KR100392350B1 - Saccahromyces cerevisiae KNU5377 strains having multi-stress tolerance - Google Patents
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Abstract
본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 고온, 고농도의 에탄올, H2O2,유기용매, 중금속 및 무기산 등의 다중적 스트레스에 강한 내성을 나타내고, 고온에서의 에탄올발효능이 우수하여 효모의 스트레스반응에 대한 연구 및 고온성 에탄올발효에 활용 가능한 매우 뛰어난 효과가 있다.Saccharomyces cerevisiae KNU5377 strain of the present invention shows high resistance to multiple stresses such as high temperature, high concentration of ethanol, H 2 O 2, organic solvents, heavy metals and inorganic acids, and excellent ethanol fermentation ability at high temperature It is very effective to study the stress response of yeast and high temperature ethanol fermentation.
Description
본 발명은 다중적 스트레스에 대한 내성을 가지며, 고온성 에탄올 발효능이 우수한 신규 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주에 관한 것이다.The present invention relates to a novel Saccharomyces cerevisiae KNU5377 strain that is resistant to multiple stresses and has excellent high temperature ethanol fermentation ability.
본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 기존에 보고된 어떠한 동종의 균주보다도 우수한 고온내성을 가지고 있으며, 또한 다중적 스트레스에 대하여도 우수한 내성을 가지고 있는 균주를 제공함으로써 새로운 스트레스내성 획득기작의 존재를 밝히고, 균주 개발의 새로운 분야인 스트레스반응을 중심으로 한 스트레스내성균주의 특성을 신기술로서 개발, 응용하여 활용할 수 있다. 또한 새로운 스트레스내성 획득기작의 존재를 밝히는 연구모델균주로서 활용할 수 있고, 존재하는 특성을 더욱 증가시키거나 조절하는 기술을 연구할 수 있는 모체균주로서 이용할 수 있다.Saccharomyces cerevisiae KNU5377 strain of the present invention has a higher temperature resistance than any of the previously reported homologous strains, and also provides a new stress resistance acquisition mechanism by providing a strain having excellent resistance to multiple stresses It is possible to develop and apply the characteristics of stress resistant strains based on stress response, which is a new field of strain development, as a new technology. In addition, it can be used as a research model strain to reveal the existence of a new stress tolerance acquisition mechanism, and as a parent strain to study the technology to further increase or control the existing characteristics.
본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 고온내성, H2O2,유기용매, 무기황산, 에탄올, 중금속 등을 대상으로 다양한 스트레스에 대한 내성능을 측정함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors completed the present invention by measuring resistance to various stresses against high temperature resistance, H 2 O 2 , organic solvents, inorganic sulfuric acid, ethanol, heavy metals, and the like in Saccharomyces cerevisiae.
따라서, 본 발명의 목적은 다중적 스트레스에 대한 내성을 가진 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주를 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a strain KNU5377 in Saccharomyces cerevisiae that is resistant to multiple stresses.
본 발명의 상기 목적은 고온내성을 가진 효모를 토양으로부터 선택적으로 분리하여, 고온하에서의 생존능과 발효능을 검증하는 한편, 상기 효모균주의 고온내성, H2O2, 유기용매, 무기황산, 에탄올 및 중금속 등의 다중적 스트레스 내성 특성을 조사함으로써 달성하였다.The above object of the present invention is to selectively separate the yeast having high temperature resistance from the soil, verifying the viability and fermentation capacity under high temperature, while the high temperature resistance of the yeast strain, H 2 O 2 , organic solvent, inorganic sulfuric acid, ethanol and heavy metals This was achieved by investigating the multiple stress tolerance characteristics of the back.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.Hereinafter, the configuration and operation of the present invention.
도 1은 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 60℃에서 30분간 열처리에서의 생존능을 나타낸 사진이다.Figure 1 is a photograph showing the viability of heat treatment for 30 minutes at 60 ℃ of KNU5377 strain Saccharomyces cerevisiae of the present invention.
도 2는 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 고온에서의 에탄올 발효율을 나타낸 결과이다.Figure 2 is a result showing the ethanol efficiency at high temperature of the KNU5377 strain Saccharomyces cerevisiae of the present invention.
도 3은 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 ITS 1과 ITS 2 염기서열을 나타낸 결과이다.Figure 3 is a result showing the ITS 1 and ITS 2 base sequence of the KNU5377 strain Saccharomyces cerevisiae of the present invention.
도 4는 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 H2O2에 대한 내성을 나타낸 사진이다.Figure 4 is a photograph showing the resistance to H 2 O 2 of the KNU5377 strain Saccharomyces cerevisiae of the present invention.
도 5는 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 유기용매내성을 나타낸 사진이다.5 is a photograph showing the organic solvent resistance of KNU5377 strain Saccharomyces cerevisiae of the present invention.
도 6는 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 0.2%의 무기황산이 포함된 배지에서의 발효능을 나타낸 결과이다.Figure 6 shows the fermentation capacity of the present invention Saccharomyces cerevisiae medium containing 0.2% of inorganic sulfuric acid of KNU5377 strain.
도 7은 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 에탄올에 대한 내성을 나타낸 사진이다.Figure 7 is a photograph showing the resistance to ethanol of the strain KNU5377 strain Saccharomyces cerevisiae of the present invention.
도 8은 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 중금속 내성을 나타낸 결과이다.8 is a result showing the heavy metal resistance of the strain KNU5377 to Saccharomyces cerevisiae of the present invention.
본 발명은 초고온내성균주를 선택적으로 분리 및 동정하는 단계; 상기 동정된 효모균주의 다중적 스트레스 내성을 조사하는 단계; 상기 다중적 스트레스 내성의 특성을 조사하는 단계로 구성된다.The present invention comprises the steps of selectively separating and identifying ultra-high temperature resistant strains; Investigating the multiple stress tolerance of the identified yeast strains; Investigating the characteristics of the multiple stress resistance.
다중적 스트레스 내성 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 초고온내성을 가진 효모를 한국내 자연계에서 분리하여 그 내성능을 측정하고, 그 내성이 유래가 없는 고온내성을 보임에 따라 그 균주가 사카로마이세스 세레비지아에라는사실을 실시예 1과 같이 재동정하여 검증하였다. 또한 아래 실시예 1과 2에 나타낸 바와 같이 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 다양한 스트레스에 대한 우수한 내성능과 고온발효능을 보였다는 점에서 다중적 스트레스에 대한 내성능도 가지고 있음을 확인하였다.The KNU5377 strain in multiple stress-resistant Saccharomyces cerevisiae isolates yeast with ultra-high temperature resistance from nature in Korea and measures its resistance ability. The romanis cerevisiaera was verified by resympathy as in Example 1. In addition, as shown in Examples 1 and 2 below, the strain KNU5377 in Saccharomyces cerevisiae showed excellent resistance to various stresses and high temperature fermentation ability, and thus, also has resistance to multiple stresses. It was.
본 발명 효모균주가 가지는 각종 스트레스에 대한 내성능과 그 관련기작의 특성은 다른 사카로마이세스 세레비지아에 균주와 상당한 차이를 보이고 있으며, 일례로 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 40℃에서의 에탄올발효율이 주정회사의 통상적인 30℃ 발효율과 유사하였다.Tolerance to various stresses of the yeast strain of the present invention and the characteristics of the related mechanisms are different from those of Saccharomyces cerevisiae. It shows a significant difference from the strain, for example, in the present invention Saccharomyces cerevisiae KNU5377 strain ethanol efficiency at 40 ℃ similar to the conventional 30 ℃ efficiency.
상기 균주가 가지는 특성 중 고온내성은 YPD agar 배지에서 60℃, 30분 열처리후에도 생존이 가능하며, 무기산 내성은 황산이 0.2%포함된 발효배지(포도당 20%, 이스트 추출액 1%)에서 2일만에 약 3%(v/v)에 달하는 알콜생산이 가능하였다. 그리고 에탄올에 대한 내성은 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 경우 20% 에탄올로 효모균주를 90분간 스트레스를 가하여도 생존이 가능하였다.Among the characteristics of the strain, high temperature resistance can survive after heat treatment at 60 ° C. for 30 minutes in YPD agar medium, and inorganic acid resistance is only in 2 days in fermentation medium containing 20% sulfuric acid (20% glucose, 1% yeast extract). About 3% (v / v) alcohol production was possible. The resistance of ethanol to Saccharomyces cerevisiae was 20% ethanol in the case of the KNU5377 strain, which survived the stress for 90 minutes.
H2O2에 의한 산화적 스트레스(oxidative stress)에 대해서는 10mM H2O2가 함유된 YPD agar 배지에서 각 효모균주를 접종하였을 때도 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 생육도가 가장 우수하였다. 또한 10mM, 15mM, 20mM, 25mM H2O2에 효모균주를 각각 2시간동안 노출시켰을 때 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 생존능은 ATCC24858와 유사하지만, W303균주보다는 상대적으로 우수한 생존능을 보였다.For the oxidative stress (oxidative stress) due to H 2 O 2 10mM H 2 O 2 containing a YPD agar when hayeoteul inoculated to each of yeast strains in a culture medium of this invention saccharide in my process is also the growth of KNU5377 strain in three Levy Jia Best. When the yeast strains were exposed to 10mM, 15mM, 20mM, and 25mM H 2 O 2 for 2 hours, the viability of KNU5377 strain in Saccharomyces cerevisiae was similar to that of ATCC24858, but showed better survival than that of W303 strain. .
또한 15종의 유기용매를 10%농도로 30분간 처리후 생존능 조사에서 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 시클로헥산을 포함해 모두 10종의 유기용매하에서 생존하였으며, 특히 나이트로메탄과 벤조나이트릴이라는 유기용매에 대해서는 다른 대조균주는 사멸한 데 반해 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 생존하였다.In addition, 15 kinds of organic solvents were treated with 10% concentration for 30 minutes and then examined for viability. KNU5377 strains survived under 10 organic solvents, including cyclohexane, and in particular, the other control strains were killed for the organic solvents nitromethane and benzonitrile, whereas the KNU5377 strain of Saccharomyces cerevisiae of the present invention. The strain survived.
중금속에 대한 내성의 증거로서 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 5mM 농도의 납에서도 생육이 가능하였다.Saccharomyces cerevisiae as evidence of resistance to heavy metals. KNU5377 strain was able to grow even at 5mM lead.
이하, 본 발명의 구체적 구성 및 작용을 실시예를 들어 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the specific configuration and operation of the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited only to these Examples.
실시예 1 : 초고온내성균주의 선택적 분리 및 동정Example 1 Selective Isolation and Identification of Ultra-High Temperature Strains
한국 자연계에서 채집된 각종 토양, 하천 등지의 미생물 중에서 고온내성을 가진 효모를 선택적으로 분리하여, 고온하에서의 생존능과 발효능을 검증하였다. 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377은 YPD agar(이스트 추출액 1%, 펩톤 2%, 덱스트로즈 2%, 한천 1.8%)배지에 획선하여 60℃, 30분간 열처리한 후 다시 30℃에서 항온배양하였다. 실험결과 도 1과 같이, 단지 15시간의 배양만으로도 본 발명 균주는 콜로니가 형성된다는 점을 통해 우수한 고온내성이 있음을 확인하였다. 또한 도 2와 같이 상기 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 고온내성을 바탕으로 발효배지(glucose 20%, yeast extract 1%)가 포함된 배지에서 40℃에서도 48시간만에 90%에 달하는 에탄올발효율을 나타내었다.Yeasts with high temperature resistance were selectively isolated from various microorganisms of soil, rivers, etc. collected from Korean natural systems, and the viability and fermentation ability at high temperature were verified. Saccharomyces cerevisiae KNU5377 was decanted on YPD agar (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 1.8% agar) and heat-treated at 60 ° C for 30 minutes, and then incubated at 30 ° C. Experimental results, as shown in Figure 1, only 15 hours of incubation was confirmed that the strain of the present invention has excellent high temperature resistance through the formation of colonies. Also in the Saccharomyces cerevisiae as shown in FIG. Based on the high temperature resistance of the KNU5377 strain, the medium containing fermentation broth (glucose 20%, yeast extract 1%) showed ethanol development efficiency of 90% in 48 hours even at 40 ℃.
이와 같은 고온내성의 특성은 일반적인 사카로마이세스 세레비지아에 균주에서는 볼 수 없었던 것으로 균주의 정밀한 동정이 요구되어 균체 지방산분석 및 ITS 1과 ITS 2 (Internally transcribed spacer 1 2) gene의 서열분석을 통해 전형적인 사카로마이세스 세레비지아에 임을 재확인하였다(도 3).Such high temperature resistance characteristics are common in Saccharomyces cerevisiae. As it was not found in the strain, precise identification of the strain was required, and the typical Saccharomyces cerevisiae was analyzed through cell fatty acid analysis and sequencing of ITS 1 and ITS 2 (Internally transcribed spacer 1 2) genes. It was confirmed again (FIG. 3).
상기의 본 발명 신규한 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 2000년 4월 15일 생명공학연구소 유전자은행에 수탁번호 KCTC 18004P로 기탁하였다.The novel Saccharomyces cerevisiae KNU5377 strain of the present invention was deposited with the accession number KCTC 18004P to the Bank of Biotechnology Research Institute on April 15, 2000.
실시예 2 : 다중적 스트레스내성의 조사Example 2 Investigation of Multiple Stress Tolerances
고온내성이 확인된 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 다른 스트레스인자에 대한 내성의 조사는 고온내성 이외에도 H2O2, 유기용매, 무기황산, 에탄올 및 중금속을 대상으로 행하여졌다.Saccharomyces cerevisiae where high temperature resistance was confirmed Investigation of the resistance of KNU5377 strains to other stressors, in addition to high temperature resistance,2O2, Organic solvents, inorganic sulfuric acid, ethanol and heavy metals.
H2O2에 대한 내성조사는 먼저 10mM 농도의 H2O2가포함된 YPD agar 배지에 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주와 다른 대조균주를 동시에 spotting하고 30℃에서 24시간동안 배양하였다. 또한 수용액상태에서 각 효모균주를 10mM, 15mM, 20mM 및 25mM 의 H2O2에 노출시킨 후 YPD agar 배지에 spotting하여 생육도를 조사하였다.H2O2Investigation of resistance to H was first conducted at a concentration of 10 mM2O2Saccharomyces cerevisiae in YPD agar medium containing KNU5377 strain and other control strains were spotted at the same time and incubated at 30 ° C for 24 hours. In addition, each of the yeast strains in the aqueous solution was 10mM, 15mM, 20mM and 25mM H2O2After exposure to the YPD agar medium by spotting on the growth was examined.
실험결과 도 4와 같이 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주가 30℃에서 24시간동안 배양기 가장 우수한 생육능을 보였고, 수용액상태에서 각 효모균주를 10mM, 15mM, 20mM 및 25mM 의 H2O2에 노출시킨 후 YPD agar 배지에 spotting한결과에서도 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주가 대조균주로서 에탄올내성을 가지고 있는 ATCC24858와 더불어 우수한 내성을 보였다.Experimental results in Saccharomyces cerevisiae as shown in FIG. The KNU5377 strain showed the best growth ability in the incubator at 30 ° C for 24 hours, and each yeast strain was 10mM, 15mM, 20mM and 25mM H in aqueous solution.2O2After exposure to YPD agar, spotting on Saccharomyces cerevisiae KNU5377 strain showed excellent resistance with ATCC24858 which has ethanol resistance as a control strain.
유기용매에 대한 내성은 효모균주들을 15가지의 유기용매 10%에 각각 30분간 노출시킨 후 YPD agar 배지에 접종하여 내성도를 확인한 결과, 도 5와 같이 DMSO(Dimethylsulfoxide)를 포함한 4종의 유기용매에서는 모든 실험균주가 사멸하였으며, 그 외 시클로헥산을 포함한 10종의 유기용매에서는 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주가 생존하였으며, 특히 나이트로메탄과 벤조나이트릴이라는 유기용매에 대해서는 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주가 유일하게 생존하였다.The resistance to the organic solvent was exposed to yeast strains in 10 kinds of 15 organic solvents for 30 minutes, and then inoculated in YPD agar medium to confirm the resistance, four organic solvents including DMSO (Dimethylsulfoxide) as shown in FIG. All experimental strains were killed by E. coli and 10 organic solvents including cyclohexane were added to Saccharomyces cerevisiae. The KNU5377 strain survived, and the only KNU5377 strain survived in Saccharomyces cerevisiae, especially for organic solvents such as nitromethane and benzonitrile.
무기황산에 대한 조사에서도 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 생존율은 유사하지만, 0.2%의 황산(36.5mM)이 포함된 발효배지에서 대조균주보다 우수한 발효능을 보인 것으로 나타나 황산에 대한 내성이 보다 우수함을 보였다(도 6).In the investigation of inorganic sulfuric acid, Saccharomyces cerevisiae The KNU5377 strain showed a similar survival rate, but showed better fermentation ability than the control strain in fermentation broth containing 0.2% sulfuric acid (36.5 mM) (Figure 6).
또한 에탄올에 대한 내성조사에서도 20% 에탄올에 10분간격으로 총 90분간 노출시킨 후 그 생존도를 YPD agar에 균주를 spotting 함으로써 조사한 결과, 도 7과 같이 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주만이 20% 에탄올에서 90분간 노출되어도 생존하였다.In addition, the resistance to ethanol was also exposed to 20% ethanol for 10 minutes at a total interval of 90 minutes, and the viability was investigated by spotting the strain on YPD agar. As shown in FIG. Only KNU5377 strain survived exposure to 20% ethanol for 90 minutes.
중금속에 대한 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 내성은 YPD 배지에 납, 카드륨, 수은을 각 농도별(0.1mM-20mM)로 혼합시켜 효모균주의 생육도를 조사하여 검증하였다. 실험결과 도 8과 같이, 카드늄과 수은에 대한 내성도는 실험균주간 차이가 없이 서로 유사하였으나, 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 특이하게도 5mM 농도의 납에서도 생육이 가능하였다.Saccharomyces cerevisiae for heavy metals The resistance of KNU5377 strain was verified by mixing lead, cadmium, and mercury in different concentrations (0.1mM-20mM) in YPD medium and examining the growth of yeast strains. Experimental results, as shown in Figure 8, the resistance to cadmium and mercury was similar to each other without differences between the experimental strains, but in Saccharomyces cerevisiae The KNU5377 strain was also able to grow even at a concentration of 5 mM lead.
실시예 3 : 다중적 스트레스내성의 특성Example 3 Characteristics of Multiple Stress Tolerances
상기 실시예 2에서 기술한 다중적 스트레스 내성의 획득에 관련한 각종 생리적 특징에 대해서도 조사하였다. 즉 전체 세포의 안정성, 세포막의 안정성과 이에 관련한 지방산의 변화 등을 관찰하였으며, 트레할로스의 축적량과 중성 트레할라제의 활성 및 효모세포의 고온내성과 밀접한 관련이 있는 Hsp(heat shock protein)인 Hsp104와 Hsp90의 발현량을 웨스턴 블로팅을 통해서 비교하였다. 또한 전기영동 패턴, 열처리후 유도되는 특정단백질의 존재여부 및 43℃에서의 단백질 합성능을 조사하였다.Various physiological features related to the acquisition of multiple stress tolerance described in Example 2 were also investigated. In other words, the stability of the whole cell, the stability of the cell membrane and related fatty acid changes were observed. Hsp104, a heat shock protein (Hsp104), closely related to trehalose accumulation, neutral trehalase activity, and high temperature resistance of yeast cells, The expression level of Hsp90 was compared by western blotting. In addition, electrophoresis patterns, the presence of specific proteins induced after heat treatment, and protein synthesis at 43 ° C were investigated.
전체 세포의 열안정성은 DSC(Differential Scanning Calorimeter)로서 5∼105℃까지 분당 1℃씩 증가시켜 세포의 열변성도를 측정하여 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 전체 세포 열안정성이 기본적으로 대조균주에 비해 열안정성이 4∼5℃정도 더 높은 것으로 밝혀졌다. 그리고 전처리 즉, 열 충격에 의한 세포내 구성성분의 유도적 안정화가 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 경우에만 특이적으로 관찰되었고, 이 결과는 트레할로스의 세포내 축적량과 중성 트레할라제의 활성의 측정결과에서 구성성분 안정화의 원인을 찾을 수 있었다. 즉 43℃에서 효모세포를 90분간 열처리한 경우 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 트레할로스의 축적량이 대조균주에 비해 상대적으로 훨씬 높게 나타났으며,반대로 중성 트레할라제의 활성은 상대적으로 훨씬 낮게 나타남에 따라 트레할로스의 축적에 의한 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주에서의 구성성분안정화가 발생한 것일 가능성이 높게 나타났다.The thermostability of the whole cell is DSC (Differential Scanning Calorimeter), which is increased by 1 ℃ per minute from 5 ~ 105 ℃ to measure the thermal denaturation of the cells. The total cell thermal stability of KNU5377 strain was found to be 4-5 ° C higher than that of the control strain. Induction stabilization of intracellular components by pretreatment, ie, thermal shock, was performed on Saccharomyces cerevisiae. Only the KNU5377 strain was specifically observed, and the result was found to be the cause of component stabilization in the measurement of the intracellular accumulation of trehalose and the activity of neutral trehalase. In other words, when the yeast cells were heat-treated at 43 ° C. for 90 minutes, they were applied to Saccharomyces cerevisiae. In the KNU5377 strain, trehalose accumulation was much higher than that of the control strain, whereas the activity of neutral trehalase was much lower than that of Saccharomyces cerevisiae. It was highly likely that component stabilization occurred in the KNU5377 strain.
세포막의 안정성 실험은 플루오폴라리메터(Fluoropolarimeter;RF-1500, Shimatsu co.)를 이용하였다. DPH(Diphenyl hexatriene;C18H16, Mw=232.32, Molcular probe #D-202)시약과 tma-DPH[1-(4-trimethylammoniumphenyl)-6-phenyl-1,3,5-hexatriene Iodide] 시약을 이용하여 지질 이중층의 막 유동성을 형광편광 분석법에 의해 측정한 결과, 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 40℃에서 12시간동안 배양하였음에도 막유동성이 상대적 안정함을 확인할 수 있었다.The stability test of the cell membrane was performed using Fluoropolarimeter (RF-1500, Shimatsu co.). DPH (Diphenyl hexatriene; C18H16, Mw = 232.32, Molcular probe # D-202) and tma-DPH [1- (4-trimethylammoniumphenyl) -6-phenyl-1,3,5-hexatriene Iodide] reagent were used to fluoresce the membrane fluidity of the lipid bilayer. As a result of measurement by polarization analysis method, to Saccharomyces cerevisiae The KNU5377 strain was found to be relatively stable even after incubation at 40 ℃ for 12 hours.
막유동성이 상대적으로 안정하게 유지된다는 결과와 더불어 각 온도별(30, 37, 40℃), 배양시간별(12hrs, 16hrs, 24hrs)로 배양한 효모균주 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377, ATCC24858 균주를 발효배지에서 시간별로 그리고 각 온도별로 배양한 배양액을 살균수로 3회 세척 후 집균하여 세포막의 지방산 분석을 위한 시료로서 사용하였다(한국과학기술원 생명공학연구소 유전자은행에 분석 의뢰). 그 결과 표 1에 나타낸 바와 같이 또한 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주의 경우만이 불포화지방산의 함량이 상대적으로 안정한 비율로 유지되었다.Yeast strain Saccharomyces cerevisiae incubated at each temperature (30, 37, 40 ℃) and incubation time (12hrs, 16hrs, 24hrs) with the result that membrane fluidity is relatively stable. KNU5377 and ATCC24858 strains were cultured in fermentation broth over time and at each temperature, washed three times with sterilized water, and then collected and used as samples for the analysis of fatty acids in cell membranes (requested by the Korea Advanced Institute of Science and Technology). . As a result, as shown in Table 1, Saccharomyces cerevisiae Only in the case of KNU5377 strain, the unsaturated fatty acid content was maintained at a relatively stable ratio.
Hsp(heat shock protein)의 발현량, 특히 효모세포의 고온내성과 각종 스트레스에 대한 내성에 깊은 관련이 있는 Hsp104, Hsp90의 발현량을 웨스턴 블로팅으로 비교한 결과에서 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 일반적으로 알려진 heat shock에 의한 Hsp의 증가가 관찰되지 않는 특이한 현상이 나타났다. 따라서 근본적으로 일반효모균주와는 다른 내성기작을 가지고 있을 가능성이 많다는 점을 알 수 있었으며, 또한 43℃에서 2시간동안 열처리한 세포에서 그 단백질 생합성능을 조사한 결과에서도 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 대조균주에 비해 월등한 단백질 생합성능을 보였다.The expression of Hsp (heat shock protein), especially Hsp104 and Hsp90, which are closely related to the high temperature resistance of yeast cells and resistance to various stresses, was compared by Western blotting. The KNU5377 strain showed an unusual phenomenon in which Hsp increase was not observed due to a known heat shock. Therefore, it was found that there is a possibility that it has fundamentally different resistance mechanism from that of the general yeast strain. KNU5377 strain showed superior protein biosynthesis compared to control strain.
이상의 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명 사카로마이세스 세레비지아에 KNU5377 균주는 고온내성, H2O2, 유기용매, 무기황산, 에탄올 및 중금속 등 각종 스트레스에 대한 내성과 스트레스하에서의 발효능이 우수하여 고온에서의 에탄올발효 및 효모의 스트레스반응에 대한 모델균주로서 이용할 수 있으므로 미생물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described through the above examples, the present invention Saccharomyces cerevisiae KNU5377 strain is resistant to various stresses such as high temperature resistance, H 2 O 2 , organic solvents, inorganic sulfuric acid, ethanol and heavy metals and fermentation ability under stress It is excellent because it can be used as a model strain for ethanol fermentation and yeast stress reaction at high temperature is a very useful invention in the microbial industry.
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