D형 2가 혼합백신 융합 단백질의 제조방법은 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 기존의 효모 혹은 대장균의 발현 시스템을 이용한 방법보다 상당히 많은 양의 재조합 단백질을 생산할 수 있으며, 곤충세포를 이용하여 백신을 생산함으로써 포유동물 세포를 이용하여 생산하는 경우에 나타나는 생산성 저하의 문제점을 개선하고 효모를 이용하여 생산하는 경우에 나타나는 당질화의 결핍에 의한 면역원성 저하의 문제점을 해결함으로써 백신의 제조에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법은 기존의 재조합 단백질의 정제과정에 비하여 보다 단순화된 정제과정을 그 특징으로 갖는데, 정제과정이 세포파쇄 후 바로 친화 크로마토그래피를 수행하는 단계만으로 구성되기 때문에 기존의 방법에 비해 비용절감 및 생산수율 향상효과를 가져올 수 있다.The production method of the B- and D-type bivalent mixed vaccine fusion proteins of the present invention can produce a significantly larger amount of recombinant protein using a baculovirus expression system than the conventional yeast or Escherichia coli expression system. By producing a vaccine using cells, the vaccine improves the problem of reduced productivity when produced using mammalian cells, and solves the problem of reduced immunogenicity due to a lack of glycation when produced using yeast. It can be usefully used for the preparation of. In addition, the preparation method of the present invention is characterized by a more simplified purification process as compared to the purification process of the existing recombinant protein, since the purification process consists of only performing affinity chromatography immediately after cell disruption. Compared with this, it can reduce cost and improve production yield.

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명의 B형 및 D형 2가 혼합백신 융합 단백질의 제조방법은 곤충세포를 이용하여 융합 단백질을 대량으로 생산하고 분리·정제 공정을 단일 단계로 단순화함으로써, 배양된 세포의 총단백질 중 30% 이상의 고수율로 B형 및 D형 2가 혼합백신을 수득할 수 있다.As described above, the production method of the B- and D-type bivalent mixed vaccine fusion proteins of the present invention is to produce a large amount of fusion proteins using insect cells and to simplify the separation and purification process in a single step, Form B and D bivalent mixed vaccines can be obtained with high yields of at least 30% in total protein.

이하 본 발명을 실시 예에 의하여 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> B형 및 D형 간염 바이러스 항원의 클로닝 및 재조합 베큘로바이러스 전이벡터의 제조Example 1 Cloning of Hepatitis B and D Virus Antigens and Preparation of Recombinant Baculovirus Transfer Vector

일차적으로서열번호 1로 기재되는 B형 간염 바이러스의 표면항원 158-836 nt 부위 (Valenzuela et al.,Nature, 280:815-819, 1979)를 클로닝하기 위하여,서열번호 2로 기재되는 센스 프라이머 SH103과서열번호 3으로 기재되는 안티센스 프라이머 SH93를 이용하여 pHBV315를 주형으로 PCR을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 산물을 베큘로바이러스 전이벡터의 제한효소 BglⅡ 위치에 삽입하여 B형 간염 바이러스의 표면항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 전이벡터 pAcHBsAg(WT)를 제조하였다.Sense primer SH103 set forth in SEQ ID NO: 2 for cloning the surface antigen 158-836 nt site (Valenzuela et al., Nature , 280: 815-819, 1979) of the hepatitis B virus primarily described as SEQ ID NO: 1 PCR was performed with pHBV315 as a template using an antisense primer SH93 as set forth in SEQ ID NO: 3 . The amplified PCR product was inserted into the restriction enzyme BglII site of the baculovirus transfer vector to prepare a transition vector pAcHBsAg (WT) containing a gene encoding the surface antigen of hepatitis B virus.

또한, B형 간염 바이러스 표면항원의 발현율을 높이기 위하여 B형 간염 바이러스 표면항원 중서열번호 4로 기재되는 에피토프 (epitope) 부분 425-682 nt (Ou JH, Rutter WJ,J. Virology, 61:782-786, 1987) 부위만을서열번호 5로 기재되는 센스 프라이머 SH105와서열번호 6으로 기재되는 안티센스 프라이머 SH110을 이용하여 PCR로 증폭한 후 이로부터 얻은 PCR 산물을 상기와 동일한 베큘로바이러스 전이벡터의 제한효소 BglⅡ 위치에 삽입하여 B형 간염 바이러스 표면항원 중 에피토프 부분만을 암호화하는 유전자를 포함하는 전이벡터 pAcHBsAg(Ep)를 제조하였다.Also, in order to increase the expression rate of hepatitis B virus surface antigen, the epitope portion 425-682 nt of SEQ ID NO: 4 of the hepatitis B virus surface antigen (Ou JH, Rutter WJ, J. Virology , 61: 782- 786, 1987) amplified by PCR using only the sense primer SH105 described in SEQ ID NO: 5 and the antisense primer SH110 described in SEQ ID NO: 6 , and then the PCR product obtained therefrom was restriction enzyme of the same baculovirus transfer vector. A transfection vector pAcHBsAg (Ep) containing a gene encoding only the epitope portion of the hepatitis B virus surface antigen was inserted into the BglII site.

아울러,서열번호 7로 기재되는 D형 간염 바이러스의 델타항원 1601-1016 nt 부위 (Hwang SB et al.,Virology, 190:413-422, 1992)를 클로닝하기 위하여,서열번호 8로 기재되는 센스 프라이머 SH107과서열번호 9로 기재되는 안티센스 프라이머 SH87을 이용하여 pECE-d-SM을 주형으로 PCR을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 산물을 앞서 제조한 B형 간염 바이러스의 표면항원 유전자를 포함하는 전이벡터 pVLHBsAg(WT)와 pVLHBsAg(Ep)의 제한효소 EcoRI과 BglⅡ 위치에 삽입하여 각각의 베큘로바이러스 전이벡터 pVLHBs(WT)-HDs와 pVLHBs(Ep)-HDs를 제조하였다. 이와 같이 제조된 각각의 베큘로바이러스 전이벡터 DNA를 야생형 베큘로바이러스 DNA인 AcNPV와 함께 양이온의 리포좀 (liposome) 중재방법을 이용하여 곤충세포주에 동시형질감염 (cotransfection)시킨 후 플라크 분석방법 (plaque assay)으로 최종 선별하여 각각의 2가 혼합백신을 발현하는 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(WT)-HDs와 pVL-HBs(EP)-HDs를 확보하였다.In addition, in order to clone the delta antigen 1601-1016 nt site (Hwang SB et al., Virology , 190: 413-422, 1992) of the hepatitis D virus described in SEQ ID NO: 7 , the sense primer described in SEQ ID NO: 8 PCR was performed with pECE-d-SM as a template using the antisense primer SH87 described by SH107 and SEQ ID NO . The PCR product amplified therefrom is inserted into the restriction enzymes EcoRI and BglII of the transfer vectors pVLHBsAg (WT) and pVLHBsAg (Ep) containing the surface antigen gene of the hepatitis B virus prepared above, respectively, to the baculovirus transfer vectors pVLHBs. (WT) -HDs and pVLHBs (Ep) -HDs were prepared. Each baculovirus transfer vector DNA thus prepared was cotransfected into an insect cell line using a cationic liposome mediation method with the wild type baculovirus DNA AcNPV, followed by plaque assay. The final selection was performed to obtain recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDs and pVL-HBs (EP) -HDs expressing each bivalent mixed vaccine.

본 발명의 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(WT)-HDs는 B형 간염 바이러스의 표면항원과 D형 간염 바이러스의 델타항원을 동시에 발현하여 B형 및 D형 2가 혼합백신을 생산할 수 있으며, 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2000년 11월 27일자로 기탁되었다 (수탁번호 : KCCM-10229). 또한, 본 발명의 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(EP)-HDs는 B형 간염 바이러스 표면항원의 에피토프 부분과 D형 간염 바이러스의 델타항원을 동시에 발현하여 B형 및 D형 2가 혼합백신을 생산할 수 있으며, 역시 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2000년 11월 27일자로 기탁되었다 (수탁번호 : KCCM-10228).Recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDs of the present invention can simultaneously express the surface antigen of hepatitis B virus and the delta antigen of hepatitis D virus to produce hepatitis B and D bivalent vaccines, Korea It was deposited on November 27, 2000 in the Center for Microbial Conservation (KCCM) (Accession No .: KCCM-10229). In addition, the recombinant baculovirus pVL-HBs (EP) -HDs of the present invention simultaneously express the epitope portion of the hepatitis B virus surface antigen and the delta antigen of the hepatitis D virus to produce hepatitis B and D bivalent mixed vaccines. It was also deposited with the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM) on November 27, 2000 (Accession Number: KCCM-10228).

<실시예 2> B형 및 D형 혼합백신의 대량생산 및 분리·정제Example 2 Mass Production, Separation, and Purification of Mixed Type B and D Type Vaccines

상기 실시예 1로부터 제조된 재조합 베큘로바이러스로부터 각각의 혼합백신을 대량으로 생산하기 위하여, 상기 재조합 베큘로바이러스들을 충분히 배양한 곤충세포 Sf9에 감염시켰다.In order to produce a large amount of each mixed vaccine from the recombinant baculovirus prepared in Example 1, the recombinant baculoviruses were infected with sufficiently cultured insect cell Sf9.

우선, 곤충세포 Sf9를 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum)을 포함하는 그레이스 곤충 배지 (grace's insect medium, Bio-Whittacker사)에 접종하여 배양 플라스크의 바닥에 고르게 퍼지도록 27℃에서 충분히 배양하였다. 세포가 1 x 10⁵cells/㎖ 농도로 충분히 배양되면 배양액의 기존배지를 제거한 후 혈청이 첨가되지않은 그레이스 곤충 배지와 앞서 제조된 각각의 재조합 베큘로바이러스가 포함된 배지를 첨가한 후 27℃에서 1∼2시간 동안 방치하였다. 그 후, 재조합 베큘로바이러스를 포함한 배지를 제거한 후 새로운 배지를 첨가하고 다시 3∼4일 동안 배양하였다. 배양 후 곤충세포를 회수하여 완충용액으로 세척하고 -80℃로 급속히 냉각시켰다가 바로 녹여서 1×결합 완충용액 (binding buffer)에 현탁하였다. 상기 현탁액을 초음파 파쇄기를 이용하여 3분간 2회 반복하여 파쇄한 후 원심분리하여 상등액만을 회수하였다. 회수한 상등액을 이용하여 각각의 재조합 단백질의 분리 및 항원성 확인에 이용하였다.First, the insect cells Sf9 were inoculated in grace's insect medium (Bio-Whittacker) containing 10% fetal bovine serum and sufficiently incubated at 27 ° C. to spread evenly on the bottom of the culture flask. After the cells have been sufficiently incubated at a concentration of 1 x 10 ⁵ cells / ml, the culture medium is removed, and then, at 27 ° C., after the addition of the medium containing no insect serum and the medium containing each recombinant baculovirus prepared above, It was left for 1-2 hours. Then, after removing the medium containing the recombinant baculovirus, fresh medium was added and cultured again for 3 to 4 days. After incubation, the insect cells were collected, washed with a buffer solution, rapidly cooled to -80 ° C, immediately dissolved, and suspended in 1 × binding buffer. The suspension was repeatedly crushed twice for 3 minutes using an ultrasonic crusher and then centrifuged to recover only the supernatant. The recovered supernatant was used for isolation and antigenicity of each recombinant protein.

상기와 같이 회수된 상등액으로부터 B형 및 D형 2가 혼합백신을 분리·정제하기 위하여, Ni-NTA 레진 친화 컬럼 크로마토그래피 (Novagen)를 다음과 같이 실시하였다. 우선, 레진을 컬럼에 충진한 후 충진한 레진의 3배 정도 부피의 멸균 증류수로 충분히 세척하고, 충진한 레진의 5배 정도 부피의 1×충진 완충용액 (charged buffer)으로 충분히 세척하였다. 상기 칼럼을 다시 충진한 레진의 3배 정도 부피의 1×결합 완충용액을 이용하여 레진을 세척한 후 컬럼에 앞서 회수한 상등액을 통과시켜 레진에 흡착시켰다. 상등액이 모두 용출된 후 레진의 10배 정도 부피의 1×결합 완충용액을 이용하여 레진을 세척하고 6배 정도 부피의 1×세척 완충용액 (washing buffer)으로 다시 세척하여 레진에 흡착된 세포유래 단백질이나 비특이적으로 결합된 베큘로바이러스 유래 단백질을 제거하였다. 이와 같이 세척된 레진에 이미다졸 (imidazole)이 40 mM∼1 M 농도로 포함된 1×용출 완충용액 (elution buffer)을 순차적으로 흘려주어 각각의 B형 및 D형 2가 혼합백신의 융합단백질을 회수하였다. 재조합 베큘로바이러스로부터 발현된 B형 및 D형 2가 혼합백신 융합 단백질은 아미노 말단에 6개의 히스티딘 잔기를 가지고 있어 양이온을 띄는 Ni-NTA 레진에 결합되어 쉽게 분리되어 진다. 이러한 과정을 거쳐 세포유래 또는 베큘로바이러스 유래 단백질들이 모두 제거된 B형 및 D형 2가 혼합백신의 융합 단백질만을 순수하게 정제한 후 원하는 농도로 농축하였다.Ni-NTA resin affinity column chromatography (Novagen) was performed as follows to separate and purify the B and D bivalent mixed vaccines from the supernatant recovered as described above. First, the resin was filled in a column, and then sufficiently washed with sterile distilled water about 3 times the volume of the filled resin, and sufficiently washed with 1 × charged buffer about 5 times the volume of the filled resin. The column was washed with a volume of 1 × binding buffer 3 times the volume of the refilled resin, and then adsorbed onto the resin by passing the supernatant recovered before the column. After all of the supernatant is eluted, the resin is washed with 10 times the volume of 1 × binding buffer and then again washed with 6 times the volume of 1 × washing buffer. However, non-specifically bound baculovirus derived proteins were removed. The washed resin was sequentially poured with 1 × elution buffer containing imidazole at a concentration of 40 mM to 1 M, thereby fusion protein of each type B and D type bivalent mixed vaccine. Recovered. Type B and D bivalent mixed vaccine fusion proteins expressed from recombinant baculovirus have six histidine residues at the amino terminus and are easily isolated by binding to a cation-containing Ni-NTA resin. Through this process, only the fusion proteins of type B and D bivalent mixed vaccines from which cell-derived or baculovirus-derived proteins were removed were purified purely and concentrated to the desired concentration.

<실시예 3> B형 및 D형 2가 혼합백신의 발현 및 항원성 확인Example 3 Expression of B and D Bivalent Mixed Vaccines and Confirmation of Antigenicity

<3-1> SDS-PAGE 분석<3-1> SDS-PAGE Analysis

본 발명의 B형 및 D형 2가 혼합백신을 발현하는 각각의 재조합 베큘로바이러스로부터 상기 단백질이 실제로 발현되는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 2로부터 얻은 곤충세포 파쇄물의 상등액을 램리 등의 방법 (Laemmli et al.,Nature, 217:680, 1970)에 따라 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동을 실시하고 코마시 블루로 염색하여 단백질의 발현을 확인하였다.In order to confirm whether the protein is actually expressed from each recombinant baculovirus expressing a mixed vaccine of type B and D type 2 of the present invention, the supernatant of the insect cell lysate obtained from Example 2 was prepared using a method such as Laemmli. et al., Nature , 217: 680, 1970) were subjected to electrophoresis on 10% SDS-PAGE gel and stained with Coomassie Blue to confirm the expression of the protein.

그 결과,도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 재조합 베큘로바이러스가 감염되지 않은 곤충세포의 상등액 (레인 2)에서는 B형 및 D형 2가 혼합백신의 융합 단백질이 검출되지 않은 반면, 상기 재조합 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포의 상등액 (레인 5)에서는 43 kDa 크기의 융합 단백질이 대량 발현됨을 확인하였다. 일반적으로, B형 간염 바이러스의 표면항원은 발현율이 극도로 미약하기 때문에, 본 발명에서는 백신으로서의 기본 기능을 유지하는 한도 내에서 발현율을 극대화하기 위하여 델타항원 뒤에 표면항원의 주요 에피토프만을 융합시킨 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(EP)-HDs를 제조하였다. 상기 재조합 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포의 상등액을 SDS-PAGE 겔에 걸어 각 단백질 밴드의 밀도 차이를 영상분석장치로 비교 분석한 결과, B형 및 D형 2가 혼합백신의 융합 단백질은 전체 세포 단백질의 약 30% 정도로 대량생산됨을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 3 , the supernatant (lane 2) of the insect cells infected with the recombinant baculovirus of the present invention (lane 2), while the fusion protein of the type B and D-type bivalent mixed vaccine was not detected, the recombinant The supernatant (lane 5) of insect cells infected with baculovirus was confirmed to express a large amount of fusion protein of 43 kDa size. In general, since the surface antigen of hepatitis B virus is extremely poor in expression rate, in the present invention, the recombinant bacul fused only the main epitope of the surface antigen after the delta antigen in order to maximize the expression rate within the limit of maintaining the basic function as a vaccine. Rovir pVL-HBs (EP) -HDs were prepared. The supernatant of the insect cells infected with the recombinant baculovirus was placed on an SDS-PAGE gel, and the difference in density of each protein band was analyzed using an image analyzer. As a result, the fusion proteins of the B- and D-type bivalent vaccines were whole cell proteins. About 30% of the mass production was confirmed.

<3-2> 웨스턴 블럿 분석<3-2> Western Blot Analysis

본 발명자들은 상기와 같이 재조합 베큘로바이러스로부터 발현된 각각의 융합 단백질이 항원으로서의 기능을 갖는지를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.We performed Western blot analysis to confirm that each fusion protein expressed from recombinant baculovirus has the function as an antigen as above.

구체적으로, 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 전기영동을 실시하여 SDS-PAGE 겔상에서 분리한 43 kDa 크기의 융합 단백질을 Hoefer사 (미국)의 단백질 전기 블럿터를 이용하여 니트로셀룰로오즈 막에 옮긴 후 상기 막을 TNT 완충용액으로 세척하였다. 상기에서 발현된 융합 단백질이 D형 간염 바이러스의 델타항원을 포함하고 있는지와 동시에 B형 간염 바이러스의 표면항원을 포함하고 있는지를 확인하기 위하여, 델타항원에 대한 항체로 토끼 항-HDAg 다중클론성 항체 (rabbit anti-HDAg polyclonal antibody, S. B. Hwang et al.,Virology, 190:413-422, 1992)를 이용하였고, B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 항체로 토끼 항-HBsAg 다중클론성 항체 (rabbit anti-HBsAg polyclonal antibody, American Qualex)를 이용하여 상기 막에 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 다시 TNT 완충용액으로 세척하고 HRP-표지 2차 항체 (HRP-labelled secondary antibody, AmericanQualex)를 이용하여 반응시킨 후 최종 각 항원을 ECL 웨스턴 블럿 검출 키트 (ECL western blot detection kit, Amersharm pharmacia biotech사)를 이용하여 확인하였다.Specifically, the nitrocellulose membrane was subjected to electrophoresis in the same manner as in Example <3-1> using a protein electric blotter of 43 kDa size fusion protein isolated on an SDS-PAGE gel by Hoefer (USA). After transfer to the membrane was washed with TNT buffer. In order to confirm whether the fusion protein expressed above contains the delta antigen of hepatitis D virus and the surface antigen of hepatitis B virus, the rabbit anti-HDAg polyclonal antibody is used as an antibody against the delta antigen. (rabbit anti-HDAg polyclonal antibody, SB Hwang et al., Virology , 190: 413-422, 1992) and rabbit anti-HBsAg polyclonal antibody (rabbit anti) as an antibody against the surface antigen of hepatitis B virus. -HBsAg polyclonal antibody, American Qualex) was used to react with the membrane for 2 hours. After completion of the reaction, the membranes were washed with TNT buffer solution and reacted with HRP-labeled secondary antibody (AmericanQualex), and each final antigen was detected by ECL western blot detection kit (Amersharm pharmacia). biotech company).

그 결과, D형 간염 바이러스의 델타항원을 확인하기 위하여 델타항원을 대조군으로 하고 항-HDAg 항체와 반응시킨 경우에는 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(WT)-HDs가 감염된 곤충세포의 상등액에서 43 kD의 밴드가 검출되었고 (도 5), B형 간염 바이러스의 표면항원을 확인하기 위하여 야생형 HBsAg를 대조군으로 하고 항-HBsAg 항체와 반응시킨 경우에도 역시 상기와 동일한 위치에서 밴드가 검출되었다 (도 4). 이들 항체는 거짓-감염 (mock-infection)된 대조군 (레인 1)이나 야생형 베큘로바이러스 DNA (AcNPV)에 감염된 세포 (레인 5)의 어떠한 단백질과도 반응하지 않아 본 발명의 재조합 베큘로바이러스로부터 발현된 융합 단백질이 B형 간염 바이러스의 표면항원과 D형 간염 바이러스의 델타항원이 융합된 2가 혼합백신임을 확인하였다.As a result, when the delta antigen was used as a control to identify the delta antigen of hepatitis D virus and reacted with an anti-HDAg antibody, the supernatant of insect cells infected with recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDs was 43 kD. The band of was detected ( FIG. 5 ), and the band was also detected at the same position even when wild-type HBsAg was used as a control and reacted with an anti-HBsAg antibody to confirm the surface antigen of the hepatitis B virus ( FIG. 4 ). . These antibodies do not react with any protein of mock-infected control (lane 1) or cells infected with wild-type baculovirus DNA (AcNPV) (lane 5) and are expressed from the recombinant baculovirus of the present invention. The fusion protein was confirmed to be a bivalent mixed vaccine in which the surface antigen of hepatitis B virus and the delta antigen of hepatitis D virus were fused.

<3-3> 아미노산 서열 분석<3-3> amino acid sequence analysis

상기 실시예 2로부터 분리·정제된 본 발명의 B형 및 D형 2가 혼합백신 융합 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과, 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(WT)-HDs가 감염된 곤충세포로부터 분리·정제된 융합 단백질은 공지의 B형 간염 바이러스 유래의 표면항원 유전자 (158-836 nt)와 D형 간염 바이러스 유래의 델타항원 유전자 (1016-1601 nt)를 포함하는,서열번호 10으로 기재되는 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드이고, 재조합 베큘로바이러스 pVL-HBs(EP)-HDs가 감염된 곤충세포로부터 분리·정제된 융합 단백질은 공지의 B형 간염 바이러스 유래의 표면항원 중 에피토프 유전자 (425-682 nt)와 D형 간염바이러스 유래의 델타항원 유전자 (1016-1601 nt)를 포함하는,서열번호 11로 기재되는 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드 임을 확인하였다.As a result of analyzing the amino acid sequences of the B- and D-type bivalent mixed vaccine fusion proteins of the present invention isolated and purified from Example 2, the recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDs were isolated from insect cells infected with The purified fusion protein is an amino acid set forth in SEQ ID NO: 10 comprising a known surface antigen gene (158-836 nt) derived from hepatitis B virus and a delta antigen gene (1016-1601 nt) derived from hepatitis D virus. The fusion protein isolated polypeptide and purified from insect cells infected with recombinant baculovirus pVL-HBs (EP) -HDs are epitope genes (425-682 nt) and D in surface antigens derived from known hepatitis B virus. It was confirmed that the polypeptide was composed of the amino acid set forth in SEQ ID NO: 11 , including the delta antigen gene (1016-1601 nt) derived from hepatitis virus.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 B형 및 D형 2가 혼합백신은 두 종류의 다른 간염 바이러스를 동시에 예방할 수 있는 차세대 백신으로서 B형 간염의 예방 뿐 아니라 동반감염 또는 중복감염에 의한 D형 간염의 예방에도 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 B형 및 D형 2가 혼합백신의 제조방법은 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 곤충세포로부터 융합 단백질을 생산함으로써 동물세포 또는 효모를 이용하는 경우의 생산성 저하 및 당질화의 결핍에 의한 면역원성 저하의 문제점을 해결하여 생산수율을 증대시킬 수 있으며, 정제과정이 단일 단계로 단순하여 비용절감 효과를 가져올 수 있다.As described above, the hepatitis B and D divalent mixed vaccine of the present invention is a next-generation vaccine that can prevent two different types of hepatitis virus at the same time, as well as the prevention of hepatitis B, as well as hepatitis D by co-infection or overlapping infection. It can be effectively used for the prevention of In addition, the production method of the mixed type B and D bivalent vaccine of the present invention by producing a fusion protein from insect cells using a baculovirus expression system to reduce the productivity and deficiency of glycation when using animal cells or yeast It is possible to increase the production yield by solving the problem of lowering immunogenicity, and the purification process is simple in a single step can bring a cost-saving effect.

<110> DONG HWA PHARM. IND. CO., LTD <120> Divalent vaccine against hepatitis B and hepatitis D and a preparing method thereof <130> 0p-11-15 <160> 11 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 681 <212> DNA <213> HBsAg (WT) NT sequence (158-836) <400> 1 atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60 ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120 tttctagggg gatctcccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180 tcaccaacct cctgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240 atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tattggttct tctggattat 300 caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcaa caacaaccag tacgggacca 360 tgcaaaacct gcacgactcc tgctcaaggc aactctatgt ttccctcatg ttgctgtaca 420 aaacctacgg atggaaattg cacctgtatt cccatcccat cgtcctgggc tttcgcaaaa 480 tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 540 cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ctatatggat gatgtggtat 600 tgggggccaa gtctgtacag catcgtgagt ccctttatac cgctgttacc aattttcttt 660 tgtctctggg 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Met Ser Arg Ser Glu Arg Arg Lys Asp Arg Gly Gly Arg Glu Asp Ile 1 5 10 15 Leu Glu Gln Trp Val Ser Gly Arg Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Arg 20 25 30 Asp Leu Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu Glu Glu Asp Asn 35 40 45 Pro Trp Leu Gly Asn Ile Lys Gly Ile Ile Gly Lys Lys Asp Lys Asp 50 55 60 Gly Glu Gly Ala Pro Pro Ala Lys Lys Leu Arg Met Asp Gln Met Glu 65 70 75 80 Ile Asp Ala Gly Pro Arg Lys Arg Pro Leu Arg Gly Gly Phe Thr Asp 85 90 95 Lys Glu Arg Gln Asp His Arg Arg Arg Lys Ala Leu Glu Asn Lys Arg 100 105 110 Lys Gln Leu Ser Ser Gly Gly Lys Ser Leu Ser Arg Glu Glu Glu Glu 115 120 125 Glu Leu Lys Arg Leu Thr Glu Glu Asp Glu Lys Arg Glu Arg Arg Ile 130 135 140 Ala Gly Pro Ser Val Gly Gly Val Asn Pro Leu Glu Gly Gly Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Phe Val Pro Ser Met Gln Gly Val Pro Glu 165 170 175 Ser Pro Phe Ala Arg Thr Gly Glu Gly Leu Asp Ile Arg Gly Ser Gln 180 185 190 Gly Phe Pro Gly Ser Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro 195 200 205 Leu Leu Val Leu Gln Ala Ser Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr 210 215 220 Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly 225 230 235 240 Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn 245 250 255 His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met 260 265 270 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 275 280 285 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 290 295 300 Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr 305 310 315 320 Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys 325 330 335 Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 340 345 350 Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser 355 360 365 Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 370 375 380 Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro 385 390 395 400 Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe 405 410 415 Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile 420 <210> 11 <211> 283 <212> PRT <213> SHDAg-HBsAg (epitope, 90-175) amino acids sequence <400> 11 Met Ser Arg Ser Glu Arg Arg Lys Asp Arg Gly Gly Arg Glu Asp Ile 1 5 10 15 Leu Glu Gln Trp Val Ser Gly Arg Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Arg 20 25 30 Asp Leu Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu Glu Glu Asp Asn 35 40 45 Pro Trp Leu Gly Asn Ile Lys Gly Ile Ile Gly Lys Lys Asp Lys Asp 50 55 60 Gly Glu Gly Ala Pro Pro Ala Lys Lys Leu Arg Met Asp Gln Met Glu 65 70 75 80 Ile Asp Ala Gly Pro Arg Lys Arg Pro Leu Arg Gly Gly Phe Thr Asp 85 90 95 Lys Glu Arg Gln Asp His Arg Arg Arg Lys Ala Leu Glu Asn Lys Arg 100 105 110 Lys Gln Leu Ser Ser Gly Gly Lys Ser Leu Ser Arg Glu Glu Glu Glu 115 120 125 Glu Leu Lys Arg Leu Thr Glu Glu Asp Glu Lys Arg Glu Arg Arg Ile 130 135 140 Ala Gly Pro Ser Val Gly Gly Val Asn Pro Leu Glu Gly Gly Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Phe Val Pro Ser Met Gln Gly Val Pro Glu 165 170 175 Ser Pro Phe Ala Arg Thr Gly Glu Gly Leu Asp Ile Arg Gly Ser Gln 180 185 190 Gly Phe Pro Gly Ser Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr 195 200 205 Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr 210 215 220 Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser 225 230 235 240 Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr 245 250 255 Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu 260 265 270 Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu 275 280<110> DONG HWA PHARM. IND. CO., LTD <120> Divalent vaccine against hepatitis B and hepatitis D and a preparing method according <130> 0p-11-15 <160> 11 <170> Kopatent In 1.55 <210> 1 <211> 681 <212> DNA < 213> HBsAg (WT) NT sequence (158-836) <400> 1 atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60 ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120 tttctagggg gatctcccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180 tcaccaacct cctgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240 atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tattggttct tctggattat 300 caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcaa caacaaccag tacgggacca 360 tgcaaaacct gcacgactcc tgctcaaggc aactctatgt ttccctcatg ttgctgtaca 420 aaacctacgg atggaaattg cacctgtatt cccatcccat cgtcctgggc tttcgcaaaa 480 tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 540 cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ctatatggat gatgt ggtat 600 tgggggccaa gtctgtacag catcgtgagt ccctttatac cgctgttacc aattttcttt 660 tgtctctggg tatacattta a 681 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH103 sense primer <400> 2 ggaagttcta tggagaacat ccac 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH93 antisense primer <400> 3 ggggatcctt aaatgtatac ccaga 25 <210> 4 <211> 261 <212> DNA <213> HBsAg (epitope) nt sequence (425-682) <400> 4 tgcctcatct tcttattggt tcttctggat tatcaaggta tgttgcccgt ttgtcctcta 60 attccaggat caacaacaac cagtacggga ccatgcaaaa cctgcacgac tcctgctcaa 120 ggcaactcta tgtttccctc atgttgctgt acaaaaccta cggatggaaa ttgcacctgt 180 attcccatcc catcgtcctg ggctttcgca aaatacctat gggagtgggc ctcagtccgt 240 ttctcttggc tcagtttatg a 261 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH105 sense primer <400> 5 ggaagatctt gcctcatctt ctta 24 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH110 antisense primer <400> 6 gggatcctca taaactgagc caaga 25 <210> 7 <211> 588 <212> DNA <213> SHDAg sequence NT sequence (1601-1016) <400> 7 atgagccggt ccgaaagaag gaaagaccgc ggggggaggg aagacatcct cgagcagtgg 60 gtgagcggaa gaaagaagtt agaggaactc gagagagacc tccggaagtt aaagaagaaa 120 atcaagaaac tagaggaaga caatccctgg ctgggaaaca tcaaaggaat aatcggaaag 180 aaggataagg atggagaggg ggcacccccg gcgaagaagc tccggatgga ccagatggag 240 atagacgccg gacctaggaa gaggcctctc aggggaggat tcaccgacaa ggagaggcag 300 gatcaccgac gaaggaaggc cctcgagaac aagaggaagc agctatcgtc ggggggaaag 360 agcctcagca gggaggagga agaggaactt aag aggttga ccgaggaaga cgagaaaagg 420 gaaagaagaa tagccggccc gtcggttggg ggtgtgaacc ccctcgaagg tggatcgagg 480 ggagcgcccg ggggcggctt cgtccccagc atgcaaggag tcccggagtc ccccttcgct 540 cggacccaggg agggact <400> 8 ccggaattca atgagccggt ccgaa 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH87 antisense primer <400> 9 ggggatcctg ggaatccctg gctt 24 <210> 10 <211> 423 <212> PRT <213> SHDAg-HBsAg Amino acids sequence <400> 10 Met Ser Arg Ser Glu Arg Arg Lys Asp Arg Gly Gly Arg Glu Asp Ile 1 5 10 15 Leu Glu Gln Trp Val Ser Gly Arg Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Arg 20 25 30 Asp Leu Arg L ys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu Glu Glu Asp Asn 35 40 45 Pro Trp Leu Gly Asn Ile Lys Gly Ile Ile Gly Lys Lys Asp Lys Asp 50 55 60 Gly Glu Gly Ala Pro Pro Ala Lys Lys Leu Arg Met Asp Gln Met Glu 65 70 75 80 Ile Asp Ala Gly Pro Arg Lys Arg Pro Leu Arg Gly Gly Phe Thr Asp 85 90 95 Lys Glu Arg Gln Asp His Arg Arg Arg Lys Ala Leu Glu Asn Lys Arg 100 105 110 Lys Gln Leu Ser Ser Gly Gly Lys Ser Leu Ser Arg Glu Glu Glu Glu 115 120 125 Glu Leu Lys Arg Leu Thr Glu Glu Asp Glu Lys Arg Glu Arg Arg Ile 130 135 140 Ala Gly Pro Ser Val Gly Gly Val Asn Pro Leu Glu Gly Gly Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Phe Val Pro Ser Met Gln G ly Val Pro Glu 165 170 175 Ser Pro Phe Ala Arg Thr Gly Glu Gly Leu Asp Ile Arg Gly Ser Gln 180 185 190 Gly Phe Pro Gly Ser Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro 195 200 205 Leu Leu Val Leu Gln Ala Ser Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr 210 215 220 Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly 225 230 235 240 Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn 245 250 255 His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met 260 265 270 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 275 280 285 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 290 295 300 Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Pro Cys Lys Thr 305 310 315 320 Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys 325 330 335 Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 340 345 350 Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser 355 360 365 Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 370 375 380 Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro 385 390 395 400 Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe 405 410 415 Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile 420 <210> 11 < 211> 283 <212> PRT <213> SHDAg- HBsAg (epitope, 90-175) amino acids sequence <400> 11 Met Ser Arg Ser Glu Arg Arg Lys Asp Arg Gly Gly Arg Glu Asp Ile 1 5 10 15 Leu Glu Gln Trp Val Ser Gly Arg Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Arg 20 25 30 Asp Leu Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu Glu Glu Asp Asn 35 40 45 Pro Trp Leu Gly Asn Ile Lys Gly Ile Ile Gly Lys Lys Asp Lys Asp 50 55 60 Gly Glu Gly Ala Pro Pro Ala Lys Lys Leu Arg Met Asp Gln Met Glu 65 70 75 80 Ile Asp Ala Gly Pro Arg Lys Arg Pro Leu Arg Gly Gly Phe Thr Asp 85 90 95 Lys Glu Arg Gln Asp His Arg Arg Arg Lys Ala Leu Glu Asn Lys Arg 100 105 110 Lys Gln Leu Ser Ser Gly Gly Lys Ser Leu Ser Arg Glu Glu Glu Glu 115 120 125 Glu Leu Lys Arg Leu Thr Glu Glu Asp Glu Lys Arg Glu Arg Arg Ile 130 135 140 Ala Gly Pro Ser Val Gly Gly Val Asn Pro Leu Glu Gly Gly Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Phe Val Pro Ser Met Gln Gly Val Pro Glu 165 170 175 Ser Pro Phe Ala Arg Thr Gly Glu Gly Leu Asp Ile Arg Gly Ser Gln 180 185 190 Gly Phe Pro Gly Ser Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr 195 200 205 Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr 210 215 220 Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser 225 230 235 240 Met Phe Pro Ser Cys Cys Cy Ly Thr Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr 245 250 255 Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu 260 265 270 Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu 275 280

Claims

delete

A gene encoding a surface antigen derived from hepatitis B virus (HBV), represented by the 158-836 nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 , and a delta antigen derived from HDV (hepatitis D virus), represented by the 1601-1016 nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7 A baculovirus transfer vector containing a fusion gene in which a gene encoding it is fused.

delete

Fusion of a gene encoding only an epitope portion of an HBV derived surface antigen represented by 425-682 nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a gene encoding an HDV derived delta antigen represented by 1601-1016 nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7 Baculovirus transfer vector containing the gene.

Recombinant baculovirus pVL-HBs (WT) -HDs transfected with the baculovirus transfer vector of claim 3 (Accession No .; KCCM-10229).

Recombinant baculovirus pVL-HBs (EP) -HDs transfected with the baculovirus transfer vector of claim 5 (Accession No .: KCCM-10228).

A type B and D type bivalent mixed vaccine fusion protein expressed from the recombinant baculovirus of claim 6 and represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 .

delete

A type B and D type bivalent mixed vaccine fusion protein expressed from the recombinant baculovirus of claim 7 and represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO.

delete

1) infecting insect cells with the recombinant baculovirus of claim 6;

2) expressing a fusion protein of type B and D bivalent mixed vaccines by culturing the insect cells; And

3) A method for producing a B-type and D-type bivalent mixed vaccine fusion protein comprising separating and purifying the fusion protein from insect cells.

13. The method of claim 12, wherein the insect cell in step 1) is a Spodoptera frugiperda (Sf) cell line.

13. The process according to claim 12, wherein in step 3) the fusion protein is purified by affinity chromatography.

The method according to claim 14, wherein the affinity chromatography uses Ni-NTA resin bearing a cation using six histidine residues present at the amino terminus of the fusion protein.