KR100453185B1 - Method for producing protein-polymer conjugate with solid-phase column - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역원성이 감소되고 혈액 내 순환 수명이 증대된 기능성 단백질-폴리머 접합체를 고정상 칼럼을 이용하여 제조하는 방법에 관한 것으로서, 단백질을 고정상 칼럼에 흡착시키는 공정; 활성화된 수용성 폴리머 용액을 상기 칼럼으로 통과시켜, 상기 칼럼에 흡착된 단백질에 상기 폴리머를 접합함으로써 단백질-폴리머 접합체를 생성하는 공정; 및 상기 단백질-폴리머 접합체를 상기 칼럼으로부터 수득하는 공정을 포함하는 고정상 칼럼을 이용한 단백질-폴리머 접합체의 제조방법을 제공한다.The present invention relates to a method for preparing a functional protein-polymer conjugate having reduced immunogenicity and increased circulation life in blood using a fixed bed column, comprising: adsorbing a protein to a fixed bed column; Passing an activated water soluble polymer solution through the column to bond the polymer to a protein adsorbed on the column to produce a protein-polymer conjugate; And it provides a method for producing a protein-polymer conjugate using a stationary phase column comprising the step of obtaining the protein-polymer conjugate from the column.
Description
본 발명은 고정상 칼럼을 이용한 단백질-폴리머 접합체의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 면역원성이 감소되고 혈액 내 순환 수명이 증대된 기능성 단백질-폴리머 접합체를 고정상 칼럼을 이용하여 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing a protein-polymer conjugate using a stationary phase column, and more particularly, to a method for preparing a functional protein-polymer conjugate having reduced immunogenicity and increased circulation life in blood using a stationary phase column. will be.
재조합 인터페론은 대장균 등의 숙주에서 성공적으로 발현되어 대량 생산되고 있는 생물학적 활성 단백질의 일종으로, B형과 C형 간염 그리고 각종 암 치료제로 널리 이용되고 있다. 그러나, 이와 같은 재조합 인터페론은 면역원성이 높아 발열, 구토, 오한 등의 부작용을 동반하여, 혈액 내 순환수명이 짧아 치료기간 중에 증상에 따라 자주 주사해야하는 단점이 있다. 이러한 부작용을 극복하기 위하여 인체에 무해한 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 수용성 폴리머를 인터페론 등의 생물학적 활성단백질에 공유적으로 결합시켜 부작용을 감소시키는 연구가 이루어지고 있다. 이와 같이, PEG 및 유사한 수용성 폴리머를 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 접합(coupling)하는 초기 개념은 미국특허 제4,179,337호에 일부 기술되어 있으며, 미국 특허 제4,766,106호 및 제4,917,888호는 mPEG-2,4,6-트리클로로-S-트리아진, mPEG-N-석신이미딜 글루타레이트 또는 mPEG-N-석신이미딜석시네이트 등의 활성화 폴리머와 접합된 베타 인터페론을 개시하고 있다. 이들 특허들은 단백질의 공유 결합적 변형이 pH 5 내지 9에서 수행된다고 기술하고 있으며, 비교적 과량(10, 20 및 50배)의 활성화 폴리머를 사용한다.Recombinant interferon is a type of biologically active protein that has been successfully expressed in a host such as Escherichia coli and produced in large quantities, and is widely used as a therapeutic agent for hepatitis B and C and various cancers. However, such a recombinant interferon has a high immunogenicity, accompanied by side effects such as fever, vomiting, chills, etc., the shorter circulation life in the blood has to be injected frequently depending on the symptoms during the treatment period. In order to overcome these side effects, research has been conducted to reduce side effects by covalently binding a water-soluble polymer such as polyethylene glycol (PEG), which is harmless to the human body, to a biologically active protein such as interferon. As such, the initial concept of coupling PEG and similar water soluble polymers to peptides or polypeptides is described in part in US Pat. No. 4,179,337, while US Pat. Nos. 4,766,106 and 4,917,888 are mPEG-2,4,6. A beta interferon conjugated with an activating polymer such as -trichloro-S-triazine, mPEG-N-succinimidyl glutarate or mPEG-N-succinimidyl succinate is disclosed. These patents describe that covalent modification of proteins is carried out at pH 5-9, using relatively excess (10, 20, and 50-fold) of activated polymers.
유럽특허출원 공개 제 0 236 987호는 대략 pH 7 내지 9의 조건에서 알파 및 감마 인터페론을 알킬 이미도 에스테르로 활성화된 과량의 PEG와 반응시키는 것을 개시하고 있으며, 유럽특허출원 공개 제 0 510 356호는 pH 7 내지 9에서 알파 인터페론을 피리딜 카보닐 및 티오카보닐로 활성화된 PEG와 접합시키는 것을 개시하고 있다. 또한, 미국특허 제5,382,657호(독일, Hoffmann La Roche 주식회사)는 높은 pH의 액상에서 활성화된 수용성 폴리머를 단백질의 라이신 잔기에 접합하는 기술을개시하고 있다. 그러나, 이와 같이 액상에서 단백질과 활성화된 폴리머를 접합하는 방법은 단백질 표면의 라이신 잔기에 폴리머가 무작위로 접합되어, 단백질 활성이 현저히 감소하는 문제점이 있다.EP 0 236 987 discloses reacting alpha and gamma interferon with an excess of PEG activated with alkyl imido esters at conditions of pH 7-9, EP 0 510 356. Discloses conjugation of alpha interferon with pyridyl carbonyl and thiocarbonyl activated PEG at pH 7-9. U.S. Patent 5,382,657 (Hoffmann La Roche, Inc., Germany) also discloses a technique for conjugating a water-soluble polymer activated in a high pH liquid phase to a lysine residue of a protein. However, this method of conjugating the protein and the activated polymer in the liquid phase has a problem in that the polymer is randomly conjugated to lysine residues on the surface of the protein, thereby significantly reducing protein activity.
따라서, 단백질의 활성부위가 아닌 부분을 부위 특이적으로 돌연 변이시켜, 예를 들면 쓰레오닌 아미노산 하나를 씨스틴으로 치환한 다음, 티올로 활성화된 PEG와 접합하는 방법이 연구되고 있으나, 이와 같은 부위 특위적 돌연변이 방법은 DNA 돌연변이 조작에 어려움이 수반되며, 단백질을 암호화하고 있는 유전자를 새로운 균주 시스템으로 형질전환하기 위한 새로운 발효기술이 필요한 단점이 있다. 단백질의활성을 유지하면서 PEG를 접합(PEGyalation)하는 다른 방법으로서, 미국특허 제5,824,784호(미국, Amgen사)는 낮은 pH의 액상에서 강력한 환원제를 이용하여 단백질의 N-말단을 환원시킨 후, 환원된 단백질의 N-말단과 활성화된 PEG를 접합하는 방법을 개시하고 있다. 이와 같이 단백질의 N-말단을 PEG화하는 방법은 라이신 잔기에 폴리머가 접합되는 것에 비해, 높은 활성을 가진 단백질을 얻을 수 있지만, 폴리머 접합 수율이 상대적으로 낮은 단점이 있으며, 또한 액상에서 반응을 수행하므로 미반응된 잉여 PEG 및 기타 첨가제를 제거하기 어려운 문제점이 있다.Therefore, a method of site-specific mutation of non-active portions of a protein, for example, by replacing one of threonine amino acids with cystine and then conjugating with thiol-activated PEG, has been studied. Site-specific mutagenesis involves difficulties in DNA mutation manipulation and requires a new fermentation technique for transforming a gene encoding a protein into a new strain system. Alternatively, while maintaining the activity of the protein to the PEG bonded (PEGyalation), U.S. Patent No. 5,824,784 (U.S., Amgen, Inc.) is then reduced to N- terminus of the protein by using a strong reducing agent in the liquid phase of low pH, reduction A method for conjugating the N-terminus of activated protein with activated PEG is disclosed. As described above, the PEGylation of the N-terminus of the protein can provide a protein having high activity compared to the polymer conjugated to the lysine residue. However, the polymer conjugate yield is relatively low, and the reaction is performed in the liquid phase. Therefore, there is a problem that is difficult to remove the unreacted excess PEG and other additives.
따라서, 본 발명의 목적은 단백질-폴리머 접합체를 높은 수율로 제조할 수 있는 고정상 칼럼을 이용한 단백질-폴리머 접합체의 제조방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for preparing a protein-polymer conjugate using a fixed bed column which can produce a protein-polymer conjugate in high yield.
본 발명의 다른 목적은 원료의 사용량이 적을 뿐만 아니라, 미반응된 잉여 폴리머, 단백질 및 기타 첨가제를 용이하게 제거할 수 있는 고정상 칼럼을 이용한 단백질-폴리머 접합체의 제조방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for preparing a protein-polymer conjugate using a fixed bed column which not only uses a small amount of raw materials but also can easily remove unreacted excess polymer, protein and other additives.
본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 활성을 유지할 뿐만 아니라, 면역원성이 감소하고 혈액 내 순환 수명이 증대되는 등 향상된 기능을 가지는 단백질-폴리머 접합체의 제조방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for preparing a protein-polymer conjugate, which not only maintains biological activity, but also has improved functions such as reduced immunogenicity and increased circulation life in the blood.
도 1a 내지 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 고정상 칼럼에서 단백질-폴리머 접합체를 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도.1A-1B are schematic diagrams illustrating a method for preparing a protein-polymer conjugate in a fixed bed column according to one embodiment of the present invention.
도 2는 순수한 단백질과 본 발명의 일 실시예에 따라 고정상 칼럼에서 용출된 단백질-폴리머 접합체의 UV 흡광 프로파일.2 is a UV absorbance profile of pure protein and protein-polymer conjugates eluted in a fixed bed column according to one embodiment of the invention.
도 3은 순수한 단백질과 본 발명의 일 실시예에 따라 고정상 칼럼에서 용출된 단백질-폴리머 접합체의 SDS-PAGE 분석 결과.3 shows the results of SDS-PAGE analysis of pure protein and protein-polymer conjugates eluted in a fixed bed column according to an embodiment of the present invention.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단백질을 고정상 칼럼에 흡착시키는 공정; 활성화된 수용성 폴리머 용액을 상기 칼럼으로 통과시켜, 상기 칼럼에 흡착된 단백질에 상기 폴리머를 접합함으로서 단백질-폴리머 접합체를 생성하는 공정; 및 상기 단백질-폴리머 접합체를 상기 칼럼으로부터 수득하는 공정을 포함하는 고정상 칼럼을 이용한 단백질-폴리머 접합체의 제조방법을 제공한다. 여기서, 상기 단백질은 인터페론이고, 상기 활성화된 수용성 폴리머는 활성화된 폴리에틸렌글리콜이며, 상기 활성화된 수용성 폴리머 용액은 환원제를 더욱 포함하는 것이 바람직하다. 또한 상기 단백질-폴리머 접합체를 상기 칼럼으로부터 수득하는 공정은 상기 단백질보다 상기 칼럼과 흡착성이 강한 완충 용액을 상기 칼럼에 유입시킴으로서 이루어지며, 상기 수용성 폴리머의 사용량이 상기 단백질에 대하여 몰비로 3 내지 7배이면 더욱 바람직하다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of adsorbing a protein to a fixed bed column; Passing an activated water soluble polymer solution through the column to bond the polymer to a protein adsorbed on the column to produce a protein-polymer conjugate; And it provides a method for producing a protein-polymer conjugate using a stationary phase column comprising the step of obtaining the protein-polymer conjugate from the column. Herein, the protein is interferon, the activated water-soluble polymer is activated polyethylene glycol, and the activated water-soluble polymer solution further includes a reducing agent. In addition, the step of obtaining the protein-polymer conjugate from the column is performed by introducing a buffer solution having a stronger adsorption property to the column than the protein, and the amount of the water-soluble polymer is 3 to 7 times the molar ratio of the protein. It is more preferable if it is.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
도 1a 내지 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 고정상에서 단백질-폴리머 접합체를 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다. 본 발명의 일 실시예에 따라 단백질-폴리머 접합체를 제조하기 위해서는 먼저, 도 1a에 도시된 바와 같이, 단백질을 고정상 칼럼에 흡착시킨다.1A to 1B are schematic diagrams illustrating a method for preparing a protein-polymer conjugate in a stationary phase according to one embodiment of the present invention. To prepare a protein-polymer conjugate according to one embodiment of the present invention, first, as shown in FIG. 1A, the protein is adsorbed onto a fixed bed column.
여기서 상기 고정상 칼럼으로는 상기 단백질을 고정시킬 수 있는 다양한 칼럼을 사용할 수 있으며, 예를 들면 SP-세파로우스 FF 레진, SP-세파로우스 XL 레진, CM-세파로우스 레진(스웨덴 Amersham Pharmacia 사) 등의 양이온 교환 수지를 사용할 수 있다. 상기 칼럼에 단백질을 흡착시키기 전에, 상기 칼럼을 버퍼 용액으로 전처리하여 평형화시키는 것이 바람직하다. 이와 같은 버퍼 용액으로는 비한정적으로 Tris HCl, 중탄산나트륨염(sodium bicarbonate), 인산나트륨염(sodium phosphate) 용액 등 통상적인 버퍼 용액을 사용할 수 있으며, 상기 버퍼 용액의 pH는 함께 사용하는 수용성 폴리머, 수용성 폴리머를 활성화하는 활성화기의 종류, 접합하고자 하는 단백질의 종류 등에 따라 적절히 조절될 수 있으나, 통상적으로 pH 1.0 내지 7.0, 바람직하게는 pH 3.0 내지 5.0인 것이 좋다.Here, as the stationary phase column, various columns capable of immobilizing the protein may be used. For example, SP-sepharose FF resin, SP-sepharose XL resin, CM-sepharose resin (Sweden Amersham Pharmacia Co., Ltd.) Cation exchange resins such as Prior to adsorbing the protein to the column, it is preferred to equilibrate the column with pretreatment with a buffer solution. Such a buffer solution can be used without limitation, conventional buffer solutions such as Tris HCl, sodium bicarbonate, sodium phosphate solution, the pH of the buffer solution is used together with the water-soluble polymer, Although it may be appropriately adjusted depending on the type of the activating group for activating the water-soluble polymer, the type of protein to be conjugated, etc., it is usually pH 1.0 to 7.0, preferably pH 3.0 to 5.0.
상기 칼럼에 단백질을 흡착하는 공정은 평형화된 이온 교환 수지에 단백질 용액을 천천히 흘려줌으로써 이루어지는데, 이때 단백질 용액의 농도는 비한정적으로 1 내지 4mg/ml인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 단백질-폴리머 접합체 제조 방법에 사용되는 단백질은 칼럼에 흡착될 수 있으며, 폴리머의 접합으로 기능을 개선할 수 있는 다양한 단백질이 사용될 수 있으며,예를 들면알파 인터페론을 예시할 수 있다. 알파 인터페론은 166개의 아미노산이 다섯 개의 알파헬릭스(A, B, C, D, E)를 형성하여, 두 개의 이황화 결합(Cys1-Cys98, Cys29-Cys138)으로 연결된 구조로 이루어져 있고, pH 5.8의 등전점을 가지며, 항바이러스성 면역증강제로서 만성 B형 및 C형 간염치료제 및 각종 암 치료제로 널리 이용되고 있다.The step of adsorbing the protein to the column is achieved by slowly flowing the protein solution to the equilibrated ion exchange resin, wherein the concentration of the protein solution is preferably 1 to 4 mg / ml without limitation. Proteins used in the protein-polymer conjugate production method according to the present invention can be adsorbed on the column, a variety of proteins that can improve the function by the conjugation of the polymer can be used, for example alpha interferon. Alpha interferon is composed of 166 amino acids forming five alpha helices (A, B, C, D, E), connected by two disulfide bonds (Cys1-Cys98, Cys29-Cys138), and isoelectric point of pH 5.8 As an antiviral immune enhancing agent, it is widely used as a treatment for chronic hepatitis B and C and various cancer treatments.
다음으로, 도 1b 및 도 1c에 도시된 바와 같이, 상기 단백질이 흡착된 칼럼에 활성화된 수용성 폴리머 용액을 통과시켜, 칼럼에 단백질-폴리머 접합체를 고정시킨다. 상기 활성화된 수용성폴리머는 수용성 폴리머에 알데히드, 숙신이미딜그루타레이트(SG), 숙신이미딜카보네이트(SC), N-숙신이미드, N-프탈이미드, N-그루타르이미드, N-테트라하이드로프탈이미드, N-노보렌-2,3-디카보옥시드 등의 활성화기를 부가한 것이며, 상기 수용성 폴리머로는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol: PEG), 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴 아미드, 폴리비닐 알콜, 카보하이드레이트계 폴리머, 이들의 유도체 등을 사용할 수 있다. 바람직한 수용성 폴리머의 예로는 숙신이미딜그루타레이트(SG) 또는 알데히드로 활성화된 PEG를 예시할 수 있다. PEG는 미국 FDA에서 무독성이며 단백질이나 세포의 활성에 해를 끼치지 않는 GRAS(generally recognized as safe) 물질로 승인을 받았으며, 그 말단기에 활성화기를 부착시킨 활성화 PEG의 형태로 여러 단백질 및 효소들의 특정 아미노산 잔기, 특히 라이신(lysine)과 공유결합을 이루어 PEG-단백질 복합체를 형성함으로써, 효소 또는 단백질의 생물학적 활성은 유지하면서, 면역 유발성 및 면역원성을 감소시키고, 단백질의 혈액 내 순환수명을 연장시키거나, 면역 내성을 유도하는 등 단백질의 기능을 향상시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.Next, as shown in FIGS. 1B and 1C, the activated water-soluble polymer solution is passed through the column to which the protein is adsorbed to fix the protein-polymer conjugate to the column. The activated water-soluble polymer is an aldehyde, succinimidyl glutarate (SG), succinimidyl carbonate (SC), N-succinimide, N-phthalimide, N-glutarimide, N-tetrahydrate in a water-soluble polymer. Addition of activating groups such as loftalimide and N-novolene-2,3-dicarbooxide, and the water-soluble polymer is polyethyleneglycol (PEG), dextran, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylamide , Polyvinyl alcohol, carbohydrate-based polymers, derivatives thereof and the like can be used. Examples of preferred water soluble polymers may be succinimidyl glutarate (SG) or aldehyde activated PEG. PEG is approved by the US FDA as a generically recognized as safe (GRAS) substance that is non-toxic and does not harm the activity of proteins or cells. Covalent bonds with amino acid residues, in particular lysine, to form a PEG-protein complex, thereby reducing immunogenicity and immunogenicity while maintaining the biological activity of the enzyme or protein, and extending the cycle life of the protein in the blood In addition, it is known to improve the function of proteins, such as inducing immune resistance.
상기 수용성 폴리머는 상기 칼럼에 흡착된 단백질에 대하여 몰비로 3 내지 7배를 사용하는 것이 바람직하고, 4 내지 6배를 사용하면 더욱 바람직하다. 여기서 상기 수용성 폴리머의 몰비가 3배 미만인 경우에는 단백질-폴리머 접합이 충분히 일어나지 않고, 수용성 폴리머의 몰비가 7배를 초과하여도 단백질-폴리머 접합 효율을 더 이상 향상시킬 수 없다. 또한, 상기 수용성 폴리머는 디티오쓰레이톨(Dithiothreitol: DTT), 소듐보로하이드라이드(Sodiumborohydride:NaBH 4 ), 소듐시아노보로하이드라이드(Sodiumcyanoborohydride: NaCNBH3), β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 디티오쓰레이톨(dithiothreitol) 등의 환원제를 포함한다. 이와 같은 환원제의 농도는 예를 들면 5 - 100 mM일 수 있으며, 비교적 낮은 pH 상태에서 칼럼에 흡착된 단백질을 부위 특이적으로 활성화시키기 위한 것으로서,단백질의 N-말단의 알파-아민기만을 활성화시켜, 비특이적 다중결합을 방지하고 단일 폴리머 접합체를 형성함으로서, 단백질의 활성을 유지시키고 안정성을 향상시키는 기능을 한다.The water-soluble polymer is preferably used 3 to 7 times in molar ratio with respect to the protein adsorbed on the column, more preferably 4 to 6 times. Here, when the molar ratio of the water-soluble polymer is less than three times, protein-polymer conjugation does not sufficiently occur, and even if the molar ratio of the water-soluble polymer is more than seven times, the protein-polymer conjugation efficiency can no longer be improved. In addition, the water-soluble polymer is dithiothreitol (DTT), sodium borohydride ( NaBH 4 ), sodium cyanoborohydride (NaCNBH 3 ), β-mercaptoethanol (β-mercaptoethanol ), Dithiothreitol and the like. The concentration of such a reducing agent may be, for example, 5 to 100 mM, for site-specific activation of the protein adsorbed on the column at a relatively low pH, by activating only the alpha-amine group at the N-terminus of the protein. By preventing nonspecific multiple bonds and forming a single polymer conjugate, it functions to maintain protein activity and improve stability.
다음으로, 도 1d에 도시된 바와 같이, 상기 단백질-폴리머 접합체를 상기 칼럼으로부터 용출시켜 수득한다. 상기 단백질-폴리머 접합체를 상기 칼럼으로부터 수득하기 위해서는, 상기 단백질보다 칼럼과의 흡착성이 강한 버퍼 용액을 칼럼에 유입시켜 상기 칼럼으로부터 단백질-폴리머 접합체를 이탈시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 칼럼이 이온 교환수지인 경우에는 이온성이 강한 염을 포함하는 버퍼 용액을 상기 칼럼에 유입시켜 이온 교환 반응을 일으킴으로서, 단백질-폴리머 접합체를 용출시킬 수 있다. 이와 같이 이온성이 강한 염을 포함하는 버퍼 용액은 Tris HCl, 중탄산나트륨염(sodium bicarbonate), 인산나트륨염(sodium phosphate) 용액 등 통상적인 버퍼 용액에 KCl, NaCl, K2HPO4, KHPO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaBO4, (NH4)2CO3등의 염을 100mM 내지 10M의 농도로 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 상기 이온성이 강한 염을 포함하는 버퍼 용액은 먼저 이온의 농도가 낮은 버퍼 용액으로부터 이온의 농도가 높은 버퍼 용액을 순차적으로 통과시켜, 단백질-폴리머 접합체를 용출시키는 것이 바람직하다.Next, as shown in FIG. 1D, the protein-polymer conjugate is obtained by eluting from the column. In order to obtain the protein-polymer conjugate from the column, a buffer solution having stronger adsorption with the column than the protein may be introduced into the column to release the protein-polymer conjugate from the column. For example, when the column is an ion exchange resin, the protein-polymer conjugate may be eluted by introducing a buffer solution containing a strong ionic salt into the column to cause an ion exchange reaction. Such a buffer solution containing a strong ionic salt is KCl, NaCl, K 2 HPO 4 , KHPO 4 , in a conventional buffer solution such as Tris HCl, sodium bicarbonate, sodium phosphate solution Salts such as Na 2 HPO 4 , NaHCO 3 , NaBO 4 , (NH 4 ) 2 CO 3, and the like may be prepared by adding in a concentration of 100 mM to 10M. In this case, it is preferable that the buffer solution containing the ionic strong salt first pass the buffer solution having a high concentration of ions from the buffer solution having a low concentration of ions to elute the protein-polymer conjugate.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 하기 실시예에 의해서 본 발명이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited by the following Examples.
[실시예]EXAMPLE
100mM 소듐포스페이트를 이용하여 pH 4.0의 제1 완충 용액을 제조하였으며, 상기 제1 완충용액에 염화나트륨(NaCl)을 첨가하여 염화나트륨의 최종 농도가 1M인 제2 완충용액을 제조하였다. 또한 100mM 소듐포스페이트 용액(pH 4.0)에 메톡시폴리에틸렌글리콜-숙신이미딜그루타레이트(mPEG-SG, 평균분자량 5000) 또는 메톡시폴리에틸렌글리콜-알데히드(mPEG-ALD)와 NaCNBH3를 첨가하여 활성화 PEG 용액을 제조하였다. 이때, 상기 활성화 PEG 용액 중의 NaCNBH3농도는25 mM였고, PEG는 칼럼에 흡착된 인터페론 : PEG의 몰비가 1:5가 되도록 첨가하였다.A first buffer solution of pH 4.0 was prepared using 100 mM sodium phosphate, and sodium chloride (NaCl) was added to the first buffer to prepare a second buffer solution having a final concentration of sodium chloride of 1M. In addition, methoxypolyethyleneglycol-succinimidyl glutarate (mPEG-SG, average molecular weight 5000) or methoxypolyethyleneglycol-aldehyde (mPEG-ALD) and NaCNBH 3 were added to a 100 mM sodium phosphate solution (pH 4.0). Was prepared. At this time, NaCNBH 3 concentration in the activated PEG solution was 25 mM , PEG was added so that the molar ratio of interferon: PEG adsorbed on the column is 1: 5.
1ml 베드볼륨(bed volume)의 SP-세파로스 FF(스웨덴, Amersham Pharmacia사) 칼럼을 0.5ml/min 유속의 제1 완충 용액으로 평형화한 후, 2.5mg/ml의 알파인터페론 500㎕를 흡착시켰다. 상기 알파인터페론이 흡착된 칼럼으로 상기활성화 PEG 용액을 흘려주어, PEG를 인터페론에 접합시키고, 다시 제1 완충 용액으로 세척하여 잔여 활성화 PEG 및 첨가제를 제거하였다. 상기 단백질-폴리머 접합체가 흡착된 칼럼에 제1 완충 용액과 제2 완충 용액의 혼합비를 100% 제1 완충 용액에서 100% 제2 버퍼 용액으로 조절하면서 흘려주어, PEG가 접합된 인터페론을 칼럼으로부터 용출시켜 수득하였다.The SP-Sepharose FF (Amersham Pharmacia, Sweden) column of 1 ml bed volume was equilibrated with a first buffer solution at a flow rate of 0.5 ml / min, followed by adsorbing 500 µl of 2.5 mg / ml alpha interferon. The activated PEG solution was flowed into the column where the alpha interferon was adsorbed, the PEG was conjugated to the interferon, and washed again with the first buffer solution to remove residual activated PEG and additives. The mixing ratio of the first buffer solution and the second buffer solution was flowed into the column to which the protein-polymer conjugate was adsorbed while adjusting from 100% first buffer solution to 100% second buffer solution to elute PEG conjugated interferon from the column. Obtained by.
도 2는 UV 분광기를 이용하여 280nm 파장에서 상기 칼럼에서의 용출액의 프로파일을 측정한 그래프로서, 도 2에 도시된 바와 같이, 칼럼에 활성화 PEG를 통과시킨 경우,mono-PEGylated IFN 단백질 피크가 먼저 나타나고, monomeric IFN 단백질 피크가 나중에 나타난다. 이를 이용해 monomeric IFN 단백질을 회수하여 다시 PEGylation 시키거나, PEGylated IFN 단백질 만을 용출시키고, monomeric IFN 단백질을 다시 PEGylation 시킴으로서 mono-PEGylated IFN 단백질을 연속으로 얻을 수 있다.도 3은 용출액의 SDS-PAGE 분석 결과로서, 도 3에서 레인 M은 마커이며, 레인 1은 순수한 인터페론, 레인 2는 상기 실시예의 칼럼에서 용출된 용액의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. 도 3에 나타난 바와 같이, 칼럼에 활성화된 PEG를 통과시켜 PEGylation한 경우, monomeric IFN 단백질과 비교하여 mono-PEGylated IFN 단백질의 분자량이 5kDa 증가한 것을 알 수 있다.또한, 단백정량 및 PEG 정량방법을 통해 단백질 한 분자당 PEG 분자의 결합 수를 계산한 결과 1:1 결합이 확인되었다.Figure 2 is a graph measuring the profile of the eluate in the column at 280nm wavelength using a UV spectrometer, as shown in Figure 2, when activated PEG passed through the column, the mono-PEGylated IFN protein peak appears first The monomeric IFN protein peak appears later. Mono-PEGylated IFN protein can be obtained continuously by recovering the monomeric IFN protein and PEGylating it again, eluting only the PEGylated IFN protein, and PEGylating the monomeric IFN protein again. FIG. 3 shows the results of SDS-PAGE analysis of the eluate. In FIG. 3, lane M is a marker, lane 1 is pure interferon, and lane 2 shows SDS-PAGE results of the solution eluted in the column of the example. As shown in FIG. 3, when PEGylation was performed by passing activated PEG through the column, the molecular weight of the mono-PEGylated IFN protein was increased by 5 kDa compared to the monomeric IFN protein. In addition, 1: 1 binding was confirmed by counting the number of PEG molecules per molecule of protein through protein quantification and PEG quantification.
이상 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질-폴리머 접합체의 제조방법은 단백질의 활성부위를 보호하면서 PEG의 단일 공유결합을 유도함으로써, 단백질의 활성은 그대로 유지하면서, 면역원성의 감소 및 혈액 내 순환수명 등의 안정성이 증대되는 효과가 있다. 또한 본 발명은 단백질과 반응하지 않은 PEG 및 기타 반응 첨가제의 제거가 용이할 뿐만 아니라, 양이온 교환 수지를 이용하는 단백질 의약품의 기존 정제공정에 쉽게 적용할 수 있는 효과가 있다.As described above, the method for preparing a protein-polymer conjugate according to the present invention induces a single covalent bond of PEG while protecting the active site of the protein, thereby maintaining the activity of the protein, while reducing the immunogenicity and circulation in the blood. There is an effect of increasing the stability, such as life. In addition, the present invention not only facilitates the removal of PEG and other reaction additives that do not react with the protein, but also has an effect that can be easily applied to the existing purification process of protein pharmaceuticals using a cation exchange resin.
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