KR100443950B1 - 조골세포 특이 전사인자인 Ｒｕｎｘ２의 발현을 대량 검색할 수 있는 형질전환 세포주 및 그의 용도 - Google Patents

조골세포 특이 전사인자인 Ｒｕｎｘ２의 발현을 대량 검색할 수 있는 형질전환 세포주 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조골세포 특이인자 결합부위(osteoblast specific factor binding element 2, OSE2)의 공통 염기서열 및 리포터 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환 세포주 및 상기 형질전환 세포주를 이용한 골형성 촉진제의 검색방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 조골세포의 분화를 촉진하는 단백질의 프로모터에 공통적인 OSE2 염기서열과 리포터 유전자(reporter gene)를 융합시켜 제조한 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환 세포주 및 상기 형질전환 세포주를 이용하여 골형성 촉진제를 검색하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 세포주는 조골세포 분화를 조절하는 전사인자인 Runx2의 표적이 되는 염기서열을 포함하고 있어서 Runx2에 의해 리포터 유전자가 발현의 차이를 나타내므로 세포내의 Runx2 발현을 정량적으로 측정할 수 있고, Runx2의 발현을 증가시키는 골형성 촉진제의 검색과 세포내 신호전달 과정을 연구하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

조골세포 특이 전사인자인 Ｒｕｎｘ２의 발현을 대량 검색할 수 있는 형질전환 세포주 및 그의 용도 {Transfected cell line which can be used for mass screening of the expression of osteoblast specific transcription factor Runx2 and use thereof}
본 발명은 조골세포 특이인자 결합부위(osteoblast specific factor binding element 2, OSE2)의 염기서열 및 리포터 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환 세포주 및 상기 형질전환 세포주를 이용한 골형성 촉진제의 검색방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 조골세포의 분화를 촉진하는 단백질의 프로모터에 공통적인 OSE2 염기서열과 리포터 유전자(reporter gene)를 융합시켜 제조한 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환 세포주 및 상기 형질전환 세포주를 이용하여 골형성 촉진제를 검색하는 방법에 관한 것이다.
골조직은 골세포와 세포외 기질로 이루어진 결합조직으로서 세포외 기질에 있는 골화된 결합물질이 무기질이라는 점에서 다른 결합조직과 다른점이 있다. 무기물질은 주로 칼슘 포스페이트(calcium phosphate)로 구성되어 있는데 이것은 하이드록시애파타이트(hydroxyapatite) 결정인 Ca10(PO4)6(OH)2형태로 이루어져 있다. 골조직은 체중을 지탱할 수 있을 만큼 충분히 견고하며 물리적인 자극에 대해서 신체를 방어하므로, 골절, 골다공증 등으로 인한 골밀도의 감소 또는 병리학적인 변화에 의한 뼈의 손상은 신체의 기형(deformity)을 야기시킨다. 보철을 사용하거나 다른 신체의 일부에서 유래한 뼈 물질을 사용하여 외과적인 수술로 상기 손상되거나 제거된 뼈를 대체하는 경우에는 뼈가 원래의 형태와 기능을 회복하는데 상당한 기간을 필요로 하며 따라서 환자가 상당히 오랜 기간동안 육제적, 정신적인 고통을 받게 된다. 더군다나, 치유 과정이 길어지면 손상된 부위에 대한 미생물의 감염 위험이 증가하게되어 원래의 형태대로 완전히 치유되지 않을 수도 있다.
최근 국내외에서 골다공증, 골절 및 수술 등으로 인하여 손실된 뼈를 회복하기 위한 골형성 촉진제의 개발이 요구되고 있다. 그러나, 현재까지 개발된 비스포스포네이츠(bisphosphonates), 칼시토닌(calcitonin), 에스트라디올(estradiol) 또는 비타민 D와 같은 골형성 촉진제는 골흡수의 억제에 주목적이 있고 이미 상실된 뼈의 재생에는 큰 효과가 없는 실정이다. 이에 골형성을 촉진할 수 있는 새로운 약제를 찾아내기 위하여 많은 노력을 기울이고 있으며, 따라서 많은 물질들을 짧은 시간내에 대량 검색할 수 있는 검색 방법의 개발이 요구되고 있다.
한편, 골형성에 관여하는 조골세포의 분화에는 Runt 도메인(domain)을 가진 Runx2(Cbfa1/Pebp2aA/AML3/Osf2라고 불리기도 한다) 전사인자의 발현이 필수적이다. Runx2의 발현은 골형성이 왕성한 조직에 국한되고 유전자를 녹아웃(knock out)한 경우 뼈의 형성이 완전히 차단되며(Komori et al., Cell) 골형성을 촉진시키는 사이토카인(cytokine) 또는 호르몬에 의해 발현이 증가한다(Lee et al.,J. Cell Biochem.,73, 114-125, 1999). 즉 조골세포의 분화를 조절하는 기전은 Dlx5나 Runx2 같은 전사인자들이 조골세포의 분화를 최상부에서 조절하는 것으로서 이들의 발현은 BMP-2, TGF-β1, FGF2와 같은 세포밖의 신호물질에 의해 조절되며, 조골모세포(osteoblast) 분화의 표지인자로 알려진 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오폰틴(osteopontin), 타입 II 콜라겐(type II collagen) 및 뼈 시알로프로테인(sialoprotein) 등의 발현을 촉진하여 미분화된 간세포(stem cell)로부터 조골모세포로의 분화를 촉진한다. 결론적으로 Runx2는 골형성을 최상부에서 조절할 수 있는 전사인자이며 골형성 촉진인자에 의해 발현이 증가되므로, 약제투여 후 세포의 Runx2의 전사활성은 약제의 골형성 유도능력과 비례한다고 볼 수 있다. 따라서 Runx2의 발현은 약제의 골형성능의 활성도를 판정하는 중요한 기준이 된다.
한편, 조골세포의 표지 단백질인 오스테오칼신, 오스테오폰틴 및 뼈 시알로프로테인 등의 프로모터에는 Runx2와 같은 조골세포 특이인자가 결합할 수 있는 조골세포 특이인자 결합부위(osteoblast specific factor binding element 2, 이하 "OSE2"라 약칭함)가 존재한다. 따라서 Runx2의 발현을 증가시키는 약제라면 상기 모든 프로모터의 활성을 증가시킬 수 있을 것인 바, 상기 프로모터 활성 증가를 측정할 수 있다면 Runx2 발현을 증가시킬 수 있는 물질 즉 골형성 유도용 약제를 검색할 수 있는데, 실제로는 이들 프로모터의 활성이 BMP-2 혹은 FGF2같은 Runx2의 발현을 촉진하는 인자에 의해 뚜렷한 변화를 보이지 아니하였다(Lee et al.,J. Cell Biochem.,73, 114-125, 1999; Harada H.et al.,J. Biol. Chem.,274(11), 6972-6978, 1999). 그 이유는 1 kb 이상의 프로모터에는 여러 전사인자의 조절부위가 있어서 Runx2에 대한 특이성이 낮았고, 또한 여러 전사인자의 작용이 상쇄되어 프로모터 활성의 뚜렷한 변화를 관찰하기 힘들기 때문이었다. 또한 지금까지의 방법은 검색을 위하여 매 실험마다 세포주를 형질전환시켜야 하므로 검색 비용과 시간이 많이 소모되는 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 조골세포 분화에 필수적인 단백질들의 프로모터 부위에존재하는 Runx2와 같은 조골세포 특이인자가 결합할 수 있는 OSE2 공통 염기서열(consensus sequence)의 중합체(multimer)를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환 세포주를 개발하였고, 상기 형질전환 세포주를 골형성을 촉진하는 물질의 검색에 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 조골세포의 분화를 촉진하는 단백질의 전사인자인 Runx2의 전사활성을 용이하게 정량적으로 측정할 수 있는 형질전환 세포주 및 상기 형질전환 세포주를 이용한 골형성 촉진제의 검색방법을 제공하는 것이다.
도 1의A는 여러 세포주에서 1 ng/㎖ 농도의 FGF2에 의해서 Runx2 mRNA의 발현이 유도되는 것을 보여주는 노던 블롯(Northern blot) 사진이고,
MC ; MC3T3-E1, ROS ; ROS 17/2.8
도 1의B는 서로 다른 농도의 FGF2를 처리한 MC3T3-E1 세포주에서의 Runx2 mRNA의 발현이 유도되는 것을 보여주는 노던 블롯 사진이고,
도 1의C는 FGF2와 단백질 합성 저해제인 사이클로헥시마이드(cycloheximide)를 처리하거나 처리하지 않은 MC3T3-E1 세포주에서 Runx2 mRNA의 발현이 유도되는 것을 보여주는 노던 블롯 사진이고,
CHX : 사이클로헥시마이드
도 1의D는 FGF2 또는 FGF4를 처리한 MC3T3-E1 세포주에서의 Runx2 mRNA의 발현이 유도되는 것을 보여주는 노던 블롯 사진이고,
도 1의E는 FGF2에 의해서 Runx2 단백질이 발현되는 것을 보여주는 웨스턴블럿 사진이고,
도 2의A는 FGF2가 배어든 비드와 BSA가 배어든 비드를 E15.5인 생쥐의 두개골의 시상봉합에 이식했을 때 봉합의 정도를 확인한 사진이고,
도 2의B는 FGF2가 배어든 비드와 BSA가 배어든 비드를 E15.5인 생쥐의 두개골의 시상봉합에 이식했을 때 Runx2의 발현은 인 시츄(in situ) 혼성화를 통해 확인한 사진이고,
도 3은 일시적으로(transiently) 형질전환된 여러 세포주에서의 6xOSE2 프로모터의 활성을 나타낸 그래프이고,
■ ; 대조군, □ ; FGF2 첨가
도 4은 일시적으로 형질전환된 C2C12 세포주에서 6XOSE2 프로모터 활성에 대한 여러 사이토카인(cytokine)의 영향을 보여주는 그래프이고,
■ ; 대조군, □ ; FGF2, ▨ ; BMP2, ▧ ; TGFβ,
도 5는 일시적으로 형질전환된 C2C12 세포주에서 6XOSE2 프로모터 활성에 FGF2 농도가 미치는 영향을 보여주는 그래프이고,
도 6은 일시적으로 형질전환된 여러 세포주에서의 6XOSE2 프로모터 활성에 항상(constitutive) 활성적인 FGF 수용체(FR2C342Y 또는 FR2Y340H)가 미치는 영향을 보여주는 그래프이고,
도 7의A는 세포내 Runx2가 발현되지 않는 세포주에서 Runx2의 두가지 이소형태(Pebp2αA 또는 Osf2)를 발현하는 벡터를 본 발명의 6xOSE2-Luc와 동시에 형질전환했을 때 FGF2를 처리한 것과 처리하지 않은 세포주에서 6xOSE2 프로모터 활성을 보여주는 그래프이고,
도 7의B는 세포내 Runx2가 발현되지 않는 세포주에서 Runx2의 두가지 이소형태(Pebp2αA 또는 Osf2)를 발현하는 벡터, 본 발명의 6xOSE2-Luc 벡터 및 항상(constitutive) 활성적인 FGF 수용체(FR2C342Y 또는 FR2Y340H)의 플라스미드를 동시에 형질전환했을 때 6xOSE2 프로모터 활성을 보여주는 그래프이고,
도 8은 안정적으로 형질전환된 세포 클론에서의 6xOSE2 프로모터 활성을 보여주는 그래프이고,
■ ; 대조군, □ ; FGF2 첨가,
도 9는 3번 세포 클론의 세포수에 따른 6XOSE2 프로모터 활성을 보여주는 그래프이고,
■ ; 대조군, □ ; FGF2 첨가,
도 10은 5번 세포 클론의 세포수에 따른 6xOSE2 프로모터 활성을 보여주는 그래프이고,
A ; 세포수에 따른 6xOSE2 프로모터 활성,
B ; 표준화한(normalized) 전체 세포 단백질당(1 ㎎/㎖) 6xOSE2 프로모터 활성,
■ ; 대조군, □ ; FGF2 첨가,
도 11은 29번 세포 클론의 세포수에 따른 6xOSE2 프로모터 활성을 보여주는 그래프이고,
A; 세포수에 따른 6xOSE2 프로모터 활성,
B; 표준화한 전체 세포 단백질당(1 ㎎/㎖) 6xOSE2 프로모터 활성,
■ ; 대조군, □ ; FGF2 첨가
도 12는 3번, 5번 및 29번 세포 클론에서 6XOSE2 프로모터 활성에 FGF2 농도가 미치는 영향을 보여주는 그래프이고,
A; 3번 세포 클론,B; 5번 세포 클론,C; 29번 세포 클론
■ ; 0.0 ng/㎖, □ ; 0.1 ng/㎖, ▨ ; 1.0 ng/㎖,
▧ ; 10.0 ng/㎖, ▤ ; 30.0 ng/㎖,
도 13의A는 p6XOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 3번 세포 클론에서 FGF2 또는 FGF4에 의해 유도되는 Runx2 mRNA의 발현을 노던 블럿으로 나타낸 사진이고,
도 13의B는 p6XOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 3번 세포 클론에서 FGF2 또는 FGF4에 의해 유도되는 상대적 루시퍼라제 활성을 나타낸 그래프이고,
도 14의A는 p6XOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 세포주에 FGF2와 Erk1/2 MAP 키나제의 저해제인 PD98059(PD)를 처리한 것과 처리하지 않은 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정한 그래프와 Runx2의 발현을 나타낸 노던블럿 사진이고,
도 14의B는 p6XOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 세포주에 FGF2와 p38 MAP 키나제의 저해제인 SB203580(SB)를 처리한 것과 처리하지 않은 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정한 그래프와 Runx2의 발현을 나타낸 노던블럿 사진이고,
도 14의C는 p6XOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 세포주에 JNK의 저해제인 DN-MEKK1 발현벡터를 도입한 것과 도입하지 않은 세포에 FGF2를 처리한 것과 처리하지 않은 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정한 그래프와 Runx2의 발현을 나타낸 노던블럿 사진이고,
도 15의A는 p6XOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 세포주에 PKC 저해제인 칼포스틴 C(Cal C) 1 uM과 FGF2 10 ng/ml를 처리한 것과 처리하지 않은 세포에서 Runx2의 발현을 나타낸 노던블럿 사진이고,
도 15의B는 p6XOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 세포주에 PKC 저해제인 칼포스틴 C(Cal C) 1 uM과 FGF2 10 ng/ml를 처리한 것과 처리하지 않은 세포에서 루시퍼라제 활성을 나타낸 그래프이고,
도 15의C는 세포내 Runx2를 발현하지 않는 Runx2(-/-) 세포에서 Osf2를 발현하는 Runx2-Osf2 발현벡터를 형질전환한 것과 하지 않은 세포에 PKC 저해제인 칼포스틴 C(Cal C) 1 uM과 FGF2 10 ng/ml를 처리한 것과 처리하지 않은 세포에서 루시퍼라제 활성을 나타낸 그래프이고,
도 16은 FGF에 의해 유도되는 Runx2의 발현과 Runx2 단백질의 활성에 대한 신호전달 경로를 나타낸 모식도이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조골세포 특이인자 결합부위 염기서열과 리포터 유전자로 융합시켜 제조한 발현벡터(p6xOSE2-Luc)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환 세포주를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 이용한 골형성 촉진제의 검색방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 조골세포 특이인자 결합부위 염기서열과 리포터 유전자를 융합시켜 제조한 발현벡터(p6xOSE2-Luc)를 제공한다.
골형성을 촉진하기 위해서는 조골모세포의 분화가 선행되어야 한다. 조골모세포의 분화를 촉진하기 위해서는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 타입 I 콜라겐 및 뼈 시알로프로테인 등의 여러가지 단백질의 발현이 필요하다. 이들 단백질의 프로모터에는 조골세포 특이인자 결합부위인 OSE2 염기서열이 존재하며 조골세포 특이인자인 Runx2는 상기 OSE2와 결합하여 단백질의 발현량을 증가시키는 전사인자이다.
본 발명자들은 상기 오스테오폰틴, 타입 I 콜라겐, 뼈 시알로프로테인에 존재하는 조골세포 특이인자 결합부위의 공통서열을 포함하는 염기서열을 여러개 반복 연결시킨 중합체를 제조하였고, 상기 중합체 염기서열과 리포터 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하였다. 본 발명의 중합체 염기서열은 조골세포 특이인자 결합부위 공통 염기서열인 PuACCPuCA 염기서열을 포함하며서열번호 1로 기재되는 OSE2 염기서열이 바람직하고 더욱 바람직하기로는 OSE2 염기서열이 여러개 반복되는 올리고머가 바람직하며, 가장 바람직하기로는 6개가 반복되는서열번호2의 6xOSE2 올리고머이다. 본 발명의 리포터 유전자는 루시퍼라제(luciferase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), GFP(green fluorescent protein) 및 CAT(chloramphenicol acetyltransferase)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 루시퍼라제가 바람직하다.
상기와 같이, 본 발명자들은 중합체 염기서열로서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 올리고머와 리포터 유전자로 루시퍼라제를 포함하는 발현벡터를 제조하였고 이를 "p6xOSE2-Luc" 벡터라 명명하였다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환 세포주를 제공한다.
먼저, 본 발명자들은 본 발명의 발현 벡터 p6xOSE2-Luc로 형질전환된 형질전환 세포주가 세포내에서의 Runx2 유전자의 발현을 잘 반영하는지 확인하기 위한 기초 실험으로서, 여러 세포주에서 기존의 골형성 촉진제가 Runx2의 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 숙주세포로는 MC3T3-E1, ROS 17/2.8 및 C2C12 등이 바람직하고, 그중 C2C12가 가장 바람직하다.
MC3T3-E1, ROS17/2.8 및 C2C12 세포주에 기존의 골형성 촉진제인 FGF2를 처리한 후 Runx2 mRNA의 발현을 측정한 결과, FGF2를 처리한 모든 세포주에서 Runx2의 발현이 강하게 증가하는 것을 관찰하였고(도 1의A참조) Runx2 mRNA에 의해 Runx2 단백질도 발현된다는 것을 관찰하였다(도 1의E참조) . 조골세포 유래의 ROS 17/2.8 및 MC3T3-E1 세포는 Runx2 mRNA의 기초 발현정도(expression basal level)가 C2C12 세포에 비해 비교적 높았으며, 특히 골육종 세포인 ROS 17/2.8 세포는 Runx2가 강하게 발현되었다. 반면에 근육세포 유래의 C2Cl2 세포는 기초 발현정도는 낮았으나 FGF2에 의해 유도되는 Runx2의 증가배수는 상대적으로 높음을 알 수 있었다.
서로 다른 농도의 FGF2에 의해 유도되는 Runx2의 발현을 측정한 결과 가해진FGF2의 농도에 비례하여 Runx2의 발현이 증가하였으나 일정한 농도(10 ng/㎖) 이상을 첨가한 경우에는 Runx2의 발현이 큰 차이를 보이지 않았고(도 1의B참조), FGF4를 처리한 세포주에서도 FGF2를 처리한 경우와 동일하게 Runx2의 발현이 증가하는지 확인한 결과, FGF2와 마찬가지로 FGF4도 Runx2 mRNA의 발현을 유도함을 확인하였다(도 1의D참조).
상기의 결과로부터, 첨가한 FGF2의 농도가 증가할수록 세포에서의 Runx2 mRNA 발현이 비례적으로 증가하고 또한 FGF2가 세포주에서 Runx2 단백질의 발현을 유도함을 확인하였다.
본 발명자들은 생체내에서도 상기와 같은 FGF에 의해 Runx2가 발현되는지 확인하기 위하여 FGF2가 배어든 헤파린 아크릴 비드를 사용하여 생체외(ex vivo)에서 인 시츄(in situ) 혼성화 방법으로 확인한 결과 FGF2 비드를 처리하면 조직부피가 늘어나고 봉합이 가속화되었고, FGF2 비드 주위에 Runx2가 특이적으로 발현되는 것을 관찰하였다(도 2참조). Runx2는 Pebp2αA1과 Osf2(Til-1)의 2가지 이소형태가 있는 것으로 알려져 있다(Park et al.,J. Bone Mineral Res., 2001, 16, 885-892). FGF2 자극에 의해 어떠한 이소형태가 유도되는지 확인하기 위하여 이소형태 특이적인 프로브를 사용하여 인 시츄(in situ) 혼성화를 수행한 결과, FGF2가 배어든 비드의 주위에 두가지 이소형태가 모두 발현되는 것으로 나타났고(도 2참조) 이는 FGF2 신호전달이 Pebp2αA 및 Osf2의 발현을 모두 유도하는 것을 알 수 있다.
본 발명의 p6xOSE2-Luc 벡터로 형질전환된 형질전환 세포주가 세포내에서의 Runx2 유전자의 발현을 잘 반영하는지 확인하기 위하여, 먼저 C2C12, MC3T3-E1 및 ROS 17/2.8 세포를 p6xOSE2-Luc 벡터로 임시 형질전환(transient transfection)시킨 형질전환 세포주를 제조하였다.
상기의 여러 가지 임시 형질전환 세포주에서 FGF2에 의해 유도되는 Runx2의 발현을 루시퍼라제 활성으로 측정한 결과, C2C12 세포에 임시 형질전환한 경우 가장 큰 루시퍼라제 활성의 차이를 나타내었다(도 3참조). 노던 블롯에서 Runx2의 기본적인 발현정도(basal level)가 가장 높았던 ROS 17/2.8 세포에서는(도 1의A참조) FGF2 처리 이전에 이미 높은 루시퍼라제 활성을 나타내고 있으므로 FGF2 처리에 의한 활성의 증가폭은 크지 않았다.
본 발명의 p6xOSE2-Luc 벡터로 임시 형질전환(transient transfection)시킨 형질전환 세포주에서 FGF2 이외의 다른 사이토카인이 6xOSE2 프로모터 활성에 미치는 영향을 측정해보면, 상기에서 가장 큰 루시퍼라제 활성의 차이를 보였던 형질전환된 C2C12 세포에서 Runx2의 발현을 증가시킨다고 보고된 TGF-β1과 BMP-2를 처리한 후 루시퍼라제 활성을 측정한 (Lee et al.,J. Cell Biochem.,73, 114-125, 1999; Lee et al.,Mol. Cell. Biol.,20(3), 8783-8792, 2000) 결과, FGF를 처리한 세포에서는 루시퍼라제 활성이 증가되었으나 TGF-β1과 BMP-2를 처리한 세포에서는 FGF를 처리하지 않은 대조구에 비해 루시퍼라제 활성이 감소되었다(도 4참조). 이는 FGF2가 Runx2의 발현을 증가시키는 신호전달 체계는 TGF-β또는 BMP 계열 사이토카인이 Smad 등을 경유해 Runx2의 발현을 증가시키는 신호전달 체계와는 서로 다름을 알 수 있고 본 발명의 형질전환 세포주를 이용하여 Runx2를 발현시키는 신호전달 체계와 TGF-β또는 BMP 계열 신호전달 체계를 구분할 수 있다.
본 발명의 발현벡터가 Runx2에 의해 루시퍼라제가 발현되는지 알아보기 위하여, FGF2 신호전달을 활성화시키는 FGF2 수용체 돌연변이체를 항상 발현하는 FR2Y340H 또는 FR2C342Y 플라스미드를 세포내 Runx2를 발현하는 세포 또는 Runx2를 발현하지 못하는 세포에 본 발명의 p6XOSE2 벡터와 동시에 형질전환시켜 루시퍼라제 활성을 측정한 결과, 세포내 Runx2 유전자가 발현되는 세포주에서 FGF2 신호전달을 항상 활성화시키는 FGF2 수용체 돌연변이체를 항상 발현하는 FR2Y340H 또는 FR2C342Y 플라스미드를 본 발명의 p6XOSE2 벡터와 동시에 형질전환시킨 형질전환 세포주에서는 FGF2를 처리하지 않아도 루시퍼라제 활성이 2-3배 증가하였으나, 세포내 Runx2를 발현하지 못하는 Runx2(-/-) 세포에서는 FGF2 신호전달은 활성화되었으나 루시퍼라제 활성은 증가하지 못했다(도 6참조). 상기의 결과로부터, 본 발명의 발현벡터는 FGF 신호전달이 Runx2를 통해 발현벡터의 루시퍼라제 활성을 증가시키는 것을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 형질전환 세포주에서 서로 다른 농도의 FGF2가 Runx2의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 형질전환된 C2C12 세포에 여러 농도의 FGF2를 처리한 후 루시퍼라제의 활성을 측정한 결과, 가해진 FGF2의 농도에 비례하여 루시퍼라제의 활성이 증가하였다(도 5참조). 상기 결과는 노던 블롯에서 나타났던 Runx2의 발현 증가(도 1의B참조)가 FGF2의 농도에 의존한다는 사실을 다시 한번 확인하였으며 이로부터 6xOSE2의 활성이 Runx2의 발현을 잘 반영한다는 것을 알 수 있다.
상기의 결과로부터, p6xOSE2-Luc 벡터가 임시 형질전환된 세포의 루시퍼라제 활성은 Runx2의 발현을 그대로 잘 반영하며 C2C12 세포에서 그 변화가 가장 뚜렷하게 나타난다는 사실을 확인하였다. 이는 p6xOSE2-Luc 벡터가 C2C12 세포에 안정하게 형질전환된(stable transfection) 형질전환세포주가 Runx2의 발현을 평가할 수 있는 가장 민감한 척도가 되고, 따라서 상기 p6xOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환(stable transfection)된 형질전환 세포주를 제조하였다.
본 발명자들은 Runx2의 발현을 조절하여 조골세포의 분화를 촉진하고 골형성을 증가시키는 물질을 대량으로 검색할 수 있는, p6xOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 형질전환 세포주를 제조하기 위하여, C2C12 세포에 네오마이신 저항 유전자(neomycin resistant gene)를 포함하는 pcDNA3.0 벡터(Invitrogen, USA)와 p6xOSE2-Luc 리포터 벡터를 동시에 형질전환(cotransfection)시킨 형질전환 세포주를 제조하였다.
본 발명자들은 p6xOSE2-Luc 벡터와 선별마커로 네오마이신 저항(resistant) 유전자를 포함하는 벡터로 모두 형질전환된 본 발명의 형질전환 세포주를 선별하기 위한 바람직한 실시예로서 형질전환 세포주를 G418이 첨가된 배지에서 배양한 결과본 발명의 p6xOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 클론을 분리하여 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 1월 10일자로 기탁하였다(KCTC 0929BP).
서로 다른 세포 농도의 형질전환 세포주에서 FGF2가 루시퍼라제 활성에 미치는 영향을 확인한 결과, 세포의 밀도가 높아질수록 FGF2에 의한 루시퍼라제 활성의 증가 배수는 감소하였다(도 9,도 10의A및도 11의A참조). 세포수의 증가에 의한 오차를 보정해주기 위하여 전체 세포 단백질당 루시퍼라제 활성으로 보정해 준 경우에도 상기 경향을 그대로 나타내었다(도 10의B및도 11의B참조).
또한, 형질전환 세포주에서 서로 다른 농도의 FGF2가 루시퍼라제 활성에 미치는 영향을 확인한 결과, 세 종류의 세포 클론 모두에서 1 ng/㎖ 농도의 FGF2에 의해서는 거의 변화를 보이지 않았으나 10 ng/㎖ 이상의 FGF2를 첨가한 경우에는 강력한 루시퍼라제 활성 증가가 관찰되어 노던 블롯에서 나타난 결과(도 1의B참조)와는 약간의 차이를 보였다(도 12참조). 그러나 낮은 농도의 FGF2는 세포의 증식을 촉진하고 높은 농도의 FGF2는 조골세포의 분화를 촉진한다는 이전의 연구 보고에 미루어볼 때, 1 ng/㎖과 10 ng/㎖ 사이의 농도에서 그러한 변화가 일어날 것으로 추측할 수 있다(Iseki S.et al.,Development,124, 3375-3384, 1997).
아울러, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 이용한 골형성촉진제의 검색방법을 제공한다.
본 발명자들은 상기 형질전환 세포주를 이용하여 다양한 화학물질 및 천연물질에 의해 유도되는 Runx2 유전자의 발현을 정량적으로 측정하여 조골세포의 분화를 촉진하고 골형성을 증가시키는 물질을 대량으로 검색하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 p6xOSE2-Luc 및 pcDNA3.0 벡터가 안정적으로 형질전환된 본 발명의 형질전환 세포주에서 p6xOSE2-Luc 프로모터 활성이 Runx2의 발현과 직결되는지 확인하기 위하여, 본 발명의 형질전환 세포주에 FGF2를 처리한 후 루시퍼라제 활성과 Runx2 발현을 동시에 측정한 결과, FGF2 및 FGF4를 처리하였을 때 Runx2 mRNA의 발현이 증가하였으며 동일한 세포에서 루시퍼라제의 활성이 증가함을 확인하였다(도 13참조).
상기의 결과로부터, 본 발명의 형질전환 세포주에 투여하였을 때 루시퍼라제 활성을 증가시키는 물질은 Runx2의 발현을 증가시키는 물질이라고 판단할 수 있으며, 이러한 물질은 골형성 촉진인자의 발현을 증가시키고 그 결과로 조골세포의 분화를 촉진시키므로, 본 발명의 발현벡터 및 발현벡터가 안정적으로 형질전환된 세포주는 골형성을 촉진하는 물질의 검색에 유용하게 사용될 수 있다.
기존의 보고에서 FGF/FGFR 신호는 MAP 키나제(mitogen-activated protein kinases)를 활성화하고 MAP 키나제는 Erk1/2 MAPKs, p38MAPks 및 p54/p46 c-Jun NH2 말단 키나제(JNKs)로 구성되어 있다(Klint and claesson-Welsh,front Biosci., 1999, 4, 165-177; Robinson and cobb,Curr. Opin. Cell Bio., 1997, 9, 180-186; Shaeffer and Weber,Mol. Cell. Biol., 19, 2435-2444). 따라서 FGF2 신호전달에 의해 어떤 MAPK 신호전달이 Runx2 발현 및 Runx2 활성의 유도에 관여하는지 알아보기 위하여, 본 발명의 6xOSE2-Luc가 안정적으로 형질전환된 세포주에 FGF2로 처리하고 각각의 MAP 키나제를 신호전달 특이적 저해제로 방해하였다. Erk1/2 특이 저해제로는 PD98059를 사용하였고, p38 MAPK 신호전달은 SB203580에 의해 저해하였다. JNK 신호전달의 합성 저해제가 없기 때문에 DN-MEKK-1(dominant negative MEKK-1)을 JNK 신호전달의 저해제로 사용하였다(Brown et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 8797-805).
그 결과, Erk1/2 특이 저해제인 PD98059는 본 발명의 형질전환 세포주에서 FGF2 유도 6xOSE2-Luc 리포터 활성을 완전히 억제하였으나 FGF2에 의해 자극된 Runx2 발현에는 영향을 주지 않았고(도 14의A참조) SB203580에 의해 저해되는 p38 MAPK 신호전달도 Erk1/2와 비슷하게 FGF2에 의해 자극된 Runx2 발현에는 영향을 주지 않지만 약 60% 정도의 리포터 활성을 감소시킨다(도 14의B참조). 그러나 JNK 신호전달에서 DN-MEKK-1의 형질전환은 FGF2에 의한 Runx2 발현의 증가에는 영향을 주지 않고 6xOSE2-Luc 리포터 활성도 저해하지 않았다(도 14의C참조).
상기의 결과로부터, MAP 키나제 신호전달 중에서 Erk1/2 또는 p38 MAPK은 FGF2 유도 Runx2 단백질의 전사활성을 증가시키나 Runx2 mRNA의 발현을 조절하지는 않는다는 것을 알 수 있다.
FGF2 유도 Runx2 mRNA의 발현에는 MAP 키나제 신호전달 이외의 다른 신호전달이 매개하는 것으로 추측하고, PKC가 FGF/FGFR 신호에 의해 활성화되기 때문에(Klint and Claesson-Welsh,Front Biosci., 1999, 4, 165-177) FGF2에 의해자극되는 Runx2의 전사에서 PKC 신호전달이 관여하는지 알아보기 위해 본 발명의 형질전환 세포주와 PKC 활성의 저해제인 칼포스틴 C(calphostin C)를 사용하여 Runx2 mRNA 발현에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과, FGF2 유도의 Runx2 mRNA의 증가는 칼포스틴 C에 의한 PKC 활성의 약학적 저해(down modulation)에 의해 Runx2 mRNA 발현이 증가하지 않고(도 15의A참조) FGF2 매개 6xOSE2-Luc 리포터 활성의 자극은 거의 없어진다(도 15의B참조).
본 발명의 형질전환 세포주를 이용하여 FGF 유도에 의한 루시퍼라제 활성의 증가가 단지 Runx2 mRNA의 발현에 의한 것인지 또는 PKC에 의해 매개된 Runx2 단백질의 전사 활성이 추가로 관여된 것인지 알아본 결과, 본 발명의 6xOSE2-Luc 벡터가 형질전환된 형질전환 세포주로부터 FGF 유도 Runx2 mRNA의 발현은 주로 PKC 신호전달에 의해 매개되고, Runx2 단백질의 전사활성은 PKC 또는 MAP 키나제 신호전달 중에서 Erk1/2 또는 p38 MAPK에 의해 매개되어 진다는 것을 알 수 있었다(도 16참조).
따라서 본 발명의 6xOSE2-Luc 벡터가 형질전환된 형질전환 세포주는 FGF2 신호전달과정 중 Runx2의 발현을 증가시키거나 Runx2 단백질을 활성화시킬 수 있는 신호전달 경로의 검색에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<참고예 1> FGF에 의해 유도되는 Runx2 발현 측정
<1-1> 세포주에서 FGF2에 의해 유도되는 Runx2 발현 측정
본 발명자들은 조골세포 분화에 필수적인 Runx2의 발현이 여러가지 전사인자를 처리한 세포주에서 증가하는지 확인하기 위하여, 먼저 세포주에 FGF2를 처리한 후 Runx2 mRNA의 발현을 측정하였다.
MC3T3-E1, ROS17/2.8(Lee M-H.et al.,J. Cell Biochem.,73, 114-125, 1999) 및 C2C12 세포 (ATCC, U.S.A.)를 100 ㎜2당 1.1x106세포로 분주한 후, 각각 10% FBS, 10 mM 베타-글리세로포스페이트(beta-glycerophosphate)및 50 ㎍/㎖ 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함하는 알파-MEM 배지, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지 및 15% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포가 완전히 자란 후 혈청이 첨가되지 않은 배지에 1 ng/㎖ 농도의 FGF2를 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 상기 배양액을 회수하였다.
상기 배양액으로부터 콤크진스키와 사키의 방법(Chomczynski P. and Sacchi N.,Anal Biochem., 162, 156-159, 1987)으로 상기 배양세포들의 전체 RNA를 분리하였다. 구체적으로, PBS 용액으로 한 번 세척한 후 100 mm 세포배양 플레이트에 4 M 구아니디움 티오시아네이트(guanidium thiocyanate)가 포함되어 있는 변성(denaturating) 용액을 1 ㎖ 첨가하였다. 새 튜브에 옮긴 후 변성된 세포용액에 0.1 ㎖의 2 M 아세트산 나트륨(sodium acetate)과 1 ㎖의 페놀, 0.2 ㎖의 클로로포름-이소아밀알콜(chloroform-isoamylalcohol)을 첨가하고 10초간 강하게 볼텍싱(vortexing)하였다. 원심분리 후 상층액을 새 튜브에 옮긴 후 1 ㎖의 이소프로판올(isopropanol)을 넣고 -20℃에서 1시간 이상 보관한 후 4℃에서 30 분간 10,000 g의 원심력으로 원심분리하였다. 원심분리 후 이소프로판올을 제거하고 75 %의 에탄올로 두 번 세척 후 다시 원심분리하였다. 에탄올을 완전히 제거 후 DEPC 처리된 물에 RNA를 녹였고 260 nm의 파장에서 분광 광도계(spectrophotometer)로 RNA를 정량하였다. 10 ㎍의 RNA를 취하여 1% 아가로스(agarose), 55% 포름알데히드(formaldehyde)의 겔상에서 전기영동한 후 모세관 현상을 이용하여 제타-프로브 막(zeta-probe membrane, Bio Rad, USA)으로 전이(transfer)시켰다. 전이된 막은 1x106cpm/㎖의 알파32P가 표지된 Runx2 cDNA를 프로브로 사용하여 노던 블롯(Northern blot)을 수행하였다. 노던 블롯은 익스프레스하이비(ExpressHyb) 혼성화 용액(Clonteck,CA,USA)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 실시하였다. 혼성화 반응 후, 전이된 막을 0.1% SDS, 2X SSC 조성의 Sol I으로 37℃에서 5분씩 3회 세척하였고 0.1% SDS, 0.1X SSC 조성의 Sol Ⅱ로 50℃에서 3회 세척하였다. 상기 전이된 막을 2X SSC로 다시 세척한 후 -70℃에서 X-선 필름(Agfa사)에 감광시켜 방사능사진(autoradiography)을 실시하였다.
그 결과, FGF2를 처리한 모든 세포주에서 Runx2의 발현이 강하게 증가하는 것을 관찰하였다(도 1의A). 조골세포 유래의 ROS 17/2.8 또는 MC3T3-E1 세포는 Runx2 mRNA의 기초 발현정도가 C2C12 세포에 비해 비교적 높았으며, 특히 골육종 세포인 ROS 17/2.8 세포는 Runx2가 강하게 발현되었다. 반면에 근육세포 유래의C2Cl2 세포는 기초 발현정도는 낮았으나 FGF2에 의해 유도되는 Runx2의 증가배수는 상대적으로 높음을 알 수 있었다.
<1-2> 서로 다른 농도의 FGF2에 의해 유도되는 Runx2 발현 측정
MC3T3-E1 세포를 100 ㎜2당 1.1x106세포로 분주한 후, 상기 참고예 <1-1>과 동일한 조성의 알파-MEM 배지에서 배양하였다. 세포가 완전히 자란 후 혈청이 첨가되지 않은 배지에 1 ng/㎖ 농도의 FGF2를 첨가하여 21 시간 동안 배양한 후 FGF2의 양을 달리하여 0, 0.1, 1, 10 및 30 ng/㎖씩 3 시간 동안 처리하였고, 세포의 전체 RNA를 분리한 후 상기 참고예 <1-1>과 동일한 방법으로 노던 블롯을 실시하였다.
그 결과, 가해진 FGF2의 농도에 비례하여 Runx2의 발현이 증가하였으며 FGF2의 농도가 10 ng/㎖ 이상일 경우에는 Runx2의 발현이 큰 차이를 보이지 않았다(도 1의B).
<1-3> 단백질 합성 억제제가 FGF2 처리 세포의 Runx2 발현에 미치는 영향 측정
MC3T3-E1 세포를 100 ㎜2당 1.1x106세포로 분주한 후, 상기 참고예 <1-1>과 동일한 조성의 알파-MEM 배지에서 배양하였다. 세포가 완전히 자란 후 혈청이 첨가되지 않은 배지에 1 ng/㎖ 농도의 FGF2를 첨가하여 21 시간 동안 배양한 후 1ng/㎖ 농도의 FGF2와 10 ㎍/㎖ 농도의 단백질 합성 억제제인 사이클로헥시마이드(cycloheximide)를 첨가하여 3시간 동안 배양하였고, 세포의 전체 RNA를 분리한 후 상기 참고예 <1-1>과 동일한 방법으로 노던 블롯을 실시하였다. 대조군으로는 사이클로헥시마이드를 처리하지 않은 세포를 사용하였다.
그 결과, 사이클로헥시마이드 처리군에서는 FGF2에 의한 Runx2의 발현 증가를 관찰할 수 없었다(도 1의C). FGF2에 의해 발현이 증가하던 Runx2의 발현이 단백질 합성 억제제인 사이클로헥시마이드를 전처리 후 FGF2를 처리했을 때는 Runx2의 발현이 감소된 상기의 실험 결과로부터, FGF2에 의해 유도되는 골형성에 필수적인 전사인자인 Runx2의 발현은 FGF2의 신호전달 체계를 통하여 합성된 새로운 단백질에 의해 간접적으로, 그러나 농도 의존적으로 유도됨을 확인하였다.
<1-4> 세포주에서 FGF4에 의해 유도되는 Runx2 발현 측정
본 발명자들은 FGF4를 처리한 세포주에서도 Runx2의 발현이 증가하는지 확인하기 위하여, FGF2와 FGF4를 각각 처리한 MC3T3-E1 세포주에서의 Runx2 mRNA 발현을 측정하였다.
MC3T3-E1 세포를 100 ㎜2당 1.1x106세포로 분주한 후, 10% FBS, 10 mM 베타-글리세로포스페이트 및 50 ㎍/㎖ 아스코르브산을 포함하는 알파-MEM 배지에서 배양하였다. 세포가 완전히 자란 후 혈청이 첨가되지 않은 배지에 각각 1 ng/㎖ 농도의 FGF2와 FGF4를 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 상기 배양액을 회수하여 참고예 <1-1>에 기재한 방법으로 세포의 전체 RNA를 분리하여 노던 블롯을 실시하였다.
그 결과, FGF2와 마찬가지로 FGF4도 Runx2 mRNA의 발현을 유도함을 확인하였다(도 1의D).
<1-5> 세포주에서 FGF2에 의해 유도되는 Runx2 단백질의 발현 측정
본 발명자들은 FGF2를 처리한 세포주에서 Runx2 단백질의 발현이 증가하는지 확인하기 위하여 Runx2의 C-말단 특이 단일클론 항체를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.
MC3T3-E1 세포를 상기 참고예 <1-1>과 동일한 조성의 알파-MEM 배지에서 배양하고, FGF2를 처리한 것과 처리하지 않은 배양 세포를 PBS로 두 번 세척하고 세포 침전물은 pH 7.9인 10 mM Tris-HCl(10mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF) 400 ㎕을 섞었다. 얼음에서 15분간 방치 후 10% NP-40 25 ㎕를 첨가하여 세포 부유물을 심하게 혼합하여 12,000 g로 30 초 동안 원심분리하였다. 원심분리한 침전물은 pH7.9인 Tris-HCl 버퍼 30 ㎕로 다시 섞은 후 4 ℃에서 20 분간 심하게 흔들었다. 세포 파편은 4 ℃에서 15분 동안 원심분리하여 제거하였고, 전기영동을 위하여 상층액만을 취하여 -70 ℃에 보관하였다. 단백질은 브래드포드 단백질 분석 키트(Bio-Rad)를 사용하여 정량하고 SDS-PAGE로 전기영동한 후 하이본드-P 막(Hybond-P membrane, Amersham Pharmacia Biotech)에 전기적으로 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼가 끝난 후 블럿을 PBS로 상온에서 5분간 세척한 후 블록킹 버퍼(0.1% Tween-20 및 5% nonfat dry milk가 포함된 PBS)로 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 블럿을 PBS로 5분 동안 3번 세척한 후 Runx2 C-말단 특이 단일클론 항체를 블록킹 버퍼에 1:2,000으로 희석하여 첨가한 것에 밤새도록 약하게 흔들며 항온 배양하였다. 블럿을 PBS로 3번 세척한 후 생쥐 항-토끼 항체를 이용하여 상온에서 1시간 동안 방치한 후 PBS로 3번 세척하여 웨스트졸(Westzol, iNtRON, 한국)을 이용하여 밴드를 검출하였다.
그 결과, FGF2를 처리하지 않았을 때보다 FGF2를 처리했을 때 더 많은 Runx2 단백질이 발현되었다(도 1의E).
상기의 결과들로부터, FGF에 의해 농도 의존적으로 Runx2 mRNA 발현이 비례적으로 증가하고 또한 Runx2 단백질의 발현을 유도함을 확인하였다.
<참고예 2> 생체외(ex vivo)에서 FGF2에 의한 Runx2 발현
생체외(ex vivo)에서도 FGF2에 의해 Runx2가 발현되는지 확인하기 위하여 FGF2가 배어든 헤파린 아크릴 비드를 사용하여 인 시츄 혼성화(in situ hybridization) 방법으로 확인하였다.
<2-1> 머리덮개뼈의 배양과 FGF2가 배어든 비드의 처리
본 발명자들은 태생 15.5일(E15.5)된 생쥐로부터 두개골을 피부가 없이 분리해하여 금속 그리드에 의해 지지되는 0.1 ㎛ 구멍 크기의 필터에 올려놓았다. 헤파린-코팅된 아크릴 비드(직경 125-150 ㎛)에 FGF2 또는 대조군으로 BSA 25 ng/㎕를 37℃에서 30분간 배어들게 하여 FGF2가 배어든 비드(FGF-soaked beads)를 제조한 후, 상기 비드를 PBS로 씻어낸 후 모세관 피펫을 이용하여 두개골의 시상 봉합의 골형성 최전방부(osteogenic front, OF)에 이식하였다. 상기 체외 배양체(explant)를 37℃의 5% CO2가 있는 습한 곳에서 48시간동안 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM에서 배양하였다.
그 결과, FGF2가 배어든 비드는 BSA가 배어든 비드로 처리한 대조군에 비해 처리 48시간 후에 조직 부피가 늘어나고 봉합이 가속화되었다(도 2의A).
<2-2> 인 시츄 혼성화(in situ hybridization)
본 발명자들은 인 시츄 혼성화를 수행하기 위하여 디옥시제닌-UTP 표지된 센스 및 앤티센스 Runx2의 리보프로브를 사용하였다.
상기 참고예 <2-1>에서 고정한 배양 조직을 단백질 분해효소 K로 처리하고 4% PFA와 0.2% 글루타르알데히드가 첨가된 PBS로 다시 고정하고 55℃에서 리보프르브로 밤새도록 혼성화하였다. 조직을 50% 포름아마이드가 포함된 2x SSC 용액으로 잘 세척한 후 디옥시제닌 RNA 레벨링 키트(Boeringermannheim, 독일)를 사용하여 발색반응을 실시하였다. 발색이 끝나면 조직을 다시 고정하였으며, 사진을 찍기 전에 50% 글리세롤에 보관하였다.
그 결과, FGF2 비드로 처리한 체외 배양체의 경우에는 FGF2 비드 근처에서 Runx2가 특이적으로 발현되었다(도 2의B).
<2-3> Runx2 이소형태(isoform)의 발현
Runx2는 Pebp2αA1과 Osf2(Til-1)의 2가지 이소형태가 있는 것으로 알려져 있다(Park et al.,J. Bone Mineral Res., 2001, 16, 885-892). 본 발명자들은 FGF2 자극에 의해 어떠한 이소형태가 유도되는지 확인하기 위하여 하기와 같이 3가지 프로브를 사용하였다. 두 가지 이소형태에 공통적인 부위를 포함하는 cDNA 프로브(pRunx2), Pebp2αA 특이 프로브(pPebp2αA) 또는 Osf2 특이 프로브(pOsf2)를 사용하여 상기 참고예 <2-2>와 동일한 방법으로 인 시츄 혼성화를 수행하였다(Park et al., Journal of Bone and Mineral Research, 2001, 16:885-892).
그 결과, FGF2가 배어든 비드의 주위에 두가지 이소형태가 모두 발현되는 것으로 나타났으며(도 2의B), 상기 결과로부터 FGF2 신호전달은 Pebp2αA 및 Osf2의 발현을 모두 유도함을 확인하였다.
<실시예 1> 발현벡터 p6xOSE2-Luc의 제조
<1-1> 6xOSE2 올리고머(oligomer)의 제조
본 발명자들은 조골세포 표지인자 중 Runx2의 표적이 되는 염기서열을 포함하는 올리고머를 제조하기 위하여, 마우스, 래트 및 인간의 오스테오칼신 유전자, 마우스 콜라게나아제 3 유전자 및 마우스 오스테오폰틴 유전자의 프로모터 부위에서 공통적으로 나타나는 염기서열을 조사하였다.
그 결과, 본 발명자들은 PuACCPuCA로 기재되는 일치 염기서열을 포함하는서열번호 1로 기재되는 OSE2 염기서열이 상기 조골세포 표지인자들의 프로모터에 공통적으로 발현됨을 확인하였고, 상기 OSE2 염기서열이 6개 반복되는서열번호 2로 기재되는 6xOSE2 올리고머를 제조하였다. 구체적으로, OSE2가 포함되어 있는 염기서열의 올리고머와 이에 상보적인 염기서열을 가진 올리고머를 Bioneer Co. (Korea)에 의뢰하여 제조하였다. 상기 두 단일가닥 올리고머를 동일한 양으로 교잡반응(hybridization)시키고, 반응 용액에 접합효소(ligase)를 처리하여 접합(ligation)시킨 후 겔 상에서 전기영동하였다. 크기 표시자(molecular size marker)와 비교하고 가장 크기가 작은 단량체(monomer)로부터 6번째 위치에 있는 육량체인 6xOSE2 DNA 띠를 겔에서 잘라내어 약 168 bp의 본 발명의서열번호 2로 기재되는 6xOSE2 올리고머 DNA를 용출 키트(Promega사)로 분리 정제하였다.
<1-2> 6xOSE2-Luc 리포터 벡터(reporter vector)의 제조
본 발명자들은 상기에서 제조한 6xOSE2 올리고머를 포함하는 발현벡터를 제조하기 위하여, 먼저 리포터 유전자로 루시퍼라제를 포함하는 pGL3 프로모터 벡터(Promega사)를 XmaI 제한효소로 처리하여 절단하였고 절단된 DNA 단편에 이미분리정제해 둔 6xOSE2 올리고머를 접합시켰다. 클론된 벡터의 염기서열을 분석하여 정확한 방향과 루시퍼라제 활성을 나타내는 벡터를 제조하였다.
그 결과, pGL3 프로모터 벡터에 본 발명의 6xOSE 올리고머 단편이 올바르게 삽입되었음을 확인하였고, 이를 "p6xOSE2-Luc" 벡터라 명명하였다.
<실시예 2> p6xOSE2-Luc 벡터로 임시 형질전환시킨 형질전환 세포주의 제조
본 발명자들은 상기 p6xOSE2-Luc 벡터가 세포내에서의 Runx2 유전자의 발현을 잘 반영하는지 확인하기 위하여, p6xOSE2-Luc 벡터로 임시 형질전환된 형질전환 세포주를 제조하였다.
먼저, 6웰 플레이트에 C2C12, MC3T3-E1, C3H10T1/2, Runx2(-/-) 및 ROS 17/2.8 세포를 1x105세포/웰 농도로 접종한 후 24시간 동안 5% CO2배양기에서 배양하였다. 0.5 ㎍의 p6xOSE2-Luc 리포터 벡터와 3 ㎕의 PLUS 시약 (Gibco BRL. CA, U.S.A.) 및 100 ㎕의 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지를 혼합하여 15 분간 상온에서 반응시킨 후, 3 ㎕의 리포펙타민(Gibco BRL. CA, U.S.A.)과 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지의 혼합액과 혼합하여 p6xOSE-Luc:리포펙타민 복합체를 제조하였다. 상기 배양한 C2C12, MC3T3-E1, C3H10T1/2, Runx2(-/-) 및 ROS17/2.8 세포에 각 웰당 800 ㎕의 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지와 207 ㎕의 p6xOSE-Luc:리포펙타민 복합체를 첨가하여 5% CO2배양기에서 3 시간 동안 배양함으로써 본 발명의 p6xOSE-Luc 벡터가 임시 형질전환된 형질전환 세포주를 제조하였다.
<2-1> 형질전환 세포주에서 FGF2에 의해 유도되는 루시퍼라제 활성 측정
본 발명자들은 FGF/FGFR 신호 전달이 Runx2-매개 전사활성을 촉진시키는지 알아보기 위하여, 상기에서 제조한 임시 형질전환된 세포에 각각 10.0 ng/㎖ 농도의 FGF2를 처리하여 5% CO2배양기에서 24시간 배양한 후 루시퍼라제 분석 킷트(Promega 사)를 사용하여 루시퍼라제의 활성을 측정하였다.
그 결과, 세포내 Runx2가 발현되지 않는 Runx2(-/-) 세포에서는 루시퍼라제 활성의 차이가 나타나지 않았고, C2C12 세포에 임시 형질전환한 경우 가장 큰 루시퍼라제 활성의 차이를 나타내었다(도 3). 노던 블롯에서 Runx2의 기본적인 발현정도(basal level)가 가장 높았던 ROS 17/2.8 세포에서는(도 1의A참조) FGF2 처리 이전에 이미 높은 루시퍼라제 활성을 나타내고 있으므로 FGF2 처리에 의한 활성의 증가폭은 크지 않았다.
<2-2> 형질전환된 세포의 루시퍼라제 활성에 사이토카인이 미치는 영향 측정
본 발명자들은 Runx2의 발현을 증가시킨다고 알려진 다른 사이토카인이 형질전환된 세포의 6xOSE2 프로모터 활성에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 상기 참고예 <2-1>에서 가장 큰 루시퍼라제 활성의 차이를 보였던 형질전환된 C2C12 세포에 Runx2의 발현을 증가시킨다고 보고된 TGF-β1과 BMP-2를 처리한 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다(Lee et al.,J. Cell Biochem.,73, 114-125, 1999; Lee et al.,Mol. Cell. Biol.,20(3), 8783-8792, 2000).
먼저, 각각 2 ng/㎖, 300 ng/㎖ 및 5 ng/㎖ 농도의 FGF2, BMP-2 및 TGF-β1을 상기 형질 전환된 C2C12 세포에 2 ㎖씩 첨가하여 24시간 배양한 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
그 결과, FGF2를 처리한 세포에서는 루시퍼라제 활성이 증가되었으나, TGF-β1과 BMP-2를 처리한 세포에서는 대조군에 비해 루시퍼라제 활성이 감소되었다(도 4). 상기 결과로부터 FGF2가 Runx2의 발현을 증가시키는 신호전달 체계는 TGF-β또는 BMP 계열 사이토카인이 Smad 등을 경유해 Runx2의 발현을 증가시키는 신호전달 체계와는 서로 다름을 알 수 있었다.
<2-3> 서로 다른 농도의 FGF2에 의해 유도되는 루시퍼라제 활성 측정
본 발명자들은 형질전환 세포주에서 서로 다른 농도의 FGF2가 Runx2의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 형질전환된 2×105세포/웰 농도의 C2C12 세포에 각각 0, 0.1, 1, 10, 30 및 50 ng/㎖의 FGF2를 처리하여 5% CO2배양기에서 24시간 배양한 후 루시퍼라제 분석 킷트를 사용하여 루시퍼라제의 활성을 측정하였다.
그 결과, 가해진 FGF2의 농도에 비례하여 루시퍼라제의 활성이 증가하였다(도 5). 상기 결과로부터 참고예 <1-2>의 노던 블롯에서 나타났던 Runx2의 발현 증가가 FGF2의 농도에 의존한다는 사실을 다시 한번 확인하였다.
<2-4> Runx2에 의한 루시퍼라제 활성 증가 측정
본 발명자들은 본 발명의 형질전환 세포주에서 Runx2에 의해 루시퍼라제가 발현되는지 알아보기 위하여, 세포내에서 Runx2를 발현하는 세포 또는 Runx2를 발현하지 못하는 세포에 FGF2 신호전달을 활성화시키는 FGFR2 돌연변이체를 항상 발현하는 FR2Y340H 또는 FR2C342Y 플라스미드를 본 발명의 p6XOSE2 벡터와 동시에 형질전환시켜 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
먼저, 6웰 플레이트에 Runx2(-/-), MC3T3-E1, C3H10T1/2 및 C2C12 세포를 1x105세포/웰 농도로 접종한 후 24시간 동안 5% CO2배양기에서 배양하였다. 0.5 ㎍의 p6xOSE2-Luc 벡터, 0.5 ㎍의 pFR2Y340H 벡터, 3 ㎕의 PLUS 시약 및 100 ㎕의 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지를 혼합하여 15분간 상온에서 반응시켰다. 3 ㎕의 리포펙타민과 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지의 혼합액을 제조한 후 상기에서 제조한 p6xOSE2-Luc 및 pFR2Y340H 벡터 또는 p6xOSE2-Luc 및 pFR2C342Y 벡터의 혼합액과 혼합하여 p6xOSE-Luc:pFR2Y340H:리포펙타민 또는 p6xOSE-Luc:pFR2C342Y:리포펙타민 복합체를 제조하였다. 상기 배양한 Runx2(-/-), MC3T3-E1, C3H10T1/2 및 C2C12 세포에 각 웰당 800 ㎕의 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지와 207 ㎕의 p6xOSE-Luc:pFR2Y340H:리포펙타민 복합체 또는 p6xOSE-Luc:pFR2C342Y:리포펙타민복합체를 첨가하여 5% CO2배양기에서 3시간 동안 배양함으로써 본 발명의 p6xOSE-Luc 벡터와 pFR2Y340H 또는 pFR2C342Y 벡터가 동시에 임시 형질전환된 형질전환 세포주를 제조하였다. 대조군으로는 pFR2Y340H 벡터 대신에 pcDNA3.1 벡터를 첨가한 것을 사용하였다.
그 결과, 세포내 Runx2 유전자가 발현되는 세포주에서 FGF2를 처리하지 않아도 루시퍼라제 활성이 2-3배 증가하였으나, 세포내에서 Runx2를 발현하지 못하는 Runx2(-/-) 세포에서는 FGF2 신호전달은 활성화되었으나 루시퍼라제 활성은 증가하지 못했다(도 6). 상기의 결과로부터, FGF 신호전달이 Runx2를 통해 발현벡터의 루시퍼라제 활성을 증가시키는 것을 알 수 있고, 이로부터 6xOSE2의 활성이 Runx2의 발현을 잘 반영한다는 사실을 확인하였다.
<실시예 3> FGF에 의한 RUNX2의 전사활성 증가
본 발명자들은 FGF에 의한 Runx2의 전사활성 증가로 인한 루시퍼라제 활성이 Runx2 mRNA 발현의 증가에 의한 것인지 또는 Runx2 단백질의 전사 활성 기능 증가에 의한 것인지를 확인해 보았다.
이를 위해 세포내에서 Runx2를 발현하지 않는 Runx2(-/-) 세포에 Runx2의 2가지 이소형태를 발현하는 플라스미드를 형질전환시켰다. 구체적으로, Runx2(-/-) 세포에 p6XOSE2-Luc 벡터와 Runx2-pebp2αA 발현벡터 또는 Runx2-osf2 발현벡터를 함께 형질전환하여(충북의대 배석철 박사로부터 받음) 10.0 ng/㎖ 농도의 FGF2를처리하여 5% CO2배양기에서 24시간 배양한 후 루시퍼라제 분석 킷트(Promega 사)를 사용하여 루시퍼라제의 활성을 측정하였다.
그 결과, Runx2의 이소형태들의 발현에 의해 Runx2(-/-) 세포에서 루시퍼라제 활성이 증가하였다(도 7). 전사 활성은 Runx2-pebp2αA보다 Runx2-osf2를 형질전환 했을 때 더욱 컸다. 상기에서 처럼 p6XOSE2-Luc 벡터와 Runx2-pebp2αA 발현벡터 또는 Runx2-osf2 발현벡터 2개로 동시에 형질전환한 세포는 FGF2를 처리하였을 때 루시퍼라제 활성의 증가를 유도하였다(도 7의A). 또한 Runx2(-/-) 세포에 p6XOSE2-Luc 리포터 벡터, Runx2 발현벡터 중 하나 및 항시 활성 돌연변이체인 FGFR2 발현벡터(FG2Y340H 또는 FR2C342Y) 3개를 동시에 형질전환했을 때도 p6XOSE2-Luc 활성은 증가하였다(도 7의B). 상기의 결과로부터, FGF/FGFR 신호전달은 Runx2 mRNA 발현을 촉진할 뿐만 아니라 세포내 Runx2 단백질의 전사 활성을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 4> p6xOSE2-Luc 벡터가 안정하게 형질전환된 세포주의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 2에서, p6xOSE2-Luc 벡터가 임시 형질전환된 세포의 루시퍼라제 활성은 Runx2의 발현을 그대로 잘 반영하며 C2C12 세포에서 그 변화가 가장 뚜렷하게 나타난다는 사실을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 p6xOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된(stable transfection) C2C12 세포가 Runx2의 발현을 평가할 수 있는 가장 민감한 척도가 될 수 있다고 판단하여 상기p6xOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 형질전환 세포주를 제조하였다.
본 발명자들은 Runx2의 발현을 조절하여 조골세포의 분화를 촉진하고 골형성을 증가시키는 물질을 대량으로 검색할 수 있는, p6xOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 형질전환 세포주를 제조하기 위하여, C2C12 세포에 네오마이신 저항 유전자(neomycin resistant gene)를 포함하는 pcDNA3.0 벡터(Invitrogen, USA)와 p6xOSE2-Luc 리포터 벡터를 동시에 형질전환(cotransfection)시킨 형질전환 세포주를 제조하였다.
먼저, 100 ㎜ 세포배양 플레이트에 C2C12 세포를 2x105세포/㎠ 농도로 접종한 후 24 시간 동안 5% CO2배양기에서 배양하였다. 10 ㎍의 p6xOSE2-Luc 리포터 벡터, 2 ㎍의 pcDNA3.0, 15 ㎕의 PLUS 시약 및 750 ㎕의 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지를 혼합하여 15 분간 상온에서 반응시켰다. 20 ㎕의 리포펙타민과 혈청이 첨가되지 않은 750 ㎕의 DMEM 배지 혼합액을 제조한 후 상기에서 제조한 p6xOSE2-Luc 리포터 벡터와 pcDNA3.0 벡터의 혼합액과 혼합하여 p6xOSE-Luc:리포펙타민 복합체를 제조하였다. 상기 배양한 C2C12 세포의 플레이트에 5 ㎖의 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지와 1,535 ㎕의 p6xOSE-Luc:리포펙타민 복합체를 첨가하여 5% CO2배양기에서 3 시간 동안 배양한 후, 30% FBS가 포함되어 있는 DMEM 배지 6.5 ㎖을 플레이트에 첨가하여 5% CO2배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 세포 배양액을 제거하고 트립신을 처리하여 세포를 떨어뜨린 후 새로운 100 ㎜ 세포배양 플레이트에 1:1000, 1:5000 및 1:10000의 비율로 혈청이 15% 첨가된 DMEM 배지에 희석하여 접종하고 5% CO2배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 세포 배양액을 제거한 후 2 ㎎/㎖ 농도의 G418(neomycin)과 15% FBS가 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 5% CO2배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. G418이 포함된 세포 배양액을 제거한 후 새로운 G418이 첨가된 세포 배양액을 첨가하여 세포를 배양하였다. PBS 용액으로 상기 세포를 세척한 후 분리 링(separation ring)을 사용하여 클론들을 분리하였으며, 12-웰 플레이트의 각 웰당 하나의 클론이 들어가도록 분주하였다. 각 웰에 G418이 첨가되지 않은 세포 배양액 1 ㎖을 넣은 후 5% CO2배양기에서 24 시간 동안 배양하였다.
정상 C2C12 세포는 2 ㎎/㎖ 농도의 G418 존재하에서 100% 죽지만 G418을 분해하는 유전자를 가진 pcDNA3.0으로 형질전환된 세포는 살아남을 수 있으므로, 본 발명자들은 2.5 ㎎/㎖ 농도의 G418과 15% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 계속적으로 사용하여 세포를 배양함으로써 본 발명의 p6xOSE2-Luc 리포터 벡터와 pcDNA3.0 벡터로 동시에 형질전환된 세포를 선별하고자 하였다. G418이 첨가되지 않은 세포 배양액을 제거한 후 2.5 ㎎/㎖ 농도의 G418과 15% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 세포에 가한 후 5% CO2배양기에서 클론이 생길 때까지 배양하였다. 상기 12-웰 플레이트에서 분리된 각각의 클론들을 6-웰 플레이트로 전달(passage)하였고, 상기 6-웰 플레이트에서 분리된 각각의 클론들을 다시 100 ㎜ 세포배양 플레이트로 전달함으로써 본 발명의 p6xOSE2-Luc 벡터가 안정적으로 형질전환된 약 60 여개의 형질전환 세포 클론을 분리하였다.
<4-1> FGF2에 의해 유도되는 루시퍼라제 활성 측정
본 발명자들은 p6xOSE2-Luc와 pcDNA3.0 벡터로 안정하게 형질전환된 형질전환 세포주에서 FGF2에 의해 유도되는 루시퍼라제의 활성을 측정하기 위하여, 상기 형질전환된 세포 클론을 2x105세포/웰의 농도로 6-웰 플레이트에 접종한 후 24시간 동안 5% CO2배양기에서 배양하였다. 상기 배양세포에 각각 10 ng/㎖ 농도의 FGF2를 처리하여 5% CO2배양기에서 24 시간 배양한 후 루시퍼라제 분석 킷트를 사용하여 루시퍼라제의 활성을 측정하였다(표 1및도 8).
선별된 안정적으로 형질전환된 세포 클론의 6xOSE2 프로모터 활성
클론번호 대조군* 표준편차(±) 실험군** 표준편차(±) 자극 배수 (FGF2/no FGF2)
# 1 167.3 33.3 301.7 31.5 1.8
# 3 2686.3 49.9 110397.3 3535.0 41.1
# 4 3568.7 98.3 10287.7 1311.3 2.9
# 5 8711.3 466.0 134590.3 8044.8 15.5
# 6 3279.7 388.2 10381.3 1182.3 3.2
# 7 62619.3 3279.2 130726.0 4324.7 2.1
# 9 1505.3 98.4 8556.3 1140.3 5.7
#11 217.3 129.5 1394.3 58.6 6.4
#15 466.0 343.0 640.7 412.2 1.4
#19 612.7 33.1 692.0 57.0 1.1
#20 14857.7 798.2 36746.0 2733.3 2.5
#21 56.7 6.8 85.3 8.1 1.5
#22 358.7 17.0 418.3 42.0 1.2
#23 258.3 22.8 1380.7 140.3 5.3
#24 2581.0 258.6 6282.0 259.1 2.4
#25 15466.3 638.5 76351.0 3746.6 4.9
#27 1240.3 42.7 5153.0 282.2 4.2
#28 10129.0 118.0 22273.7 2497.7 2.2
#29 2104.7 52.8 16370.7 629.0 7.8
* : FGF2를 첨가하지 않을 경우의 평균 상대적 루시퍼라제 활성
** : FGF2를 첨가한 경우의 평균 상대적 루시퍼라제 활성
그 결과, 루시퍼라제 활성을 가지는 20 여개의 세포 클론을 선택하였으며, 상기 세포 클론 중에서 FGF2 처리에 의해 루시퍼라제 활성이 강하게 증가하는 세 개의 세포 클론(클론 번호 #3, #5 및 #29)을 선별하여 이후의 실험에 사용하였다(표 1및도 8). #3 클론은 FGF2를 처리할 경우 평균 40 배 정도의 루시퍼라제 활성 증가가 있었고 기초 활성(basal activity)도 비교적 높게 유지되었다. #5 클론은 상대적으로 기초 활성이 가장 높은 편에 속하였으며, FGF2를 처리한 후에는 평균 15 배의 활성 증가를 보였다. 반면에, #29 클론은 기초 활성이 낮았고 FGF2 처리에 의해서 루시퍼라제 활성이 7 내지 8 배정도 증가하였다(표 1).
<4-2> 세포의 농도가 루시퍼라제 활성에 미치는 영향 측정
서로 다른 세포 농도의 형질전환 세포주에서 FGF2가 루시퍼라제 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 각각 0.2×105, 1.0×105및 10×105세포/웰 농도의 #3, #5 및 #29 형질전환 세포 클론에 10.0 ng/㎖의 FGF2를 처리하여 5% CO2배양기에서 24 시간 배양한 후 루시퍼라제 분석 킷트를 사용하여 루시퍼라제의 활성을 측정하였고, 세포수의 증가에 의한 오차를 보정해 주기 위하여 용혈된 세포액의 전체 세포 단백질을 BCA 단백질 측정 키트(Pierce Chemical Co., Rockford, U.S.A.)로측정하여 전체 세포 단백질 당 루시퍼라제 활성을 결정하였다.
그 결과, 세포의 밀도가 높아질수록 FGF2에 의한 루시퍼라제 활성의 증가 배수는 감소하였다(도 9,도 10의A및도 11의A). 그러나, #3 클론에서는 여전히 10 배 이상의 강한 루시퍼라제 활성 증가를 나타내었고(도 9), #5 클론 및 #29 클론의 경우에는 세포가 포화상태(confluent state)를 초과한 경우에는 FGF2에 의한 루시퍼라제 활성의 증가 비율이 급격히 떨어져서 2-3 배 정도에 불과하였다(도 10의A및도 11의A). 세포수의 증가에 의한 오차를 보정해주기 위하여 전체 세포 단백질당 루시퍼라제 활성으로 보정해 준 경우에도 상기 경향을 그대로 나타내었다(도 10의B및도 11의B).
<4-3> 서로 다른 농도의 FGF2에 의해 유도되는 루시퍼라제 활성 측정
형질전환 세포주에서 서로 다른 농도의 FGF2가 루시퍼라제 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 형질전환된 2×105세포/웰 농도의 #3, #5 및 #29 형질전환 세포 클론에 각각 0, 0.1, 1, 10 및 30 ng/㎖의 FGF2를 처리하여 5% CO2배양기에서 24 시간 배양한 후 루시퍼라제 분석 킷트를 사용하여 루시퍼라제의 활성을 측정하였다.
그 결과, 세 종류의 세포 클론 모두에서 1 ng/㎖ 농도의 FGF2에 의해서는 거의 변화를 보이지 않았으나 10 ng/㎖ 이상의 FGF2를 첨가한 경우에는 강력한 루시퍼라제 활성 증가가 관찰되어 노던 블롯에서 나타난 결과(도 1의B참조)와는 약간의 차이를 보였다(도 12). 그러나 낮은 농도의 FGF2는 세포의 증식을 촉진하고 높은 농도의 FGF2는 조골세포의 분화를 촉진한다는 이전의 연구 보고에 미루어볼 때 (Iseki S.et al.,Development,124, 3375-3384, 1997)), 1 ng/㎖과 10 ng/㎖ 사이의 농도에서 그러한 변화가 일어날 것으로 추측할 수 있다.
상기의 결과로부터, 본 발명자들은 #3 세포 클론이 골형성 촉진인자를 검색하기 위한 세포주로서 가장 적합한 것으로 판단하여 상기 세포 클론을 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 1월 10일 자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 0929BP).
<실시예 5> 루시퍼라제 활성과 Runx2 발현과의 상관관계 조사
본 발명자들은 p6xOSE2-Luc 및 pcDNA3.0 벡터가 안정적으로 형질전환된 본 발명의 #3 세포 클론에서 p6xOSE2-Luc 프로모터 활성이 Runx2의 발현과 직결되는지 확인하기 위하여, FGF2를 처리한 #3 세포 클론의 루시퍼라제 활성과 Runx2 발현을 동시에 측정하였다.
먼저, 2.0×105세포/웰 농도의 #3 세포 클론에 10.0 ng/㎖의 FGF2를 처리하여 5% CO2배양기에서 24 시간 배양한 후 루시퍼라제 분석 킷트를 사용하여 루시퍼라제의 활성을 측정하였고, 상기 참고예 <1-1>의 방법으로 노던 블롯을 실시하였다.
그 결과, 본 발명의 #3 세포 클론은 FGF2 및 FGF4를 처리하였을 때 Runx2 mRNA의 발현이 증가하였으며 동일한 세포에서 루시퍼라제의 활성이 증가하였다(도 13).
상기의 결과로부터, 본 발명의 #3 세포 클론에 투여하였을 때 루시퍼라제 활성을 증가시키는 물질은 Runx2의 발현을 증가시키는 물질이라고 판단할 수 있으며, 이러한 물질은 골형성 촉진인자의 발현을 증가시키고 그 결과로 조골세포의 분화를 촉진시킨다고 생각할 수 있으므로, 본 발명의 p6xOSE2-Luc 및 pcDNA3.0 벡터가 안정적으로 형질전환된 #3 세포 클론은 골형성을 촉진하는 물질의 검색에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
<실시예 6> FGF-유도 Runx2의 발현 및 Runx2의 전사 활성에 관여하는 다른 신호 전달
기존의 문헌에서 FGF/FGFR 신호는 MAP 키나제(mitogen-activated protein kinases)를 활성화하고 MAP 키나제는 Erk1/2 MAPKs, p38MAPks 및 p54/p46 c-Jun NH2 말단 키나제(JNKs)로 구성되어 있다(Klint and claesson-Welsh,front Biosci., 1999, 4, 165-177; Robinson and cobb,Curr. Opin. Cell Bio., 1997, 9, 180-186; Shaeffer and Weber,Mol. Cell. Biol., 19, 2435-2444). 따라서 본 발명자들은 FGF2 신호전달에 의해 어떤 MAPK 신호전달이 Runx2 발현 및 RUNX2 활성의 유도에 관여하는지 알아보았다. 이를 위하여, 본 발명의 6xOSE2-Luc 안정 세포인클론 3번을 FGF2로 처리하고 각각의 MAP 키나제를 신호전달 특이적 저해제로 방해하였다. Erk1/2 특이 저해제로는 PD98059를 사용하였고, p38 MAPK 신호전달은 SB203580에 의해 저해하였다. JNK 신호전달의 합성 저해제가 없기 때문에 본 발명자들은 DN-MEKK-1(dominant negative MEKK-1)을 JNK 신호전달의 저해제로 사용하였다(Brown et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 8797-805). C2C12 세포에서 저해제의 적정 농도를 알아보기 위하여 저해제 세포독성(cytotoxicity)을 세포의 호흡이 약해져서 발색이 사라지거나 약해지는 것을 이용하여 세포독성을 관찰하는 방법인 MTT 분석에 의해 테스트하고 (Thykjaer T, Christensen M, Clark AB, Hansen LR, Kunkel TA, Orntoft TF. Functional analysis of the mismatch repair system in bladder cancer.Br J Cancer. 2001 85(4):568-75) 루리퍼라제 활성을 측정하였다. 루시퍼라제 활성은 농도 의존적으로 방해되었다. 본 발명에서 저해해 농도는 세포독성에 영향을 주지 않는 최고 농도로 하였다.
그 결과, Erk1/2 특이 저해제인 PD98059는 본 발명의 형질전환 세포주에서 FGF2 유도 6xOSE2-Luc 리포터 활성을 완전히 억제하였으나 FGF2에 의해 자극된 Runx2 발현에는 영향을 주지 않았다(도 14의A). SB203580에 의해 저해되는 p38 MAPK 신호전달도 Erk1/2와 비슷하게 FGF2에 의해 자극된 Runx2 발현에는 영향을 주지 않지만 약 60% 정도의 리포터 활성을 감소시킨다(도 14의B). 그러나 JNK 신호전달에서 DN-MEKK-1의 형질전환은 기본 Runx2 mRNA 레벨을 증가시키고 FGF2에 의한 Runx2 발현의 증가에는 영향을 주지 않는다. 또한, DN-MEKK-1의 형질전환은6xOSE2-Luc 리포터 활성은 저해하지 않고 이는 노던블럿의 결과와 일치한다(도 14의C).
상기의 결과로부터, MAP 키나제 신호전달 중에서 Erk1/2 또는 p38 MAPK은 FGF2 유도 Runx2 단백질의 전사활성을 증가시키나 Runx2 mRNA의 발현을 조절하지는 않는다.
<실시예 7> PKC를 통한 FGF2 유도 Runx2 발현
본 발명자들은 FGF2 유도 Runx2 mRNA의 발현에는 MAP 키나제 신호전달 이외의 다른 신호전달이 매개하는 것으로 추측하고, PKC가 FGF/FGFR 신호에 의해 활성화되기 때문에(Klint and Claesson-Welsh,Front Biosci., 1999, 4, 165-177) FGF2에 의해 자극되는 Runx2의 전사에서 PKC 신호전달이 관여하는지 알아보았다. 이를 위하여 본 발명자들은 PKC 활성의 저해제인 칼포스틴 C(calphostin C)가 Runx2 mRNA의 발현에 미치는 영향을 측정하였다.
구체적으로, 세포를 FBS가 없는 DMEM 배지에 6시간 동안 배양한 후, PKC 활성 저해제인 칼포스틴 C를 3시간 동안 처리하여 기존의 PKC활성을 모두 차단한 한다. 그후 배지에 FGF2를 0 혹은 10 ng/ml의 농도가 되도록 첨가하여 3시간 동안 더 배양한 후 세포를 회수하여 Runx2 RNA를 노던 블롯 분석으로 정량하거나, 루시퍼라제 활성을 측정하였다
그 결과, FGF2 유도의 Runx2 mRNA의 증가는 칼포스틴 C에 의한 PKC 활성의약학적 저해(down modulation)에 의해 Runx2 mRNA 발현이 증가하지 않고(도 15의A) FGF2 매개 6xOSE2-Luc 리포터 활성의 자극은 거의 없어졌다(도 15의B).
또한, 본 발명자들은 FGF2 유도에 의한 루시퍼라제 활성의 증가가 단지 Runx2 mRNA의 발현에 의한 것인지 또는 PKC에 의해 매개된 Runx2 단백질의 전사 활성이 추가로 관여된 것인지 알아보았다.
상기 실시예 3에서 살펴본 바와 같이 Runx2(-/-) 세포에서 Runx2-osf2의 과발현은 기본 6xOSE2 조절 루시퍼라제 활성을 증가시키고, 이런 세포에 FGF2 처리하면 상기 루시퍼라제 활성을 더욱 증가시켰다(도 7). 그러나, 이와 같은 FGF2에 의해 증가되는 루시퍼라제 활성은 칼포스틴 C의 전처리에 의한 PKC 신호의 방해에 의해 루시퍼라제 활성이 거의 나타나지 않았다(도 15의C). 그러나 Runx2-osf2 발현벡터를 동시에 형질전환 했을 때는 Runx2의 발현에 의해 루시퍼라제 활성이 어느 정도 증가하였다.
상기의 결과로부터, 본 발명의 6xOSE2-Luc 벡터가 형질전환된 형질전환 세포주로부터 FGF2 유도 Runx2 mRNA의 발현은 주로 PKC 신호전달에 의해 매개되고, Runx2 단백질의 전사활성은 PKC 또는 MAP 키나제 신호전달 중에서 Erk1/2 또는 p38 MAPK에 의해 매개되어 진다는 것을 알 수 있었다(도 16).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 형질전환 세포주는 조골세포의 분화를 촉진하는 단백질의 프로모터에 공통적인 염기서열과 리포터 유전자를 융합시켜 제조된 바, 조골세포의 분화를 촉진하는 모든 단백질을 대상으로 하며 조골세포 특이인자에 대한 특이성이 높아 매우 효율적으로 골형성 촉진제를 검색 할 수 있다.
<110> RYOO, Hyun-Mo KIM, Jung-Keun OSCOTEC INC. <120> Transfected cell line which can be used for mass <130> 1p-07-10 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSE2 sequence of mouse osteocalcin promoter <400> 1 caggctgcaa tcaccaacca cagcatcc 28 <210> 2 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6xOSE2 sequence <400> 2 ccgggctgca atcaccaacc acagcatccc gggctgcaat caccaaccac agcatcccgg 60 gctgcaatca ccaaccacag catcccgggc tgcaatcacc aaccacagca tcccgggctg 120 caatcaccaa ccacagcatc ccgggctgca atcaccaacc acagcatc 168

Claims (11)

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  8. p6xOSE2-Luc 발현벡터로 C2C12 세포에 형질전환하여 제조되는 형질전환 세포주(수탁번호 : KCTC 0929BP).
  9. 삭제
  10. 제 8항의 형질전환 세포주에 골형성 촉진제의 후보물질을 처리하고 Runx2의 발현여부를 측정함으로써 골형성 촉진제를 검색하는 방법.
  11. 제 8항의 형질전환 세포주를 이용하여 FGF 신호전달 과정 중 Runx2의 발현을 증가시키거나 Runx2 단백질을 활성화시키는 신호전달 경로를 검색하는 방법.
KR10-2001-0060753A 2001-03-13 2001-09-28 조골세포 특이 전사인자인 Ｒｕｎｘ２의 발현을 대량 검색할 수 있는 형질전환 세포주 및 그의 용도 KR100443950B1 (ko)

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Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Mol Cell Biol. 1995 Apr;15(4):1858-69, Ducy P *
Mol Cell Biol. 2000 Dec;20(23):8783-92, 동일 출원인 논문 *
Mol. Cell. Biol., vol.15(4), pp.1858-1869 (1995.04) *
Mol. Cell. Biol., vol.20(23), pp.8783-8792 (2000.12) *

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