KR100442322B1 - 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로포함하는 비만, 고지혈증 또는 지방간 예방 또는 치료제 - Google Patents

이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로포함하는 비만, 고지혈증 또는 지방간 예방 또는 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이소시트릭산 탈수소화효소(isocitrate dehydrogenase) 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 비만, 고지혈증 또는 지방간 치료제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 옥살로 말릭산(oxalomalic acid), 메틸이소시트릭산(methylisocitric acid) 등을 포함한 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 비만, 고지혈증 또는 지방간 예방 또는 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 예방 또는 치료제는 체중감소 효과, 비만억제 효과, 생체 중성지질 및 콜레스테롤 저하 효과가 우수하며 따라서 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 비만, 고지혈증 또는 지방간 예방 또는 치료제{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of obesity, hyperlipidemia or fatty liver containing inhibitors of isocitrate dehydrogenase activity}
본 발명은 이소시트릭산 탈수소화효소(isocitrate dehydrogenase) 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 비만, 고지혈증 또는 지방간 치료제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 옥살로 말릭산(oxalomalic acid), 메틸이소시트릭산(methylisocitric acid) 등을 포함한 이소시트릭산 탈수소화효소활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 비만, 고지혈증 및 지방간 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
이소시트릭산 탈수소화 효소는 에너지 대사를 위한 TCA(tricarboxilic acid) 회로의 주요 효소로서, 구연산을 산화적으로 탈탄산화시켜 α-케토글루타릭산(α-ketoglutaric acid)과 NADH 또는 NADPH 등을 생산하는 것으로 알려져 있다.
고등동물의 이소시트릭산 탈수소화 효소는 조효소(cofactor)의 종류와 세포 내 존재 위치에 따라, 미토콘드리아 NAD+-특이적 이소시트릭산 탈수소화 효소(이하, 'IDH'로 약칭함), 세포질 NADP+-특이적 이소시트릭산 탈수소화 효소(이하, 'IDPc'로 약칭함) 및 미토콘드리아 NADP+-특이적 이소시트릭산 탈수소화 효소(이하, 'IDPm'으로 약칭함)의 3종류의 동위효소(isozyme)로 나뉜다.
이들 중 IDH는 TCA 회로 내에서 이소시트릭산을 탈탄산화시킴으로써 NADH와 α-키토글루타레이트를 생성하는데, 이들은 전자전달계를 통한 에너지 대사 뿐 아니라, 글루타민산, 글루타민, 아르기닌 및 프롤린 등의 아미노산 생합성 또는 다른 생체 대사물질들을 합성하는 중간대사 산물이므로, 에너지 대사, 단백질 생합성 및 질소 대사를 위한 TCA 회로의 중요한 조절효소로 작용하게 된다.
IDPm 및 IDPc들은 효소활성 면에서 강한 조직특이성을 보여주어 심장조직에서는 NADP+-특이적 이소시트릭산 탈수소화효소의 전체 효소 활성 중 90% 이상이 미토콘드리아에 존재하고 10% 정도가 세포질에 존재하며, 이와 반대로 간조직에서는 3% 만이 미토콘드리아에 존재하고 나머지 97% 정도가 세포질에 존재한다고 알려져 있다(Plaut, G.W.E,Current Topics in Cell Regulation, 2, 1-27, 1983).
이소시트릭산 탈수소화효소의 동위효소들은 그 구조적인 특징만이 일부 밝혀졌을 뿐 기능은 거의 규명되어 있지 않은데, 특히 IDPc와 IDPm의 정확한 작용기작에 대한 연구는 전혀 이루어져 있지 않다.
한편, 고등동물에 있어서 지방의 축적은 하기의 과정에 따라 이루어진다. 즉, 체내에 에너지가 과다하면 백색 지방 조직(white adipose tissue)의 수와 크기가 늘어나는 지방세포의 분화가 촉진되어 지방질의 축적이 증가되게 되고, 이에 따른 백색지방조직에서ob유전자의 발현이 증가되어 체내에 렙틴(leptin) 농도의 증가가 나타나게 되며 이에 의해 뇌의 호르몬 작용을 변화시켜 식욕을 저하시키게 되고, 한편으로는 과다하게 섭취된 칼로리를 UCP(uncoupler protein)들에 의해서 체온으로 발산하는 기작을 거치게 된다. 백색 지방 조직에서는 지방세포 분화의 주요 전사인자(master transcription factor)들로 알려져 있는 PPARγ(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ), C/EBPα 및 ADD1/SREBP1 등의 유전자 발현이 촉진되어 지방세포 분화 및 지방 축적이 증가되며, 체내의 과다한 에너지가 지방의 형태로 저장하게 되므로 체내의 에너지 균형을 조절하게 된다(Hu, E. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 9856-9860; Keller, H. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 20, 9856-9860; Freytag. S.O. et al.,Genes Dev.,1994, 8, 1654-1663; Tontonoz, P. et al.,Mol. Cell. Biol., 1993, 13, 4753-4759; Spiegelman, B.M.,Cell, 1996, 87, 377-389). 지방세포 분화의 주 전사인자인 PPARγ의 활성화에 필요한 생체 내 리간드(ligand)로 작용하는 물질로서는 지방산의 일종인 리놀린산(linoleic acid), 도코사헥사논산(docosahexaenoic acid, DHA)와 아라키돈산(arachidonic acid)등의 다중 불포화 지방산들(Krey, G. et al.,Mol. Endocrinol., 1997, 11, 779-791; Yu et al.,J. Biol. Chem., 1995, 270, 23975-23983)과 함께 프로스타글란딘 J2(prostagladin J2)(Forman B. M. et al.,Cell, 1995, 83, 803-812; Kliewer. S. A. et al.,Cell, 1995, 83, 813-819)가 알려져 있다.
본 발명자들은 이소시트릭산 탈수소화효소의 유전자 발현 및 효소의 증가, 그리고 이로 인한 효소반응 생성물인 NADPH들의 증가가 지방의 축적을 증가시켜 비만과 지방간을 유발하며, 이와 동시에 혈액중의 중성지질(triglyceride) 및 콜레스테롤(cholesterol)의 양도 증가시킴을 확인하였다(대한민국 특허출원 2000-0061962). 이에, 본 발명자들은 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제인 옥살로 말릭산과 메틸이소시트릭산을 지방세포 및 생쥐에 투여하여 체중감소효과 및 비만 억제효과, 생체 중성지질 및 콜레스테롤 저하 효과가 우수함을 확인하고 이소시트릭산 탈수소효소 활성 저해제를 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 체중감소 효과, 비만억제 효과, 생체 중성지질 및 콜레스테롤 저하 효과가 우수한 비만, 고지혈증 또는 지방간 예방 또는 치료제를 제공하는 것이다.
도 1은 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해물질인 옥살로 말릭산과 메틸이소시트릭산을 처리한 지방세포에서의 효소활성 저해도를 나타낸 그래프이고,
◆ : 0.5mM 옥살로 말릭산, ■ : 0.5mM 메틸이소시트릭산,
도 2는 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해물질인 옥살로 말릭산과 메틸이소시트릭산을 처리한 지방세포에서의 지방축적의 억제효과를 나타낸 그래프이고,
도 3의A는 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해물질인 옥살로 말릭산을 투여한 마우스(오른쪽)에서의 뒷목 부위의 지방 축적량을 정상 마우스(왼쪽)와 비교한 결과 사진이고,
도 3의B는 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해물질인 옥살로 말릭산을 투여한 마우스(오른쪽)에서의 복부의 지방 축적량을 정상 마우스(왼쪽)와 비교한 결과 사진이고,
도 3의C는 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해물질인 옥살로 말릭산을 투여한 마우스(오른쪽)에서의 복부의 지방 조직을 떼어 내어 정상 마우스(왼쪽)와 크기를 비교한 결과 사진이고,
도 3의D는 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해물질인 옥살로 말릭산을 투여한 마우스(오른쪽)에서의 피하조직의 지방 축적정도를 정상 마우스(왼쪽)와 비교한 결과 사진이고,
도 4는 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해물질인 옥살로 말릭산을 투여한 마우스에서의 몸무게의 증가를 억제하는 효과를 나타낸 막대 그래프이고,
도 5는 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해물질인 옥살로 말릭산을 투여한 마우스에서의 혈중 중성지질(트리글리세라이드)을 저하하는 효과를 나타낸 막대 그래프이고,
도 6은 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해물질을 투여한 마우스에서의 혈중 콜레스테롤을 저하하는 효과를 나타낸 막대 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 하는 비만, 고지혈증, 또는 지방간의 예방 또는 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 옥살로 말릭산 또는 메틸이소시트릭산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 하는 비만, 고지혈증, 또는 지방간의 예방 또는 치료제를 제공한다.
본 발명자들은 이소시트릭산 탈수소화효소의 이소자임인 IDPc 유전자를 포함한 세포질내 NADPH 생성 이소시트릭산 탈수소화효소 유전자 발현의 증가 및 효소활성의 증가 그리고 NADPH의 증가는 지질 및 콜레스테롤의 생합성에 관여하는 여러 효소 반응들을 촉진하여 주며, 이와 함께 지질성분의 증가를 통한 지질단백질의 합성도 증가시켜 지질단백질과 결합된 형태로 존재하는 생체 콜레스테롤 복합체의 생성량도 증가시킨다는 것을 확인하였다(대한민국 특허출원 2000-0061962).
또한, 본 발명은 옥살로 말릭산 또는 메틸이소시트릭산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제를 제공한다.
옥살로 말릭산은 생체 내에서 TCA 회로의 중간체인 옥살로 아세테이트와 글리옥실레이트 회로의 중간체인 글리옥실레이트의 알돌축합반응에 의해 생성되어 이소시트릭산 탈수소화효소의 활성을 특이적으로 저해하며 메틸이소시트릭산은 기질인 이소시트릭산과 경쟁적으로 이소시트릭산 탈수소화효소를 강력하게 저해한다.
상기의 옥살로 말릭산과 메틸이소시트릭산을 지방세포에 첨가하면 이소시트릭산 탈수소화효소 활성이 각각 30분과 1시간만에 50% 정도 저하된다(도 1). 또한 지방전구세포(preadipocyte)에 처리시 지방세포로의 분화가 억제되며 또한 생성된 지방세포에 지방의 축적량도 억제된다(도 2). 상기의 경우에 옥살로 말릭산과 메틸이소시트릭산의 농도는 0.1 μM∼100 mM의 범위가 적합하고 바람직하게는 10 μM∼5 mM의 범위가 최적이다.
이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제가 비만 억제 및 중성지방과 콜레스테롤 저하에 높은 효과를 보임을 생쥐 실험을 통해 확인하였다. 이는 복부지방의 증가와 체내 지질 축정량을 측정하는 등 하기의 몇 가지 지표의 측정을 통해 확인한다.
본 발명자들은 생쥐에 14주 동안 옥살로 말릭산과 메틸이소시트릭산을 체중 1 kg 당 25 mg 씩 일주일에 3회 복강 주사로 투여하였다. 그 결과 생리식염수를 복강 투여한 대조군 생쥐에 비해 체중이 10% 이상 감소하였다(도 4). 상기의 생쥐를 해부하였을 때 복부 지방조직(epididymal fat pad)의 크기가 매우 작아졌음을 확인할 수 있었으며 지방조직의 중량으로는 약 5배 감소되었다. 또한, 겉피부를 제거한 후 등쪽 모습도 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 처리한 생쥐의 비만조직의 양이 많이 감소하였음을 볼 수 있었다(도 3). 또한 피하조직의 지방축적정도를 탐색하기 위하여 복부피하조직을 횡단면으로 절취한 다음 통상적인 고정절차 및 탈수과정을 거친 후 파라핀으로 조직을 포매하여 관찰하여 보면 복부피하 침윤정도를 대조군과 비교해 보면 이소시트릭산 탈수소효소 저해제가 체중감소와 세포내 지방의 축적량을 감소시키는데 중요한 작용을 하고 있음을 확인할 수 있다(도 3).
본 발명자들은 상기의 옥살로 말릭산과 메틸이소시트릭산 등의 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제가 체내 지질과 콜레스테롤에 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보았다. 상기의 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제인 옥살로 말릭산과 메틸이소시트릭산을 투여한 생쥐의 혈청(serum)을 분리하여 중성지질및 총 콜레스테롤의 양을 측정한 결과 대조군 생쥐에 비하여 각각 50% 와 30% 정도 감소하였다(도 5, 6).
상기한 바와 같이 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제는 체중 감소의 효과와 아울러 체내 지방 축적을 효과적으로 억제하며 콜레스테롤의 생합성을 억제하여 생체 콜레스테롤 복합체의 생성량도 저하시킴을 확인할 수 있다.
본 발명의 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 하는 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제의 유효 투여량은 통상적으로 평균 성인 환자(70㎏)에 대해 1일당 약 7 ㎎ 내지 70 g의 범위이다.
본 발명의 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 하는 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제의 구체적인 투여량은 연령, 체중, 증상, 치료대상이 되는 질병, 투여경로, 치료기간 등에 따라 결정된다. 즉 의사가 각 환자에 대하여 가장 적합한 실질 투여량을 결정할 것이며, 그 환자의 연령, 체중, 증상 및 치료대상이 되는 질병등에 따라 실질 투여량은 달라질 수 있다. 따라서 투여량이 상기 언급된 범위보다 작거나 클 수도 있으며, 이러한 모든 투여량은 본 발명의 범위내에 속한다.
본 발명의 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 하는 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제는 단독으로 투여될 수도 있지만, 일반적으로 목적된 투여경로 및 표준 약학적 관행에 있어서 선택된 약학적 허용가능한 담체, 또는 희석제와 혼합되어 투여된다. 이러한 본 발명의 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제의 투여는 고형 제형, 액체 제형 또는 다른 제형과 같은 경구 투여용 형태, 주사액, 도포제 또는 좌약 등과 같은 비경구 투여용 형태로 이루어질 수 있다. 또한 본 발명의 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제는 1일 1회 내지 수회 투여될 수 있다.
본 발명의 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 하는 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제는 경구 또는 비경구 투여를 통해 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제, 과립제, 캡슐제, 액제, 에멀젼, 현탄액, 시럽제 등의 형태로 경구투여된다. 비경구적 방법으로 투여되는 경우에는, 예를 들면 주사제의 경우에는 정맥내, 근육내 또는 피하내로 주사될 수 있다. 예를 들면 팻치, 연고 또는 외용제의 형태로 피부에 적용되어 경피투여될 수 있고, 좌약 형태로 직장 내에 투여될 수 있다. 전형적인 경구투여용 고체 제형으로서는 산제, 정제, 환제, 과립제, 캡술제 등이 있으며, 여기서 활성성분들은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 하나 이상의 불활성 희석제(예, 전분, 셀룰로오스, 락토오스, 카올린 등)와 혼합되며, 임의의 윤할제, 결합제, 붕해제, 안정화제 등과 혼합될 수 있다. 전형적인 경구투여용 액체 제형으로서는 약학적 허용액, 에멀젼, 현탄액, 시럽제, 엘릭서 등이 있으며, 여기서 활성성분들은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 하나 이상의 불활성 희석액(예, 정제수, 에탄올 등)중에 포함되며,임의의 감미제, 방향제, 보존제 등과 혼합될 수 있다. 전형적인 비경구투여용 주사제로는 무균 용액, 에멀젼, 현탄액 등이 있으며, 여기서 활성성분들은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 하나이상의 불활성 수성 희석액(예, 주사용 증류수, 생리적 식염수 등) 또는 불활성 비수성 희석액(예, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 에틴올 등)과 혼합되며, 임의의 등장제, 완충제,방부제, 안정화제 등과 혼합될 수 있다. 상기 예시된 제형의 형태들은 공지의 방법으로 제조될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 처리한 지방세포에서의 이소시트릭산 탈수소화 효소활성 측정
NIH3T3-L1 preadipocyte 세포주에 옥살로 말릭산과 메틸이소시트릭산을 각각 0.5 mM로 처리하여 10분, 30분, 1시간 배양한 후 세포를 회수하여 이소시트릭산 탈수소화효소활성을 측정하였다. 3 ×107개의 세포를 1X 인산염 완충용액으로 2번 세척한 후, 수크로오즈 완충용액(0.32 M sucrose, 0.01 M Tris-Cl, pH 7.4)을 이용하여 파쇄하였다. 이를 1,000 g로 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고, 다시 15,000 g로 원심분리하여 상등액의 세포질 부분과 침전물인 미토콘드리아 부분을 분리하였다. 세포질 분핵인 상등액에 전체 용액의 1/10 부피로 0.1% 트리톤 (Triton) X-100이 포함된 인산염 완충용액을 첨가하고 브래드포드 방법(Bradford assay)를 통하여 정량하였으며, 효소 활성 측정은 25℃의 완충용액(50 mM MOPS, pH 7.2, 35.5 mM triethanolamine, pH 7.2, 2 mM NADP+, 2 mM MgCl2, 5 mM isocitrate,1 ㎍/㎖ rotenone)에서 반응시켜 수행하였다. 반응이 끝난 후 340 nm에서 2분간 비색계에서 흡광도의 변화를 측정하여 1분간 1 μM의 NADPH를 생성하는 효소의 양을 1 unit로 하여 효소의 활성을 나타내었다.
그 결과, 대조군 세포는 1시간 동안 이소시트릭산 탈수소화효소 활성의 변화가 없는데 반하여 옥살로 말릭산과 메틸이소시트릭산을 처리한 세포는 약 50%의 이소시트릭산 탈수소화효소 활성의 감소가 확인되었다(표 1,도 1).
효소활성 저해도(%)
처리 시간 옥살로 말릭산 메틸이소시트릭산
0분 100% 100%
10분 59.1% 54.1%
30분 50% 48.6%
60분 59.1% 44.5%
<실시예 2> 이소시트릭산 탈수소화 효소 활성 저해제를 처리한 지방세포에서의 지방 합성량 확인
이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제가 지방 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, NIH3T3-L1 세포주를 10%의 소 태아 혈청(fetal bovine serume, FBS)가 포함된 DMEM에 5 ㎍/㎖ 농도의 인슐린, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX, Sigma), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone, DEX), 페니실린-스트렙토마이신(Gibco BRL)을 각각 1 리터 당 50,000 U씩 첨가하며 배양하며 세포의 밀도가 약 3 ×104세포/㎠에 도달할 때까지 이틀간 지방세포의 분화를 촉진시켰다. 그 이후 다시 상기의 배지에서 IBMX와 DEX를 제거시킨 배지를이용하여 이틀마다 배지를 갈아주며 10일간 계속 배양하였다. 세포배양은 CO2배양기 내에서 5% CO2, 37℃의 습윤상태로 실시하였다. 배양이 끝난 후 지방세포 내 형성된 지방을 특이적으로 염색하는 오일 레드 오(Oil Red O)를 처리하여 지방세포 내에 형성된 지방 알갱이의 수와 지방축적정도를 관찰하였다.
오일 레드 오 염색은 세포가 배양되고 있는 플레이트에서 배지를 버리고, 고정용액(cacodylate buffer, 90 mM cacodylate, pH 7.2, 2% formaldehtde, 2.5% glutarardehyde, 0.025% CaCl2, 5% sucrose)을 10 ㎖ 첨가한 다음, 4℃에서 1시간 동안 방치한 뒤 제거하고 다시 40% 이소프로판올(isopropanol)에 용해되어 있는 오일 레드 오 용액을 5 ㎖ 첨가하여 1시간 동안 천천히 혼합한 다음 40% 이소프로판올로 세척함으로써 수행하였다.
그 결과도 2에서 보듯이, 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제가 처리된 세포에서는 대조군에 비해 지방의 생성이 감소됨을 확인할 수 있다(도 2). 상기 결과는 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제가 세포 내 지방의 축적량을 감소시키는데 중요한 작용을 하고 있음을 의미한다.
<실시예 3> 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제에 의한 생쥐의 체중, 체내 지질, 콜레스테롤 증가 조사
<3-1> 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제에 의한 체중의 변화 조사
생쥐에 14주 동안 옥살로 말릭산과 메틸이소시트릭산을 체중 1 kg 당 25 mg씩 일주일에 3회 복강 주사로 투여하였다. 그 결과, 생리식염수를 복강 투여한 대조군 생쥐대조군 생쥐에 비해 체중이 10% 이상 감소하였으며 이를 해부하였을 때 복부 지방 조직(epididymal fat pad)의 크기가 매우 작아졌음을 확인할 수 있었으며 지방조직의 중량으로는 약 5배 감소되었다. 또한, 겉피부를 제거한 후 등쪽 모습도 이소시트릭산 탈수소화효소 저해제를 처리한 생쥐의 비만조직의 양이 많이 감소하였음을 볼 수 있었다. 피하조직의 지방축적정도를 탐색하기 위하여 복부피하조직을 횡단면으로 절취한 다음 10% 중성포르말린 용액으로 고정을 하고 통상적인 고정절차 및 탈수과정을 거친 후 파라핀으로 조직을 포매하였다. 포매한 조직을 4 ㎛의 두께로 조직 절편을 하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색을 실시한 다음 광학현미경으로 관찰하여 복부피하 침윤정도를 대조군과 비교하였다(도 3).
또한, 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 투여한 생쥐와 정상 생쥐의 체중을 측정하기 위하여, 동물체중 측정용 저울의 영점을 조절한 후 생쥐를 가만히 올려놓은 후 표시되는 무게를 생쥐 체중으로 측정하였다(표 2,도 4).
몸무게 증가량(g)
대조군 22.19 ± 1.11 g
옥살로 말릭산 처리군 17.17 ± 1.9 g
<3-2> 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제에 의한 혈중 중성지질 및 총 콜레스테롤 농도 측정
중성지질 및 총 콜레스테롤 농도의 측정은 아산제약 주식회사에서 나온 측정용 키트들을 각각 사용하였다. 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 투여한 생쥐와 정상 생쥐에서 혈액을 채취하여 원심분리하여 혈청(serum)을 확보하였다. 확보한 혈청 10 ㎕에 1.5 ㎖의 중성지질 측정 키트액(리포푸로테인리파제 10800 U, 글리세롤키나제 5.4 U, 퍼옥시다제 13,5000 U, L-α-글리세로 인산옥시다제 160 U를 72 ㎖의 N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노메탄설폰산 완충액에 녹인 용액) 또는 1.5 ㎖의 콜레스테롤 효소측정 키트액(효소액 (콜레스테롤에스테라제 20.5 KU/ℓ, 콜레스테롤옥시다제 10.7 KU/ℓ, 수산화나트륨 1.81 g/ℓ)과 완충액 (인산일칼륨 13.6 g/ℓ, 페놀 1.88 g/ℓ)을 1:1로 섞은 용액)을 섞은 후 37℃에서 5분간 반응시키고 마이크로 플레이트 분석기(microplate reader)에서 콜레스테롤은 500 nm, 중성지질은 540 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 중성지질 및 총 콜레스테롤의 혈중 농도를 측정하였다. 중성지질 및 콜레스테롤의 정량 환산은 이들의 표준물질 용액에 대하여 상기와 동일한 방법을 적용한 후 얻어진 표준 농도곡선을 이용하여 실시하였다.
그 결과 복부 지방조직의 무게는 대조군에 비해 약 5배가 감소하였다(도 3). 한편, 혈액의 혈청 중에 중성지질 및 총 콜레스테롤의 양은 이소시트릭산 탈수소화효소 저해제를 투여한 생쥐에서 정상 생쥐에 비하여 각기 50% 및 30% 감소하였다(표 3,도 5, 6).
트리글리세라이드(㎎/dl) 총 콜레스테롤 양(㎎/dl)
대조군 147.6 ± 8 214.23 ± 13.5
옥살로 말릭산 처리군 70.07 ± 4.9 148.74 ± 6.6
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 하는 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제는 체중감소 효과, 비만억제 효과, 생체 중성지질 및 콜레스테롤 생합성 억제효과가 우수하며 따라서 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (4)

  1. 옥살로 말릭산, 메틸이소시트릭산, 옥살로 아세테이트 및 글리옥실레이트로 구성되는 군으로 부터 선택되는, NADP+-특이적 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제를 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증 또는 지방간의 예방 또는 치료제.
  2. 제 1항에 있어서, NADP+-특이적 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제로 옥살로 말릭산을 포함하는 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
  3. 제 1항에 있어서, NADP+-특이적 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제로 메틸이소시트릭산을 포함하는 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
  4. 제 1항에 있어서, NADP+-특이적 이소시트릭산 탈수소화효소 활성 저해제로 옥살로 아세테이트와 글리옥실레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
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