KR100372516B1 - 엔도스테틴을 이용하여 세포간질 금속성단백질분해효소의활성을 저해함으로써 세포간질분해를 억제하는 방법 - Google Patents

엔도스테틴을 이용하여 세포간질 금속성단백질분해효소의활성을 저해함으로써 세포간질분해를 억제하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엔도스테틴을 이용하여 세포간질 금속성단백질분해효소(MMP)의 활성을 저해함으로써 세포간질분해를 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 엔도스테틴이 세포간질 금속성단백질분해효소의 활성을 저해함과 동시에, 활성화된 세포간질 금속성단백질분해효소의 활성을 저해하여 세포간질분해를 억제하는 사실을 확인하였다.

Description

엔도스테틴을 이용하여 세포간질 금속성단백질분해효소의 활성을 저해함으로써 세포간질분해를 억제하는 방법{A Method for Inhibiting Degradation of Extracellular Matrix by Endostatin through Inhibition of the Catalytic Activity of Matrix Metalloproteinases}
본 발명은 엔도스테틴(endostatin)을 이용하여 세포간질 금속성단백질분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs)의 활성을 저해하여 세포간질의 분해를 억제하는 방법에 관한 것이다.
세포간질 금속성단백질분해효소는 활성부위에 아연을 포함하며 세포간질 구성성분들의 분해에 중요한 역할을 하는 효소군이다. 세포간질 금속성 단백질분해효소는 세포간질의 분해가 필수적인 배발생(embryonic development), 상처의 수복 및 재생 등과 같은 정상적인 과정 뿐 아니라, 암전이(tumor metastasis), 관절염 등과 같은 병리학적 과정에도 관여하는 것으로 알려져 있다(참조: Cawston,Br. Med. Bull., 51:385-401, 1995). 이러한 세포간질 금속성단백질분해효소는 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-8(matrix metalloproteinase-8)이 속하는 콜라게나제(collagenase) 계열, MMP-2 및 MMP-9이 속하는 젤라티나제(gelatinase) 계열, MMP-3 및 MMP-10이 속하는 스트로멜리신(stromelysin) 계열, MMP-14(세포막 제 1형 세포간질 금속성단백질분해효소, MT1-MMP) 등이 속하는 세포막형 MMP(membrane type MMP)계열로 분류된다. 이 중, 세포막을 통과하는 세포막형 MMP 계열을 제외한 모든 MMP는 세포내에서 N-말단 선구도메인(pro-domain)을 포함하는 불활성 형태의 전구체로 합성되어 세포외로 분비되며, N-말단 선구도메인이 절단됨으로써 MMP는 활성을 갖게되어, 선구도메인의 절단은 MMP 활성조절에 매우 중요하다(참조: Stetler-Stevenson et al.,J. Biol. Chem., 265:13933-13938, 1990). 상술한 MMP중에서 MMP-2는 기저막(basement membrane)의 주성분인 type Ⅳ 콜라겐(type Ⅳ collagen)을 비롯한 여러 세포간질 성분을 분해한다. 아울러, MMP-2의 전구체인 proMMP-2는 활성화된 MMP-2 또는 다른 용해성 MMP(soluble MMP)에 의하여 활성화될 수 있으며, 특히 세포표면에서 세포막 1형 세포간질 금속성단백질분해효소(membrane type-1 MMP, MT1-MMP)에 의하여 활발히 생성되는 것으로 밝혀졌다(참조: Sato et al.,Nature, 370:61-65, 1994)
한편, 뮤린 헤만지오엔도셀리오마(murine hemangioendothelioma) 세포주에서 얻은 콜라겐ⅩⅧ의 가수분해산물로서 20kDa의 크기를 가진 엔도스테틴이 혈관신생을 억제하는 물질로 밝혀졌고, 이종이식(xenograft) 모델을 사용한 연구에서 엔도스테틴을 투여하였을 때, 여러 종양세포의 성장을 억제하였음이 보고되었고(참조: O'Reilly M.S. et al.,Cell, 86:353-364, 1994; Boehm T. et al.,Nature, 390:404-407,1997), 종양으로 발전하는 조직에다 엔도스테틴을 장시간 처리해도 엔도스테틴에 대한 약물저항성을 보이지 않았다(참조: Boehm T, et al.,Nature, 390:404-407, 1997). 또한, 엔도스테틴은 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)에 의하여 유도된혈관내피세포의 증식과 이동을 억제하고, 혈관내피세포의 사멸(apoptosis)를 유도하는 것으로 관찰되었다.
그러나, 이러한 생체외(in vitro) 조건 및 생체내(in vivo) 조건에서 엔도스테틴의 효능과 관련된 작용표적 및 작용방법이 알려져 있지 않으므로, 이를 밝혀낸다면, 엔도스테틴을 사용한 종양의 치료를 효과적이고 안전하게 수행하고 모니터링할 수 있을 뿐 아니라, 엔도스테틴의 작용기작과 관련된 기타 질환의 치료에도 응용될 수 있을 것이다.
따라서, 엔도스테틴의 탁월한 항암효과는 혈관내피세포의 증식억제 뿐 아니라, 혈관내피세포의 침윤 및 종양세포의 전이에도 직접적인 영향을 미칠 수 있다는 점에 착안하여, 세포의 침윤에 필수적 과정인 세포간질 분해 억제와 엔도스테틴의 작용의 상관관계를 추측하게 되었으며, 세포간질분해에 중요한 세포간질 금속성단백질분해효소의 작용에 대한 엔도스테틴의 효과에 대하여 더욱 더 규명해야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 엔도스테틴과 세포간질 금속성단백질분해효소의 관계를 밝히려고 예의 연구 노력한 결과, 엔도스테틴이 MMP-2의 전구체인 proMMP-2(promatrix metalloproteinase-2)를 MMP-2로 활성화시키는 MT1-MMP의 활성을 저해하는 동시에, 활성화된 MMP-2의 활성을 저해함으로써 세포간질분해를 억제한다는 사실을 밝혀내고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 엔도스테틴을 이용하여 세포간질 금속성단백질분해효소의 활성을 저해함으로써 세포간질분해를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1a는 재조합 MT1-MMP에 의하여 재조합 proMMP-2가 MMP-2의 중간생성물로 활성화되는 단계에서 재조합 엔도스테틴의 작용을 나타내는 자이모그래피이다.
도 1b는 APMA 처리에 의하여 proMMP-2가 MMp-2로 활성화되는 단계에서 재조합 엔도스테틴의 작용을 나타내는 자이모그래피이다.
도 2는 PMA에 의하여 proMMP-2가 MMP-2로 활성화되는 단계에서 재조합 엔도스테틴의 작용을 나타내는 자이모그래피이다.
도 3a는 proMMP-2에서 MMP-2로 활성화되는 단계에서 재조합 엔도스테틴 및 면역적으로 결핍된 재조합 엔도스테틴의 작용을 나타내는 자이모그래피이다.
도 3b는 도3a의 결과를 항MMP-2 항체로 면역검출분석법을 시행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 재조합 MT1-MMP의 활성 및 MMP-2의 세포간질 분해작용에 대한 재조합 엔도스테틴의 억제작용을 나타내는 그래프이다.
도 5a는 항FLAG 항체를 사용하여 엔도스테틴을 면역침전하여 항FLAG 항체로 면역검출분성을 시행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5b는 항FLAG 항체를 사용하여 엔도스테틴을 면역침전하여 항MMP-2 항체로 면역검출분석을 시행한 결과를 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명의 세포간질 금속성단백질분해효소의 전구체 및 세포간질 금속성단백질분해효소의 활성을 억제하는 방법을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
우선, 재조합 엔도스테틴을 수득하기 위하여, 마우스의 뇌 cDNA 라이브러리를 주형으로 삼아 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행한 다음, 수득한 PCR 산물을 제한효소로 절단하여 pFLAG-CMV-1 벡터에 클로닝하여 이를 사람의 배아신장세포에 감염시켜 배양한 후, FLAG의 항원부위를 함유한 재조합 엔도스테틴을 컬럼으로 순수분리하여 20kDa의 단백질을 PAGE 젤에서 확인하고 아울러, 상기한 재조합 엔도스테틴의 FLAG의 항원부위가 엔도스테틴의 활성에 영향을 주지 않음도 확인하였다. 한편, MMP-2의 전구체인 재조합 proMMP-2 및 이를 MMP-2로 전환시키는데 관여하는 sMT1-MMP는 바쿨로바이러스를 사용하여 곤충세포 Sf9에서 발현시켜 수득하고, MMP-2는 재조합 proMMP-2에 재조합 MT1-MMP를 처리하여 반응시킨 후 사용하였다.
전기에서 수득한 재조합 proMMP-2의 활성화를 엔도스테틴이 억제하는지 알아본 결과, PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)처리된 사람의 배꼽정맥내피세포에서 재조합 엔도스테틴이 농도의존적으로 proMMP-2로부터 MMP-2의 활성을 억제함을알 수 있었다. 이어, 재조합 엔도스테틴을 항FLAG 항체 비드(anti-FLAG antibody bead)를 사용하여 면역적으로 결핍(immuno-depleted)시키면, proMMP-2에서 MMP로의 활성화를 억제하지 못하므로, 엔도스테틴이 pro-MMP-2의 활성화에 대하여 선택적 억제작용을 보이고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, MT1-MMP는 proMMP-2의 선구도메인(pro-domain)을 분해함으로써 proMMP-2를 MMP-2로 활성화하며, APMA(p-aminophenylmercuric acetate)는 proMMP-2의 선구도메인을 탈안정화함으로써 MMP-2로의 자가활성을 유도하기 때문에, 엔도스테틴이 MT1-MMP 매개성 및 APMA 매개성 proMMP-2의 활성을 억제하는지 여부를 알아본 결과, 엔도스테틴은 MT1-MMP 매개성 및 APMA 매개성 proMMP-2의 활성을 모두 억제하는 것으로 나타났다. 최종적으로, 엔도스테틴이 MMP-2를 억제하는 방법이 MMP-2의 기질분해작용을 억제함으로써 나타나는지, 또는 MT1-MMP에 의한 proMMP-2의 MMP-2로의 활성화을 억제함으로써 나타나는지 여부를 알아보기 위하여, 엔도스테틴의 존재시 형광펩타이드를 기질로 이용하여 sMT1-MMP의 proMMP-2활성화작용 및 MMP-2의 기질분해작용을 펩타이드절단 분석법으로 확인한 결과, 재조합 엔도스테틴은 농도의존적으로 MMP-2의 기질분해작용을 억제하며, 재조합 MT1-MMP의 proMMP-2 활성도 억제함을 알 수 있었다.
전기한 결과로부터 재조합 엔도스테틴은 MT1-MMP의 활성을 저해하여 proMMP-2의 MMP로의 활성화를 억제할 뿐 아니라, 활성화된 MMP-2의 활성도 억제하여 세포간질의 분해를 억제함을 알 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 세포배양
사람의 탯줄정맥에 콜라겐분해효소를 처리하여 배꼽정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)를 분리한 후, 전기 세포를 20%(w/v) FBS, 100units/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신, 3ng/㎖의 bFGF(basic fibroblast growth factor, Upstate Biotechnology, U.S.A.) 및 5units/㎖의 헤파린을 함유한 M19배지(Life Technologies, U.S.A.)가 담겨진 75㎠의 플라스크에 접종한 후, 37℃의 5% CO2배양기에서 배양하였다. 한편, 재조합 엔도스테틴의 합성시에 사용되는 사람의 배아육종세포(human fibrosarcoma cell)인 HT1080 세포주(ATCC CCL121) 및 사람의 배아신장세포(human embryokidney cell)인 HEK293 세포주(한림대환경생명과학연구소)는 10% FBS, 100units/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신을 포함한 둘베코의 변형된 이글스배지(DMEM, Life Technologies, U.S.A.)에서 배양하였다.
실시예 2: 재조합 엔도스테틴의 제조
마우스 콜라겐 ⅩⅧ의 C 말단부분인 183개의 아미노산을 암호하는 엔도스테틴 cDNA를 수득하기 위하여 하기와 같은 방법으로 PCR을 시행하였다. 마우스의 뇌 cDNA를 주형으로 5' 프라이머는 GGGAAGCTTCATACTCATCAGGACTTT-CAGC(참조: 서열번호 1)를, 3' 프라이머는 GGGGTCGACCTATTTGGAGAAAGAGGTCATG(참조: 서열번호 2)를 사용하여 PCR을 수행한 후, 수득한 PCR산물을 제한효소인 HindⅢ/Sa1I로 절단하였다. 이어, 절단된 부위를 N 말단 부분인 FLAG(DYKDDDDK)의 항원결정부위(epitope) 및 링커(linker) 아미노산을 암호하는 pFLAG-CMV-1 벡터(KODAK, U.S.A.)내에서 클로닝하여 pFLAG-CMV-1-endostatin을 수득하였다. 실시예 1에서 수득한 사람의 배아신장세포 HEK293에 pFLAG-CMV-endostatin 벡터와 pcDNA3.1(Clontech, U.S.A.)을 함께 감염시킨 후, G418(0.6㎎/㎖)을 함유한 혈장이 없는 배지에서 배양하여 세포를 수득하고, 재조합 엔도스테틴을 컬럼 크로마토그래피로 순수분리하였다(참조: Sasaki T. et al.,EMBO J., 17:4249-4256(1998)). 전기 순수분리된 재조합 엔도스테틴을 확인하기 위하여, 0.1㎍/㎖의 재조합 엔도스테틴 200㎕에 항FLAG 항체(KODAK, U.S.A.)가 결합된 비드 100㎕ 또는 항FLAG 항체가 결합되지 않은 단백질A 비드(Upstate Biotechnology, U.S.A.) 100㎕를 사용하여 4℃에서 24시간 방치한 후, 4000rpm에서 2분동안 원심분리하여 비드들을 제거한 상등액 10㎕를 15% SDS-PAGE 수행하였다. 또한, 재조합 엔도스테틴의 FLAG항원결정부위인 DYKDDDDK는 사람의 배꼽정맥내피세포의 이동과 침윤에 영향을 주지 않으며, 전이성 암세포주인 HT1080(ATCC CCL121)의 성장에 전혀 영향을 미치지 않았으므로, MMP-2에 대한 엔도스테틴의 기능을 알아보기 위하여 재조합 엔도스테틴을 사용할 수 있음을 확인하게 되었다.
실시예 3: 세포간질 금속성분해효소의 전구체 및 세포간질 금속성분해효소의 수득
세포간질 금속성분해효소의 일종인 MMP-2의 활성은, MT1-MMP가 proMMP-2의 선구도메인(pro-domain)을 분해함으로써 나타난다는 것이 알려져 있으므로(참조: Sato et al.,J. Biochem., 119:209-215, 1996), proMMP-2와 트랜스멤브레인 부분이 소실된(transmembrane-deleted) sMT1-MMP(soluble membrane type-1 MMP)를 곤충세포 Sf9(ATCC CRL1711)에서 바쿨로바이러스를 이용하여 발현시켜서 분리하였다(참조: Jo et al.,J Biochem. Mol. Biol., 32:60-66, 1999).
실시예 4: proMMP-2에서 MMP-2로의 활성화에 대한 재조합 엔도스테틴의 작용
재조합 proMMP-2로부터 MMP-2를 활성화시키기 위하여, 20mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 5mM CaCl2, 100μM ZnCl2및 0.025% Brij 35로 구성된 MMP 분석용 완충용액 40㎕에 각각 0, 0.31, 0.63, 1.3, 2.5, 5.0, 10 또는 20㎍/㎖의 재조합 엔도스테틴을 처리한 후, 실시예 3에서 수득한 10ng의 재조합 proMMP-2 및 12ng의재조합 sMT1-MMP를 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 또한, APMA는 proMMP-2의 선구도메인을 탈안정화시켜 proMMP-2를 자가활성시킨다는 사실에 근거하여(참조: Okada et al.,Eur. J. Biochem., 194:721-730, 1990), 재조합 proMMP-2를 활성화시키기 위한 다른 방법으로, 12ng의 재조합 sMT1-MMP대신 1mM APMA(Sigma Chemical Co., U.S.A.)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 전기한 실험으로부터 얻어진 결과를 젤라틴 자이모그래피를 수행하여 분석하였다. 이때, 젤라틴 자이모그래피는 0.1% 젤라틴 존재하에 9% SDS-PAGE를 세포배양액으로 수행한 후, 2.5% Triton X-100을 사용하여 전기영동 젤에서 SDS를 제거함으로써 젤라틴분해효소를 재활성화시키고, 수득한 전기영동 젤을 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl 및 10mM CaCl2로 구성된 용액에서 24시간 동안 방치한 후, 0.25% 쿠마시블루R250으로 염색하였다.
도 1a는 재조합 MT1-MMP에 의하여 재조합 proMMP-2가 MMP-2로 활성화되는 단계에서 재조합 엔도스테틴의 작용을 나타내는 자이모그래피이다. 도 1a에서, 제 1 레인은 대조군으로 재조합 proMMP-2(68kDa)를 나타내고, 제 2 내지 9 레인은 12ng의 재조합 sMT1-MMP가 처리된 재조합 proMMP-2에 상기 기술된 각 농도별 재조합 엔도스테틴을 처리한 것을 나타낸다. 도 1a의 제 2레인에서 보듯이, 재조합 엔도스테틴이 처리되지 않은 재조합 proMMP-2(68kDa)는 재조합 MT1-MMP에 의하여, MMP-2가 되기전의 64kDa의 중간형(intermediate form)으로 활성화되지만, 제 3레인 내지 9레인에서는 재조합 엔도스테틴이 처리된 경우에 농도의존적으로 중간형(64kDa)의양이 감소됨을 보여준다.
한편, 도 1b는 APMA처리에 의한 재조합 proMMP-2로부터 MMP-2의 활성화에 대한 재조합 엔도스테틴의 작용을 나타내는 자이모그래피이다. 도 1b에서, 제 1레인은 대조군으로 재조합 proMMP-2(68kDa)를 나타내고, 제 2 내지 9레인은 1mM의 APMA가 처리된 재조합 proMMP-2에 상기 기술된 각 농도별 재조합 엔도스테틴을 처리한 것을 나타낸다. 도 1b의 제 2레인에서 보듯이, 재조합 엔도스테틴이 처리되지 않은 재조합 proMMP-2는 APMA 존재하에 MMP-2(62kDa)으로 활성화되지만, 제 3 내지 9레인에서는 재조합 엔도스테틴이 처리한 경우에 농도의존적으로 MMP-2(62kDa)의 양이 감소됨을 확인할 수 있었다.
상기 기술된 결과에서, sMT1-MMP 또는 APMA 존재하에 형성되는 재조합 proMMP-2로부터 MMP-2의 활성화는, 재조합 엔도스테틴의 농도의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 세포배양조건에서 재조합 엔도스테틴의 효과
실시예 4에서 MT1-MMP 또는 APMA 매개성 proMMP-2에서 MMP-2로의 활성에 대한 재조합 엔도스테틴의 억제 작용이 생체내에서도 일어나는지 여부를 확인하기 위하여, 세포에서 정상적으로 발현되는 proMMP-2에서 MMP-2로의 활성화에 대한 재조합 엔도스테틴의 작용을 사람의 배꼽정맥내피세포를 대상으로 알아보았다.
실시예 1의 방법으로 사람의 배꼽정맥내피세포에 60ng/㎖의 PMA와 각각 0.1,1, 3, 5 또는 10mg/㎖의 재조합 엔도스테틴을 처리하여 37℃에서 24시간 동안 배양 후, 배양액을 10㎕ 수득하고, 그 결과를 젤라틴 자이모그래피를 이용하여 분석하였다. 또한, 배양액에 60ng/㎖의 PMA(Alexis, U.S.A.)와 함께 재조합 엔도스테틴 또는 면역적으로 결핍된(immuno-depleted) 재조합 엔도스테틴을 처리하여 37℃에서 24시간 동안 배양시킨 후, 배양액을 10㎕ 수득하고, 젤라틴 자이모그래피 및 면역검출 분석법(immunoblotting)으로 분석하였다. 이때, 면역적으로 결핍된 재조합 엔도스테틴은 항FLAG 항체를 재조합 엔도스테틴에 처리하여 수득하였고, 면역검출분석법은 항MMP-2 항체를 이용하여 proMMP-2 및 MMP-2를 검출하였다.
도 2는 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)에 의하여 proMMP-2가 MMP-2로 활성화되는 단계에서 재조합 엔도스테틴의 작용을 나타내는 자이모그래피이다. 도 2에서, 제 1레인은 어떠한 처리도 되지 않은 배양액이고, 제 2레인은 PMA를 단독 처리한 배양액이며, 제 3 내지 8 레인은 제 2 레인의 시료에 각각 다른 농도의 재조합 엔도스테틴을 처리한 것이다. 실시예 4의 결과와 유사하게, proMMP-2(68kDa)는 PMA에 의하여 MMP-2(62kDa)로 활성화되지만, 재조합 엔도스테틴이 처리된 경우에는 재조합 엔도스테틴의 농도 의존적으로 MMP-2(62kDa)의 양이 감소된다.
또한, 도 3a는 proMMP-2에서 MMP-2로 활성화 되는 단계에서 재조합 엔도스테틴 및 면역적으로 결핍된 재조합 엔도스테틴의 작용을 나타내는 자이모그래피이며, 도 3b은 도 3a와 동일한 시료에 함유된 proMMP-2와 MMP-2를 항MMP-2 항체로 면역검출분석법을 시행한 결과를 나타낸 사진이다. 도 3a 및 도 3b에서, 제 1레인은 어떠한 처리도 하지 않은 배양액을, 제 2레인은 PMA만을 처리한 배양액을, 제 3레인은 재조합 엔도스테틴과 PMA를 함께 처리한 배양액을, 제 4레인은 면역적으로 결핍된 재조합 엔도스테틴과 PMA를 함께 처리한 배양액을, 또한 제 5레인은 제 4레인에 대한 대조군으로 단백질 A를 처리한 재조합 엔도스테틴과 PMA를 함께 처리한 배양액을 나타낸다. PMA가 처리되지 않거나 또는 재조합 엔도스테틴이 존재하는 제 1, 3 및 5 레인에서는 proMMP-2(68kDa)가 MMP-2(62kDa)로 활성화되지 못하였으나. 재조합 엔도스테틴이 처리되지 않거나 또는 면역적으로 결핍된 재조합 엔도스테틴이 존재하는 제 2 및 제 4레인에서는 proMMP-2가 MMP-2로 활성화되었음을 나타낸다.
이상의 결과로부터, 사람의 배꼽정맥세포에서 PMA에 의하여 proMMP-2가 MMP-2로 활성화되는 단계를 재조합 엔도스테틴이 억제함을 알 수 있었다. 따라서, 엔도스테틴을 사용하여 세포간질분해 억제를 통한 질병치료를 수행할 때, proMMP-2에서 MMP-2가 활성화되는 단계가 억제되는지 여부를, proMMP-2 및 MMP-2의 변화양상을 모니터링하여 확인할 수 있을 것이다.
실시예 6: MMP-2 및 MT1-MMP의 활성억제에 대한 엔도스테틴의 작용
실시예 4 및 5의 결과에서, proMMP-2가 MMP-2로 활성화되는 단계를 재조합 엔도스테틴이 농도의존적으로 억제함이 입증되었고, proMMP-2는 MMP-2에 의하여 자가활성화되거나 MT1-MMP에 의하여 활성화되므로, MMP-2 및 MT1-MMP의 활성 저해에 대한 엔도스테틴의 작용을 알아보았다.
우선, 실시예 3에서 수득한 재조합 proMMP-2에 1mM의 APMA를 37℃에서 30분동안 처리하여 MMP-2로 활성화시킨 후, 활성측정을 위하여 형광펩타이드인 Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2(Bachem, U.S.A.)를 기질로 하여 펩타이드 절단분석법을 시행하였다(참조: Yamamoto et al.,J. Med. Chem., 41:1209-1217, 1998). 이에 따라, 20ng의 MMP-2 또는 20ng의 재조합 MT1-MMP를 각각 0, 0.31, 0.63, 1.3, 2.5, 5, 10 또는 20㎍의 재조합 엔도스테틴과 함께 1μM의 형광펩타이드가 함유된 40㎖의 MMP분석완충용액과 혼합하여 반응 혼합액을 제조하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 혼합액에 0.1M의 초산나트륨(pH 4.0)을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, KONTRON SFM 25 형광검출기를 사용하여 328nm에서 활성화(excitation)시켰을 때, 393nm에서 방출되는 형광을 측정하였다.
도 4는 재조합 MT1-MMP의 활성 및 MMP-2의 활성에 대한 재조합 엔도스테틴의 억제작용을 나타내는 그래프이다. 각 농도별 재조합 엔도스테틴에 의하여 MMP-2(○) 및 MT1-MMP(■)의 활성의 변화를 백분율(%)로 나타내었다. 이때, 백분율은 재조합 엔도스테틴이 첨가되지 않은 반응 혼합액의 형광방출량을 대조군으로 하여, 각 실험군의 반응 혼합액으로부터 얻어진 형광방출량을 환산한 것이다. MMP-2의 활성이 재조합 엔도스테틴의 농도의존적으로 억제되는 양상과 유사하게, proMMP-2를 MMP-2로 변화시키는 재조합 sMT1-MMP의 활성도 재조합 엔도스테틴의 농도의존적으로 억제되었으며, sMT1-MMP 또는 MMP-2의 활성에 대한 엔도스테틴의 50% 억제농도는 각각 2.0㎍/㎖ 또는 0.82㎍/㎖임을 확인할 수 있었다.
상기의 결과를, 엔도스테틴에 의하여 재조합 sMT1-MMP가 proMMP-2를 활성화시키는 단계가 억제된다는 실시예 4 및 5의 결과와 비교해 볼 때, 엔도스테틴은 proMMP-2를 활성화시키는 MT1-MMP의 활성을 저해하여 proMMP-2로부터 MMP-2로의 활성화를 억제할 뿐 아니라, 이미 활성화된 MMP-2의 활성을 억제하는 방법으로 세포간질 분해를 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 엔도스테틴과 proMMP-2의 결합 측정
엔도스테틴은, MT1-MMP 또는 APMA 존재하에 이루어지는 proMMP-2에서 MMP-2로의 활성을 억제하므로, 엔도스테틴이 proMMP-2와 결합함으로써 이러한 작용이 나타나는지 확인하기 위해서, 하기와 같이 엔도스테틴을 면역침전분석법 (coimmunoprecipitation)으로 침전시켰을 때, proMMP-2가 동시면역침전 되는지 조사함으로써 엔도스테틴과 proMMP-2의 결합여부를 확인하였다.
1㎍/㎖의 proMMP-2를 함유하는 HT1080 세포의 조건 배양액에 재조합 엔도스테틴을 각각 0, 0.1, 1 또는 10㎍씩 분주하고 4℃에서 2시간 동안 배양한 다음, proMMP-2와 결합한 엔도스테틴을 검출하기 위하여, 배양액에 25㎕의 항FLAG 항체(KODAK, U.S.A.)가 결합된 비드를 첨가하여 1시간 동안 추가 배양하였다. 이어서, 배양액을 4000rpm에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 분리한 후, 0.5% NP-40(Nonidet P-40, Sigma, U.S.A.)를 포함하는 500㎕의 PBS로 5회 세척한 다음, 비드를 제외한 면역침전물을 항MMP-2 항체(Santa Cruz Biotechnology, U.S.A.) 또는 항FLAG 항체를 사용하여 웨스턴블라팅(western blotting)으로 검출하였다.
도 5a는 항FLAG 항체를 사용한 면역침전물을 항FLAG 항체를 사용하여 면역검출분석한 결과를 나타내는 사진이며, 도 5b는 동일한 면역침전물을 항MMP-2 항체를 사용한 면역침전분석결과를 나타내는 사진이다. 도 5a에서, 제1레인은 엔도스테틴을 첨가하지 않은 HT1080세포에 대한 면역침전 결과물이고, 제 2 내지 4레인은 재조합 엔도스테틴을 각각 0.1, 1 또는 10㎍을 첨가한 HT1080세포에 대한 면역침전 결과물이다. 또한, 도 5b에서, H레인은 HT1080세포의 배양액 30㎕를 젤에 전기영동한 결과물이고, 제 1레인 내지 제 4레인은 상술한 도5a에서의 제 1내지 4레인과 동일한 결과물을 항MMP-2 항체를 사용하여 검출한 결과를 나타낸다. 도 5a 및 도 5b에서 보듯이, 외인성 재조합 엔도스테틴(20kDa)의 양이 증가함에 따라서, proMMP2(68kDa)가 엔도스테틴과 농도의존적으로 결합하여 동시면역침전되는 양상이 증가함을 확인할 수 있었다.
따라서, 재조합 엔도스테틴은 적어도 proMMP-2와 안정한 화합물을 이루므로 MT1-MMP 매개성 proMMP-2의 MMP-2로의 활성화 또는 APMA 매개성 proMMP-2의 MMP-2로의 활성화의 단계를 억제함을 재확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 엔도스테틴을 이용하여 세포간질 금속성단백질분해효소의 활성화를 저해하여 세포간질 분해를 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 엔도스테틴이 세포간질 금속성단백질분해효소의 일종인 MT1-MMP의 활성을 저해하여 세포간질 금속성단백질분해효소인 MMP-2의 전구체(proMMP-2)를 분해시켜 MMP-2로 활성화시키는 과정을 저해하면서, 활성화된 세포간질 금속성단백질분해효소의 활성도 억제하여 효과적으로 세포간질의 분해를 억제하는 사실을 확인하였다.

Claims (3)

  1. 엔도스테틴을 이용하여 인간을 제외한 포유동물의 세포간질 금속성단백질분해효소(MMP)의 활성을 저해함으로써 세포간질분해를 억제하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    엔도스테틴이 세포막 제 1형 세포간질 금속성단백질분해효소(MT1-MMP)의
    활성을 억제함으로써, 세포간질 금속성단백질분해효소-2의 전구체
    (proMMP-2)가 세포간질 금속성단백질분해효소-2(MMP-2)로 활성화되는
    것을 저해하는 것을 특징으로 하는
    세포간질분해를 억제하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    엔도스테틴이 활성화된 세포간질 금속성단백질분해효소-2(MMP-2)의
    활성을 저해하는 것을 특징으로 하는
    세포간질분해를 억제하는 방법.
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