KR100388942B1 - A Single Chain Variable Fragment of an Antibody for Protein Expressed on Cell Surface of Human Cortical Thymocyte and Leukemic Cell - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인체의 피질 흉선 세포에 발현되는 세포 표면 단백질에 특이적으로 반응하는 재조합 항체에 관한 것으로서, 피질 흉선 세포와 백혈병과 T-림프 아구성 림프종의 종양세포에만 국한되어 발현됨이 면역 조직화학 염색과 유세포 측정을 통하여 밝혀진 12만 달톤(120kDa)정도의 분자량을 갖는 단백질인 JL-1항원을 인식하여 선택적으로 결합하는 항원인식부위를 포함하는 분절항체와 이를 제조하는 방법과 이러한 분절항체를 백혈병의 진단 및 치료에 이용하는 방법에 대한 것이다.The present invention relates to a recombinant antibody that specifically reacts with cell surface proteins expressed in human cortical thymic cells, and is expressed only in tumor cells of cortical thymic cells, leukemia, and T-lymphoblastic lymphoma. Segmented antibodies comprising an antigen recognition site that selectively recognizes and selectively binds JL-1 antigen, a protein having a molecular weight of about 120,000 Daltons (120 kDa) revealed through staining and flow cytometry, and a method of manufacturing the same and leukemia It is about the method used for the diagnosis and treatment of the.
Description
본 발명은 인체의 피질 흉선 세포와 백혈병 종양 세포의 표면 단백질에 특이적으로 반응하는 항체 및 그의 임상적 응용에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 피질 흉선 세포와 백혈병 및 T-림프 아구성 림프종의 종양 세포 표면에 발현되는 12만 달톤(120kDa)정도의 분자량을 갖는 단백질(이 단백질은 대한민국 특허출원 공개 제 94-26067호에 의해 JL-1항원으로 명명되어 있다)에 특이적으로 반응하는 항원인식부위(CDRs)를 포함하는 분절항체와 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to antibodies and their clinical applications that specifically react to surface proteins of human cortical thymic cells and leukemia tumor cells. More specifically, the present invention provides a protein having a molecular weight of about 120,000 Daltons (120 kDa) expressed on the surface of cortical thymic cells and tumor cells of leukemia and T-lymphocytic lymphoma (this protein is Korean Patent Application Publication No. 94-26067). Segmented antibodies comprising antigen-recognition sites (CDRs) that specifically respond to JL-1 antigens) and methods of making the same.
최근에 개발된 JL-1 항원에 대한 항체(이 항체는 대한민국 특허 제97-55593호에서 JL-1 항체로 명명되어 있다)는 인체 흉선세포를 항원으로서 흰 생쥐에게 주사하여 인체 흉선세포와 반응하는 항체를 생산하여 이를 분리한 후, 분리된 항체로 면역조직화학 염색을 통해 피질흉선세포(Cortical thymocyte)와 반응하는 항체를 선별하여 제조되며, 기탁번호 제 KCLRF-BP-00010호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 단클론 항체이다.Recently developed antibodies against the JL-1 antigen (the antibody is designated as JL-1 antibody in Korean Patent No. 97-55593), which react with human thymic cells by injecting human thymic cells as antigens into white mice After producing and isolating the antibody, it was prepared by screening the antibody that reacts with the cortical thymocytes through immunohistochemical staining with the separated antibody, deposited hybridoma No. No. KCLRF-BP-00010 It is a monoclonal antibody produced by.
백혈병 및 종양을 치료하고 그 발암 과정 메카니즘을 밝히고자 연구해온 과정에 있어서 개발된 기존의 단일 항체는 항체 생산 유전자의 인간화 작업 혹은 항체 분절화(단일사슬 가변영역 항체제조)등을 거치지 않은 동물(생쥐, 토끼 등) 유래의 항체로서, 인체 내에서 이종 단백질로 인지되기 때문에 과민 반응 혹은 면역거부 반응이 유도될 수도 있고, 또한 이러한 단일 항체의 분자량이 크기 때문에 작용 부위로의 접근이 느려 체내 주입용 치료제 및 진단제로서는 사용하기 어려운 문제 점이 있었다.Existing single antibodies developed in the process of treating leukemia and tumors and to investigate their carcinogenic mechanisms have not undergone humanization of antibody-producing genes or fragmentation (single-chain variable region antibodies). A rabbit-derived antibody, which is recognized as a heterologous protein in the human body, which may induce hypersensitivity reactions or immunorejection reactions, and due to its large molecular weight, access to the site of action slows access to the site of action, There was a problem that was difficult to use as a diagnostic agent.
따라서, 최근에는 기존의 생쥐 유래의 단일 항체를 키메라 항체 또는 인간화 항체, 분절 항체(single chain variable fragment(scFv)혹은 단일사슬가변영역항체)등의 인체내의 면역 거부 반응이 적고 항체 치료 효율이 좋은 유전자 재조합항체로 변형시킨 후에 인체에 투여하는 시도가 활발히 진행되고 있다.Therefore, in recent years, a single antibody derived from a mouse has a low immune rejection response in the human body such as a chimeric antibody, a humanized antibody, a single chain variable fragment (scFv), or a single chain variable region antibody, and has a high efficiency in antibody treatment. Attempts to administer to humans after transformation into recombinant antibodies are actively underway.
본 발명의 목적은 JL-1 항원을 인식하여 선택적으로 결합하는 항체(대한민국 특허 제 97-55593호에 의해 JL-1 항체라고 명명된 것)의 항원인식부위와 이들을 연결하는 링커로 이루어진 분절항체의 제조방법과 백혈병의 진단 및 치료제로서 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a fragment antibody comprising an antigen recognition site of an antibody that recognizes and selectively binds a JL-1 antigen (named JL-1 antibody by Korean Patent No. 97-55593) and a linker linking them. It provides a method of manufacture and a method of using the same for the diagnosis and treatment of leukemia.
이러한 JL-1 분절항체는 특히 인체의 피질 흉선 세포에 발현되는 단백질을 인식하는 항원인식부위를 포함하는 항체의 일부분으로 이루어져 항원을 특이적으로 인지할 수 있으며, 항체의 항원인식부위를 포함한 가변 영역에 해당하는 중사슬과 경사슬을 링커로 연결한 단일사슬 가변영역으로 이루어진다.The JL-1 fragment antibody consists of a part of an antibody including an antigen recognition site that recognizes a protein expressed in human cortical thymic cells, in particular, can recognize the antigen specifically, the variable region including the antigen recognition site of the antibody It consists of a single-chain variable region in which the heavy and light chains corresponding to the linker are linked by a linker.
JL-1 항체는 세포의 분화단계를 밝힐 수 있는 단백질로서 피질 흉선 세포와 백혈병과 T-림프아구성 림프종의 종양세포에만 발현되는 단백질에 특이적으로 반응하므로, 이 항체와의 반응 여부를 판단함으로써 흉선세포 및 조혈기관에서 유래된 종양 세포를 효과적이고 용이하게 진단, 치료할 수 있다.JL-1 antibody is a protein that can reveal the differentiation stage of cells, and specifically responds to proteins expressed only in cortical thymic cells and tumor cells of leukemia and T-lymphoblastic lymphoma. Tumor cells derived from thymic cells and hematopoietic organs can be diagnosed and treated effectively and easily.
도1은 본 발명의 분절항체를 제조하기 위한 플라즈미드(pTFvSN)의 유전자지도이다.1 is a genetic map of plasmid (pTFvSN) for producing the fragment antibody of the present invention.
도2는 도1에 나타난 플라즈미드를 이용하여 제조한 본 발명의 분절항체의 전기영동사진이다.Figure 2 is an electrophoresis picture of the fragment antibody of the present invention prepared using the plasmid shown in Figure 1.
도3은 실시예 4에서 수행한 효소면역측정(EIA) 결과이다.Figure 3 is an enzyme immunoassay (EIA) results performed in Example 4.
도4는 본 발명의 분절항체에 시스테인 택(Cys-tag)을 부착시킨 플라즈미드(pTFvCSN)의 유전자지도이다.Figure 4 is a genetic map of plasmid (pTFvCSN) to which the cysteine tag (Cys-tag) is attached to the fragment antibody of the present invention.
도5는 본 발명의 JL-1 분절항체(scFv)에 안지오제닌 서열을 붙여 함께 발현시키기 위한 플라즈미드(pTFvASN)의 유전자지도이다.Fig. 5 is a genetic map of plasmid (pTFvASN) for attaching and expressing angiogenin sequence to JL-1 segmental antibody (scFv) of the present invention.
도6은 도4와 도5의 시스테인 택을 포함한 JL-1 분절항체(JL-1 scFv-Cys)와 안지오제닌을 붙여 발현한 항체(JL-1 scFv-Ang)의 전기영동(SDS-PAGE)사진(좌)과 웨스턴 블럿 사진(우)이다.FIG. 6 shows electrophoresis (SDS-PAGE) of JL-1 fragment antibody (JL-1 scFv-Cys) and angiogenin-expressed antibody (JL-1 scFv-Ang) including the cysteine tag of FIGS. 4 and 5 (Left) and western blot (right).
도7은 JL-1 분절 항체의 효소면역측정 결과이다.7 shows enzyme immunoassay results of the JL-1 fragment antibody.
본 발명의 분절 항체는 30,000 달톤 정도의 분자량을 갖는 단백질이고, 이단백질의 정보를 갖는 염기 서열은 732개의 염기로 구성되어 있다. 이것은 JL-1 항원을 인식할 수 있는 항원인식부위서열을 각각 3개씩 포함하고 있는 중사슬(VH)과 경사슬(VL) 가변영역 단백질이 링커(linker)에 의해 단일 사슬로 연결된 형태이다.The fragment antibody of the present invention is a protein having a molecular weight of about 30,000 Daltons, and the base sequence having information of a diprotein is composed of 732 bases. This is a form in which the heavy chain (V H ) and light chain (V L ) variable region proteins, each containing three antigen recognition region sequences capable of recognizing the JL-1 antigen, are linked in a single chain by a linker. .
본 발명에 있어서의 분절항체의 제조방법은 다음과 같다. JL-1 항원에 대한 단일 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주(hybridoma cell line, 한국세포주 연구 재단에 기탁번호 제 KCARF-BP-00010H호로 기탁된 것)에서 mRNA를 mRNA 정제키트(Quick Prep mRNA 정제 키트 : 스웨덴 파마시아 제품)를 사용하여 정제한 후, 이로부터 면역 글로블린 중사슬과 경사슬의 가변영역 염기 사슬을 역전사-피시알(RT-PCR: Reverse Transcriptase-Polymerase Chain React-ion)로 증폭하고, 이것을 다시 PCR법으로 두 가변 영역 염기 사슬을 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser의 정보를 가진 DNA 링커와 함께 PCR을 수행하여 연결시킨다. 이렇게 제조된 DNA를 pCANTAB5E 벡터(스웨덴 파마시아 제품)에 삽입시켜 파지 선별을 수행할 대장균들에게 감염시킨다. M13K07 보조 파지를 이용하여 파지 회수를 시행하면 pCANTAB5E의 gIII단백질에 단일사슬가변영역 단백질이 접합되어 있는 파지를 얻을 수 있게 된다. 이러한 파지를 정제된 JL-1 항원(Molt-4 세포 혹은 흉선세포)으로 표면처리되어 있는 효소면역측정 플래이트에 팬닝(panning: 항원과 항체를 발현하고 있는 파지의 결합 및 세척을 반복하여 항원에 대한 결합력이 좋은 항체만을 선별하는 방법)하여 항체와 결합력이 좋은 것을 선별한다. 이렇게 선별된 항체 유전자의 대장균내 삽입을 통하여 후보클론들을 얻고, 웨스턴 블럿과효소면역분석을 통하여 JL-1 항원에 친화도를 보이는 클론을 선택하고 염기 서열 분석을 통해 염기서열을 확인한다. 이후 이러한 파지에서 얻은 DNA를 이용하여 가능성이 있는 몇 개의 박테리아 발현 시스템에서 용해성 단일사슬가변영역 단백질로서 발현시켜 원하는 분절항체를 얻는다. 본 발명의 단백질은 서열1의 아미노산 서열을 가지며 본 발명의 DNA는 서열2의 염기서열을 갖는다.The manufacturing method of the fragment antibody in this invention is as follows. MRNA was purified from a hybridoma cell line secreting a single antibody against the JL-1 antigen (deposited under Accession No. KCARF-BP-00010H to the Korea Cell Line Research Foundation) (Quick Prep mRNA Purification Kit). : Purified by Pharmacia, Sweden, and amplified by reverse transcriptase-polymer (RT-PCR: Reverse Transcriptase-Polymerase Chain React-ion) of the immunoglobulin heavy chain and light chain PCR was performed again with the DNA linker having the information of two variable region base chains Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser Connect it. The DNA thus prepared is inserted into a pCANTAB5E vector (product of Swedish Pharmacia) to infect E. coli for phage screening. Phage recovery using M13K07 supplemental phage yields phages in which a single chain variable region protein is conjugated to the gIII protein of pCANTAB5E. These phages were plated on purified JL-1 antigen (Molt-4 cells or thymic cells) onto an enzyme immunoassay plate to repeat the binding and washing of antigen and phage expressing antibodies. How to select only the antibody with good binding ability) to screen for the antibody and good binding ability. Candidate clones are obtained through the insertion of the selected antibody gene in E. coli, and the clones showing affinity to the JL-1 antigen are selected by Western blot and enzyme immunoassay, and the nucleotide sequence is confirmed by sequencing. The DNA obtained from these phages is then used as a soluble single chain variable region protein in several possible bacterial expression systems to obtain the desired fragment antibody. The protein of the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the DNA of the present invention has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 다음의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위해서 제공되는 것일 뿐 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are provided only to explain the present invention more easily, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예1: JL-1 항원에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 추출Example 1 Extraction of mRNA from Hybridoma Cells Secreting Antibody to JL-1 Antigen
원침된 하이브리도마 세포 1×107개에 1.5 ml의 추출용 완충 용액(구아니딘 티오사이아네이트와 N-라우릴 사르코신이 포함된 완충 용액)을 첨가하고 주사기로 수회 흡입하여 전 DNA를 절단하였다. 용출 완충 용액(10mM 트리스(Tris). pH7.4,1mM EDTA)3ml을 첨가하고, 다시 주사기로 수회 흡입하였다. 이 세포 균질액을 원심 분리하여 상층액만 분리해 보관하였다.1.5 ml of extract buffer (buffer solution containing guanidine thiocyanate and N-lauryl sarcosine) was added to 1 × 10 7 centrifuged hybridoma cells, and the whole DNA was digested by inhalation with a syringe. . 3 ml of elution buffer solution (10 mM Tris. PH 7.4,1 mM EDTA) was added and again aspirated several times with a syringe. The cell homogenate was centrifuged to separate only the supernatant and stored.
이 상층액에서 mRNA 정제키트(스웨덴 파마시아 제품)를 사용하여 정제된 mRNA를 얻고, 이 후 260nm와 280nm에서의 흡광도를 측정하여 mRNA의 순도와 정제된 양을 확인하였다.Purified mRNA was obtained from the supernatant using an mRNA purification kit (Sweden Pharmacia), and then the absorbance at 260 nm and 280 nm was measured to confirm the purity and purified amount of mRNA.
실시예2: cDNA의 합성, 중사슬 및 경사슬 가변 영역의 증폭 그리고 단일 사슬 가변 영역을 제조Example 2 Synthesis of cDNA, Amplification of Heavy and Light Chain Variable Regions and Preparation of Single Chain Variable Regions
퍼스트 스트랜드 cDNA(first strand cDNA) 합성키트(스웨덴 파마시아제품)를 이용하여 mRNA로 부터 cDNA를 얻은 후, PCR을 통하여 중사슬, 경사슬의 cDNA를 증폭하였다. 이후 중사슬 및 경사슬의 cDNA을 PCR로 증폭한 각 반응액을 페놀/클로로폼으로 추출하고 1% 한천 젤 전기 영동을 시행하여 정량하였다. 이후 각 cDNA의 젤 추출을 시행하여 증폭된 DNA를 회수하였다. 이후 중사슬 및 경사슬 가변영역 cDNA와 링커 PCR용 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 통한 링커와의 결합 (linker PCR) 을 시행하고 생성된 단일 사슬 가변영역(VH+ linker + VL)을 다시 한번 PCR을 이용하여 증폭하였다. 이 때 후위 프라이머의 5´부위에는 Sfi Ⅰ제한 효소부위를, 전위 프라이머의 5´부위에는 Not I 제한효소부위 첨가하여 추후 pCANTAB5E 벡터(스웨덴 파마시아 제품)로의 클로닝이 용이하도록 하였다.CDNA was obtained from mRNA using a first strand cDNA synthesis kit (manufactured by Swedish Pharmacia), and amplified heavy and light chain cDNA by PCR. Then, each reaction solution amplified by PCR of heavy and light chain cDNA was extracted with phenol / chloroform and quantified by 1% agar gel electrophoresis. Thereafter, gel extraction of each cDNA was performed to recover the amplified DNA. After using the heavy chain and light chain variable region cDNA and linker PCR primers (linker PCR) to perform the linker (linker PCR) by PCR and the resulting single chain variable region (V H + linker + V L ) Once again amplified using PCR. At this time, the Sfi I restriction enzyme site was added to the 5 ′ region of the posterior primer and the Not I restriction enzyme site was added to the 5 ′ region of the translocation primer to facilitate cloning into the pCANTAB5E vector (Sweden Pharmacia).
실시예3: 단일사슬가변영역이 접합된 파지 디스플레이 라이브러리를 제조Example 3: Fabrication of a phage display library in which a single chain variable region is bonded
위 과정에서 얻은 단일 사슬 가변영역 cDNA 200ng과 pCANTAB5E 벡터 250ng을 Sfi I과 Not I으로 자르고, 잘려진 벡터와 단일사슬 가변영역 염기 사슬을 1% 한천 젤 전기 영동한 후, 각 DNA 밴드에 젤 추출을 시행하여 정제하였다. 잘려진 벡터와 단일사슬가변영역에 cDNA를 결합한 후,(Maniatis etal. 1989. Molecular cloning: A Laboratory manual. CSH Lab ., N.Y., 미국)DNA를 회수하여 숙주세포인 대장균 XL1-블루에 감염시켰다. 여기에 SOC배지(2% 박토-트립톤, 0.5%박토-이스트 추출물, 0.05% NaCl, 20mM 글루코스)를 3ml가하고 37℃에서 한 시간 동안 배양한 다음, 카베니실린(carbenicillin)20μg/ml, 테트라사이클린(tetracycline)10μg/ml을 첨가한 SB배지(3% 박토-트립톤, 2% 박토-이스트 추출물, 1% Mops 94%증류수, pH 7.0)에 1시간 동안 배양하고 보조 파지(helper phage) M13K07를 1012개 플라크들만큼 첨가하고 2시간 동안 배양하였다. 이 후 카나마이신(kanamycin) 70 μg/ml을 첨가하고 37℃에서 15시간 동안 배양하여 파지 회수를 시행하였다. 배양액을 4000rpm에서 15시간 원심분리한 다음, 상층액에 폴리에틸렌 글리콜 8000을 최종 농도 4%(w/v)까지, 염화나트륨을 3%(w/v)농도가 되도록 첨가하고 얼음에 30분간 정치하였다. 4℃에서 20분간 원심분리한 다음, 침전된 파지를 2ml의 PBS (phosph-ate buffered saline: 50mM 인산, pH 7.2, 150mM, 염화나트륨)에 녹이고, 마이크로원심분리기에서 3분간 원심 분리시켜 박테리아로부터의 잔존물을 제거하였다.250ng of the single-chain variable region cDNAA 200k and 250CVCA vector obtained from the above procedure were cut into Sfi I and Not I, and the cut vector and single-chain variable region base chain were subjected to 1% agar gel electrophoresis, followed by gel extraction for each DNA band. Purification by After binding the cDNA to the cut vector and the single chain variable region (Maniatis et al. 1989. Molecular cloning: A Laboratory manual. CSH Lab., NY, USA), the DNA was recovered and infected with the host cell Escherichia coli XL1-Blue. Here, 3 ml of SOC medium (2% bacto-tryptone, 0.5% bacto-yeast extract, 0.05% NaCl, 20 mM glucose) was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour, followed by 20 μg / ml carbenicillin, tetra Incubated for 1 hour in SB medium (3% bacto-tryptone, 2% bacto-east extract, 1% Mops 94% distilled water, pH 7.0) to which 10 μg / ml of tracycline was added and helper phage M13K07 Was added by 10 12 plaques and incubated for 2 hours. Afterwards, 70 μg / ml of kanamycin was added and cultured at 37 ° C. for 15 hours to recover phage. The culture solution was centrifuged at 4000 rpm for 15 hours, and then polyethylene glycol 8000 was added to the supernatant to a final concentration of 4% (w / v), sodium chloride was added to a concentration of 3% (w / v), and allowed to stand on ice for 30 minutes. After centrifugation at 4 ° C. for 20 minutes, the precipitated phage is dissolved in 2 ml of PBS (phosphate buffered saline: 50 mM phosphoric acid, pH 7.2, 150 mM, sodium chloride) and centrifuged for 3 minutes in a microcentrifuge to remove residues from bacteria. Was removed.
위와 같이 정제한 팩키지된 파지미드(packaged phagemid)를 SB 배지에 10-3, 10-5, 10-8의 배율로 희석하여 1μl를 취하고, 50μl의 바로 제조한 대장균 XL1-블루 (OD at 660nm = 1)와 혼합하였다. 이를 테트라사이클린 10μg/ml를 포함하는 SB배지에 15분간 배양한 뒤 루리아베르타니/카베니실린(Luria Bertani/ carbenicillin) 평판배지에 도포하였다. 이를 15시간 배양한 후 군락수를 세어 봄으로써 파지의 수를 알 수 있었다. 마이크로타이터 플래이트를 각 웰(well)당 25μl의 JL-1 항원 용액 (흉선 세포 혹은 Molt-4 세포 등, 10μg/ml in 100mM bicarbonate buffer, pH 8.6)으로 12시간 동안 코팅하였다. 이 후, 200μl의 1% BSA/PBS용액으로 각 웰을 차단하였다. 각 웰에 50μl의 파지 디스플레이 라이브러리(대개, 1011개 플라크들)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 배양시켰다. 플래이트를 우선 증류수로 1회 세척하고, 50mM 트리스-염산(Tris-HCl) (pH 7.5), 150mM 염화나트륨, 0.5% 트윈 20(Tween 20)을 포함한 용액으로 1시간 이상에 걸쳐 10회 이상 세척하였다. 플래이트를 다시 증류수로 1회 세척하고, 붙어있는 파지를 50μl의 용출 완충용액 (0.1M 염산, 고체 글리신으로 pH 2.2로 맞춘 후 0.1% BSA첨가 )을 첨가하고 실온에서 10분간 배양하여 떼어냈다. 이후 각 웰의 용액을 피펫으로 몇 회 잘 섞어준 다음, 하나의 튜브에 모았다. 이후 각 50μl당 3μl의 2M 트리스-염산용액을 첨가하여 중화시켰다. 회수된 파지를 2ml의 바로 제조한 대장균 XL1-블루(OD at 600nm = 1)에 첨가하고, 실온에 15분간 정치하여 감염시킨 다음 카베니실린(20μg/ml)와 테트라사이클린(10μg/ml)를 포함하는 SB배지 10ml를 첨가하였다. 다시 한 시간 동안 300rpm, 37℃에서 배양한 뒤, 100ml의 카베니실린(50μg/ml)과 테트라사이클린(10μg/ml)을 포함하는 SB배지를 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 여기에 보조 파지 M13K07(1012개 플라크들)을 첨가하고, 2시간 동안 배양하였다. 이후 카나마이신(70μg/ml)을 첨가하고, 37℃에서 12시간동안 배양하였다. 이후 파지 준비와 팬닝은 위의 과정과 동일하게 하되, 파지 배양율이 더 이상 높아지지 않을 때까지 반복하였다. 파지 배양율은 배양 파지의수를 첨가한 파지의 수로 나누어 계산하였다.A package the phagemid (packaged phagemid) purified as above in SB medium to 10 -3, 10 -5, and diluted by a factor of 10 -8 take 1μl, just manufactured E. coli XL1- Blue of 50μl (at OD 660nm = Mixed with 1). This was incubated for 15 minutes in SB medium containing 10 μg / ml of tetracycline and then applied to Luria Bertani / carbenicillin (Luria Bertani / carbenicillin) plate medium. After culturing for 15 hours, the number of phages was determined by counting colonies. Microtiter plates were coated with 25 μl of JL-1 antigen solution (10 μg / ml in 100 mM bicarbonate buffer, pH 8.6, such as thymic cells or Molt-4 cells) for 12 hours per well. Thereafter, each well was blocked with 200 μl of 1% BSA / PBS solution. 50 μl of phage display library (typically 10 11 plaques) was added to each well and incubated at 37 ° C. for 2 hours. The plate was first washed once with distilled water and then at least 10 times over 1 hour with a solution comprising 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM sodium chloride, 0.5% Tween 20. The plate was washed once again with distilled water, and the attached phage was added to 50 μl of elution buffer (0.1 M hydrochloric acid, adjusted to pH 2.2 with solid glycine and added 0.1% BSA) and incubated for 10 minutes at room temperature. The solution from each well was then mixed well several times with a pipette and collected in one tube. Thereafter, 3 μl of 2M tris-hydrochloric acid solution was added to each 50 μl and neutralized. The recovered phage was added to 2 ml of immediately prepared E. coli XL1-blue (OD at 600 nm = 1), and allowed to stand at room temperature for 15 minutes for infection, followed by carbenicillin (20 µg / ml) and tetracycline (10 µg / ml). 10 ml of containing SB medium was added. After another one hour of incubation at 300rpm, 37 ° C, 100 ml of carbenicillin (50 μg / ml) and tetracycline (10 μg / ml) containing SB medium was added and incubated for 1 hour. Supplemental phage M13K07 (10 12 plaques) was added thereto and incubated for 2 hours. Kanamycin (70 μg / ml) was then added and incubated at 37 ° C. for 12 hours. Since phage preparation and panning was the same as the above process, the phage culture rate was repeated until it is no longer high. Phage culture rate was calculated by dividing by the number of phage added to the number of culture phage.
마지막 팬닝에서 선택된 파지를 동일한 방법으로 대장균 XL1-블루에 감염시키고, 10ml의 SB배지를 첨가하여 한 시간 동안 300rpm, 37℃에서 배양하였다. 이 중에서 100μl를 취한 다음 1/10, 1/100, 1/1000으로 희석하고, 각각 100 μl를 LB/카베니실린 평판 배지에 플레이팅한 다음, 12시간 동안 37℃에서 배양하였다. 멸균된 마이크로타이터 플래이트의 각 웰에 100μl의 카베니실린(50μg/ml)과 테트라사이클린(10μg/ml)을 포함하는 SB배지를 넣은 후, 각 웰에 LB/카베니실린 평판 배지 위의 파지 콜로니를 옮기고 천천히 흔들면서 12시간 동안 배양하였다. 한편 보조 파지인 M13K07 파지(1.05×1010개 플라크들)를 21ml의 카베니실린 (50μg/ml)과 테트라사이클린(10μg/ml)이 들어 있는 SB배지에 희석한 다음, 바로 멸균시킨 마이크로타이터 플래이트의 각 웰에 200μl씩 넣어 둔다. 위와 같이 항체가 클로닝된 파지를 포함하는 균 배양액 20μl씩을 보조 파지가 들어 있는 플래이트의 각 웰로 옮긴다. 천천히 흔들면서 37℃에서 2시간 동안 배양한 다음, 플래이트를 원심분리한다. 상층액을 모두 흡입하여 버리고, 카나마이신이 포함된 SB배지를 각 웰당 200μl씩 첨가했다. 천천히 흔들면서 2시간 동안 37℃에서 배양한 다음 플래이트를 원심분리하였다. 패키지된 파지가 들어 있는 상층액의 일부는 잘 보관하고, 상층액 50μl만을 이용하여 효소면역측정을 시행하였다.The phage selected in the last panning was infected with E. coli XL1-Blue in the same manner, and incubated at 37 rpm for 1 hour by adding 10 ml of SB medium. 100 μl of this was taken and diluted to 1/10, 1/100, and 1/1000, and 100 μl of each was plated on LB / carbenicillin plate medium, and then incubated at 37 ° C. for 12 hours. Each well of the sterilized microtiter plate was loaded with SB medium containing 100 μl of carbenicillin (50 μg / ml) and tetracycline (10 μg / ml), and then phage on the LB / carbenicillin plate medium in each well. The colonies were transferred and incubated for 12 hours with slow shaking. Meanwhile, the auxiliary phage M13K07 phage (1.05 × 10 10 plaques) was diluted in an SB medium containing 21 ml of carbenicillin (50 μg / ml) and tetracycline (10 μg / ml), and then immediately sterilized microtiter. Put 200 μl into each well of the plate. As described above, 20 μl of the culture medium containing the phage in which the antibody was cloned is transferred to each well of the plate containing the auxiliary phage. Incubate at 37 ° C. for 2 hours with slow shaking, then centrifuge the plate. All supernatants were aspirated off and 200 μl of SB medium containing kanamycin was added to each well. After incubation at 37 ° C. for 2 hours with slow shaking the plates were centrifuged. Some of the supernatant containing the packaged phage was well stored, and enzyme immunoassay was performed using only 50 μl of the supernatant.
실시예4: 효소면역측정을 이용한 파지선택Example 4 Phage Selection Using Enzyme Immunoassay
마이크로타이터 플래이터의 각 웰당 100μl의 1mg/ml의 폴리-엘-라이신 하이드로브로마이드(poly-L-lysine-hydrobromide: TypeI-B, 분자량 400,000, PBS에 용해)를 가하고 30분 후 제거하였다. 이후 JL-1항원을 세포막 표면에 발현하고 있는 세포주인 몰트-4 세포(ATCC CRL-1582)를 DMEM 용액으로 2회 세척한 후, 5×106/ml 농도로 맞추었다. 이 세포용액을 각 웰당 100μl씩 가하고 원심분리하였다. 실온에서 15분간 정치한 후에 용액을 제거하였다. 이후 각 웰당 350μl의 PBS완충 용액을 가하고 제거하는 세척과정을 3회 반복하였다. 이후 200μl의 1% BSA/PBS 용액으로 각 웰을 차단하였다. 실시예 3에서 얻은 파지 상층액 50μl을 각 웰에 가하고 37℃에서 2시간 동안 유지시켰다. 플래이트를 우선 증류수로 1회 세척하고 50mM 트리스-염산(pH 7.5), 150 mM 염화나트륨 및 0.5% 트윈 20을 포함한 용액으로 세척하였다. 플래이트를 증류수로 1회 세척하고, 1% BSA/PBS에 1/1,000으로 희석시킨 안티-M13 파지 항체(Horseradish peroxidase conjugated sheep anti-M13 phage antibody: 스웨덴 파마시아 제품)를 각 웰에 50μl씩 가하고 37℃에서 2시간동안 유지시켰다. 플래이트를 우선 증류수로 1회 세척하고 50 mM 트리스-염산(pH 7.5), 150 mM 염화나트륨 및 0.5% 트윈 20을 포함한 용액으로 세척하였다. 플래이트를 다시 증류수로 1회 세척하고, 50μl의 O-페닐랜디아민(O-phenylenediamine)을 함유하는 발색 기질 용액을 가하였다. 충분히 발색된 후, 50μl의 0.5N 황산 용액을 가하여 발색 반응을 정지시켰다. 발색된 용액을 효소면역측정용 플래이트를 옮긴 다음, 효소결합면역측정용 흡광분석기로 495nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.100 μl of 1 mg / ml poly-L-lysine-hydrobromide (TypeI-B, molecular weight 400,000, dissolved in PBS) per microwell platter was added and removed after 30 minutes. Thereafter, malt-4 cells (ATCC CRL-1582), a cell line expressing JL-1 antigen, were washed twice with DMEM solution, and then adjusted to 5 × 10 6 / ml. 100 μl of this cell solution was added to each well and centrifuged. The solution was removed after standing at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the washing process was repeated three times to add and remove 350 μl of PBS buffer solution per well. Each well was then blocked with 200 μl of 1% BSA / PBS solution. 50 μl of the phage supernatant obtained in Example 3 was added to each well and maintained at 37 ° C. for 2 hours. The plate was first washed once with distilled water and then with a solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM sodium chloride and 0.5% Tween 20. The plate was washed once with distilled water, and 50 μl of each of the anti-M13 phage antibodies (Horseradish peroxidase conjugated sheep anti-M13 phage antibody (made in Sweden Pharmacia) diluted in 1 / 1,000 in 1% BSA / PBS was added to each well and 37 ° C. It was kept for 2 hours at. The plate was first washed once with distilled water and then with a solution containing 50 mM tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 150 mM sodium chloride and 0.5% Tween 20. The plate was washed once again with distilled water and a color substrate solution containing 50 μl of O-phenylenediamine was added. After sufficient color development, 50 µl of 0.5N sulfuric acid solution was added to stop the color reaction. The developed solution was transferred to an enzyme immunoassay plate, and then absorbance was measured at a wavelength of 495 nm using an enzyme-linked immunoassay analyzer.
경쟁(반응) 효소면역측정(competition EIA)은 위와 거의 동일한 방법이지만, 파지클론과 항 JL-1 항체를 경쟁시켜 항원에 결합하는 성향을 보는 방법이며, 다음과 같이 수행하였다. 파지 상층액을 효소면역측정용 웰에 첨가할 때 파지 한 클론당 항 JL-1항체를 최종 농도 10μg/ml이 되게 넣어 준 웰과 항 JL-1항체를 첨가하지 않은 웰로 나누어 각각 효소면역측정을 시행하엿다. 이중 다른 클론에 비하여 흡광도 차이가 크며, JL-1을 첨가한 웰과 첨가하지 않은 웰사이의 흡광도 차이가 많이 나는 클론중 3개를 선택하여 웨스턴 블럿과 염기서열분석을 시행하였다. 이러하 흡광도 분석 데이터를 도 7에 나타내었다.Competence (reaction) enzyme immunoassay (competition EIA) is almost the same method as above, but the phageclone and anti-JL-1 antibody to see the tendency to bind to the antigen, was performed as follows. When the phage supernatant was added to the enzyme immunoassay well, the anti-JL-1 antibody was added to a final concentration of 10 μg / ml per clone and the wells to which the anti-JL-1 antibody was not added. It was done. Among them, Western blot and sequencing were performed by selecting three clones with a large difference in absorbance compared to the other clones and a large difference in absorbance between the wells with and without JL-1. This absorbance analysis data is shown in FIG.
실시예 5: 중사슬과 경사슬 가변 영역의 염기서열 결정Example 5: Determination of the base sequence of the heavy chain and light chain variable region
본 실시예에서는 효소면역측정 및 웨스턴 블럿 상에서 양성으로 확인된 3개의 파지 클론을 골라서 파지미드 상태의 DNA를 얻은 다음, 염기 서열 분석을 시행하였다. 이때 염기서열 분석 프라이머로는 pCANTAB5E 벡터의 염기서열과 링커의 염기서열을 이용하였다. 얻은 염기서열은 DNAsis 프로그램을 이용하여 분석하였고 이를 통해 서열1 및 서열 2에 나타난 JL-1 항체의 VH및 VL서열을 결정하였다. VH의 경우는 서브그룹: IIA, 패밀리: V에 속하며, 블라스트 서치(Blast sear_ch)에서 지금까지 동일한 염기 서열이 현재까지 보고된 바 없음을 확인하였다. VL의 경우는 서브 그룹; V, 패밀리; XIII에 속하며 역시 블라스트 서치에서 동일한 염기서열이 현재까지 보고된 바 없음을 확인하였다.In this example, three phage clones identified as positive on enzyme immunoassay and Western blot were selected to obtain DNA in phagemid state, followed by sequencing. The sequencing primer was used as the base sequence of the pCANTAB5E vector and the base sequence of the linker. The obtained nucleotide sequence was analyzed using the DNAsis program to determine the V H and V L sequences of the JL-1 antibodies shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. In the case of V H belonging to the subgroup: IIA, family: V, it was confirmed that the same base sequence has not been reported so far in the blast search (Blast sear_ch). For V L , a subgroup; V, family; It was confirmed that the same base sequence belonging to XIII and also in blast search has not been reported to date.
실시예 6; 분절항체 발현 벡터의 제조Example 6; Preparation of Segmented Antibody Expression Vectors
JL-1 분절항체를 대량 발현시키기 위하여, pCANTAB5E 벡터에 복제되어 있는 가변영역항체 유전자를 pTFvSN 플라즈미드 벡터로 옮겨 재복제하였다. 이 pTFvSN(도1, 기탁번호 제KCTC 0791BP호)은 pRSET B 벡터(미국 인비트로젠사가 시판하는 제품)에 가변영역항체 유전자를 결합함으로써 얻을 수 있다. JL-1 단일사슬 유전자가 복제되어 있는 pCANTAB5E 벡터와 pTFvSN 벡터를 공히 Sfi I, Not I 제한 효소로 절단한 다음, 1% 한천 젤 전기영동을 시행하였다. 이후 각 DNA를 젤로부터 추출하여 가변영역항체 유전자와 벡터를 회수하고, 이를 결합시켜 얻은 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)균주에 전이시켜 본 발명의 분절항체를 생산하는 균주 (기탁번호 제KCTC 0790BP호)를 제조하였다.In order to mass express the JL-1 fragment antibody, the variable region antibody gene cloned in the pCANTAB5E vector was transferred to the pTFvSN plasmid vector and replicated. This pTFvSN (Fig. 1, Accession No. KCTC 0791BP) can be obtained by binding the variable region antibody gene to the pRSET B vector (commercially available from Invitrogen, Inc.). The pCANTAB5E vector and pTFvSN vector, which were cloned with the JL-1 single chain gene, were digested with Sfi I and Not I restriction enzymes, and then subjected to 1% agar gel electrophoresis. After extracting each DNA from the gel to recover the variable region antibody gene and vector, and transfer the plasmid obtained by binding to the E. coli BL21 (DE3) strain to produce the fragment antibody of the present invention (Accession No. KCTC 0790BP) Was prepared.
같은 방법으로 JL-1 분절항체 유전자를 pTFvCSN 벡터(도4)에 복제하여 테크네티움-99m 라벨링(technetium-99m labeling)이 쉽도록 C-말단에 시스테인이 붙은 JL-1 분절항체 (JL-1 scFv-Cys)합성 벡터를 만들었다. 또한, JL-1 분절 항체 유전자를 pTFvASN 벡터(도5)에 복제하여 C-말단에 인간 유래의 독소인 안지오제닌이 융합단백질형태로 붙어있는 JL-1 분절항체 (JL-1 scFv-Ang) 발현 벡터를 만들었다. JL-1 scFv-Ang는 일종의 면역독소로 볼 수 있다.In the same way, the JL-1 fragment antibody gene was cloned into the pTFvCSN vector (FIG. 4) to facilitate the technetium-99m labeling. scFv-Cys) synthetic vector was made. In addition, the JL-1 fragment antibody gene was cloned into the pTFvASN vector (FIG. 5), and a JL-1 fragment antibody (JL-1 scFv-Ang) in which angiogenin, a human-derived toxin, was attached to the C-terminus in the form of a fusion protein. Expression vectors were made. JL-1 scFv-Ang can be viewed as a kind of immunotoxin.
실시예7: 재조합 JL-1 분절 항체의 발현Example 7 Expression of Recombinant JL-1 Segmented Antibody
실시예 6에서의 재조합 JL-1 항체 플라즈미드를 항체과발현 균주로서 적합한 대장균(E. coli) BL21(DE3) (Takara, Japan)에 전이시켰다. 이것을 루리아 베르타니 배지(IPTG 0.3mM, 30℃)가 든 발효기 내에서 200rpm의 교반속도도 10시간 정도 발효시켰으며 이 과정에서 항체는 균주 내에 인클루젼 바디(inclusion body, 봉입체)의 형태로 합성되었다.The recombinant JL-1 antibody plasmid in Example 6 was transferred to E. coli BL21 (DE3) (Takara, Japan) suitable as antibody overexpressing strain. This was fermented in a fermentor containing Luria Bertani medium (IPTG 0.3mM, 30 ° C) for 10 hours at 200 rpm, and in the process, the antibody was synthesized in the form of an inclusion body in the strain. It became.
실시예 8: 재조합 JL-1 분절항체의 정제Example 8: Purification of Recombinant JL-1 Segmented Antibody
인클루젼 바디(봉입체)로부터 정제된 용액상의 단일 사슬 가변 영역 단백질을 얻기 위한 조건은 다음과 같다. 우선 항체발현이 유도된 균주를 파쇄 완충액 (50mM 트리스-염산, 1.0 mM EDTA, 100mM 염화칼륨, 0.1mM PMSF, pH 8.0)에 부유시킨 후, 충분히 파쇄시켰다. 이 대장균 파쇄물을 원심분리하고 상층액은 제거하였다. 이러한 세척과정을 6회 반복하여 인클루젼바디 팰릿(pellet)을 얻었다.The conditions for obtaining the purified solution single chain variable region protein from the inclusion body (inclusion body) are as follows. First, the strains induced with antibody expression were suspended in crushing buffer (50 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, 100 mM potassium chloride, 0.1 mM PMSF, pH 8.0), and then sufficiently disrupted. The E. coli lysate was centrifuged and the supernatant was removed. This washing process was repeated six times to obtain an inclusion body pellet.
해리 완충액(6M guanidine hydrochloride, 50mM 트리스-염산, 10mM 염화 칼슘, 50mM 염화칼륨, pH 8.0)을 첨가하여 완전히 용해시킨 후 원심분리하여 상층액을 얻었다. 280nm에서의 흡광도를 측정한 후, 흡광도가 25이하가 되도록 해리 완층액을 첨가하였다. 이 용액에 리폴딩 완충액(50mM 트리스-염산, 10mM 염화칼슘, 50mM 염화칼륨, pH 8.0)을 천천히 첨가하여 원래 부피의 10배가 되도록 한다. 이 첨가 시간이 2시간 이상이 되도록 하고 20시간 이상 정치한 후, 리폴딩 완충액에 투석하였다.Dissociation buffer (6M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-hydrochloric acid, 10 mM calcium chloride, 50 mM potassium chloride, pH 8.0) was added to complete dissolution and centrifugation to obtain supernatant. After measuring the absorbance at 280 nm, the dissociation complete layer solution was added so that the absorbance became 25 or less. Slowly add refolding buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM calcium chloride, 50 mM potassium chloride, pH 8.0) to 10 times the original volume. The addition time was 2 hours or more, left to stand for 20 hours or more, and dialyzed into the refolding buffer.
투석용액에 암모늄 설페이트(ammomium sulfate)를 40% 포화 농도까지 첨가하고 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상층액에 암모늄 설페이트를 80% 포화농도 가 되도록 첨가하고 원심분리하여 침전물을 얻었다. 침전물을 100ml의 PBS에 부유시키고 단백질 양을 정량하였다. 아울러 도데실황산나트륨 폴리아크릴아마이드 젤 전기 영동을 통하여 그 순도를 확인하였다. 도2에 pTFvSN 벡터를 이용하여 발현시킨 JL-1 scFv를 확인한 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 사진을 나타내었다. 세포 라이세이트(lysate)와 정제 샘플에는 BL21(DE3) 대장균에는 없던 JL-1 scFv밴드가 나타남을 확인 할 수 있다. 도4와 도5에 나타낸 플라즈미드를 이용하여 시스테인 택을 포함한 JL-1(JL-1 scFv-Cys)과 안지오제닌을 붙여 발현한 항체(JL-1 scFv-Ang)의 도데실황산나트륨 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 사진(좌)과 JL-1 항체내부에 포함된 엑스프레스 택을 인식하는 항체를 이용하여 수행한 웨스턴 블럿 사진(우)을 도6에 나타내었다. 두 사진 모두 BL21 (DE3) 세포 라이세이트에는 보이지 않던 JL-1 scFv 밴드가 원하는 분자량의 위치에 형성됨을 확인할 수 있었다.Ammonium sulfate was added to the dialysis solution to 40% saturation concentration and centrifuged to obtain a supernatant. Ammonium sulfate was added to the supernatant to 80% saturated concentration and centrifuged to obtain a precipitate. The precipitate was suspended in 100 ml of PBS and the protein amount was quantified. In addition, the purity was confirmed through sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Figure 2 shows the electrophoresis picture of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel confirming JL-1 scFv expressed using the pTFvSN vector. Cell lysate and purified samples showed that the JL-1 scFv band was absent in BL21 (DE3) Escherichia coli. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide of JL-1 (JL-1 scFv-Cys) containing cysteine tag and angiogenin-expressed antibody (JL-1 scFv-Ang) using the plasmid shown in FIGS. 4 and 5 Figure 6 shows a Western blot photograph (right) performed using an gel electrophoresis photograph (left) and an antibody that recognizes an express tag contained in the JL-1 antibody. In both photographs, it was confirmed that the JL-1 scFv band, which was not visible in BL21 (DE3) cell lysate, was formed at the position of the desired molecular weight.
실시예 9: JL-1 분절항체의 JL-1 항원에 대한 친화력 분석Example 9: Analysis of affinity of JL-1 fragment antibody against JL-1 antigen
실시예 8에서 제조된 JL-1 분절항체가 JL-1 항원에 대하여 친화력을 나타내는지를 검증해 보았다. 마이크로타이터 플래이트 각 웰당 100μl의 1mg/ml의 폴리-앨-라이신 하이드로브로마이드를 가하고 30분 후에 제거하였다. 이후 JL-1항원이 세포막 표면에 발현되어 있는 세포주인 몰트-4 세포를 DMEM용액으로 2회 세척한후, 1×107/ml 농도로 맞추었다. 이 세포 용액을 각 웰당100μl씩 가하고 원심분리하였다. 실온에서 15분간 정치한 후에 용액을 제거하였다. 이후 각 웰당 350μl의 완충 용액(PBS)를 가하고 제거하는 세척 과정을 3회 반복하였다. 여기에 다시 100μl의 2% 글루타알데하이드 용액을 30분 정도 가하여 세포를 고정하였다. 이후 200μl의 1% BSA/PBS용액으로 각 웰을 차단하였다. 이후 앞의 실시예10에서 얻은 JL-1 분절 항체를 농도별로 6% BSA 함유 완충용액(PBS)과 1:1 비로 섞어 50μl을 각 웰에 가하고 37℃으로 2시간 동안 유지시켰다. 플래이트를 우선 증류수로 1회 세척하고 50mM 트리스-염산 (pH 7.5), 150mM 염화나트륨 및 0.5% 트윈 20을 포함하는 용액으로 세척하였다. 처리가 끝나면 JL-1 항원에 붙은 JL-1 분절항체의 엑스프레스 택(Tag)을 인식할 수 있는 알파 엑스프레스 항체를 3% BSA 함유 완충용액 (PBS)와 1:5,000 비로 섞어 각 웰에 가해 주어, 2시간 동안 실온에서 배양한 후 앞서의 방법과 같이 세척해 주었다. 항체에 대한 효소발색반응을 일으켜 주기 위하여 각 웰에 3% BSA/PBS에 1/500으로 희석시킨 홀스래디쉬퍼록시다아제 (horseradish peroxidase: 스웨덴 파마시아 제품)를 각 웰에 50μl씩 가하고 37℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 플래이트를 증류수로 1회 세척하고 50mM 트리스-염산(pH 7.5), 150mM 염화 나트륨 및 0.5% 트윈 20을 포함한 용액으로 세척하였다. 1-STEP ABTS 기질 용액(미국 피어스사 제품)을 가하여 발색 반응을 일으키고, 충분히 발색된 후 발색된 용액을 새 효소면역측정용 플래이트로 옮긴 다음 효소결합면역측정용 흡광 분석기로 405nm 에서 흡광도를 측정하였다. 위와 같은 과정을 통하여 측정된 JL-1 분절 항체 농도와 평균 흡광도 및 표준 편차를 도7에 나타내었다.The JL-1 fragment antibody prepared in Example 8 was examined to show affinity for the JL-1 antigen. 100 μl of 1 mg / ml poly-al-lysine hydrobromide per microtiter plate was added and removed after 30 minutes. Thereafter, malt-4 cells, a cell line expressing the JL-1 antigen on the cell membrane surface, were washed twice with DMEM solution, and then adjusted to a concentration of 1 × 10 7 / ml. 100 μl of this cell solution was added to each well and centrifuged. The solution was removed after standing at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the washing process was repeated three times, adding and removing 350 μl of buffer solution (PBS) for each well. 100 μl of 2% glutaaldehyde solution was added thereto for about 30 minutes to fix the cells. Each well was then blocked with 200 μl of 1% BSA / PBS solution. Thereafter, the JL-1 fragment antibody obtained in Example 10 was mixed in a 1: 1 ratio with 6% BSA-containing buffer solution (PBS) by concentration, and 50 μl was added to each well, and maintained at 37 ° C. for 2 hours. The plate was first washed once with distilled water and then with a solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM sodium chloride and 0.5% Tween 20. After the treatment, the alpha-express antibody that can recognize the express tag of the JL-1 fragment antibody attached to the JL-1 antigen was mixed with 3% BSA-containing buffer (PBS) in a ratio of 1: 5,000 and added to each well. After incubation at room temperature for 2 hours, the cells were washed as described above. To generate an enzyme reaction against the antibody, 50 μl of horseradish peroxidase (Pharmacia, Sweden) diluted in 1/500 in 3% BSA / PBS in each well was added to each well. Kept for hours. The plate was washed once with distilled water and with a solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM sodium chloride and 0.5% Tween 20. 1-STEP ABTS substrate solution (product of Pierce Co., Ltd.) was added to develop a color reaction, and after sufficient color development, the developed solution was transferred to a new enzyme immunoassay plate and absorbance was measured at 405 nm with an enzyme-linked immunoassay absorbance analyzer. . JL-1 fragment antibody concentration, mean absorbance, and standard deviation measured through the above procedure are shown in FIG. 7.
실시예 10: JL-1 분절항체를 이용한 면역독소의 제조Example 10 Preparation of Immunotoxins Using JL-1 Segmented Antibody
본 실시예에서는 JL-1 분절항체의 백혈병 치료에 대한 임상적 응용을 위하여 항체와 젤로닌(gelonin), 안지오제닌, 리신 등의 독성 단백질(toxin)을 결합시켜 JL-1 면역 독소를 제조하였다. 이렇게 제조된 JL-1 면역 독소는 백혈병 세포를 선택적으로 결합, 제거함으로써 치료효과를 얻을 수 있다. JL-1 분절 항체와 독성 단백질의 결합은 미국 피어스사에서 제공하고 있는 SPDP법을 이용하여 수행하였다.In this embodiment, JL-1 immunotoxin was prepared by combining toxic proteins such as gelonin, angiogenin, lysine and the like for the clinical application of leukemia treatment of JL-1 fragment antibody. . Thus prepared JL-1 immunotoxin can obtain a therapeutic effect by selectively binding and removing leukemia cells. The binding of the JL-1 fragment antibody and the toxic protein was performed using the SPDP method provided by Pierce, USA.
우선 SPDP (미국 피어스사 제품, N-succinimidy3-(2-pridyldithio) propii- onate)3.Omg/ml 수용액 혹은 설포-LC-SPDP(미국 피어스사 제품, Sulfosuccinimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio) propionamido] hexanote)5.2mg/ml수용액을 준비하였다. 이것은 항체 단백질에 있는 아민기와 반응하여 이중 황 결합을 형성하기 쉽도록 항체를 활성화시키는 역활을 한다. JL-1 분절항체를 pH 7.4의 생리식염수에 10mg/ml의 농도로 녹인 후, 앞에서 제조한 SPDP용액 혹은 설포-LC-SPDP용액과 부피비 10:1 (SPDP용액:항체용액)로 상온에서 30분간 반응시키고 이것을 젤 여과 크로마토그래피(스웨덴 파마시아사 제품 세파덱스 G-25 칼럼 이용)로 정제하였다.SPDP (US Pierce, N-succinimidy3- (2-pridyldithio) propiionate) 3.Omg / ml aqueous solution or sulfo-LC-SPDP (US Pierce, Sulfosuccinimidyl 6- [3- (2-pyridyldithio) propionamido] hexanote) 5.2 mg / ml aqueous solution was prepared. It acts to activate the antibody to react easily with the amine groups in the antibody protein to form double sulfur bonds. The JL-1 fragment antibody was dissolved in physiological saline at pH 7.4 at a concentration of 10 mg / ml, and then mixed with the previously prepared SPDP solution or sulfo-LC-SPDP solution at a volume ratio of 10: 1 (SPDP solution: antibody solution) at room temperature for 30 minutes. The reaction was carried out and purified by gel filtration chromatography (using a Sephadex G-25 column manufactured by Pharmacia Sweden).
질소 분사를 통해 용존 기체를 제거한 TEA-EDTA 완충용액 (Triethanolamine- EDTA buffer. TEA-HCl 50mM, EDPA 10mM, pH 8.0 )에 독성 단백질을 0.33mM 농도로 녹이고 20mg/ml의 2-이미노티올랜(iminothiolane) 수용액(미국 피어스사 제품, Traut's reagent)과 부피비 100:7(독성 단백질:2-Iminothiolane)로 냉장상태에서 1시간 동안 반응시켜 독성 단백질에 티올기를 도입하고 이것을 젤 여과 크로마토그래피로 정제하였다.Triethanolamine-EDTA buffer (Triethanolamine-EDTA buffer.TEA-HCl 50mM, EDPA 10mM, pH 8.0) removes dissolved gases by nitrogen injection at 0.33mM concentration and 20mg / ml 2-iminothiolane (iminothiolane) ) A thiol group was introduced into the toxic protein by reacting with an aqueous solution (traut's reagent, manufactured by Pierce, USA) at a volume ratio of 100: 7 (toxic protein: 2-Iminothiolane) for 1 hour, and purified by gel filtration chromatography.
위 과정을 거친 독성 단백질과 활성화된 항체를 몰비 5:1로 냉장 상태에서 20시간 반응시킨 후, 2mM 요오드아세트아미드(iodoacetamide)를 가하고 상온에서 1시간 방치하여 반응을 정지시켰다. 제조된 면역독소는 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 수행하여 생성 여부를 확인하였으며, 이후 젤 여과 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피로 정제하여 JL-1 면역독소를 얻었다.After reacting the above toxic protein and the activated antibody at a molar ratio of 5: 1 for 20 hours in a refrigerated state, 2mM iodoacetamide was added and the reaction was stopped at room temperature for 1 hour to stop the reaction. The prepared immunotoxin was confirmed by the production of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, and then purified by gel filtration chromatography and ion exchange chromatography to obtain JL-1 immunotoxin.
실시예 11: JL-1 분절 항체에의 방사성 동위원소 요오드-125 표지Example 11: Radioisotope Iodine-125 Labeling with JL-1 Segmented Antibody
JL-1 분절항체를 방사선 영상진단 및 방사선 치료용으로 응용하기 위하여 JL-1 분절항체에 방사성 동위원소를 표지하였다. 표지방법은 관련 문헌 (Radio- isotope in Biology ; A Practical Approch, Slater, IRL Press) 및 관련 방사성 동위원소표지 키트제품(미국 아머샴사 MDP kit) 사용설명서에 기재된 대로 수행하였다.Radioactive isotopes were labeled on JL-1 fragment antibodies for the application of JL-1 fragment antibodies for radiographic imaging and radiotherapy. The labeling method was carried out as described in the literature (Radio- isotope in Biology; A Practical Approch, Slater, IRL Press) and in the instructions for use of the relevant radioisotope kit (Amersham Corporation MDP kit).
요오드-125는 그린우드 등의 클로라민-티법(Chloramine-T 법) (Radioisotope in Biology ; A Practical Approach, R.J.Slater, IRL Press)을 이용하여 표지하였다. 우선 2mg/ml 농도의 JL-1 분절 항체 용액 50μl와 pH 7.5의 0.5M 인산나트륨용액 500μl을 섞어 준 후 요오드-125 100μCi를 가해 주었다. pH 7.5인 0.05M인산 나트륨용액에 클로라민 -티(Chloramine-T) 를 1mg/ml 농도로 녹인 용액 3μl을 넣고 가볍게 섞어 준 후 2분간 실온에서 반응시키고 pH 7.5인 0.05M 인산나트륨용액에 소디움 메타바이설파이트(sodium metabisulphite)를 1 mg/ml 농도로 녹인 용액 7μl를 가하여 반응을 정지시켰다. 이후 세파덱스 G-25 PD-10 컬럼 (스웨덴 파마시아사 제품)을 이용하여 방사성 동위원소가 표지된 항체를 정제하여 얻을 수 있었다.Iodine-125 was labeled using Chloramine-T method (Radioisotope in Biology; A Practical Approach, R. J. Slater, IRL Press) such as Greenwood. First, 50 μl of a JL-1 fragment antibody solution at a concentration of 2 mg / ml and 500 μl of 0.5 M sodium phosphate solution at pH 7.5 were mixed, and then 100 μCi of iodine-125 was added thereto. 3 μl of a solution of Chloramine-T (1 mg / ml) dissolved in 0.05 M sodium phosphate solution at pH 7.5 was gently mixed, reacted at room temperature for 2 minutes, and dissolved in sodium metabidium at 0.05 M sodium phosphate solution at pH 7.5. The reaction was stopped by adding 7 μl of a solution of sodium metabisulphite dissolved at a concentration of 1 mg / ml. Since the Sephadex G-25 PD-10 column (Sweden Pharmacia Co., Ltd.) was purified by radiolabeled antibody can be obtained.
실시예 12 : JL-1 분절항체에 방사성 동위원소 테크니슘-99m 표지Example 12 Radioisotope Technium-99m Labeling on JL-1 Segmented Antibodies
테크니슘-99m표지는 다음과 같이 수행하였다. 항체 2mg에 pH 7.0인 12μl 0.3M EDTA 용액과 12μl 1.0M 소디움 비카보네이트(Sodium bicarbonate)용액을 가하여 잘 섞어 주고 여기에 15μl의 1.5M 베타-머캡토에탄올(β-mercaptoethanol)을 가하여 37℃에서 30분간 반응시켜 항체를 환원시켰다. 이렇게 환원된 항체는 세파덱스 G-25 PD-10컬럼(스웨덴 파마시아사 제품)을 이용하여 정제하고 이것에 질소가스를 충전하여 -70℃에서 보관, 사용하였다. 미국 아머샴사 제품인 방사성 동위 원소 표지 키트 시약에 생리식염수 5ml을 가하고 이중 150μl를 분취하여 환원, 보관된 항체 200μg에 가해준 후 200mCi/ml의 테크니슘-99m 퍼테크네이트(perTechnicium-99m label was performed as follows. To 2 mg of antibody, 12 μl 0.3 M EDTA solution with pH 7.0 and 12 μl 1.0 M sodium bicarbonate solution were added and mixed well. 15 μl of 1.5 M beta-mercaptoethanol was added thereto, followed by 30 The reaction was reduced for a minute to reduce the antibody. The antibody thus reduced was purified using Sephadex G-25 PD-10 column (manufactured by Swedish Pharmacia), filled with nitrogen gas, and stored and used at -70 ° C. 5 ml of physiological saline was added to the reagent for the radioisotope labeling kit manufactured by Amersham, USA, and 150 μl of the aliquot was added to 200 μg of the reduced and stored antibody, followed by 200mCi / ml of technium-99m pertechnate
technetate)를 넣어 실온에서 30분간 반응시켜 본 발명의 분절 항체에 테크니슘- 99m을 표지하였다.technetate) was added and reacted at room temperature for 30 minutes to label technicium-99m on the fragment antibody of the present invention.
실시예 13: JL-1 분절 항체에 방사성 동위 원소 레늄-188 표지Example 13: Radioactive Isotope Rhenium-188 Labels on JL-1 Segmented Antibodies
본 발명의 분절항체에의 레늄-188표지는 주석: 타르트레이트(tartrate) 몰비가 1:9인 스테이너스 타르트레이트를 제조하여 주석 이온의 양 422μg에 해당하는 양을 위에서 제조, 보관하였던 환원된 항체에 가해 주고, 여기에 20 mCi/ml 농도로레늄-188을 넣어 실온에서 1시간 반응시킴으로써 레늄-188이 표지된 JL-1이 분절항체를 제조하였다.The rhenium-188 label to the fragment antibody of the present invention was prepared by the use of a tin: tartrate molar ratio of 1: 9, and a reduced antibody that prepared and stored the amount corresponding to 422 μg of tin ions in the above. Rhenium-188 was added thereto at a concentration of 20 mCi / ml and reacted for 1 hour at room temperature to prepare a fragment antibody of JL-1 labeled with rhenium-188.
상기 실제예 11, 12, 13에서 제조한 방사성동위원소의 항체 표지 효율은, 85%메탄올 용액으로 박막 크로마토그래피(TLC)로 분리시키고 전개시킨 크로마토그래피 각 부위의 방사능치를 측정함으로써 계산할 수 있었으며, 각 표지 항체는 젤 여과 크로마토그래피로 정제할 수 있었다.The antibody labeling efficiency of the radioisotope prepared in Examples 11, 12, and 13 was calculated by measuring the radioactivity of each portion of the chromatography separated and developed by thin layer chromatography (TLC) with an 85% methanol solution. Labeled antibodies can be purified by gel filtration chromatography.
본 발명의 분절 항체는 우선, 그 분자량이 대한민국특허 출원 제 97-55593호에 개시된 JL-1항체의 분자량의 1/4 정도인 30,000달톤 정도이기 때문에 작용 부위로의 접근이 훨씬 용이하고, 항체의 불변 부위가 없어서 인체의 면역거부반응을 크게 줄여 주며, 본 발며의 JL-1 분절 항체의 C말단등의 부위에 진단이나 치료를 위해 동위 원소 혹은 독소, 유전자 등을 부착할 수 있는 등의 여러 가지 응용이 종래의 JL-1 항체보다 크게 용이하다.Since the fragment antibody of the present invention has a molecular weight of about 30,000 Daltons, which is about 1/4 of the molecular weight of the JL-1 antibody disclosed in Korean Patent Application No. 97-55593, it is much easier to access the site of action. There is no constant region, which greatly reduces the body's immune rejection reaction, and isotopes, toxins, genes, etc. can be attached to the C-terminus of the JL-1 fragment antibody for diagnosis and treatment. Application is significantly easier than conventional JL-1 antibodies.
본 발명은 JL-1 항원을 인지하는 항체의 가장 중요한 인식 부위인 VH및 VL영역과 항원 인식 부위 서열을 밝힘으로써 이것을 포함한 키메라 항체, 인간화 항체, 단일 사슬 가변 영역 항체를 개발하고 산업적으로 응용할 수 있다. 한편, 이와 같은 항원 인식영역의 확인은 이 영역의 일부 아미노산의 변형을 통해 보다 항원 친화력이 높은 항체를 개발하는 데도 기여할 수 있는 효과가 있다.The present invention is intended to develop and industrially apply chimeric antibodies, humanized antibodies, single chain variable region antibodies comprising the V H and V L regions and antigen recognition site sequences, which are the most important recognition sites of antibodies that recognize the JL-1 antigen. Can be. On the other hand, the identification of such an antigen recognition region has an effect that can also contribute to the development of antibodies with higher antigen affinity through modification of some amino acids of this region.
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KR20020005128A (en) | 2002-01-17 |
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