KR100389075B1 - Kit for Identifying Motile Microorganisms and Method for Using Thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 운동성 미생물을 용이하게 검출하기 위한 키트에 관한 것으로서, 각 웰의 내부 중앙에 구멍이 형성되어 있고, 하단부 일부가 절단된 팁이 상기 각 구멍에 삽입되어 있는 상층 웰 마이크로티터 플레이트와; 상기 팁의 하단이 각 웰의 내부 바닥면과 이격되도록 상기 상층 웰 마이크로티터 틀레이트와 결합되어 있는 하층 웰 마이크로티터 플레이트;로 구성된다.The present invention relates to a kit for easily detecting a moving microorganism, comprising: an upper well microtiter plate in which a hole is formed in an inner center of each well, and a tip having a portion cut at a lower end thereof is inserted into each hole; And a lower well microtiter plate coupled to the upper well microtiter tlate so that the lower end of the tip is spaced apart from the inner bottom surface of each well.
본 발명에 의하면 증균배지와 회수배지가 같은 장치안에 장착되어 2 종 이상의 운동성이 있는 미생물을 동시에 검출할 수 있고, 다수의 식품 또는 사료의 샘플을 증균 후 다시 다른 장치에 옮겨야 하는 문제점을 해결할 수 있게 된다.According to the present invention, the enrichment medium and the recovery medium can be mounted in the same device to simultaneously detect two or more kinds of motility microorganisms, and solve the problem of transferring a plurality of food or feed samples to another device after enrichment. do.
Description
본 발명은 운동성이 있는 미생물을 동시에 검출할 수 있는 키트 및 그 사용방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 편모 내지 섬모를 가진 운동성이 있는 미생물들에 오염되어있다고 생각하는 식품 또는 사료의 조직으로부터 운동성 미생물의 오염여부를 간편하게 실험할 수 있는 키트 및 사용방법에 관한 것이다.The present invention relates to a kit capable of detecting motility microorganisms at the same time and a method of using the same, and more particularly, to motility microorganisms from tissues of food or feed which are considered to be contaminated with motility microorganisms having flagella to cilia. It relates to a kit that can be easily tested whether the contamination and the method of use.
종래 식품 또는 사료에 대한 미생물의 오염여부를 판단하기 위해서는, 대상 식품 또는 사료에 비해 미생물이 차지하는 비율이 낮으므로, 먼저 식품 또는 사료의 조직의 일부를 채취하여 증균배지에 배양하여 균수를 증가시키는 단계가 필수적으로 요구되었다.In order to determine whether the microorganisms are contaminated with the conventional food or feed, the microorganisms occupy a lower proportion than the target food or feed, so that a part of the tissue of the food or feed is first collected and cultured in an enrichment medium to increase the number of bacteria. Was required.
구체적인 확인방법으로는, 첫째 직접 조직을 광학현미경이나 전자현미경으로 확인하는 방법이 있고, 둘째 오염이 의심스러운 조직을 파괴하여 전기영동 등으로 게놈(Genome)을 분리한 후 이를 혼성화시킨 후 서던 블라팅 또는 노던 블라팅으로 의심되는 미생물의 게놈과의 결합여부를 검사하여 미생물을 확인하는 방법이 있다. 셋째 미생물이 자기만의 고유한 단백질을 생성한다는 점을 이용하여 이에 결합하는 항체와 결합시킨 후 이를 다시 형광물질로 표지된 2차항체를 붙여 시각적으로 확인가능한 방법이 있고, 넷째 검출하고자 하는 미생물의 세포막단백질이나 미생물이 생성하는 단백질에 반응하는 배지를 이용하는 방법 등이 있다.As a specific method of verification, first, a direct tissue can be identified by an optical microscope or an electron microscope. Second, by destroying a tissue suspected of contamination and separating the genome by electrophoresis, hybridizing it, and then Southern blotting. Alternatively, there is a method for identifying microorganisms by checking whether the microorganisms are suspected of Northern blotting and their binding to the genome. Third, there is a method of visually confirming by attaching a secondary antibody labeled with a fluorescent material after binding to the antibody that binds to it using the fact that the microorganism generates its own unique protein. And a method of using a medium that reacts with a protein produced by cell membrane proteins or microorganisms.
광학현미경이나 전자현미경에 의한 관찰방법은 미생물이 아주 작은 경우나 미생물의 특징이 없어 식별이 불가능한 경우에는 사용하지 못하는 단점이 있다.Observation method by optical microscope or electron microscope has a disadvantage that cannot be used when the microorganism is very small or when the identification is not possible due to the characteristics of the microorganism.
서던 블라팅 또는 노던 블라팅의 방법은 여러공정을 거쳐야하는 번거로움과 방사성물질을 사용하기 때문에 위험을 내포하고 있다. 또한 상기의 실험에는 전문인력이 필요하고 고가장비가 필요하다.Southern blotting or northern blotting involves risks due to the hassle and radioactive materials that have to go through several processes. In addition, the above experiment requires professional personnel and expensive equipment.
항체를 이용하는 방법은 미생물 고유의 단백질의 여부를 검사하여야 하고,그 특정 단백질에 반응하는 항체를 제조해야하는 불편함이 있다.The method of using an antibody is inconvenient to test for the presence of a protein unique to the microorganism, and to prepare an antibody that responds to the specific protein.
미생물에 반응하는 배지를 이용하는 방법은 퓽(Fung)과 크래프트(Kraft)가 살모넬라(Salmonellasp.)의 검출에 운동성 미생물용 선택배지와 생화학적 실험의 조합을 사용하여 멀티레이어 네펠로플라스크(multilayer nepheloflask)을 1970년에 고안하였다. 또한, 유(Yu)와 퓽(Fung)은 이용한 퓽-유 튜브(Fung-Yu tube)을 개발하여 리스테리아(Listeriasp.)의 검출을 용이하게 하였다. 최근(1999년)에 강(Kang) 과 퓽(Fung)은 10㎖ 피펫과 1㎖ 피펫을 이용하여 더블 피펫메소드 (Double-pipette(DP) method)를 고안한 바 있다.A method using a microorganism-responsive medium is a multi-layer nepheloflask using a combination of Fung and Kraft's selection of kinetic microbial and biochemical experiments for the detection of Salmonella sp. ) Was devised in 1970. In addition, Yu and Fung developed a Fung-Yu tube that facilitated the detection of Listeria sp. Recently (Kang) and Fung have devised a double-pipette method (Double-pipette (DP) method) using a 10 ml pipette and a 1 ml pipette.
이들의 방법은 신뢰성 있게 미생물의 검출을 조기에 시각적으로 판단할 수 있게하여 기존의 방법에 비해 진일보 되었으나, 미생물이 들어있는 식품 또는 사료유래 병원균을 동시에 분리할 수 없는 단점이 있다.These methods have advanced compared to the conventional method by allowing the early detection of microorganisms can be visually determined reliably, but there is a disadvantage in that food or feed-derived pathogens containing microorganisms cannot be separated at the same time.
본 발명은 상기와 같은 미생물에 반응하는 배지를 이용하는 방법이 가지는 2가지 이상의 운동성이 있는 미생물을 동시에 검출할 수 없는 문제점과, 증균된 액체배지를 다시 다른 장치에 옮겨야하는 문제점을 해결하고, 손쉽게 구할 수 있는 웰 마이크로티터 플레이트, 팁, 등을 이용하여 운동성이 있는 여러종류의 미생물들이 감염되어 있다고 생각되는 식품 또는 사료들의 샘플로 부터 쉽게 시각적으로 검출할 수 있게 하는 키트 및 그 키트의 사용장법을 제공하는 것이다.The present invention solves the problem of not being able to simultaneously detect two or more motility microorganisms of the method using a medium that reacts with such microorganisms, and the problem of transferring the enriched liquid medium back to another device, and is easily obtained. Provides a kit and a method of using the kit that can easily visually detect from a sample of a food or feed that is thought to be infected with a variety of motility microorganisms using a number of well microtiter plates, tips, etc. It is.
도 1은 본 발명에 의한 키트의 일 예를 보여주는 사진.1 is a photograph showing an example of a kit according to the present invention.
도 2는 본 발명에 의한 키트의 웰 및 팁 부분의 확대도.2 is an enlarged view of the well and tip portions of a kit according to the present invention.
도 3은 본 발명에 의한 키트 사용시 미생물의 운동방향을 나타내는 도면.3 is a view showing the direction of movement of microorganisms when using the kit according to the present invention.
도 4는 실시예1에 따른 선택배지의 색깔의 변화를 나타내는 도면.4 is a view showing a change in color of the selection medium according to the first embodiment.
(도면부호의 설명)(Explanation of drawing)
1...상층 웰 마이크로티터 플레이트1 ... Top Well Microtiter Plate
2...하층 웰 마이크로티터 플레이트2 ... lower layer well microtiter plate
3...팁 4...선택배지3 ... Tip 4 ... Optional Badge
5...회수배지 6...증균배지5 ... Recovery medium 6 ... Enrichment medium
본 발명에 의한 키트는, 각 웰의 내부 중앙에 구멍이 형성되어 있고, 하단부일부가 절단된 팁이 상기 각 구멍에 삽입되어 있는 상층 웰 마이크로티터 플레이트와; 상기 팁의 하단이 각 웰의 내부 바닥면과 이격되도록 상기 상층 웰 마이크로티터 틀레이트와 결합되어 있는 하층 웰 마이크로티터 플레이트;로 구성된다.The kit according to the present invention includes an upper well microtiter plate in which a hole is formed in an inner center of each well, and a tip of which a lower end portion is cut is inserted into each hole; And a lower well microtiter plate coupled to the upper well microtiter tlate so that the lower end of the tip is spaced apart from the inner bottom surface of each well.
상기 웰 마이크로티터 플레이트는 통상 본 발명이 속하는 분야의 실험실에서 사용하는 12웰, 24웰 등 어느 것이라도 가능하며, 상층 및 하층 웰 마이크로티터 플레이트는 서로 적층이 가능하도록 된 것을 이용한다.The well microtiter plate may be any one of 12 wells, 24 wells, and the like, which are generally used in a laboratory of the present invention. The upper and lower well microtiter plates may be stacked on each other.
한편, 상기 키트를 사용하기 위하여 본 발명은, 파라필름으로 상기 팁의 하부를 밀봉한 후 운동성 미생물에 대한 선택배지를 상기 팁의 상부로부터 분주하여 고형화시킨 다음 파라필름을 제거하고, 회수배지를 상기 팁의 상면보다 높게 분주한 상층 웰 마이크로티터 플레이트를; 각 웰에 검체샘플이 혼합된 증균배지를 분주한 하층 웰 마이크로티터 플레이트에; 결합시키는 과정으로 이루어진 상기 키트의 사용방법을 제공한다.On the other hand, in order to use the kit, the present invention, after sealing the lower part of the tip with a parafilm, the selective medium for the motility microorganisms is dispensed from the top of the tip to solidify and then remove the parafilm, the recovery medium is An upper well microtiter plate dispensed higher than the top of the tip; A lower well microtiter plate in which an enrichment medium in which sample samples are mixed in each well is dispensed; It provides a method of using the kit consisting of a process of bonding.
구체적인 상기 키트의 제조 및 사용과정을 설명한다.It describes the manufacturing and use process of the specific kit.
먼저, 상층 웰 마이크로티터 플레이트의 중앙부를 유리 막대기 등을 사용하여 구멍을 뚫고, 그 구멍에 팁을 삽입하여 팁의 외부와 상기 구멍이 접하는 부분을 밀봉처리한다. 이어서 상기의 팁들의 하단부분을 소독된 칼 등을 사용하여 자른 후, 살균처리한 파라필름을 사용하여 팁의 하부를 밀봉하고 운동성 미생물에 특징적으로 반응하는 선택배지를 팁에 부어 웰 마이크로티터 플레이트의 저면에서 일정높이까지 차도록 한다. 상기의 선택배지가 고형화된 후 회수배지를 선택배지 위부분에 부어 팁 위부분에 일정높이까지 차도록한 다음, 상기의 방법으로 만든 상층 웰 마이크로티터 플레이트를 검체 샘플이 혼합된 증균배지가 들어있는 하층 웰 마이크로티터 플레이트에 삽입하여 배양하는 것이다.First, the center portion of the upper well microtiter plate is drilled using a glass rod or the like, and a tip is inserted into the hole to seal the outside portion of the tip and the part in contact with the hole. Subsequently, the lower portions of the tips were cut using a sterilized knife or the like, and then, using a sterilized parafilm, the lower part of the tip was sealed and a selective medium that was characteristically reacted to the motility microorganisms was poured on the tip of the well microtiter plate. Try to kick it to a certain height from the bottom. After the selective medium is solidified, the recovery medium is poured into the upper part of the selective medium to fill the upper part of the tip to a certain height, and then the lower layer containing the enrichment medium containing the sample sample is mixed with the upper well microtiter plate made by the above method. It is inserted into a well microtiter plate and cultured.
본 발명에 의한 키트에 사용되는 웰 마이크로티터 플레이트는 웰 마이크로티터 플레이트의 지름의 크기에 따라 60㎖, 100㎖, 125㎖, 150㎖ 등을 사용할 수 있다. 또한 웰의 개수에 따라 8웰, 16웰, 24웰, 40웰 등 다양한 것을 사용할 수 있다. 본 명세서에서는 단순히 "웰 마이크로티터 플레이트"라는 용어를 사용하지만 상기 플레이트 이외에 여러 개의 작은 컵 등으로 대용하는 것도 가능하다.The well microtiter plate used in the kit according to the present invention may use 60 mL, 100 mL, 125 mL, 150 mL, etc. according to the size of the diameter of the well microtiter plate. In addition, depending on the number of wells can be used a variety of 8 well, 16 well, 24 well, 40 well. In this specification, the term "well microtiter plate" is simply used, but it is also possible to substitute a plurality of small cups or the like in addition to the plate.
본 발명에 의한 키트에 사용되는 팁은 용량에 따라 100㎕, 200㎕, 1㎖ 등 필요에 따라 다양한 것을 사용할 수 있다. 팁 역시 대용으로서 내부를 볼 수 있는 소형 깔때기 등을 사용할 수 있다.The tip used in the kit according to the present invention may be variously used as necessary, such as 100 µl, 200 µl, or 1 ml, depending on the dose. The tip can also be used as a substitute for a small funnel to look inside.
본 발명에 사용되는 선택배지의 예로서 리스테리아(Listeriaspp.)에 대해서는 리스테리아 선택배지(LSM)로서 옥스포드 아가 미디움(Oxford agar medium), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)에 대해서는 변형된(모든 탄소원이 제거된) 자일로스 라이신 디카보실라제(Xylose Lysine Decaboxylase(MXLD;Difco))가 있고, 다른 미생물에 대해서도 많은 선택배지가 밝혀져 있다.Listeria (Listeria spp.) As an example of a selective medium for use in the present invention as Listeria selection medium (LSM) for the (all carbon transformation for Oxford agar medium (Oxford agar medium), Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium) Xylose Lysine Decaboxylase (MXLD; Difco) has been removed, and many selection media have been identified for other microorganisms.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것이 아니다.The present invention will be described in detail through the following examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the present invention is not limited thereto.
사용된 배양균Cultures Used
칸사스 주립대학의 식품미생물학 컬쳐 콜렉션(Food Microbiology Culture Collection)으로 구한 리스테리아 모노사이토진(Listeria monocytogenes(Scott A)), 대장균(Escherichia coli(ATCC 11775)),대장균 O157:H7(Escherichia coliO157:H7(Eh7-7)), 살모넬라 티피모리엄(Salmonella typhimurium(ATCC 23566)), 예르시니아 엔터로콜리티카(Yersinia enterocolitica(CDC 1806-96)), 슈도모나스 플루레산스(Pseudomonas fluorescens(ATCC 13525)), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus(B-1)), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus(S-18))을 회수 배지(BHI broth)로 옮겨 37℃에서 24시간동안 배양한 균을 사용하였다. Listeria monocytogenes (Scott A), Escherichia coli (ATCC 11775) and Escherichia coli O157: H7 from Kansas State University's Food Microbiology Culture Collection (Eh7-7)), Salmonella typhimurium (ATCC 23566), Yersinia enterocolitica (CDC 1806-96), Pseudomonas fluorescens (ATCC 13525)) , Bacillus cereus (B-1) and Staphylococcus aureus (S-18) were transferred to recovery medium (BHI broth) and cultured for 24 hours at 37 ° C. It was.
실험의 정확도를 높이기 위해 검출하고자 하는 리스테리아 모노사이토진과 살모넬라 티피모니움의 균수는 10-6내지 10-7으로 희석시켜 사용하였고, 다른 배양균 들은 경쟁세균으로 10-2내지 10-3로 희석시켜 사용하였다.To increase the accuracy of the experiment, the number of bacteria of Listeria monocytozin and Salmonella typhimoniium to be detected was diluted to 10 -6 to 10 -7 , and other cultures were diluted to 10 -2 to 10 -3 with competitive bacteria. Used.
<실시예1>Example 1
두 플레이트 모두 24웰 마이크로티터 플레이트와, 선택용 고체배지로는 옥스포드 아가 배지를 사용하였다.Both plates used 24-well microtiter plates and oxford agar medium for selection as a solid medium.
하층 24 웰 마이크로티터 플레이트에는 상기의 살모넬라 티피모니움, 대장균, 대장균 O157:H7, 리스테리아 모노사이토진, 예르시니아 엔터로콜리티카, 슈도모나스 플루레산스, 바실루스 세레우스 및 스타필로코쿠스 아우레우스 각각 10㎖를 증균배지(90㎖)와 혼합하여 각각 3개의 웰에 접종한 후 30℃, 24시간 배양하여 선택배지의 색깔의 변화를 보았다.The lower layer 24-well microtiter plate contains Salmonella typhimonium, E. coli, E. coli O157: H7, Listeria monocytogene, Yersinia enterocytica, Pseudomonas fluresans, Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. Each 10ml was mixed with the enrichment medium (90ml) and inoculated in three wells, and then incubated at 30 ° C. for 24 hours to see the change in color of the selective medium.
선택배지에서의 색깔의 변화는 도4와 같이 리스테리아 모노사이토진을 접종 한 웰만이 검은색으로 변화하였다. 상기의 결과는 리스테리아 모노사이토진이 증균배지에서 증식하여 선택배지인 옥스포드 아가 미디움으로 이동하여 색깔의 변화가 나타난 것을 알 수 있다.As for the color change in the selection medium, only the wells inoculated with Listeria monocytogenes as shown in FIG. 4 changed to black. The results indicate that Listeria monocytogenes proliferate in enrichment medium and move to Oxford agar medium, which is a selective medium, to show a change in color.
<실시예 2><Example 2>
상기 자일로스 리신 디카보실라제가 함유된 선택배지를 사용하였다.A selective medium containing the xylose lysine dicarbosilase was used.
하층 24 웰 마이크로티터 플레이트에는 상기의 살모넬라 티피모니움, 대장균, 대장균 O157:H7, 리스테리아 모노사이토진, 예르시니아 엔터로콜리티카, 슈도모나스 플루레산스, 바실루스 세레우스 및 스타필로코쿠스 아우레우스 각각 10㎖를 증균배지(90㎖)와 혼합하여 각각 3개의 웰에 접종한 후 30℃, 24시간 배양하여 선택배지의 색깔의 변화를 보았다.The lower layer 24-well microtiter plate contains Salmonella typhimonium, E. coli, E. coli O157: H7, Listeria monocytogene, Yersinia enterocytica, Pseudomonas fluresans, Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. Each 10ml was mixed with the enrichment medium (90ml) and inoculated in three wells, and then incubated at 30 ° C. for 24 hours to see the change in color of the selective medium.
선택배지에서의 색깔의 변화는 살모넬라 티피모니움을 접종 한 웰만이 검은색으로 변화하였다. 상기의 결과는 살모넬라 티피모니움이 증균배지에서 증식하여 선택배지인 자일로스 리신 디카보실라제으로 이동하여 색깔의 변화가 나타난 것을 알 수 있다.The color change in the selection medium changed only to wells inoculated with Salmonella typhimoniium. The results indicate that Salmonella typhimonium was grown in the enrichment medium and moved to the selected medium, xylose lysine dicarbosilase, to show a change in color.
<실시예3>Example 3
24웰 마이크로티터 플레이트를 사용하였고 옥스포드 아가 배지 및 자일로스 리신 디카보실라제가 함유된 선택배지를 각각 12개의 팁에 적용하였다.A 24-well microtiter plate was used and a selection medium containing oxford agar medium and xylose lysine dicarbosilase was applied to 12 tips each.
하층 24 웰 마이크로티터 플레이트에는 상기의 살모넬라 티피모니움, 대장균, 대장균 O157:H7, 리스테리아 모노사이토진, 예르시니아 엔터로콜리티카, 슈도모나스 플루레산스, 바실루스 세레우스 및 스타필로코쿠스 아우레우스 각각 10㎖를 증균배지(90㎖)와 혼합하여 각각 3개의 웰에 접종한 후 30℃, 24시간 배양하여 선택배지의 색깔의 변화를 보았다.The lower layer 24-well microtiter plate contains Salmonella typhimonium, E. coli, E. coli O157: H7, Listeria monocytogene, Yersinia enterocytica, Pseudomonas fluresans, Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. Each 10ml was mixed with the enrichment medium (90ml) and inoculated in three wells, and then incubated at 30 ° C. for 24 hours to see the change in color of the selective medium.
선택배지에서의 색깔의 변화는 리스테리아 모노사이토진과 살모넬라 티피모니움을 접종 한 웰에서 선택배지가 일치하는 웰만이 검은색으로 변화하였다. 상기의 결과는 리스테리아 모노사이토진과 살모넬라 티피모니움이 증균배지에서 증식하여 선택배지인 옥스포드 아가 미디움, 자일로스 리신 디카보실라제으로 이동하여 색깔의 변화가 나타난 것을 알 수 있다.The color change in the selection medium changed from the wells that were inoculated with Listeria monocytozin and Salmonella typhimonium to black only with the matching medium. The results indicate that Listeria monocytozin and Salmonella typhimoniium were grown in enrichment medium and moved to selective medium, Oxford agar medium, and xylose lysine dicarbosylase.
이상과 같이 본 발명인 운동성이 있는 미생물을 동시에 검출할 수 있는 키트는 증균배지와 회수배지가 같은 장치안에 장착되어 있어 여러개의 식품 또는 사료의 샘플을 증균 후 다시 다른 장치에 옮겨야 하는 증균단계를 생략할 수 있게 한다.As described above, the kit that can simultaneously detect the motility microorganisms of the present invention is equipped with the same medium and recovery medium as the enrichment medium, so that the enrichment step of transferring several samples of food or feed after the enrichment to another device is omitted. To be able.
또한 동시에 2 종 이상의 운동성 미생물을 검출할 수 있어 기존의 미생물 검출방법에 비해 1/2 내지 1/3의 시간내에 검출이 가능하고, 기존의 미생물의 검출방법에 비해 선택배지의 양을 줄일 수 있다.In addition, two or more kinds of motility microorganisms can be detected at the same time, which can be detected in 1/2 to 1/3 of the time compared to the conventional microbial detection method, and can reduce the amount of selective medium compared to the conventional microbial detection method. .
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| KR10-2000-0024483A KR100389075B1 (en) | 2000-05-08 | 2000-05-08 | Kit for Identifying Motile Microorganisms and Method for Using Thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100389075B1 (en) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3649464A (en) * | 1969-12-05 | 1972-03-14 | Microbiological Ass Inc | Assay and culture tray |
| US3785928A (en) * | 1971-01-27 | 1974-01-15 | M Kessler | Bacteriological titration tray |
| US4511534A (en) * | 1982-05-26 | 1985-04-16 | John T. Bennett | Liquid transfer device |
| JPS60150456U (en) * | 1984-03-16 | 1985-10-05 | 日清製粉株式会社 | Microbial test reagent needle |
| US4591556A (en) * | 1969-05-03 | 1986-05-27 | Rolf Saxholm | Apparatus and associated methods for use in microbiological, serological, immunological, clinical-chemical and similar laboratory work |
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-
2000
- 2000-05-08 KR KR10-2000-0024483A patent/KR100389075B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (7)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20000058370A (en) | 2000-10-05 |
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