KR100445186B1 - Transducing method for copper ion recovered superoxide dismutase fusion protein into the cells - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합이나 화학적 결합 방법으로 단백질 수송 도메인과 결합된 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스(SOD) 융합 단백질에 Cu이온을 회복시킴으로써 이 융합 단백질의 세포내 도입능력을 획기적으로 증가시키는 방법을 제공한다.The present invention provides a method of dramatically increasing the intracellular introduction capacity of the fusion protein by restoring Cu ions to a superoxide dismutase (SOD) fusion protein coupled with a protein transport domain by recombinant or chemical binding methods.
Description
본 발명은 단백질 수송 도메인과 결합된 세포 침투성을 지닌 인간 Cu,Zn 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스(Cu,Zn-Superoxide dismutase; 이하 본 명세서에서 "Cu,Zn-SOD", "SOD"를 혼용하였음, 모두 동일한 의미임) 융합단백질의 세포내 도입능력을 구리이온 회복 방법을 이용하여 효율적으로 증가시키는 방법에 관한 것이다.The present invention uses a combination of human Cu, Zn-Superoxide dismutase (Cu, Zn-SOD), "SOD", hereinafter referred to herein as having a cell permeability coupled with a protein transport domain. All of the same meaning) relates to a method of efficiently increasing the intracellular introduction capacity of the fusion protein using a copper ion recovery method.
인간 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스는 효소의 구조와 활성을 유지하는데 구리이온이 필수적으로 요구되며, 효소 한 분자당 2개의 구리이온이 함유되어 있는 메탈로엔자임(metalloenzyme)이다. 그러나, 보통 대장균에서 SOD를 발현시켜 분리하면 발현된 SOD의 70% 가량이 분자내에 구리이온을 함유하고 있지 않은 상태로 정제된다. 본 발명에서는 정제한 Cu,Zn-SOD의 구리이온의 함량을 원래의 양대로 회복시켜 주는 방법인 구리이온 회복 방법을 개발함으로써 단백질 수송 도메인과 공유결합된 SOD 융합단백질의 세포내 도입능력을 효율적으로 증가시켰다.Human Cu, Zn-superoxide dismutase is a metalloenzyme that requires copper ions to maintain the structure and activity of the enzyme, and contains two copper ions per molecule of enzyme. However, when SOD is expressed and isolated from E. coli, approximately 70% of the expressed SOD is purified without containing copper ions in the molecule. In the present invention, by developing a copper ion recovery method that recovers the purified copper ions of Cu, Zn-SOD in the original amount, the cell transduction ability of the SOD fusion protein covalently bonded with the protein transport domain can be efficiently Increased.
활성산소종 (reactive oxygen species)은 산소를 이용하여 에너지를 얻는 모든 생명체에서, 여러 세포내 대사과정의 부산물로 필연적으로 생성된다. 이러한 활성산소종은 세포내의 단백질, 핵산 및 지방과 같은 생체고분자에 손상을 입히며, 인체의 여러 질병의 진행과정과 깊게 관련되어 있다. 특히, 발암과정, 뇌졸중, 관절염, 동맥경화, 방사선 손상 및 염증반응에 관여하며 정상적인 노화과정에서도 노화를 촉진시키는 중요한 요인으로 작용한다[Floyd, R.A. (1990) FASEB J. 4, 2587-2597; Anderson, W. F. (1998) Human gene therapy. Nature 392, 25-30; Halliwell B. and Gutteridge J.M.C. (1999) Free radicals in biology and medicine, Oxford University Press, Oxford].Reactive oxygen species are inevitably produced as by-products of many intracellular metabolic processes in all living organisms that use oxygen for energy. These reactive oxygen species damage biopolymers such as proteins, nucleic acids and fats in cells and are deeply involved in the progress of various diseases in the human body. In particular, it is involved in carcinogenesis, stroke, arthritis, arteriosclerosis, radiation damage and inflammatory reactions, and plays an important role in promoting aging even in normal aging [Floyd, R.A. (1990) FASEB J. 4, 2587-2597; Anderson, W. F. (1998) Human gene therapy. Nature 392, 25-30; Halliwell B. and Gutteridge J.M.C. (1999) Free radicals in biology and medicine, Oxford University Press, Oxford.
Cu,Zn-SOD는 이러한 자유라디칼의 해독과 산소의 손상으로부터 세포의 손상을 막아주는 세포내 중요한 방어 효소이다[Fridovich, I. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64, 97-112]. 모든 생체내 고분자들은 이러한 산소라디칼의 해로운 작용에 항상 노출되어 있기 때문에 여러 질환에서 Cu,Zn-SOD를 치료 목적으로 이용하려는 관심도가 매우 높아지고 있다.Cu, Zn-SOD is an important intracellular defense enzyme that prevents cell damage from detoxification and oxygen damage of free radicals [Fridovich, I. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64, 97-112. Since all in vivo polymers are always exposed to the harmful effects of oxygen radicals, there is a growing interest in using Cu, Zn-SOD for therapeutic purposes in various diseases.
최근에, 사람 면역결핍 바이러스(Hunan Immunodeficiency Virus type-1) 단백질의 일종인 Tat(transactivator of transcription) 단백질은 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 기능은 Tat 단백질의 중간부위인 단백질 형질도입 부위(protein transduction domain)의 특성때문에 나타나는 것으로서 아직 그 정확한 기전은 알려지지 않은 상태이다[Frankel, A.D. and Pabo, C.O. (1988) Cell 55, 1189-1193; Green, M. and Loewenstein, P.M. (1988) Cell 55, 1179-1188; Ma, M. and Nath, A. (1997) J. Virol. 71, 2495-2499; Vives, E., Brodin, P. and Lebleu, B. (1997) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017]. Tat 단백질의 세포막 통과에는 특정 수용체나 운반체가 관여하지 않는 것으로 보이며 단백질 형질도입 부위가 직접 막의 지질 이중층과 작용함으로써 일어나는 것으로 이해하고 있다[Vives, E., Brodin, P. and Lebleu, B. (1997) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017; Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G. and Prochiantz, A. (1996) J. Biol. Chem. 271, 18188-18193]. 이것은 Tat 단백질이 세포막을 지닌 모든 종류의 세포에서 세포막을 통과하여 세포질 내로 투과할 수 있음을 의미한다.Recently, it has been discovered that the Tat (transactivator of transcription) protein, a type of Human Immunodeficiency Virus type-1 protein, efficiently moves through the cell membrane and easily migrates into the cytoplasm. This function appears to be due to the nature of the protein transduction domain, which is the intermediate region of the Tat protein, and its exact mechanism is still unknown [Frankel, A.D. and Pabo, C. O. (1988) Cell 55, 1189-1193; Green, M. and Loewenstein, P.M. (1988) Cell 55, 1179-1188; Ma, M. and Nath, A. (1997) J. Virol. 71, 2495-2499; Vives, E., Brodin, P. and Lebleu, B. (1997) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017. It is understood that no specific receptors or carriers are involved in the transmembrane passage of Tat protein and that the protein transduction site occurs by directly interacting with the lipid bilayer of the membrane [Vives, E., Brodin, P. and Lebleu, B. (1997). ) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017; Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G. and Prochiantz, A. (1996) J. Biol. Chem. 271, 18188-18193. This means that the Tat protein can penetrate into the cytoplasm through the cell membrane in all kinds of cells with a cell membrane.
본 연구진은 이미 Tat 단백질의 단백질 형질도입 부위를 외부단백질인 사람 Cu,Zn-SOD에 융합시켜 이 융합단백질이 효과적으로 세포 내로 투과되는지를 HeLa 세포를 이용한 실험에서 확인하였다[Kwon, H.Y., Eum, W.S., Jang, H.W., Kang, J.H., Ryu, J.Y., Lee, B.R., Jin, L.H., Park, J.S., and Choi, S.Y. (2000) FEBS Letters. 485, 163-167].We have already fused the protein transduction site of Tat protein to human Cu, Zn-SOD, an external protein, and confirmed whether the fusion protein was effectively penetrated into cells [Kwon, HY, Eum, WS]. , Jang, HW, Kang, JH, Ryu, JY, Lee, BR, Jin, LH, Park, JS, and Choi, SY (2000) FEBS Letters. 485, 163-167.
또한, 본 연구진은 Tat-SOD 융합단백질을 다량 제조하고 순수정제하기 위한 기술을 개발하였다[최수영 등 특허출원 2000-43039, 2001-5094, 2001-10980]. 본 연구진은 재조합된 Tat-SOD 융합단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며, 금속 킬레이팅 크로마토그래피(metal-chelating affinity chromatography)법으로 쉽고 편리하게 정제하였다. 정제된 Tat-SOD 융합단백질은 배양된 HeLa 세포에 농도 및 시간 의존적으로 투과되었으며 이와 동시에 세포 내의 SOD 효소 활성도도 유의하게 증가함을 관찰하였다.In addition, the researchers have developed a technique for producing large amounts of Tat-SOD fusion proteins and purifying them [Patent Application 2000-43039, 2001-5094, 2001-10980]. We overexpressed the recombinant Tat-SOD fusion protein in Escherichia coli and purified it easily and conveniently by metal-chelating affinity chromatography. It was observed that purified Tat-SOD fusion protein was permeated in cultured HeLa cells in a concentration and time dependent manner, and at the same time, the SOD enzyme activity in the cells was also significantly increased.
뿐만 아니라, 본 연구진은 5-12개의 라이신 잔기로 이루어진 올리고라이신 단백질 수송 도메인이 SOD를 세포 내로 효과적으로 침투시킬 수 있음을 밝혀내었다(최수영 등 특허출원 2000-43022,2001-6178, 2000-10981).In addition, the researchers found that oligolysine protein transport domains consisting of 5-12 lysine residues can effectively infiltrate SOD into cells (Patent Application 2000-43022, 2001-6178, 2000-10981).
또한, 본 연구진은 단백질 수송 능력이 있다고 알려진 HIV-1 Tat의 49-57잔기 중 일부를 결여시킨 후 SOD에 대하여 침투실험을 하여 HIV-1 Tat(51-57), Tat(50-56), Tat(50-57) 및 Tat(50-55)가 SOD 단백질을 세포 내로 수송하는 능력이 있음을 확인하였다(최수영 등 특허출원 2001-7487).In addition, the team lacked some of the 49-57 residues of HIV-1 Tat, which are known to be capable of transporting proteins, and then penetrated the SOD to detect HIV-1 Tat (51-57), Tat (50-56), It was confirmed that Tat (50-57) and Tat (50-55) are capable of transporting SOD proteins into cells (Patent Application 2001-7487, et al.).
최근의 연구에서, 이형단백질을 HIV-1 Tat 단백질과 융합시켜 투여하였을 때 생체 각 조직 및 배양된 세포 내로 직접 운반되는 정도가 각 이형단백질의 종류에 따라 서로 다르며, 같은 이형단백질이라도 그 단백질의 구조적 특성에 따라 서로 다르게 나타난다는 보고가 있다[Schwartze, S.R., Hruska, K,A., and Dowdy, S.F. (2000) Trends in Cell Biology 10, 290-295]. 즉, 같은 종류의 융합단백질이라 하여도 단백질의 변성정도, 단백질의 삼차구조 유지에 관련되는 보조인자(cofactor)의 유무 등이 융합단백질의 세포 내 투과능력에 큰 영향을 미친다는 것이다.In a recent study, the extent of direct delivery of heterologous protein into HIV-1 Tat protein and in vivo in different tissues and cultured cells differed according to the type of heterologous protein. It is reported that they appear differently according to their characteristics [Schwartze, SR, Hruska, K, A., and Dowdy, SF]. (2000) Trends in Cell Biology 10, 290-295. In other words, even in the same kind of fusion proteins, the degree of protein denaturation and the presence or absence of cofactors related to the maintenance of the tertiary structure of proteins have a significant effect on the intracellular permeability of the fusion proteins.
인간 Cu,Zn-SOD는 단백질 내에 금속이온을 함유하고 있는 메탈로엔자임(metalloenzyme)으로써 단백질 한 분자 당 2분자의 구리이온과 아연이온을 함유하고 있다. 이중 구리이온은 SOD의 삼차원적 구조와 효소의 활성을 유지하는데 필수적인 것으로 알려져 있으나, 보통 대장균에서 SOD를 발현시켜 분리하면 발현된 SOD의 70% 가량이 분자내에 구리이온을 함유하고 있지 않은 상태로 정제되는 것으로 알려져 있다.Human Cu, Zn-SOD is a metalloenzyme that contains metal ions in proteins and contains two molecules of copper and zinc ions per molecule of protein. Copper ions are known to be essential for maintaining the three-dimensional structure and enzyme activity of SOD. However, when SOD is expressed and isolated from E. coli, approximately 70% of the expressed SOD is purified without containing copper ions in the molecule. It is known to become.
본 연구진은 이러한 관점에서 단백질 수송 도메인과 결합되어 세포투과성을 지닌 SOD의 세포투과력을 증가시키기 위하여 정제한 Cu,Zn-SOD에 구리이온의 양을 회복시켜 주는 방법인 구리이온 회복 방법을 개발하게 되었다.From this point of view, the researchers have developed a method for recovering copper ions, which is a method of restoring the amount of copper ions in purified Cu, Zn-SOD to increase the cell permeability of SOD with cell permeability combined with protein transport domain. .
본 발명의 목적은 세포투과성을 지닌 SOD 융합단백질의 세포투과 효율을 증가시키려는 것이다.An object of the present invention is to increase the cell permeation efficiency of cell permeable SOD fusion protein.
또한, 본 발명의 다른 목적은 세포투과성을 지닌 SOD 융합단백질의 세포 내 활성을 높이려는 것이다.In addition, another object of the present invention is to increase the intracellular activity of SOD fusion proteins having cell permeability.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 정제한 Cu,Zn-SOD의 구리이온의 양을 회복시켜 주는 방법인 구리이온 회복 방법을 개발함으로써 SOD 융합단백질의 세포내 침투능력을 획기적으로 증가시켰다.In order to achieve the above object, the present invention significantly improved the intracellular penetration ability of SOD fusion protein by developing a copper ion recovery method, which is a method for recovering the amount of purified copper ions of Cu, Zn-SOD.
좀더 자세히는 본 발명자들은 정제된 Tat-SOD 융합단백질에 구리이온을 첨가하여 충분한 양의 구리이온이 융합단백질에 결합하게 하고 결합하지 않은 자유 구리이온은 금속이온 킬레이터 수지(chelator resin)로 처리하여 제거함으로써 구리이온 회복 Tat-SOD(Copper ion recovered Tat-SOD; 이하 본 명세서에서 "CR-Tat-SOD"와 "구리이온 회복 Tat-SOD"를 혼용하였음, 모두 동일한 의미임)를 제조하였다. 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예로서 단백질 수송 도메인으로 HIV-1 Tat 49-57잔기를 이용하여 Tat-SOD 융합단백질을 제조하여 실험하였으나, 본 발명에 있어서 단백질 수송 도메인으로서는 HIV-1 Tat 49-57잔기에만 국한되는 것은 아니며, 본 발명자들 및 타 연구자들에 의해 세포 내로 단백질 침투능력을 가지는 것으로 밝혀진 다른 단백질 수송 도메인과 결합된 SOD 융합단백질에도 본 발명의 범위가 미친다.More specifically, the present inventors added copper ions to the purified Tat-SOD fusion protein to allow a sufficient amount of copper ions to bind to the fusion protein, and unbound free copper ions were treated with a metal ion chelator resin. Copper ion recovered Tat-SOD (hereinafter, "CR-Tat-SOD" and "copper ion recovery Tat-SOD" were used in the present specification, all have the same meaning). The present inventors experimented to prepare a Tat-SOD fusion protein using HIV-1 Tat 49-57 residue as a protein transport domain as an embodiment of the present invention, but in the present invention, as a protein transport domain, HIV-1 Tat 49- It is not limited to only 57 residues, but the scope of the present invention also extends to SOD fusion proteins coupled with other protein transport domains which have been found by the present inventors and other researchers to have protein penetrating ability into cells.
본 발명자들은 구리이온을 회복시킨 CR-Tat-SOD 융합단백질의 투과효율은 HeLa 세포를 이용한 실험에서 확인하였다. 또한, 산화적 스트레스에 의한 세포사멸의 억제 정도를 측정함으로써 세포 내로 투과된 CR-Tat-SOD 융합단백질의 생물학적 활성도를 측정하는 방법을 개발하였다.The present inventors confirmed the permeation efficiency of CR-Tat-SOD fusion protein recovering copper ions in the experiment using HeLa cells. In addition, a method for measuring the biological activity of the CR-Tat-SOD fusion protein permeated into cells by measuring the degree of inhibition of cell death by oxidative stress was developed.
도 1은 Tat-SOD 융합단백질 및 CR-Tat-SOD의 준비과정을 도식화한 것이다.Figure 1 illustrates the preparation of Tat-SOD fusion protein and CR-Tat-SOD.
도 2a는 농도에 따른 CR-Tat-SOD와 Tat-SOD의 HeLa 세포투과 정도를 비교하기 위하여 인간 Cu,Zn-SOD 단일클론항체를 이용한 웨스턴블랏 분석방법을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 0.25∼2 μM의 CR-Tat-SOD와 Tat-SOD를 세 포배양액 내에 투여하고 1시간 뒤에 투과된 융합단백질의 양을 나타낸다.Figure 2a shows the results of Western blot analysis using human Cu, Zn-SOD monoclonal antibody to compare the HeLa cell permeability of CR-Tat-SOD and Tat-SOD according to the concentration. The amount of fusion protein permeated 1 hour after administration of 0.25-2 μM of CR-Tat-SOD and Tat-SOD into the cell culture medium.
도 2b는 도 3A 웨스턴블랏 밴드의 발색정도를 컴퓨터 프로그램(TotalLab)을 이용하여 분석한 것으로 투여한 농도에 따라 HeLa 세포안으로 투과된 융합단백질의 양을 정량적으로 나타낸다.FIG. 2B is a quantitative analysis of the amount of fusion protein permeated into HeLa cells according to the concentration administered by analyzing the degree of color development of FIG. 3A Western Blot band using a computer program (TotalLab).
도 3a는 시간에 따른 CR-Tat-SOD와 Tat-SOD의 HeLa 세포투과 정도를 비교하기 위하여 인간 Cu,Zn-SOD 단일클론항체를 이용한 웨스턴블랏 분석방법을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 2 μM의 CR-Tat-SOD와 Tat-SOD를 세포 배양액 내에 투여하고 5분∼1시간 뒤에 투과된 융합단백질의 양을 나타낸다.Figure 3a shows the results of Western blot analysis using human Cu, Zn-SOD monoclonal antibody to compare the HeLa cell permeability of CR-Tat-SOD and Tat-SOD over time. 2 μM of CR-Tat-SOD and Tat-SOD are administered in the cell culture to show the amount of permeated fusion protein 5 minutes to 1 hour.
도 3b는 도 3A 웨스턴블랏 밴드의 발색정도를 컴퓨터 프로그램(TotalLab)을이용하여 분석한 것으로 2 μM의 융합단백질 투여 후 시간별로 HeLa 세포안으로 투과된 융합단백질의 양을 정량적으로 나타낸다.FIG. 3B is a quantitative amount of the fusion protein permeated into HeLa cells over time after administration of the 2 μM fusion protein by analyzing the degree of color development of FIG. 3A Western Blot band using a computer program (TotalLab).
도 4는 HeLa 세포내로 침투된 CR-Tat-SOD와 Tat-SOD의 생물학적 활성도를 비교 분석한 결과이다. 0.1∼2 μM의 CR-Tat-SOD와 Tat-SOD를 배양액 내에 투여하고 1시간 후 5mM의 파라쿠아트(paraquat)를 배양액에 처리하였다. 세포를 12시간 더 배양한 다음 살아있는 세포의 수를 MTT 분석법으로 측정함으로써 융합단백질에 의한 사포사멸의 억제정도를 측정하였다.4 shows the results of comparing the biological activity of CR-Tat-SOD and Tat-SOD infiltrated into HeLa cells. 0.1 to 2 μM of CR-Tat-SOD and Tat-SOD were administered in the culture solution, and 1 hour later, 5 mM paraquat (paraquat) was treated to the culture solution. After culturing the cells for another 12 hours, the number of living cells was measured by MTT assay to determine the degree of suppression of sandpaper death by the fusion protein.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.Definitions of main terms used in the detailed description of the present invention are as follows.
본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 수개 내지 십수개의 아미노산 잔기로 구성된 것을 말한다.As used herein, a "protein transport domain" may be covalently bound to a polymer organic compound such as oligonucleotide, peptide, protein, oligosaccharide or polysaccharide to introduce the organic compound into a cell without requiring a separate receptor, carrier, or energy. Refers to composed of several to ten amino acid residues.
"단백질 수송 도메인-SOD 융합 단백질"이란 단백질 수송 도메인과 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스(SOD)의 DNA 재조합 방법에 의한 유전적 융합이나 화학 결합으로형성된 복합체를 의미한다."Protein transport domain-SOD fusion protein" refers to a complex formed by genetic fusion or chemical bonding by DNA recombination of the protein transport domain and superoxide dismutase (SOD).
또한, "세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.In addition, "cell" means a cell to which a cargo molecule is delivered by a transport domain, and a target cell refers to a cell in or outside the body. That is, a target cell is meant to include cells in the body, that is, cells constituting organs or tissues of living animals or humans, or microorganisms found in living animals or humans. In addition, target cells are meant to include extracellular cells, ie cultured animal cells, human cells or microorganisms.
또한, 본 명세서에서는 SOD 단백질을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들을 혼용하였다.Also used herein are expressions of "carrying", "penetration", "transport", "delivery", "transmission" and "pass" for "introducing" the SOD protein into cells.
본 발명자들은 재조합된 Tat-SOD 융합단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며, 금속 킬레이팅 크로마토그래피 (metal-chelating affinity chromatography)법으로 융합단백질을 쉽고 편리하게 정제하였다. 정제된 Tat-SOD 융합단백질에 구리이온을 회복시켜 주면 구리이온 회복시키지 않은 상태보다 배양된 HeLa 세포 내로 빠른 시간 내에 투과되었고, 이와 동시에 세포 내의 SOD 효소 활성도 역시 구리이온을 회복시켜주지 않은 것에 비하여 유의하게 증가함을 관찰하였다. 또한 산화적 스트레스를 주어 HeLa 세포의 세포사멸을 유도하였을 때 세포사멸을 억제하는 정도가 구리이온을 회복시킨 Tat-SOD 융합단백질이 유의하게 높게 나타났다.The inventors overexpressed the recombinant Tat-SOD fusion protein in E. coli, and purified the fusion protein easily and conveniently by metal-chelating affinity chromatography. The recovery of copper ions into purified Tat-SOD fusion proteins was faster permeated into cultured HeLa cells than in the absence of copper ions recovery, and at the same time, SOD enzyme activity in the cells was also significantly higher than that of copper ions. The increase was observed. In addition, when oxidative stress induced apoptosis of HeLa cells, the degree of inhibition of apoptosis was significantly higher in Tat-SOD fusion protein recovering copper ions.
본 발명에서 구리이온 용액은 실시예의 기재와 같이 증류수를 이용하여 제조하거나 또는 SOD 융합단백질에 구리이온이 정상적으로 결합하는 것을 저해하지 않고, SOD 융합단백질의 활성에 영향을 미치지 않는 완충용액을 이용하여 제조하는것도 가능하다.In the present invention, the copper ion solution is prepared using distilled water as described in the Examples or prepared using a buffer solution that does not inhibit the normal binding of copper ions to the SOD fusion protein and does not affect the activity of the SOD fusion protein. It is also possible.
본 발명은 구리이온 회복에 의하여 세포침투성 Tat-SOD 융합단백질의 세포내 침투능력을 효율적으로 증가시키는 구리이온 회복방법 및 세포내로 침투된 Tat-SOD 융합단백질의 생물학적 활성도를 측정하는 방법을 제공한다.The present invention provides a copper ion recovery method for efficiently increasing the cellular penetrating ability of the cell penetrating Tat-SOD fusion protein by copper ion recovery and a method for measuring the biological activity of the Tat-SOD fusion protein infiltrated into the cell.
이를 위하여 재조합된 Tat-SOD 융합단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며, 금속 킬레이팅 크로마토그래피(metal-chelating affinity chromatography)법으로 쉽고 편리하게 정제하였다. 정제한 Tat-SOD융합단백질을 구리이온이 포함되어 있는 용액에 교반기로 섞어주며 투석한 후, 구리이온 용액에 융합단백질을 옮겨 주고, 융합단백질에 결합되지 않은 자유 구리이온을 제거하기 위해서 금속이온 킬레이터인 킬렉스 100 수지(Chelex 100 resin)를 넣어주었다. 이어 킬렉스 100 수지를 처리한 용액 또는 증류수에서 교반기로 섞어주며 투석함으로써 융합단백질에 결합하지 않은 자유구리이온을 모두 제거함으로써 CR-Tat-SOD를 제조하였다.To this end, the recombinant Tat-SOD fusion protein was overexpressed in Escherichia coli and purified easily and conveniently by metal-chelating affinity chromatography. The purified Tat-SOD fusion protein is mixed with a solution containing copper ions using a stirrer and dialyzed, followed by transferring the fusion protein to a copper ion solution, and removing metal ions to remove free copper ions not bound to the fusion protein. Chelex 100 resin was added. Subsequently, CR-Tat-SOD was prepared by removing all free copper ions that were not bound to the fusion protein by mixing and dialysis with a stirrer in a solution treated with KYLEX 100 resin or distilled water.
CR-Tat-SOD의 세포내 투과효율은 HeLa 세포를 이용한 실험에서 확인하였다. 실험 결과 CR-Tat-SOD는 구리이온을 회복시키지 않은 Tat-SOD에 비하여 세포 내로 침투하는 능력이 월등히 높았다. 구리이온을 회복시키지 않은 Tat-SOD는 투여 5분 후에 HeLa 세포 내에서 투과된 융합단백질을 확인할 수 있었으며 처리 시간에 따라 세포 내 투과 정도가 비례하여 증가함을 관찰할 수 있었다(시간의존적 양상, time-dependent manner). 반면, 구리이온을 회복시킨 CR-Tat-SOD의 경우는 투여 20분 후에 거의 모든 CR-Tat-SOD가 세포 내로 빠르게 투과되었다(빠른포화 양상, rapid-saturation manner). 이러한 결과는 구리이온 회복으로 Tat-SOD의 세포내 침투 능력을 크게 증가시킬 수 있다는 것을 의미한다.Intracellular permeation efficiency of CR-Tat-SOD was confirmed in experiments using HeLa cells. As a result, CR-Tat-SOD had a much higher ability to penetrate into cells than Tat-SOD which did not recover copper ions. Tat-SOD that did not recover copper ions was able to confirm the fusion protein permeated in HeLa cells 5 minutes after administration and the proportion of intracellular permeation increased proportionally with treatment time (time-dependent pattern, time -dependent manner). On the other hand, in the case of CR-Tat-SOD recovering copper ions, almost all CR-Tat-SOD penetrated rapidly into cells 20 minutes after administration (rapid saturation mode, rapid-saturation manner). These results indicate that the recovery of copper ions can significantly increase the intracellular penetration of Tat-SOD.
또한, 본 발명에서는 산화적 스트레스에 의한 HeLa 세포의 세포사의 억제 정도를 측정함으로써 세포 내로 투과된 Tat-SOD의 생물학적 활성도를 측정하는 방법을 개발하였다. 실험 결과 CR-Tat-SOD는 구리이온을 회복시키지 않은 것에 비하여 paraquat에 의해 유발된 HeLa 세포의 세포사를 억제하는 능력이 유의하게 높았다. 따라서, CR-Tat-SOD는 구리이온을 회복시키지 않은 것에 비하여 세포내로 빠르게 침투하여 효소활성을 나타냄으로써 세포내의 산화적 스트레스를 보다 더 효과적으로 제거하는 것으로 여겨진다.In addition, the present invention has been developed a method for measuring the biological activity of Tat-SOD permeated into cells by measuring the degree of inhibition of cell death of HeLa cells by oxidative stress. As a result, CR-Tat-SOD was significantly higher in inhibiting paraquat-induced cell death of HeLa cells than in recovering copper ions. Therefore, it is believed that CR-Tat-SOD removes oxidative stress in cells more effectively by exhibiting enzymatic activity by rapidly penetrating into cells as compared with not recovering copper ions.
본 발명은 단백질 수송 도메인과 공유결합되어 세포 내로 침투 가능한 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스 융합단백질에 구리이온 용액을 가하여 구리이온을 회복시킴으로써 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스 융합단백질의 세포 내 침투능력을 증가시키는 방법에 관한 것이다.The present invention is a method of increasing the intracellular penetration ability of the superoxide dismutase fusion protein by adding a copper ion solution to the superoxide dismutase fusion protein covalently bonded to the protein transport domain to recover the copper ion. It is about.
또한, 본 발명은 상기 단백질 수송 도메인이 HIV-1 Tat(49-57), Tat(51-57), Tat(50-56), Tat(50-57), Tat(50-55), 5∼12개의 아르기닌 잔기로 구성되는 올리고 아르기닌, 5∼12개의 라이신 잔기로 구성되는 올리고라이신, 5∼12개의 아르기닌 또는 라이신 잔기로 구성되는 올리고(A+L) 중의 하나인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the protein transport domain is HIV-1 Tat (49-57), Tat (51-57), Tat (50-56), Tat (50-57), Tat (50-55), 5 ~ It is characterized by one of the oligo arginine consisting of 12 arginine residues, the oligolysine consisting of 5-12 lysine residues, the oligo (A + L) consisting of 5-12 arginine or lysine residues.
또한, 본 발명은 구리이온 회복방법으로서 단백질 수송 도메인에 공유결합되어 세포 내로 침투 가능한 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스(SOD) 융합단백질을 정제하는 공정; 상기 정제된 SOD 융합단백질에 구리이온 용액을 가하여 구리이온을 회복시키는 공정;으로 구성되는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention provides a method for recovering copper ions, the method comprising: purifying a superoxide dismutase (SOD) fusion protein that is covalently bound to a protein transport domain and penetrated into a cell; And recovering copper ions by adding a copper ion solution to the purified SOD fusion protein.
또한, 본 발명은 상기 구리이온 회복 공정 이후 SOD 융합단백질과 결합되지 않은 자유 구리이온을 제거하는 공정이 부가되는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that after the copper ion recovery process is added a process for removing free copper ions not bonded with SOD fusion protein.
나아가, 본 발명은 SOD 융합단백질을 정제하는 공정이 우레아 등의 변성제를 가한 상태에서 진행되는 것을 포함한다.Furthermore, the present invention includes the step of purifying the SOD fusion protein in a state where a modifier such as urea is added.
또한, 본 발명은 상기 구리이온 회복 방법들에 의하여 제조된 구리이온 회복 SOD 융합단백질을 제공한다.The present invention also provides a copper ion recovery SOD fusion protein prepared by the above copper ion recovery methods.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 구리이온 회복 SOD 융합단백질에 있어서 구리이온이 SOD 단량체당 0.4∼1.0몰 함유된 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that in the copper ion recovery SOD fusion protein, the copper ions contained 0.4 to 1.0 mole per SOD monomer.
나아가, 본 발명은 상기 구리이온 회복 SOD 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 사구체신염, 맥관염, 자가면역성 질환, 졸중, 심근경색, 부정맥, 협심증, 특발성 헤모크로마토시스, 방사선 치료에 의한 질병, 조로증, 질병 관련 노화, 겸상적혈구증, 말라리아, 폐기종, 심근증, 자가면역 신증후군, 베텔넷-관련 구강암, 고압산소증, 알쯔하이머병, 파킨슨병 또는 백내장 등의 SOD 의존성 질환에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.Furthermore, the present invention is characterized in that the copper ion recovery SOD fusion protein as an active ingredient and comprises a pharmaceutically acceptable carrier, glomerulonephritis, vasculitis, autoimmune diseases, stroke, myocardial infarction, arrhythmia, angina pectoris, Idiopathic hemochromatosis, diseases caused by radiation therapy, premature ejaculation, disease-related aging, sickle cell disease, malaria, emphysema, cardiomyopathy, autoimmune nephrotic syndrome, Betelnet-related oral cancer, hyperbaric oxygen, Alzheimer's disease, Parkinson's disease or cataracts Provided are pharmaceutical compositions useful for SOD dependent diseases.
본 발명은 또한, 상기 구리이온 회복 SOD 융합단백질을 유효성분으로 하고 활성산소종을 제거하는 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition, characterized in that the copper ion recovery SOD fusion protein as an active ingredient and has the function of removing active oxygen species.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the cosmetic composition is characterized in that the lotion, gel, water-soluble liquid, oil-in-water (O / W) type and water-in-oil (W / O) type.
구리이온 회복 SOD 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사형태로 제형할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 텍스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀루로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 항미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.Pharmaceutical compositions containing a copper ion recovery SOD fusion protein as an active ingredient can be formulated orally or injectable by conventional methods in combination with a carrier that is conventionally acceptable in the pharmaceutical art. Oral compositions include, for example, tablets and gelatin capsules, which, in addition to the active ingredient, may contain diluents (e.g. lactose, textose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine), suspending agents (e.g. silica, Talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and / or polyethylene glycols, and the tablets also contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpi It is preferred to contain a disintegrant (eg starch, agar, alginic acid or its sodium salt) or a boiling mixture and / or absorbents, colorants, antiseptics and sweeteners. Injectable compositions are preferably aqueous isotonic solutions or suspensions, and the compositions mentioned are sterile and / or contain auxiliaries (eg, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifier solution promoters, salts or buffers for controlling osmotic pressure). In addition, they may contain other therapeutically valuable substances.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.0001~100㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.The pharmaceutical preparations thus prepared may be administered orally as desired, or parenteral, that is, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, or topically applied, and the dosage may be 0.0001-100 mg / kg in daily dose. It can be administered in 1 to several times. Dosage levels for a particular patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, time of administration, method of administration, rate of excretion, severity of the disease, and the like.
또한, 본 발명의 구리이온 회복 SOD 융합 단백질을 주요성분으로 하는 화장료 조성물은 크림, 연고, 젤, 로션, 화장수 등으로 제형화되어 사용될 수 있으며, 어떤 제형으로 제조하여 사용하는가는 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자에 의해 극히 용이하게 결정될 수 있다.In addition, the cosmetic composition containing the copper ion recovery SOD fusion protein of the present invention as a main component can be formulated and used as a cream, ointment, gel, lotion, lotion, etc. Which formulation is used to make and use It can be determined very easily by one skilled in the art.
또한, 본 발명의 구리이온 회복 SOD 융합단백질을 유효성분으로 하는 로션, 젤, 에센스, 크림, 화장수 등은 각각 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있으며, 기초 화장품 등에 편리하게 첨가하여 피부노화방지, 개선제 등의 용도로서 사용될 수 있다.In addition, lotions, gels, essences, creams, lotions, etc. using the copper ion recovery SOD fusion protein of the present invention as an active ingredient can be easily prepared in any form according to conventional manufacturing methods, and conveniently added to basic cosmetics, etc. It can be used as a skin anti-aging, improver and the like.
일례로서 크림을 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 올리고라이신-SOD 융합단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.For example, in the preparation of creams, the oligolysine-SOD fusion protein of the present invention is contained in a general oil-in-water type (O / W) or water-in-oil type (W / O) cream base, and the fragrance, chelating agent, pigment, antioxidant While preservatives and the like are used, synthetic or natural materials such as proteins, minerals and vitamins can be used in combination for the purpose of improving the properties.
이하에서는 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail by examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following examples.
재료material
제한 효소와 T4 DNA 리가아제(ligase)는 Promega(USA)에서 구입하였고, Pfu 폴리머라아제(polymerase)는 stratagene(USA)에서 구입하였다. Tat 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)는 Gibco BRL custom primer(USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa(Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21 (DE3) 플라스미드(plasmid)는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni-니트릴로 트리아세틱 애시드 세파로즈 수퍼 플로우(Ni-nitrilo-triactic acid sepharose superflow)는 Qiagen(Germany)에서 구입하였다. 인간 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스 (Cu,Zn-SOD) cDNA는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: 이하 "PCR"이라 함) 방법으로 사람 태반 cDNA 라이브러리(library)에서 분리하였다[Kang, J.H., Choi, B.J. and Kim, S.M. (1997) J. Biochem. Mol. Biol. 30, 60-65]. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.Restriction enzymes and T4 DNA ligase were purchased from Promega (USA) and Pfu polymerase was purchased from stratagene (USA). Tat oligonucleotides were synthesized by Gibco BRL custom primer (USA). IPTG was purchased from Duchefa (Netherland). pET-15b and BL21 (DE3) plasmids were purchased from Novagen (USA) and Ni-nitrilo-triactic acid sepharose superflow was purchased from Qiagen (Germany). . Human Cu, Zn-superoxide dismutase (Cu, Zn-SOD) cDNA was isolated from human placental cDNA library by polymerase chain reaction ("PCR") method [Kang , JH, Choi, BJ and Kim, S. M. (1997) J. Biochem. Mol. Biol. 30, 60-65]. All other reagents were used as express products.
CR-Tat-SOD 융합단백질의 구리이온 함량 측정Determination of Copper Ion Content in CR-Tat-SOD Fusion Proteins
Tat-SOD와 구리이온이 회복된 CR-Tat-SOD 융합단백질 내에 함유되어 있는 구리이온의 양을 측정하기 위하여 단백질을 과산화수소와 반응시켜 단백질과 결합되어 있는 구리이온을 유리시킨 다음 울트라필트레이션(Millipore Ultrafree-MC filter, cutoff 5 kDa)하여 단백질을 제거하였다. 여과액 내의 구리이온의 농도를 분자흡광광도계(atomic absorption spectrophotometer, Shimadzu, AA-6601F)로 측정하였다.In order to measure the amount of copper ions contained in the CR-Tat-SOD fusion protein in which Tat-SOD and copper ions have been recovered, the protein is reacted with hydrogen peroxide to release the copper ions bound to the protein and then ultrafiltration (Millipore). Ultrafree-MC filter, cutoff 5 kDa) to remove the protein. The concentration of copper ions in the filtrate was measured with a molecular absorption spectrophotometer (Shimadzu, AA-6601F).
웨스턴 블랏 분석Western blot analysis
세포 분쇄액 내의 단백질을 15% SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기이동법으로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 전기이동시켰다. 단백질이 이동된 니트로셀룰로스 멤브레인을 5% 우혈청 알부민 용액으로 처리하고 이어, 인간 Cu,Zn-SOD에 대한 단일클론항체(hSOD mAb-1.4)로 1시간 처리하였다. 세척 후, 멤브레인을 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 결합된 고우트 항-마우스 IgG(goat anti-mouse IgG 항체; Sigma, 1:5,000 희석)와 1시간동안 반응시켰다. 최종적으로 알칼린 포스파타아제 결합 기질 킷트(alkaline phosphatase conjugate substrate kit; Bio-Rad, USA)를 처리하여 인간 Cu,Zn-SOD 단일클론항체에 반응하는 단백질 띠를 확인하였다.Proteins in the cell mill were separated by 15% SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and the proteins in the gels were then electrophoresed onto a nitrocellulose membrane. The protein-shifted nitrocellulose membrane was treated with 5% bovine serum albumin solution and then treated with monoclonal antibody (hSOD mAb-1.4) against human Cu, Zn-SOD for 1 hour. After washing, the membrane was reacted with goat anti-mouse IgG antibody (Sigma, 1: 5,000 dilution) for 1 hour with alkaline phosphatase. Finally, an alkaline phosphatase conjugate substrate kit (Bio-Rad, USA) was treated to identify protein bands that respond to human Cu, Zn-SOD monoclonal antibodies.
CR-Tat-SOD의 생물학적 활성도 측정법Determination of Biological Activity of CR-Tat-SOD
HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 4∼6시간 동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1ml의 신선한 배양액으로 교체하고 0.1∼2 μM의 CR-Tat-SOD와 구리이온을 회복시키지 않은 Tat-SOD를 배양액 내에 투여하였다. 투여 1시간 후 5 mM의 파라쿠아트(paraquat)를 배양액에 처리하고 12시간 더 배양한 다음 살아있는 세포의 수를 MTT 분석법으로 측정하였다.HeLa cells were grown in 6-well plates for 4-6 hours, then replaced with 1 ml fresh culture medium without FBS, and 0.1-2 μM of CR-Tat-SOD and Tat-SOD without recovery of copper ions were added to the culture medium. Administered. After 1 hour of administration 5 mM paraquat (paraquat) was treated in the culture medium and further incubated for 12 hours, the number of living cells was measured by MTT assay.
<실시예 1> Tat-SOD 융합단백질의 정제 및 구리이온 회복 CR-Tat-SOD의 제조Example 1 Purification of Tat-SOD Fusion Protein and Preparation of Copper Ion Recovery CR-Tat-SOD
본 연구실에서 제조한 인간 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스 cDNA가 포함되어 있는E. coliBL21(DE3) 세포를 앰피실린(ampicillin)이 포함된 LB 배지에 넣고37℃에서 200rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D600= 0.5∼1.0를 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5 mM되게 한 다음 3-4시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 5 ml 결합완충액(binding buffer; 5 mM 이미다졸(imidazole), 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)를 넣고 초음파처리(sonication)하였다. 재조합 Tat-SOD는 변성상태(denaturing condition)에서 정제하였다. 변성상태 하에서 정제하기 위하여 결합완충액에 6 M 우레아를 첨가하여 초음파처리하였다. E. coli BL21 (DE3) cells containing human Cu, Zn-superoxide dismutase cDNA prepared in the laboratory were placed in LB medium containing ampicillin and stirred at 200 rpm at 37 ° C. It was. When the bacterial concentration in the culture showed OD 600 = 0.5 to 1.0, IPTG was added to the medium to bring the final concentration to 0.5 mM, followed by further incubation for 3-4 hours. The cultured cells were collected by centrifugation and sonicated with 5 ml binding buffer (5 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9). Recombinant Tat-SOD was purified in denaturing conditions. In order to purify under denatured state, 6 M urea was added to the binding buffer and sonicated.
원심분리하여 상층액을 즉시 2.5 ml Ni-니트릴로 트리아세틱 애시드 세파로즈 수퍼 플로우(Ni-nitrilotriacetic acid sepharose super flow) 컬럼에 부하하고 10배 부피의 결합완충액과 6배 부피의 세척완충액(60 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)로 세척한 다음 용출완충액(elution buffer; 1M 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)로 융합단백질을 용출하였다. 이어, 융합단백질이 포함된 분획들을 모아 세파덱스 G-15 컬럼 크로마토그래피(Sephadex G-15 column chromatography)를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다.Centrifuge immediately and load the supernatant into a Ni-nitrilotriacetic acid sepharose super flow column with 2.5 ml Ni-nitrile and 10-fold volume of binding buffer and 6-fold volume of wash buffer (60 mM Dazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9), and then the fusion protein was eluted with elution buffer (1M imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9). Subsequently, the fractions containing the fusion protein were collected and Sephadex G-15 column chromatography was performed to remove salts contained in the fractions.
분획의 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드 방법으로 측정하였다 [Bradford, M.A. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254].Protein concentrations of the fractions were determined by Bradford method using bovine serum albumin as standard [Bradford, M.A. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254.
본 연구에서는 세포투과능력을 지니게 하기 위하여 변성상태(denaturing condition)에서 융합단백질을 정제하였다. 변성시킨 융합단백질을 얻기 위하여 세포를 6 M 우레아가 함유된 용액 내에서 초음파처리로 파쇄시키고 즉시 정제과정에들어갔다. 한편, 융합단백질은 N-말단에 6개의 히스티딘(histidine)을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피(immobilized metal-chelate affinity chromatography) 한 단계로 융합단백질을 거의 순수하게 (순도>90%) 정제하였다.In this study, fusion proteins were purified in denaturing conditions to have cell permeability. To obtain denatured fusion protein, the cells were sonicated in a solution containing 6 M urea and immediately purified. On the other hand, since the fusion protein contains six histidines at the N-terminus, the fusion protein is almost pure (purity> 90%) in a step of immobilized metal-chelate affinity chromatography. Purified.
최종적으로 정제된 융합단백질은 도 1에 나타낸 바와 같이 일부는 구리이온을 회복시킨 CR-Tat-SOD를 제조하였으며, 일부는 비교실험을 위하여 구리이온을 회복시키지 않은 Tat-SOD로 제조하였다. 정제된 Tat-SOD를 4℃를 유지하면서 1000 ml의 3차 증류수에 1 mM 되게 CuCl2를 넣어준 뒤 2-4시간 교반기로 섞어주며 투석하였다. 투석을 한 후, 1000 ml의 3차 증류수에 Tat-SOD를 옮겨 주고, 자유 구리이온을 제거하기 위해서 금속이온 킬레이터(chelator)인 킬렉스 100 수지를 넣어주었다. 킬렉스 100 수지를 처리한 3차 증류수에서 12시간 교반기로 섞어주며 투석을 하고, 다시 한번 킬렉스 100 수지를 처리한 3차 증류수로 바꾸어 주어 12시간 투석하여 Tat-SOD 융합단백질에 결합되지 않은 자유 구리이온을 제거함으로써 구리이온이 함유된 CR-Tat-SOD(Cupper ion recovered Tat-SOD)를 제조하였다.Finally, the purified fusion protein, as shown in FIG. Purified Tat-SOD was added to 1 mM CuCl 2 in 1000 ml of tertiary distilled water while maintaining 4 ℃ and dialyzed by mixing with a stirrer for 2-4 hours. After dialysis, Tat-SOD was transferred to 1000 ml of tertiary distilled water, and a metal ion chelator (Keelx 100) resin was added to remove free copper ions. Dialysis was carried out in a tertiary distilled water treated with Killex 100 resin with a stirrer for 12 hours. Copper ion recovered Tat-SOD (CR-Tat-SOD) containing copper ions was prepared by removing copper ions.
표 1에 나타낸 바와 같이 정제한 Tat-SOD의 구리이온 함량은 0.27 mol/subunit로 나타났으며, 구리이온을 회복시킨 CR-Tat-SOD의 구리이온 함량은 0.96 mol/subunit로 거의 정상 상태로 구리이온이 회복되었음을 확인하였다. 또한, 정제한 Tat-SOD를 6M 우레아 하에서 변성시킬 경우 SOD 활성도가 거의 소실되었으나, 단백질 변성 후 구리이온을 다시 회복시켜줌으로써 소실되었던 효소활성도의86%가 다시 회복되었다(표 2).As shown in Table 1, the copper ions content of purified Tat-SOD was 0.27 mol / subunit, and the copper ions content of CR-Tat-SOD recovering copper ions was 0.96 mol / subunit. It was confirmed that the ions were recovered. In addition, when the purified Tat-SOD was denatured under 6M urea, SOD activity was almost lost, but 86% of the enzyme activity that was lost was recovered by restoring copper ions after protein denaturation (Table 2).
<실시예 2> CR-Tat-SOD의 HeLa 세포 내 투과Example 2 Intracellular HeLa Cell Permeation of CR-Tat-SOD
구리이온의 회복이 Tat-SOD 융합단백질의 세포내 투과능력에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 Tat-SOD와 구리이온을 회복시킨 CR-Tat-SOD 융합단백질의 세포투과력을 HeLa 세포배양에서 비교 관찰하였다.To investigate the effect of the recovery of copper ions on the intracellular permeability of Tat-SOD fusion proteins, the cell permeability of Tat-SOD and copper ions restored CR-Tat-SOD fusion protein was compared in HeLa cell culture. .
HeLa 세포는 37℃에서 95% 공기와 5% CO2를 공급해주며 20 mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 5 mM NaHCO3, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 항생제 (100㎍/ml 스트렙토마이신, 100U/ml 페니실린)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다.HeLa cells provide 95% air and 5% CO 2 at 37 ° C with 20 mM HEPES / NaOH (pH 7.4), 5 mM NaHCO 3 , 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics (100 μg / ml streptomycin, Incubated in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing 100 U / ml penicillin).
CR-Tat-SOD의 세포내 투과를 관찰하기 위하여, HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 4∼6시간동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1 ml의 신선한 배양액으로 교체하고 여러 농도의 CR-Tat-SOD와 구리이온을 회복시키지 않은 Tat-SOD를 배양액 내에 투여하였다. 투여 1시간 후 또는 시간별로 세포를 트립신-EDTA (Gibco BRL)로 처리하고 PBS(phosphate buffered saline)로 충분히 세척한 다음 세포를 분쇄하여 세포 내로 투과된 융합단백질의 양을 웨스턴블랏으로 측정하였다.To observe intracellular permeation of CR-Tat-SOD, HeLa cells were grown for 4-6 hours in 6-well plates, then replaced with 1 ml of fresh culture medium without FBS and CR-Tat-SOD at various concentrations. And Tat-SOD which did not recover copper ions were administered in the culture. After 1 hour of administration or hourly, the cells were treated with trypsin-EDTA (Gibco BRL), thoroughly washed with PBS (phosphate buffered saline), and the cells were ground to measure the amount of fusion protein permeated into the cells by Western blot.
도 2a, b에 나타낸 바와 같이 두 종류의 융합단백질들은 모두 처리한 농도에 비례하여 세포에 투과되는 양이 증가되었으나, 같은 농도를 처리하였을 때 세포 내로 투과된 융합단백질의 양은 CR-Tat-SOD가 Tat-SOD에 비하여 크게 증가하였다. 이러한 현상은 저농도의 융합단백질을 처리했을 때 현저하게 나타나 0.25 μM과 0.5 μM을 처리한 경우 CR-Tat-SOD의 세포투과력은 Tat-SOD에 비하여 각각 136%와 125%를 나타내었다. 또한, 도 3a, b에 나타낸 바와 같이 2 μM의 융합단백질을 처리하고 시간별로 세포 내로 이동한 융합단백질의 양을 관찰한 결과, 구리이온을 회복시키지 않은 Tat-SOD의 경우 처리한 시간에 비례하여 융합단백질이 세포 내로 이동하여 처리 1시간 후에 거의 모든 융합단백질이 세포 내로 이동되었다(시간의존적 양상, time-dependent manner). 반면, 구리이온 회복을 시킨 CR-Tat-SOD의 경우는 처리 후 빠르게 세포 내로 침투하여 5분 내에 75%의 융합단백질이 세포 내로 이동되었으며, 20분내에 거의 모든 융합단백질이 세포 내로 이동하였다(빠른 포화적 양상, rapid-saturation manner). 이런 결과는 구리이온의 회복으로 융합단백질의 세포내 침투속도가 5배 이상 크게 증가되었음을 나타낸다.As shown in FIGS. 2A and 2B, both types of fusion proteins increased in proportion to the concentration of the cells, but the amount of the fusion proteins that were penetrated into the cells when treated with the same concentration was CR-Tat-SOD. Significant increase compared to Tat-SOD. This phenomenon was remarkable when low concentration fusion protein was treated, and the cell permeability of CR-Tat-SOD was 0.25% and 125%, respectively, when treated with 0.25 μM and 0.5 μM. In addition, as shown in Figure 3a, b treated with a 2 μM fusion protein and observed the amount of fusion protein moved into the cell by time, in the case of Tat-SOD that did not recover the copper ions in proportion to the processing time The fusion protein migrated into the cell and almost one fusion protein was transferred into the cell 1 hour after treatment (time-dependent manner). On the other hand, CR-Tat-SOD recovering copper ion rapidly penetrated into cells after treatment, and 75% of fusion proteins were transferred into cells within 5 minutes, and almost all fusion proteins were transferred into cells within 20 minutes (fast Saturation pattern, rapid-saturation manner. These results indicate that the recovery of copper ions increased the intracellular penetration rate of the fusion protein more than five times.
<실시예 3> CR-Tat-SOD의 생물학적 활성도Example 3 Biological Activity of CR-Tat-SOD
세포 내로 투과된 융합단백질은 세포 내에서 그 고유한 생물학적 활성을 유지해야만 이를 단백질 치료(protein therapy)에 응용할 수 있다. 따라서 실제 응용에 있어서 세포 내로 투과된 융합단백질의 생물학적 활성도의 측정이 매우 중요한 요소가 된다. 본 연구에서는 Tat-SOD의 생물학적 활성도를 측정하기 위하여 배양액내에 파라쿠아트(paraquat)를 처리하여 HeLa 세포의 사멸을 유도하였을 때, 세포내로 침투된 Tat-SOD가 사포사멸을 어느 정도 억제하는지를 측정함으로써 판단하였다. 파라쿠아트는 세포내에서 활성산소종을 증가시켜 결국 세포사멸을 유도하는 물질로 잘 알려져 있다.Fusion proteins permeated into cells must maintain their inherent biological activity in cells before they can be applied to protein therapy. Therefore, the measurement of the biological activity of the fusion protein permeated into the cell is a very important factor in practical applications. In this study, we measured how much Tat-SOD penetrated into cells inhibits sandpaper death when Paraquat was treated in culture to induce HeLa cell death to measure the biological activity of Tat-SOD. Judging Paraquat is well known as a substance that increases free radical species in cells and eventually induces cell death.
도 4에 나타낸 바와 같이 0.1∼2μM의 CR-Tat-SOD와 Tat-SOD를 처리했을 때 두 종류의 융합 단백질은 모두 농도 의존적으로 세포의 사멸을 억제하였다. 그러나, 세포 사멸의 억제 정도는 모든 농도에서 CR-Tat-SOD이 Tat-SOD 보다 높게 나타났다. 특히, 0.25∼0.5μM의 저농도에서 CR-Tat-SOD의 생물학적 활성도는 Tat-SOD에 비하여 통계적으로 유의하게 높게 나타났다 (p<0.05). 이는 CR-Tat-SOD가 구리이온을 회복시키지 않은 Tat-SOD에 비하여 세포 내로 더 빠르게 침투하여 세포 내의 활성산소를 제거시킴으로써 세포사멸을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.As shown in FIG. 4, both kinds of fusion proteins inhibited cell death in a concentration-dependent manner when treated with 0.1 to 2 μM of CR-Tat-SOD and Tat-SOD. However, the degree of inhibition of cell death showed that CR-Tat-SOD was higher than Tat-SOD at all concentrations. In particular, the biological activity of CR-Tat-SOD was significantly higher than that of Tat-SOD at low concentrations of 0.25-0.5 μM (p <0.05). This indicates that CR-Tat-SOD can effectively inhibit cell death by penetrating into cells faster than Tat-SOD which does not recover copper ions and removing free radicals in cells.
본 발명은 단백질 수송 도메인과 공유 결합된 SOD 융합 단백질의 구리이온을 회복시켜주는 방법에 의하여 세포투과성 SOD 융합단백질의 세포투과 효율을 획기적으로 증가시켰다.The present invention dramatically increased the cell permeation efficiency of the cell-permeable SOD fusion protein by a method for restoring the copper ions of the SOD fusion protein covalently bound to the protein transport domain.
구리이온이 SOD 융합단백질의 세포 침투에 어떤 방법으로 작용하는가에 관하여는 명확히 밝혀지지 않았으나, 특히 0.5 μM 이하의 낮은 농도로 구리이온 회복 SOD 융합 단백질을 투여한 경우 구리이온 회복공정은 SOD 융합단백질의 세포투과효율을 획기적으로 증가시켰으며, 이는 SOD와 관련된 것으로 알려진 100여종 질환의 단백질 치료에 SOD 융합단백질이 효율적으로 응용될 가능성을 한층 더 높여주고 있다.It is not clear how the copper ion affects the cellular infiltration of SOD fusion protein.However, especially when the copper ion recovery SOD fusion protein is administered at a low concentration of 0.5 μM or less, the copper ion recovery process is performed by the SOD fusion protein. The cell permeation efficiency has been dramatically increased, further increasing the possibility of the efficient application of SOD fusion proteins to the protein treatment of over 100 diseases known to be related to SOD.
본 기술을 바탕으로 항산화효소의 일종인 SOD를 세포내로 직접 전달하여 우리 인체에 해로운 활성산소종을 제거할 수 있기 때문에 SOD와 관련된 여러 질병 이외에도 화장품 및 건강식품산업 등에 본 기술이 광범위하게 활용될 수 있다.Based on this technology, SOD, a type of antioxidant enzyme, can be delivered directly into cells to remove free radicals that are harmful to our body. Therefore, this technology can be widely used in cosmetics and health food industries as well as in various diseases related to SOD. have.
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