KR100437887B1 - Western blot diagnostic kit using principle of chromatography - Google Patents
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Abstract
본 발명은 크로마토그래피(chromatography)의 원리를 이용한 웨스턴 블롯(western blot) 분석키트에 관한 것으로서, 구체적으로는 시료흡수패드, 1차항체 방출패드, 발색제와 결합된 2차항체 방출패드, 검출막 부분 및 흡수패드로 구성되는 웨스턴 블롯 분석키트에 관한 것이다. 본 발명의 웨스턴 블롯 분석키트는 제조가 간편하고 제조비용이 저렴하며 빠르고 간편하게 특정 물질을 검출할 수 있고 소량으로 존재하는 물질도 용이하게 검출할 수 있으므로 단백질 검출을 비롯한 여러 가지 물질의 검출에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a Western blot analysis kit using the principle of chromatography, specifically, a sample absorbing pad, a primary antibody release pad, a secondary antibody release pad combined with a colorant, a detection membrane portion And it relates to a Western blot analysis kit consisting of an absorption pad. Western blot analysis kit of the present invention is easy to manufacture, inexpensive manufacturing cost, can quickly and easily detect a specific substance, and even a small amount of substances can be easily detected, it is useful for the detection of various substances including protein detection Can be used.
Description
본 발명은 크로마토그래피(chromatography)의 원리를 이용한 웨스턴 블롯(western blot) 분석키트에 관한 것으로서, 구체적으로는 시료흡수패드, 1차항체 방출패드, 발색제와 결합된 2차항체 방출패드, 검출막 부분 및 흡수패드로 구성되는 웨스턴 블롯 분석키트에 관한 것이다.The present invention relates to a Western blot analysis kit using the principle of chromatography, specifically, a sample absorbing pad, a primary antibody release pad, a secondary antibody release pad combined with a colorant, a detection membrane portion And it relates to a Western blot analysis kit consisting of an absorption pad.
검체내의 특정 물질을 검출하기 위해서는 GC, HPLC 등과 같은 크로마토그래피, ELISA, 면역조직화학법(Immunohistochemistry) 및 DNA 분석(DNA-based Assays)등과 같은 방법을 사용할 수 있다. 생물학 분야에서 단백질을 검출하기 위하여 널리 쓰이는 방법으로는 웨스턴 블롯(western blot)을 들 수가 있는데 이는 항원과 항체반응을 이용하여 시료를 검출하는 방법이다. 기존의 웨스턴 블롯 분석은 단백질을 세포나 조직으로부터 추출하여 이를 SDS-PAGE 전기영동을 통해 전개시키고, 이를 다시 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 막(membrane)으로 트랜스퍼시킨 다음 여기에 일차항체와 이차항체를 붙여 효소-기질반응이나 X-레이 필름 등으로 현상하여 단백질의 발현을 검출하였다. 그러나, 이러한 과정은 짧게는 하루에서 길게는 이틀이상 걸리는 작업으로 시간이 오래 걸릴 뿐만 아니라 과정 자체도 매우 복잡한 단점이 있다. 본 발명자들은 상기의 크로마토그래피의 원리를 연구용으로 응용 개발하여 이와 같은 웨스턴 블롯의 단점을 극복하였다. 즉, 단백질을 세포나 조직으로부터 분리한 후에 이를 희석용액(dilution buffer)으로 희석하여 전기영동하지 않고 직접 키트내의 시료 흡수패드에 로딩(loading)하게 되면 단백질 용액이 크로마토그래피의 원리에 따라 이동하여 항체와 결합되어 있는 골드복합체와 검출하고자 하는 단백질이 결합하게 되고 이것이 색으로 나타나게 됨으로써 특정 단백질의 발현을 검출할 수 있다. 이러한 크로마토그래피 원리를 응용한 웨스턴 블롯용 키트의 개발은 단백질 검출을 빠른 시간 내에 매우 간편하게 할 수 있다는 점에서 분자생물학 연구에 있어 획기적이라 하겠다.In order to detect specific substances in the sample, chromatography such as GC, HPLC, etc., ELISA, immunohistochemistry and DNA-based assays can be used. A widely used method for detecting proteins in the biological field is a western blot, which is a method for detecting a sample using antigen and antibody reactions. Conventional western blot analysis extracts proteins from cells or tissues and deploys them by SDS-PAGE electrophoresis, which are then transferred to PVDF (Polyvinylidene fluoride) membranes (membrane), followed by attaching primary and secondary antibodies to enzymes. -Expression of protein was detected by developing with substrate reaction or X-ray film. However, this process is not only time-consuming but also very complicated. The present inventors have developed the principle of the above chromatography for research and overcome the disadvantages of such Western blot. In other words, when proteins are separated from cells or tissues, they are diluted with dilution buffer and loaded directly onto the sample absorption pad in the kit without electrophoresis, and the protein solution moves according to the principle of chromatography. It is possible to detect the expression of a specific protein by combining the gold complex which is combined with the protein to be detected and it appears in color. The development of a Western blot kit that applies this chromatographic principle is a breakthrough in molecular biology research in that protein detection can be made very easy in a short time.
한편, 크로마토그래피는 물질의 분석에 유용한 방법이며 그 응용범위가 대단히 넓은데, 이러한 원리를 이용하여 임신의 진단에 이용할 수 있다. 기존의 크로마토그래피의 원리를 이용한 임신진단키트는 막형태(membrane type)를 하고 있으며 크게 4부분으로 구성되어 있다(도 1참조). 첫 번째 부분은 시료흡수패드 부분(medium absorbent pad)으로 소변이나 기타 시료물질을 흡수하는 부분이며, 두 번째 부분은 항체와 골드클로라이드(gold chloride; HAuCl4·3H2O)가 결합된 골드복합체(gold conjugate)를 포함하는 골드복합체 방출패드(gold conjugate-releasing pad), 세 번째 부분은 시험선(test line)과 대조선(control line)에 대한 항체가 각각 결합되어 있는 검출막(detector membrane) 부분, 그리고 마지막으로 원활한 크로마토그래피로 시료가 빠르게 움직일 수 있도록 하는 흡수패드(absorbent pad) 부분으로 나뉘게 된다.Chromatography, on the other hand, is a useful method for the analysis of substances and its application is very wide, and this principle can be used to diagnose pregnancy. Pregnancy diagnosis kits using the principle of chromatography have a membrane type (membrane type) and consists of four parts (see Fig. 1 ). The first part is a medium absorbent pad part that absorbs urine or other sample material, and the second part is a gold complex in which antibody and gold chloride (HAuCl 4 · 3H 2 O) are combined. a gold conjugate-releasing pad comprising a gold conjugate, a third portion of a detector membrane to which antibodies to a test line and a control line are bound, And finally, it is divided into absorbent pads that allow the sample to move quickly with smooth chromatography.
이러한 크로마토그래피 원리를 활용한 대표적인 임신진단키트는 항체 방출패드를 한 종류만 사용하였다. 즉, 방출패드에 hCG 일차항체를 골드클로라이드와 결합시킨 골드복합체를 붙여 놓은 한 종류의 방출패드를 사용하는데, 이와 같은 골드복합체의 제조에는 많은 시간과 경비가 들어가며 제조하기도 매우 어렵기 때문에 제조 단가가 비싸며, 검출하고자 하는 시료마다 서로 다른 골드복합체를 만들어야하는 단점이 있었다.Representative pregnancy diagnostic kits utilizing this chromatographic principle used only one type of antibody release pad. In other words, one type of release pad in which a gold complex in which hCG primary antibody is combined with gold chloride is attached to the release pad. The production of such a gold complex requires a lot of time and expense and is very difficult to manufacture. It was expensive and had the disadvantage of making different gold complexes for each sample to be detected.
이에, 본 발명자들은 특정 물질에 대한 일차항체가 결합된 방출패드와 이러한 일차항체와 결합 가능한 이차항체를 발색제와 결합시킨 복합체가 결합된 방출패드를 포함하는 새로운 분석키트를 개발하였으며, 상기 분석키트가 단백질을 비롯한 다양한 물질의 검출에 공통적으로 사용될 수 있고 제조방법이 간편하며 또한 제조단가를 절감할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have developed a new analysis kit including a release pad in which a primary antibody is bound to a specific substance, and a release pad in which a complex in which a secondary antibody capable of binding the primary antibody is combined with a coloring agent is combined. The present invention has been completed by revealing that it can be commonly used for the detection of various substances including proteins, the manufacturing method is simple, and the manufacturing cost can be reduced.
본 발명의 목적은 다양한 물질의 검출에 공통적으로 사용할 수 있는 신규한 웨스턴 블롯 분석키트를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a novel western blot analysis kit that can be commonly used for the detection of various substances.
도 1은 기존의 크로마토그래피의 원리를 임신진단키트를 예로하여 보여주는 모식도이고, Figure 1 is a schematic diagram showing the principle of the conventional chromatography as an example of a pregnancy diagnostic kit,
(1) : 시료흡수패드 부분(medium absorbent pad),(1): sample absorbent pad (medium absorbent pad),
(2) : 골드복합체 방출패드(gold conjugate-releasing pad),(2): gold conjugate-releasing pad,
(3) : 검출막(detector membrane), (4) : 흡수패드(absorbent pad)(3): detector membrane, (4): absorbent pad
도 2는 본 발명에서 사용한 크로마토그래피의 변형된 원리를 보여주는 모식도이고, 2 is a schematic diagram showing a modified principle of the chromatography used in the present invention,
(1) : 시료흡수패드 부분,(1): sample absorption pad portion,
(2) : 항체 방출패드(Ab releasing pad; 1st pad),(2): antibody release pad (Ab releasing pad; 1st pad),
(3) : 골드복합체-항체 방출패드(gold conjugated Ab releasing pad; 2nd pad),(3): gold conjugated Ab releasing pad (2nd pad),
(4) : 검출막, (5) : 흡수패드(4): detection film, (5): absorption pad
도 3은 기존의 단백질 분석 방법(western blot analysis)과 본 발명의 분석키트(WESTICK)를 사용한 방법과의 편리성 및 간편성을 비교하여 보여주는 그림이고, 3 is a view showing the convenience and simplicity of the conventional protein analysis method (western blot analysis) and the method using the analysis kit (WESTICK) of the present invention,
도 4는 본 발명의 분석키트를 사용하여 사이클린(cyclin) D1 단백질 검출시험을 수행한 결과를 나타내는 사진이며, Figure 4 is a photograph showing the results of performing a cyclin (cyclin D1 protein detection test using the assay kit of the present invention,
Sample 1 : 약제 투약 HL-60, Sample 2 : 약제 미투약 HL-60Sample 1: drug dose HL-60, sample 2: drug dose HL-60
도 5는 기존의 웨스턴 블롯 방법과본발명의 분석키트를 사용하여 특정 단백질 검출시험을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. Figure 5 is a photograph showing the results of performing a specific protein detection test using the existing Western blot method and the assay kit of the present invention.
Sample 1 : Bax 단백질의 발현양상, Sample 2 : Bcl-2 단백질의 발현양상Sample 1: Expression of Bax Protein, Sample 2: Expression of Bcl-2 Protein
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 특정 물질에 대한 일차항체와 상기 일차항체와 결합하는 이차항체를 포함하는 웨스턴 블롯 분석키트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a Western blot analysis kit comprising a primary antibody for a specific substance and a secondary antibody binding to the primary antibody.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 특정 물질에 대한 일차항체와 상기 일차항체와 결합하는 이차항체를 포함하는 웨스턴 블롯 분석키트를 제공한다.The present invention provides a Western blot analysis kit comprising a primary antibody against a specific substance and a secondary antibody binding to the primary antibody.
본 발명의 분석키트는 시료흡수패드, 1차항체 방출패드, 발색제와 결합된 2차항체 방출패드, 검출막 부분 및 흡수패드로 구성되어 있다(도 2참조).The assay kit of the present invention is composed of a sample absorption pad, a primary antibody release pad, a secondary antibody release pad in combination with a coloring agent, a detection membrane portion and an absorption pad (see FIG. 2 ).
일반적인 검출키트와 마찬가지로 본 발명의 검출막 부분에도 시험선과 대조선에 대한 항체가 각각 결합되어 있는 부분이 있다.Similar to the general detection kit, the detection membrane portion of the present invention has a portion where antibodies to the test line and the control line are respectively bound.
상기에서 1차항체는 검출하고자 하는 물질에 특이적인 항체를 의미하며 2차항체는 상기 1차항체에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 이러한 2차항체에는 여러 가지가 사용될 수 있으나 항-면역글로불린 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 발색제로는 감도가 높고 영구적 보존이 가능한 염화골드(NAuCl4·3H2O)가 사용된다. 시료흡수패드는 100% 보로실리케이트 미세 유리섬유(borosilicate micro- glass fiber)로서 시료의 흡수력과 보유능력이 높은 특징을 가지고 있다. 흡수패드의 성분은 100% α-셀룰로오즈 섬유(Cellulose fiber)로 만들어진 높은 순도의 면지(High purity cotton paper)로, 시료를 분석막의 끝까지 빠르게 이동시킬 수 있는 흡수력이 필요하다.In the above, the primary antibody means an antibody specific for a substance to be detected, and the secondary antibody means an antibody that specifically binds to the primary antibody. Various kinds of secondary antibodies can be used, but anti-immunoglobulin antibodies are preferably used. As a color developing agent, gold chloride (NAuCl 4 · 3H 2 O), which has high sensitivity and permanent preservation, is used. The sample absorbing pad is a 100% borosilicate micro-glass fiber and has a high absorption and retention capability of the sample. The component of the absorbent pad is a high purity cotton paper made of 100% α-Cellulose fiber, which needs an absorbent ability to quickly move the sample to the end of the analyte.
기존의 크로마토그래피의 원리를 활용한 대표적인 진단키트(예를 들면, 임신 진단키트)는 항체 방출패드를 한 종류만 사용하였다. 즉, 방출패드에 hCG 1차항체를 골드클로라이드(gold chloride) 등의 발색제와 결합시킨 복합체를 붙여 놓은 한 종류의 방출패드를 사용하는데, 이와 같은 복합체는 많은 시간과 경비가 들어가기 때문에 제조하기가 매우 어렵다. 하지만, 본 발명에서는 두 종류의 방출패드를 사용한다. 즉, 앞쪽에는 특정단백질에 대한 항체가 결합된 1차항체(primary antibody)를 항체 안정화용액을 사용하여 방출패드에 결합시켰으며, 뒤쪽에는 1차항체에 결합할 수 있는 2차항체(secondary antibody)를 발색제와 결합시킨 후 이를 붙여놓았다. 이러한 이유는 한 종류의 방출패드를 사용하는 경우 수십-수백종의단백질에 대한 항체마다 발색제를 결합시킨 복합체를 제조해야 하는 단점이 존재하는 반면에, 본 발명과 같이 이차항체에만 발색제를 결합시킨 복합체를 사용하게 되면 다양한 단백질의 검출에 공통적으로 사용할 수 있다는 장점이 있다. 즉, 일반적으로 1차항체와 결합하는 2차항체의 호스트(host) 종류로는 생쥐(mouse), 토끼(rabbit), 래트(rat), 염소(goat) 등에 지나지 않기 때문에 이와같은 항체를 이용하여 복합체를 만들게 되면 모든 단백질의 검출에 사용할 수 있다는 장점이 있다. 다시 말해서 앞쪽 패드에는 다양한 1차항체를 붙이고, 2차항체는 1차항체의 호스트에 따라 복합체를 붙여 놓음으로써 제조방법을 간편하게 할 뿐만 아니라 제조공정은 물론 제조단가 또한 절감할 수 있게 된다.Representative diagnostic kits (eg, pregnancy diagnostic kits) utilizing conventional chromatographic principles used only one type of antibody release pad. In other words, one type of release pad is used, in which a complex in which hCG primary antibody is combined with a coloring agent such as gold chloride is used on a release pad. Such a complex is very difficult to manufacture because it requires a lot of time and expense. it's difficult. However, the present invention uses two types of release pads. In other words, the first antibody (primary antibody) is bound to the release pad using the antibody stabilizing solution in the front, the second antibody (secondary antibody) that can bind to the primary antibody in the back Was combined with a colorant and pasted. The reason for this is that when one type of release pad is used, there is a disadvantage in that a complex in which a colorant is bound to an antibody to dozens or hundreds of proteins is used. On the other hand, as in the present invention, a complex in which a colorant is bound only to a secondary antibody is used. The advantage is that it can be used commonly for the detection of various proteins. That is, in general, the host type of the secondary antibody that binds to the primary antibody is only mouse, rabbit, rat, goat, and the like. Creating a complex has the advantage that it can be used to detect all proteins. In other words, by attaching a variety of primary antibodies to the front pad, the secondary antibody is attached to the complex according to the host of the primary antibody not only to simplify the manufacturing method but also to reduce the manufacturing process as well as the manufacturing cost.
본 발명의 분석키트는 검출하고자 하는 물질(예를 들면, 단백질)을 세포나 조직으로부터 분리한 후에 이를 희석용액(dilution buffer)으로 희석하여 전기영동하지 않고 직접 키트내의 시료 흡수패드에 먼저 로딩(loading)하게 되는데, 이때 시료 용액이 크로마토그래피의 원리에 따라 이동하면 검출하고자 하는 물질이 여기에 특이적인 1차항체와 결합하게되고 다음으로 2차항체와 결합되어 있는 발색제복합체와 상기 1차항체가 서로 결합하게 되어 이것이 색으로 나타나게 됨으로써 특정 물질을 검출할 수 있게 된다. 이러한 크로마토그래피 원리를 응용한 웨스턴 블롯용 키트는 빠른 시간내에 매우 간편하게 원하는 물질을 검출할 수 있다는 점에서 분자생물학 연구에 있어 획기적이라 하겠다.The assay kit of the present invention separates a substance (for example, a protein) to be detected from a cell or tissue, and then dilutes it with a dilution buffer and loads it directly onto a sample absorption pad in the kit without electrophoresis. In this case, when the sample solution moves according to the principle of chromatography, the substance to be detected is bound to the specific primary antibody, and then the chromosome complex and the primary antibody are bound to the secondary antibody. When combined, they appear in color, making it possible to detect specific substances. Western blot kits using this chromatographic principle can be a breakthrough in molecular biology research in that they can easily detect desired substances in a short time.
본 발명의 근간은 크로마토그래피의 원리를 이용한 것인데, 이 때 분석하고자 하는 시료의 점도(viscosity)가 크로마토그래피에 미치는 영향은 매우 크다. 즉, 점도가 높아 끈적끈적하게 되면 원활한 크로마토그래피가 일어날 수 없는데, 본 발명의 진단키트는 단백질을 세포나 조직으로부터 추출한 후, 여기에 단백질 희석용액을 첨가하여 점도를 엷게(dilution)함으로써 크로마토그래피가 원활하게 일어나도록 하였다. 기존의 웨스턴 블롯은 웰에 로딩할 수 있는 단백질의 부피가 최대 30-50 ㎕를 넘을 수 없기 때문에 많은 양의 단백질을 전기영동하기 위해서는 단백질을 고농도로 농축시키거나 또는 매우 큰 크기의 PAGE 젤을 준비하여야 한다는 단점이 있었지만, 본 발명의 진단키트는 세포나 조직으로부터 단백질을 추출한 후에 원하는 양만큼 단백질을 튜브에 넣고 여기에 적당량의 단백질 희석용액을 사용하여 희석시켜 이를 키트의 흡수패드에 로딩하기 때문에 단백질 로딩양에 이론적으로 제한이 없다. 이 때문에 세포나 조직에서 발현량이 극도로 적은 단백질의 경우에도 검출할 수 있다는 장점이 있다.The basis of the present invention is to use the principle of chromatography, the effect of the viscosity (viscosity) of the sample to be analyzed on the chromatography is very large. In other words, when the viscosity is high and sticky, smooth chromatography cannot occur. The diagnostic kit of the present invention extracts proteins from cells or tissues, and then dilutes the viscosity by adding a protein dilution solution to the chromatography. It was supposed to happen smoothly. Conventional Western blots can't exceed 30-50 μl of the volume of protein that can be loaded into the wells, so electrophoresis of large amounts of protein can be done by concentrating the protein in high concentrations or preparing very large PAGE gels. However, the diagnostic kit of the present invention extracts proteins from cells or tissues, and then puts the proteins in a tube as desired and dilutes them with an appropriate amount of protein dilution solution and loads them into the kit's absorption pad. There is no theoretical limit on the amount of loading. Therefore, there is an advantage that even in the case of a protein having an extremely low expression level in a cell or tissue, it can be detected.
본 발명자들은 본 발명의 진단키트를 시료의 분석에 사용하는 바람직한 실시예로서 몇가지 단백질에 대한 검출 효능을 확인하였다. 상기 단백질 이외에도 다른 단백질, 다당류, 지질류 및 화합물이 본 발명의 진단키트에 적용될 수 있음은 당업자에게는 자명한 일이라 할 것이다.The present inventors have confirmed the detection efficacy of several proteins as a preferred example of using the diagnostic kit of the present invention in the analysis of a sample. It will be apparent to those skilled in the art that other proteins, polysaccharides, lipids and compounds in addition to the above proteins can be applied to the diagnostic kit of the present invention.
본 발명자들은 HL-60 세포로부터 단백질 추출시약(PRO-PREP, 인트론바이오테크놀로지)을 사용하여 단백질을 추출한 후, 본 발명의 분석키트(WESTICK)의 시료흡수패드(medium absorbent pad)에 로딩한 후 10분간 실온에 방치하였다.The present inventors extracted the protein from the HL-60 cells using a protein extraction reagent (PRO-PREP, Intron Biotechnology), and then loaded on a medium absorbent pad of the assay kit (WESTICK) of the present invention. It was left to stand at room temperature for a minute.
그 결과, 사이클린 D1을 발현시키는 것으로 알려진 약제를 처리하여 배양한 HL-60 세포주에서는 대조선과 시험선 모두에서 밴드가 나타난 반면, 약제를 처리하지 않고 배양한 HL-60 세포주에서는 대조선에만 밴드가 나타났다(도 4참조). 따라서 본 발명의 웨스틱 키트를 사용하면 시료로부터 간편하고 빠르게 단백질을 검출할 수 있음을 확인하였다.As a result, a band appeared in both the control line and the test line in the HL-60 cell line cultured with a drug known to express cyclin D1, whereas a band appeared only in the control line in the HL-60 cell line cultured without the drug ( See FIG. 4 ). Therefore, it was confirmed that the westic kit of the present invention can detect proteins easily and quickly from a sample.
본 발명자들은 또한, PCI-1 세포주(서울대학교 의과대학 내과)에 약제를 처리한 후 단백질을 추출하여 Bax와 Bcl-2 단백질의 발현을 비교하였다. 단백질 용액을 기존의 웨스턴 블롯 방법과 본 발명의 웨스틱 키트를 이용한 방법으로 각각 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 웨스틱을 사용한 결과(도 5오른쪽 참조)는 기존의 웨스턴 블롯 방법을 사용한 결과(도 5왼쪽 참조)와 별 차이가 없었으며, 따라서 약 2일이 소요되는 웨스턴 블롯 방법에 비해 단지 10여분 내에 결과를 확인할 수 있는 본 발명의 웨스틱을 사용한 분석 방법은 생명공학 연구에 있어서 매우 뛰어나다고 할 수 있다.The present inventors also compared the expression of Bax and Bcl-2 proteins by extracting proteins after treating drugs with a PCI-1 cell line (Seoul National University College of Medicine). Protein solutions were analyzed by the conventional Western blot method and the method using the wetstick kit of the present invention, respectively. As a result, the results of using the westic of the present invention (see FIG. 5 right) were not significantly different from those of the conventional Western blot method (see FIG. 5 left), and thus, the western blot method, which took about 2 days, In contrast, the analytical method using the stick of the present invention, which can confirm the result in about 10 minutes, is very excellent in biotechnology research.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by Examples and Experimental Examples.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.However, the following Examples and Experimental Examples are only illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following Examples and Experimental Examples.
<실시예 1> 분석키트의 제조Example 1 Preparation of Analysis Kit
본 발명자들은 일반적인 골드클로라이드 복합체(gold chloride conjugate) 방법(Pemawansa, K. P. W., et al.,Biotechniques,1993, 9(3), 352-355)을 사용하여 본 발명의 분석키트를 제조하였다. 한 예로써 사이클린-D1 항체를 검출할 수 있는 키트의 제조과정을 하기에 나타내었다.The present inventors prepared the assay kit of the present invention using a general gold chloride conjugate method (Pemawansa, KPW, et al., Biotechniques , 1993 , 9 (3), 352-355). As an example, the preparation of a kit capable of detecting a cyclin-D1 antibody is shown below.
<1-1> 항체<1-1> antibody
정제된 염소 항-마우스 IgG 항체, 마우스 항-사이클린 D1 단일항체 그리고 토끼 항-사이클린 D1 복합항체 및 토끼 항-염소 IgG 항체를 산타크루즈사(SANTA CRUZ Co.)로부터 구입하여 사용하였다.Purified goat anti-mouse IgG antibody, mouse anti-cyclin D1 monoantibody and rabbit anti-cyclin D1 complex antibody and rabbit anti-goat IgG antibody were purchased from Santa Cruz Co., Ltd. and used.
<1-2> 콜로이달 골드복합체의 제조<1-2> Preparation of Colloidal Gold Composite
유리병에 100 ㎖의 증류수를 넣고 가열하면서 1% 골드클로라이드와 1% 트리소디움 사이트레이트(trisodium citrate)를 첨가하고 용액의 색이 갈색으로 변할 때까지 가열한 후에 실온에서 식혀주었다. 원심분리를 통해 콜로이달 골드를 분리하여 1.5 ㎖ 튜브에 1 ㎖씩 분주하고 여기에 1 ㎎/㎖의 염소 항-마우스(goat anti-mouse) IgG 항체를 첨가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 보락스(borax) 용액(Na2B4O7; 20 mM, Sigma) 100 ㎕를 첨가하고 원심분리하여 골드복합체를 얻었다. 이 과정을 3회 반복하고 얻어진 골드복합체에 보락스 용액을 첨가하여 혼합한 후 4℃에서 보관하였다.100 ml of distilled water was added to the glass bottle, and 1% gold chloride and 1% trisodium citrate were added while heating, and the solution was heated until it turned brown, and then cooled at room temperature. Colloidal gold was separated by centrifugation, and 1 mL was dispensed into 1.5 mL tubes, and 1 mg / mL goat anti-mouse IgG antibody was added thereto and reacted at room temperature for 1 hour. 100 μl of borax solution (Na 2 B 4 O 7 ; 20 mM, Sigma) was added and centrifuged to obtain a gold complex. This process was repeated three times, and the borax solution was added to the obtained gold complex, mixed, and stored at 4 ° C.
<1-3> 복합체패드(conjugate pad)의 제조<1-3> Preparation of conjugate pad
상기에서 제조한 콜로이달 골드를 복합체 버퍼(conjugate buffer; 100 mM Tris (pH 8.0), 5% BSA, 0.1% Tetronic, 5% Sucrose)에 희석하여 복합체패드에 적신 후 58℃에서 30분간 건조시켰으며 이를 건조한 상태로 보관하였다.The colloidal gold prepared above was diluted in a conjugate buffer (100 mM Tris (pH 8.0), 5% BSA, 0.1% Tetronic, 5% Sucrose), soaked in a composite pad and dried at 58 ° C. for 30 minutes. It was stored dry.
<1-4> 시험스트립(testing strips)의 제조<1-4> Preparation of Testing Strips
검출막(detection membrane)에 검출하고자 하는 항체를 붙이기 위해 적당한 크기로 자른 후에 IVEK사의 자동화 설비를 사용하여 대조선(control line)과 시험선(test line)을 만들고 각 선에 각각의 항체(대조선; 토끼 항-염소 IgG 항체, 시험선; 토끼 항-사이클린 D1 복합항체)를 결합시킨 후 검출막을 건조시켰다.After cutting to a suitable size to attach the antibody to be detected on the detection membrane, control lines and test lines are made using IVEK's automated equipment, and each antibody (control line; rabbit) is placed on each line. The detection membrane was dried after binding the anti-goat IgG antibody, test line; rabbit anti-cyclin D1 complex antibody.
<실험예 1> 사이클린 D1 검출용 웨스틱 키트를 이용한 사이클린 D1 단백질 검출Experimental Example 1 Cyclin D1 Protein Detection Using a Cyclin D1 Wetstick Kit
HL-60 세포(ATCC)로부터 단백질 추출시약(PRO-PREP, 인트론바이오테크놀로지)을 사용하여 단백질을 추출한 후, 단백질 측정시약(PRO-MEASURE, 인트론바이오테크놀로지)으로 단백질 농도를 측정하여 단백질이 20 ㎍ 정도 되게끔 단백질 용액 30 ㎕를 준비하였다. 상기의 단백질 용액에 희석액 500 ㎕를 첨가하여 본 발명의 분석키트(WESTICK)의 시료흡수패드(medium absorbent pad)에 로딩한 후 10분간 실온에 방치하였다.Protein was extracted from HL-60 cells (ATCC) using a protein extraction reagent (PRO-PREP, Intron Biotechnology), and the protein concentration was measured using a protein measuring reagent (PRO-MEASURE, Intron Biotechnology). 30 μl of protein solution was prepared. 500 μl of the diluent was added to the protein solution, loaded onto a medium absorbent pad of the assay kit of the present invention, and then allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
그 결과, 사이클린 D1을 발현시키는 것으로 알려진 약제(EB1089, 한양대학교 의과대학)를 10-8M의 농도로 처리하여 배양한 HL-60 세포주에서는 대조선과 시험선 모두에서 밴드가 나타난 반면, 약제를 처리하지 않고 배양한 HL-60 세포주에서는 대조선에만 밴드가 나타났다(도 4). 따라서 본 발명의 웨스틱 키트를 사용하면 시료로부터 간편하고 빠르게 단백질 검출을 확인할 수 있음을 확인하였다.As a result, in the HL-60 cell line cultured with a drug known to express cyclin D1 (EB1089, Hanyang University Medical College) at a concentration of 10 -8 M, bands appeared in both the control line and the test line, whereas the drug was treated. In HL-60 cell line cultured without the band appeared only in the control line ( Fig. 4 ). Therefore, using the westic kit of the present invention was confirmed that the protein detection can be confirmed easily and quickly from the sample.
<실험예 2> 기존의 웨스턴 블롯 방법과 웨스틱과의 비교Experimental Example 2 Comparison of Conventional Western Blot Method with Westic
PCI-1 세포주(서울대학교 의과대학 내과)에 약제(As2O3,Sigma)를 2uM의 농도로 처리한 후 단백질을 추출하여 Bax와 Bcl-2 단백질의 발현을 비교하였다. 1 ㎍/㎕ 농도의 단백질 용액 20 ㎕를 각각 SDS-PAGE에 로딩한 후 PVDF 막으로 단백질을 옮긴 후 HRP를 결합시킨 2차항체(HRP-tagged secondary Ab)를 사용하여 2일간 반응시킨 후 웨스트졸(WEST-ZOL, 인트론바이오테크놀로지)로 단백질 발현을 확인하였다. 한편, 1 ㎍/㎕ 농도의 단백질 용액 20 ㎕를 단백질 희석용액 500 ㎕에 희석한 후 웨스틱의 시료흡수패드에 로딩하여 10분간 반응시키고 그 결과를 관찰하였다.Drugs (As 2 O 3, Sigma) were treated in a PCI-1 cell line (Seoul National University College of Medicine) at a concentration of 2 u M, and proteins were extracted to compare the expression of Bax and Bcl-2 proteins. 20 μl of protein solution of 1 μg / μl concentration was loaded on SDS-PAGE, and then transferred to PVDF membrane. Protein expression was confirmed by (WEST-ZOL, Intron Biotechnology). Meanwhile, 20 μl of a protein solution having a concentration of 1 μg / μl was diluted in 500 μl of the protein dilution solution, and then loaded on a sample absorption pad of the wastic, reacted for 10 minutes, and the results were observed.
그 결과, 본 발명의 웨스틱을 사용한 결과(도 5오른쪽)는 기존의 웨스턴 블롯 방법을 사용한 결과(도 5왼쪽)와 별 차이가 없었으며, 따라서 약 2일이 소요되는 웨스턴 블롯 방법에 비해 단지 10여분 내에 결과를 확인할 수 있는 본 발명의 웨스틱을 사용한 분석 방법은 단백질 검출을 비롯한 생명공학 연구에 있어서 매우 유용하게 사용할 수 있다.As a result, the results of using the westic of the present invention ( Fig. 5 right) were not significantly different from those of the conventional Western blot method (left of Fig. 5 ), and thus, compared to the Western blot method, which took about two days, The analytical method using the stick of the present invention, which can confirm the result in about 10 minutes, can be very useful for biotechnology research including protein detection.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 크로마토그래피의 원리를 이용한 웨스턴 블롯(western blot) 분석키트는 특정 물질에 대한 1차항체와 상기 1차항체와 결합하는 2차항체를 발색제와 결합시켜 특정 항체마다 발색제를 결합시켜야 하는 기존 분석키트의 번거러움을 해소하였으며 제조가 간편하고 비용이 저렴하며 빠르고 간편하게 특정물질을 검출할 수 있고 소량으로 존재하는 물질도 용이하게 검출할 수 있으므로, 단백질 검출을 비롯한 여러 가지 물질의 검출에 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the western blot analysis kit using the principle of chromatography of the present invention binds a primary antibody to a specific substance and a secondary antibody that binds to the primary antibody with a colorant, so that each specific antibody It eliminates the hassle of existing analytical kits that need to bind colorants, and is easy to manufacture, inexpensive, quick and easy to detect a specific substance, and even a small amount of substances can be easily detected. It can be usefully used for the detection of.
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