KR100364105B1 - Process for preparing erythritol by optimization of medium concentration and culture conditions - Google Patents
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Abstract
본 발명은 토룰라속 변이주(Torulasp. 돌연변이주로 한국미생물보존협회 기탁번호 KCCM-10171호로 기탁)에 의한 에리스리톨(erythritol) 발효 생산 과정 중 배지인 포도당의 농도를 조절하고 배지 내 무기염의 첨가를 통해 최적 배양 조건을 제공함으로서 고수율, 고생산성으로 에리스리톨을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세히는 성장배지에서 종배양된 토룰라속 변이주 KCCM-10171호를 발효 배지에서 배양하여 에리스리톨을 제조함에 있어서, 발효 배지내 초기 포도당의 농도를 20∼40(w/v)%, 유지되는 포도당의 농도를 10∼30(w/v)%로 조절하고, 구리나 망간을 배지내 소량 첨가시킴을 특징으로 하는 고수율 에리스리톨의 제조방법 및 그 방법에 따라 제조된 에리스리톨을 제공하는 것이다.The present invention regulates the concentration of glucose as a medium during the production of erythritol fermentation by Torula sp. The present invention relates to a method for producing erythritol in high yield and high productivity by providing culture conditions. More specifically, in the production of erythritol by incubating Tolulla strain KCCM-10171 cultured in a growth medium in fermentation medium, the concentration of initial glucose in the fermentation medium was 20-40 (w / v)%, It is to provide a method for producing high yield erythritol, characterized in that the concentration is adjusted to 10 to 30 (w / v)%, and a small amount of copper or manganese in the medium and erythritol prepared according to the method.
Description
본 발명은 토룰라속 변이주(Torulasp. 돌연변이주로 한국미생물보존협회 기탁번호 KCCM-10171호로 기탁)에 의한 에리스리톨(erythritol) 발효 생산 과정 중 배지인 포도당의 농도를 조절하고 배지 내 무기염의 첨가를 통해 최적 배양 조건을 제공함으로서 고수율, 고생산성으로 에리스리톨을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention regulates the concentration of glucose as a medium during the production of erythritol fermentation by Torula sp. The present invention relates to a method for producing erythritol in high yield and high productivity by providing culture conditions.
사탄당 알코올 에리스리톨은 올리고당이나 자일리톨과 더불어 대표적인 기능성 감미료로 해초류, 버섯및 과실류 비롯하여 포도주나 맥주, 된장 등의 발효식품등의 광범위한 자연계에 존재하고 있다. 에리스리톨의 당도는 설탕의 70∼80%이고 용해될 때 열 감소가 일어나 입안에서 느끼는 청량감이 큰 특성이 있고, 용해도가 낮아 결정이 잘 생기는 성질이 있다. 이러한 성질들로 인하여 에리스리톨은 청량감과 결정성이 필수적인 캔디 등의 제과제품의 무설탕 원료로 사용되고 있다. 에리스리톨은 저 칼로리 감미료로 체내에서 에너지원으로 이용되지 않고 소변으로 대부분 배출되며, 충치균에 의해서 이용되지 않기 때문에 충치 예방효과도 가지고 있다.Satan sugar alcohol erythritol, along with oligosaccharides and xylitol, is a representative functional sweetener in seaweeds, mushrooms and fruits, and is found in a wide range of natural products such as fermented foods such as wine, beer, and miso. The sugar content of erythritol is 70-80% of the sugar, and when dissolved, heat decreases, resulting in a great cooling feeling in the mouth. Due to these properties, erythritol is used as a sugar-free raw material for confectionery products, such as candy, which is essential for cooling and crystallinity. Erythritol is a low-calorie sweetener that is mostly excreted in the urine instead of being used as an energy source in the body.
에리스리톨의 생산에는 천연물 추출법, 화학적 합성법 및 발효법이 있다. 이중 천연물 추출법은 과일이나 채소 등의 자연상태에서 극히 미량으로만 존재하기 때문에 산업적으로 경제성이 없다. 화학적 합성법도 원료물질이 고가이기 때문에 경제성이 없어 대량생산에 이용되고 있지 못한다. 따라서 현재 대부분의 에리스리톨은 발효법으로 생산되며 이러한 생산을 위한 새로운 미생물 균주에 관한 연구도 활발히 진행되고 있다.Production of erythritol includes natural product extraction, chemical synthesis and fermentation. Among them, the extraction method of natural products is economically insignificant because it exists only in a very small amount in a natural state such as fruits or vegetables. Chemical synthesis is also not economical because it is expensive because raw materials are expensive. Therefore, most of the erythritol is produced by the fermentation method, and research on new microbial strains for such production is being actively conducted.
공업적 생산에 이용되고 있는 균주로는 오레오바시디움속의 균주 (Aureobasidiumsp.)가 있는데, 이 균주는 일본의 농림수산성 식품종합연구소와 일연화학의 공동연구에 의하여 분리 동정되었다. 자연에서 분리한 오레오바시디움속 야생 균주는 에리스리톨 생산성과 내당성에 있어서도 만족할 만하지 못했지만 이 균주를 돌연변이시켜 생산성과 내당성의 향상된 돌연변이주를 얻을 수 있었다.이 변이주는 포화 포도당 농도(83.3%)에서도 발효가 가능하고 포도당 농도 40∼50%에서 2 g/L-h의 에리스리톨 생성속도를 보였다. 또한, 포도당으로부터 에리스리톨의 수율이 45%(w/w)로 높은 수준이었으며 부산물은 소량의 글리세롤을 생성하였다.A strain of Aureobasidium sp., Which is used for industrial production, was isolated and identified by a joint study by Japan Research Institute for Agriculture, Forestry and Fisheries, and Ilyeon Chemical. Wild strains of Oreosidium spp. Isolated from nature were not satisfactory in erythritol productivity and glucose tolerance, but they could be mutated to obtain improved mutant strains of productivity and glucose tolerance.These strains were fermented even at saturated glucose concentrations (83.3%). And erythritol production rate of 2 g / Lh at a glucose concentration of 40-50%. In addition, the yield of erythritol from glucose was high at 45% (w / w) and the byproduct produced a small amount of glycerol.
미생물에 의하여 에리스리톨을 생산할 때는 초기에 포도당을 고농도로 첨가하여 배양을 하지만, 이러한 회분식 배양은 배양시간이 경과함에 따라 포도당의 농도가 낮아져 에리스리톨의 생산성이 낮아지는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해서는 포도당의 농도를 일정하게 유지시켜야 한다. 그러나, 토룰라속 균주를 사용하여 포도당 농도를 일정하게 유지시켜 에리스리톨의 생산을 증가시킨 보고가 없다. 또한 지금까지 무기염이 에리스리톨 생산에 미치는 영향은 보고되었으나, 특수한 미네랄 이온을 첨가하여 에리스리톨의 생산성을 증가시킨 보고는 없다.When erythritol is produced by microorganisms, glucose is initially added at a high concentration, but the batch culture has a disadvantage in that the productivity of erythritol is lowered because the concentration of glucose decreases as the incubation time passes. To overcome this disadvantage, the concentration of glucose must be kept constant. However, there have been no reports of increasing production of erythritol by maintaining a constant glucose concentration using a Tollula strain. In addition, the effects of inorganic salts on erythritol production have been reported so far, but there have been no reports of increasing the productivity of erythritol by adding special mineral ions.
따라서, 본 발명자들은 토룰라속 균주를 이용하여 포도당의 농도를 적절히 조절하고 특수한 미네랄 이온을 첨가하면 에리스리톨의 생산성이 증가됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have found that the productivity of erythritol is increased by properly adjusting the concentration of glucose using a strain of Torula, and adding special mineral ions, and completed the present invention.
따라서 본 발명의 목적은 성장배지에서 종배양된 토룰라속 변이주 KCCM-10171호를 발효 배지에서 배양하여 에리스리톨을 제조함에 있어서, 발효 배지내 초기 포도당의 농도를 20∼40(w/v)%, 유지되는 포도당의 농도를 10∼30(w/v)%로 조절하고, 구리나 망간을 배지내 소량 첨가시킴을 특징으로 하는 고수율 에리스리톨의 제조방법 및 그 방법에 따라 제조된 에리스리톨을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to prepare the erythritol by incubating the cultivars of Torula strain KCCM-10171 cultured in a growth medium in the fermentation medium, the concentration of the initial glucose in the fermentation medium 20 to 40 (w / v)%, maintenance It is to provide a method for producing high erythritol, characterized in that the concentration of glucose to be adjusted to 10 to 30 (w / v)%, and a small amount of copper or manganese in the medium and erythritol prepared according to the method.
또한 이때 상기 발효 배지에 피틱산 0.05∼0.4%를 첨가시킴을 특징으로 하고, 상기 배지내에 망간 이온을 1∼20 mg/L 첨가하거나, 구리 이온을 0.1∼10 mg/L 첨가시킴을 특징으로 한다.In addition, the fermentation medium is characterized in that the addition of 0.05 to 0.4% of the phytic acid, characterized in that the addition of 1 to 20 mg / L of manganese ions or 0.1 to 10 mg / L of copper ions in the medium. .
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
성장 배지로는 포도당 15∼25 %, 효모추출물 0.8∼1.2 %로 구성된 배지를 사용하였고 생산배지는 발효조 실험에서 포도당 30∼50 %, 효모추출물 1.5∼2.5 %, 피틱산(phytic acid) 0.15∼0.25 %와 소량의 미네랄 이온을 사용하였다.As a growth medium, a medium consisting of 15-25% of glucose and 0.8-1.2% of yeast extract was used, and the production medium was 30-50% of glucose, 1.5-2.5% of yeast extract, and 0.15-0.25 of phytic acid in the fermenter experiment. % And small amounts of mineral ions were used.
종배양은 보관된 토룰라속 변이주의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 230∼270 rpm, 27∼33 ℃로48시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 500 mL의 플라스크에 접종하여 230∼270 rpm, 27∼33 ℃로 24시간 동안 배양하였다.Species cultures were inoculated in a single colony of stored Torula strains in 20 mm diameter test tubes containing 5 mL of growth medium and incubated for 48 hours at 230-270 rpm, 27-33 ° C in a shaker. 5 mL of the culture was inoculated into a 500 mL flask containing 100 mL of growth medium and incubated at 230-270 rpm and 27-33 ° C. for 24 hours.
본 배양은 플라스크 배양의 경우는 생산배지 100 mL가 들어있는 500 mL의 배플(baffled) 플라스크에 접종하여 초기 pH를 5.5로 조절하고 진탕배양기에서 230∼270 rpm, 31∼37 ℃로 120시간 동안 배양하였고, 발효조 배양의 경우는 5 L 발효조(한국발효기(주))를 사용하여 배양을 수행하였다.In the case of flask culture, inoculate into a 500 mL baffled flask containing 100 mL of production medium, adjust the initial pH to 5.5, and incubate at 230-270 rpm and 31-37 ° C for 120 hours in a shaker. In the case of fermenter culture, the culture was performed using a 5 L fermenter (Korea Fermenter Co., Ltd.).
회분식 배양에서는 포도당이 함유된 배지부피가 3 L이었고 발효과정 중에 교반속도는 용존산소가 고갈되지 않는 범위에서 500∼800 rpm으로 조절하였고 통기량은 0.3∼0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 유가식 배양에서는 초기에 2.4 L에 0.6 L의 80 % 포도당 용액을 첨가하여 최종 부피가 3 L로 하였고 총 첨가된 포도당의 농도를 40 %로 하였다.In batch cultivation, the medium volume containing glucose was 3 L. During the fermentation, the stirring speed was controlled at 500 to 800 rpm and the aeration amount was adjusted to 0.3 to 0.5 vvm within the range of dissolved oxygen. The pH was adjusted to 5.5 during the fermentation process and the incubation temperature was 34 ° C. In fed-batch culture, the initial volume was added to 2.4 L and 0.6 L of 80% glucose solution to make 3 L final volume and 40% of the total added glucose concentration.
에리스리톨의 농도는 탄수화물 분석칼럼(Carbohydrate analysis column, Waters, USA)이 장착된 HPLC(Shimadzu C-R6A, Japan)의 Refractive Index Detector (Shimadzu RID-6A, Japan)를 이용하여 측정하였다. 이때, 용리액은 아세토니트릴(acetonitrile)과 물을 8:2로 섞어 사용하였고, 유속은 2.0 ㎖/min이었다. 균체 농도는 분광계를 이용하여 600nm에서 현탁도를 측정하여 미리 측정한표준곡선을 이용하여 건조중량으로 전환하였다. 포도당의 농도는 포도당 산화효소(영동제약, 한국)를 사용하여 측정하였다. 용존산소의 농도는 Ingold사(Swiss, polarographic type)의 용존산소 전극을 사용하여 측정하였다.The concentration of erythritol was measured using a Refractive Index Detector (Shimadzu RID-6A, Japan) of HPLC (Shimadzu C-R6A, Japan) equipped with a carbohydrate analysis column (Waters, USA). At this time, the eluent was mixed with acetonitrile and water at 8: 2, and the flow rate was 2.0 ml / min. The cell concentration was converted to dry weight using a standard curve measured in advance by measuring the suspension at 600 nm using a spectrometer. Glucose concentration was measured using glucose oxidase (Youngdong Pharm., Korea). The dissolved oxygen concentration was measured using a dissolved oxygen electrode of Ingold (Swiss, polarographic type).
본 발명을 실시예에 따라 상술하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail as follows.
(실시예 1)(Example 1)
종 배양 : 보관된 토룰라속 변이주의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 250 rpm, 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하여 250 rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하였다.Species culture: A single colony of stored Torula strains was inoculated into a 20 mm diameter test tube containing 5 mL of growth medium and incubated for 48 hours at 250 rpm and 30 ° C in a shaker. 5 mL of the culture was inoculated into a 250 mL flask containing 100 mL of growth medium and incubated at 250 rpm and 30 ° C. for 24 hours.
본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 포도당이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 20∼40% 포도당, 2.0% 효모추출물과 0.2% 피틱산이었다. 초기 포도당의 농도를 달리하여 실험한 결과 표 1과 같았고 30% 포도당 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.Main culture: The main culture was carried out in a 5 L fermenter (Korea Fermenter Co., Ltd.). The culture medium containing glucose in the culture volume was 3 L and the stirring speed during the fermentation was adjusted from 500 to 800 rpm in the range of 20% or more dissolved oxygen until 24 hours before fermentation. Aeration rate was adjusted from 0.3 to 0.5 vvm. The pH was adjusted to 5.5 during the fermentation process and the incubation temperature was 34 ° C. Medium components were 20-40% glucose, 2.0% yeast extract and 0.2% phytic acid. Experimental results of different initial glucose concentrations were shown in Table 1, and the optimum productivity was shown at 30% glucose concentration.
(실시예 2)(Example 2)
종 배양 : 보관된 토룰라속 변이주의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 250 rpm, 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하여 250 rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하였다.Species culture: A single colony of stored Torula strains was inoculated into a 20 mm diameter test tube containing 5 mL of growth medium and incubated for 48 hours at 250 rpm and 30 ° C in a shaker. 5 mL of the culture was inoculated into a 250 mL flask containing 100 mL of growth medium and incubated at 250 rpm and 30 ° C. for 24 hours.
본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 유가식 배양을 수행하였다. 배양 초기에 배지부피가 2.4 L로 포도당의 농도가 30%로 시작하여 특정 농도에 도달하면 일정한 포도당의 농도가 유지되게 0.6L의 80% 포도당 용액을 첨가하였다. 유지되는 포도당의 농도는 15%, 17.5%, 20%, 22.5%, 25%이었고 유지되는 범위는 ±1%를 넘지 않았다. 발효과정 중에 교반속도는 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 포도당, 2.0% 효모추출물과 0.2% 피틱산이었다. 유지되는 포도당의 농도를 달리하여 실험한 결과 표 2와 같았고 22.5% 포도당 농도에서 최적의 생산성이 나타났다.Main culture: fed-batch culture was performed in a 5 L fermenter (Korea Fermenter Co., Ltd.). At the beginning of the culture, the volume of the medium was 2.4 L, and the concentration of glucose started at 30%, and when a certain concentration was reached, 0.6L of 80% glucose solution was added to maintain a constant concentration of glucose. The glucose concentrations maintained were 15%, 17.5%, 20%, 22.5% and 25%, and the maintained range did not exceed ± 1%. During the fermentation, the stirring speed was adjusted from 500 to 800 rpm in the range of 20% or more dissolved oxygen. Aeration rate was adjusted from 0.3 to 0.5 vvm. The pH was adjusted to 5.5 during the pre-fermentation process and the incubation temperature was 34 ° C. Media components were glucose, 2.0% yeast extract and 0.2% phytic acid. Experimental results of different concentrations of glucose were shown in Table 2 and the optimum productivity was shown at 22.5% glucose concentration.
(실시예 3)(Example 3)
종 배양 : 보관된 토룰라속 변이주의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 250 rpm, 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하여 250 rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하였다.Species culture: A single colony of stored Torula strains was inoculated into a 20 mm diameter test tube containing 5 mL of growth medium and incubated for 48 hours at 250 rpm and 30 ° C in a shaker. 5 mL of the culture was inoculated into a 250 mL flask containing 100 mL of growth medium and incubated at 250 rpm and 30 ° C. for 24 hours.
본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 유가식 본배양을 수행하였다. 배양 초기에 배지부피가 2.4 L로 포도당의 농도가 30%로 시작하여 특정 농도에 도달하면 일정한 포도당의 농도가 유지되게 0.6L의 80% 포도당 용액을 첨가하였다. 유지되는 포도당의 농도는 22.5%이었고 유지되는 범위는 ±1%를 넘지 않았다. 발효과정 중에 교반속도는 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 포도당, 2.0% 효모추출물과 0.2% 피틱산이었다. 포도당 농도를 22.5%로 유지하는 유가식 배양 결과 총 40% 포도당으로부터 배양시간 103 시간에 180 g/L의 에리스리톨이 생산되어 수율 45%와 생산성 1.69 g/L-h를 나타내었다.Main culture: A fed-batch main culture was performed in a 5 L fermenter (Korea Fermenter Co., Ltd.). At the beginning of the culture, the volume of the medium was 2.4 L, and the concentration of glucose started at 30%, and when a certain concentration was reached, 0.6L of 80% glucose solution was added to maintain a constant concentration of glucose. The glucose concentration maintained was 22.5% and the maintained range did not exceed ± 1%. During the fermentation, the stirring speed was adjusted from 500 to 800 rpm in the range of 20% or more dissolved oxygen. Aeration rate was adjusted from 0.3 to 0.5 vvm. The pH was adjusted to 5.5 during the fermentation process and the incubation temperature was 34 ° C. Media components were glucose, 2.0% yeast extract and 0.2% phytic acid. As a result of fed-batch culture keeping the glucose concentration at 22.5%, 180 g / L of erythritol was produced at a culture time of 103 hours from a total of 40% glucose, yielding a yield of 45% and a productivity of 1.69 g / L-h.
(실시예 4)(Example 4)
종 배양 : 보관된 토룰라속 변이주의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 250 rpm, 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하여 250 rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하였다.Species culture: A single colony of stored Torula strains was inoculated into a 20 mm diameter test tube containing 5 mL of growth medium and incubated for 48 hours at 250 rpm and 30 ° C in a shaker. 5 mL of the culture was inoculated into a 250 mL flask containing 100 mL of growth medium and incubated at 250 rpm and 30 ° C. for 24 hours.
본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 포도당이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 40% 포도당, 2.0% 효모추출물과 0.2% 피틱산과 MnSO4·4H2O이었다. MnSO4·4H2O의 농도를 달리하여 실험한 결과 표 3과 같았고 10 mg/L에서 최적의 생산성이 나타났다.Main culture: The main culture was carried out in a 5 L fermenter (Korea Fermenter Co., Ltd.). The culture medium containing glucose in the culture volume was 3 L and the stirring speed during the fermentation was adjusted from 500 to 800 rpm in the range of 20% or more dissolved oxygen until 24 hours before fermentation. Aeration rate was adjusted from 0.3 to 0.5 vvm. The pH was adjusted to 5.5 during the fermentation process and the incubation temperature was 34 ° C. The media components were 40% glucose, 2.0% yeast extract, 0.2% phytic acid and MnSO 4 .4H 2 O. Experimental results of different concentrations of MnSO 4 · 4H 2 O were shown in Table 3, and the optimum productivity was shown at 10 mg / L.
(실시예 5)(Example 5)
종 배양 : 보관된 토룰라속 변이주의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 250 rpm, 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하여 250 rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하였다.Species culture: A single colony of stored Torula strains was inoculated into a 20 mm diameter test tube containing 5 mL of growth medium and incubated for 48 hours at 250 rpm and 30 ° C in a shaker. 5 mL of the culture was inoculated into a 250 mL flask containing 100 mL of growth medium and incubated at 250 rpm and 30 ° C. for 24 hours.
본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 포도당이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 40% 포도당, 2.0% 효모추출물과 0.2% 피틱산과 CuSO4·5H2O이었다. CuSO4·5H2O의 농도를 달리하여 실험한 결과 표 4와 같았고 2 mg/L에서 최적의 생산성이 나타났다.Main culture: The main culture was carried out in a 5 L fermenter (Korea Fermenter Co., Ltd.). The culture medium containing glucose in the culture volume was 3 L and the stirring rate was adjusted from 500 to 800 rpm in the range in which dissolved oxygen was maintained at 20% or more until 24 hours before fermentation. Aeration rate was adjusted from 0.3 to 0.5 vvm. The pH was adjusted to 5.5 during the fermentation process and the incubation temperature was 34 ° C. Medium components were 40% glucose, 2.0% yeast extract, 0.2% phytic acid and CuSO 4 · 5H 2 O. The results of experiments with different concentrations of CuSO 4 · 5H 2 O were as shown in Table 4, and the optimum productivity was shown at 2 mg / L.
(실시예 6)(Example 6)
종 배양 : 보관된 토룰라속 변이주의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 250 rpm, 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하여 250 rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하였다.Species culture: A single colony of stored Torula strains was inoculated into a 20 mm diameter test tube containing 5 mL of growth medium and incubated for 48 hours at 250 rpm and 30 ° C in a shaker. 5 mL of the culture was inoculated into a 250 mL flask containing 100 mL of growth medium and incubated at 250 rpm and 30 ° C. for 24 hours.
본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 포도당이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 40% 포도당, 2.0% 효모추출물과 0.2% 피틱산, 10 mg/L MnSO4·4H2O와 2 mg/L CuSO4·5H2O이었다. 배양 결과 135 시간 후에 211 g/L의 에리스리톨을 생산하여 수율 53%, 생산성 1.57 g/L-h를 나타내었다.Main culture: The main culture was carried out in a 5 L fermenter (Korea Fermenter Co., Ltd.). The culture medium containing glucose in the culture volume was 3 L and the stirring speed during the fermentation was adjusted from 500 to 800 rpm in the range of 20% or more dissolved oxygen until 24 hours before fermentation. Aeration rate was adjusted from 0.3 to 0.5 vvm. The pH was adjusted to 5.5 during the fermentation process and the incubation temperature was 34 ° C. Medium components were 40% glucose, 2.0% yeast extract and 0.2% phytic acid, 10 mg / L MnSO 4 · 4H 2 O and 2 mg / L CuSO 4 · 5H 2 O. As a result of the culture, 211 g / L of erythritol was produced after 135 hours, yielding 53% and productivity 1.57 g / Lh.
(실시예 7)(Example 7)
종 배양 : 보관된 토룰라속 변이주의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 250 rpm, 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하여 250 rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하였다.Species culture: A single colony of stored Torula strains was inoculated into a 20 mm diameter test tube containing 5 mL of growth medium and incubated for 48 hours at 250 rpm and 30 ° C in a shaker. 5 mL of the culture was inoculated into a 250 mL flask containing 100 mL of growth medium and incubated at 250 rpm and 30 ° C. for 24 hours.
본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 유가식 배양을 수행하였다. 배양 초기에 배지부피가 2.4 L로 포도당의 농도가 30%로 시작하여 특정 농도에 도달하면 일정한 포도당의 농도가 유지되게 0.6L의 80% 포도당 용액을 첨가하였다. 유지되는 포도당의 농도는 22.5%이었고 유지되는 범위는 ±1%를 넘지 않았다. 발효과정 중에 교반속도는 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 포도당, 2.0% 효모추출물과 0.2% 피틱산, 10 mg/L MnSO4·4H2O와 2 mg/L CuSO4·5H2O이었다. 포도당 농도를 22.5%로 유지하고 미네랄 이온을 첨가한 유가식 배양 결과 총 40% 포도당으로부터 배양시간 100 시간에 220 g/L의 에리스리톨이 생산되어 수율 55%와 생산성 2.20 g/L-h를 나타내었다.Main culture: fed-batch culture was performed in a 5 L fermenter (Korea Fermenter Co., Ltd.). At the beginning of the culture, the volume of the medium was 2.4 L, and the concentration of glucose started at 30%, and when a certain concentration was reached, 0.6L of 80% glucose solution was added to maintain a constant concentration of glucose. The glucose concentration maintained was 22.5% and the maintained range did not exceed ± 1%. During the fermentation, the stirring speed was adjusted from 500 to 800 rpm in the range of 20% or more dissolved oxygen. Aeration rate was adjusted from 0.3 to 0.5 vvm. The pH was adjusted to 5.5 during the fermentation process and the incubation temperature was 34 ° C. The media components were glucose, 2.0% yeast extract and 0.2% phytic acid, 10 mg / L MnSO 4 · 4H 2 O and 2 mg / L CuSO 4 · 5H 2 O. As a result of fed-batch culture with glucose concentration maintained at 22.5% and mineral ions, 220 g / L of erythritol was produced at 100 hours of incubation time from total 40% glucose, yielding 55% yield and 2.20 g / Lh productivity.
따라서 본 발명의 효과는 토룰라속 균주를 이용하여 포도당의 농도를 적절히 조절하고 특수한 미네랄 이온을 첨가하면 에리스리톨의 생산성이 증가됨을 발견하여, 배지내의 포도당 농도 및 구리, 망간 등의 미네랄 이온의 농도를 조절함으로서 고수율 고생산성으로 에리스리톨 발효 생산방법을 제공하는 것이다.Therefore, the effect of the present invention is that by controlling the concentration of glucose appropriately using the strains of the genus Torula and adding special mineral ions found that the productivity of erythritol increases, thereby controlling the concentration of glucose in the medium and the concentration of mineral ions such as copper and manganese By providing a high yield and high productivity erythritol fermentation production method.
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