KR100361583B1

KR100361583B1 - 인체 면역결핍 바이러스(ｈｉｖ) 1형 표면단백질 도입용벡터

Info

Publication number: KR100361583B1
Application number: KR1020000054040A
Authority: KR
Inventors: 이명규; 서정곤; 김길룡
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-09-14
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2002-11-22
Also published as: KR20020021418A

Abstract

본 발명은 인체 면역결핍 바이러스(HIV) 1형 표면단백질 도입용 벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 모든 HIV env 유전자에 공통적으로 존재하는KpnI 제한효소 부위와 함께 트랜스멤브레인(transmembrane)에 대한 서열과 144 아미노산 절단신호인 정지코돈 사이에ClaI 서열을 삽입한 다양한 인체 면역결핍 바이러스(HIV) 1형 표면단백질 도입용 벡터에 관한 것이다. 따라서, 이러한 본 발명에 따르면, 항 HIV 활성 측정이 가능한 HIV 위형 바이러스를 용이하게 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 바이러스의 표면단백질에 따른 숙주 특이성 연구 및 HIV 표면단백질을 타겟(target)으로 하는 백신 제조 시에 실험실내(in vitro) 효능 검사에 이용할 수 있고, 중화항체 제조 시 중화활성 검출에 이용할 수 있는 등 그 용도가 매우 많고, 특히 HIV에 비해 매우 안전하여 일반 실험실 수준에서도 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

인체 면역결핍 바이러스(ＨＩＶ) 1형 표면단백질 도입용 벡터{Vector for introducing surface protein of HIV1 type}

본 발명은 인체 면역결핍 바이러스(HIV) 1형 표면단백질 도입용 벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 모든 HIV env 유전자에 공통적으로 존재하는KpnI 제한효소 부위와 함께 트랜스멤브레인(transmembrane)에 대한 서열과 144 아미노산 절단신호인 정지코돈 사이에ClaI 서열을 삽입한 다양한 인체 면역결핍 바이러스(HIV) 1형 표면단백질 도입용 벡터에 관한 것이다.

HIV의 숙주세포 감염은 그 표면 단백질과 숙주의 수용체들, 즉 CD4 및 케모카인(chemokine) 수용체의 결합에 의하여 일어난다[Berger, 1997, AIDS, 11, S3; Doranz 등, 1997, Immunol. Res., 16, 15; Moore 등, 1997, Current Opin. Immunol., 9, 551]. HIV의 gp120이 먼저 숙주의 CD4에 결합하면 gp120의 구조변화가 일어난 다음 케모카인 수용체와 결합하게 된다. HIV1 아형들의 gp120과 숙주 케모카인 수용체의 결합은 HIV1 아형들의 숙주 선택성에 의해 결정되는데, X4 트로픽 HIV는 숙주의 케모카인 수용체 중 CXCR4에, R5 트로픽 HIV는 CCR5에 특이적이며, R5X4 트로픽 HIV는 CCR5 및 CXCR4에 특이적이다[Alkhatib 등, 1996, Science, 272, 1955; Feng 등, 1996, Science, 272, 872; Doranz 등, 1996, Cell, 85, 1149, Choe 등, Cell, 85, 1135]. Gp120과 숙주 수용체들의 결합이 일어난 다음, gp41의 아미노 말단의 소수성 펩타이드 부위가 숙주세포막에 박힌 후, 3개 gp41 분자의 세포밖 부위 중 아미노 말단 4-3 소수성 반복서열과 카르복시 말단의 4-3 소수성 반복서열이 코일-코일(coiled-coil) 구조를 형성하면서 숙주세포막과바이러스 세포막의 세포막 융합이 일어나 바이러스 코어(core) 부위가 세포질 내로 침투하게 된다 [Chan과 Kim, 1998, Cell, 93, 681]. 이와 같이 HIV1의 감염은 HIV1 표면단백질의 세포외 부위가 주된 역할을 한다. 또한, HIV env 유전자에는 RRE 서열이 존재하는데, 이 서열을 지닌 RNA는 단독으로는 핵막을 통과하지 못하지만, HIV Rev 단백질이 존재하면 서로 결합하여 핵막을 통과하고 세포질에서 단백질을 만들게 된다[Malim 등, 1989, Nature, 338, 254; Felber 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1495]. 그러므로 HIV 표면단백질 발현 시 Rev 단백질도 함께 발현시켜야 HIV 표면단백질이 발현된다. HIV rev 유전자는 env 유전자의 5'-말단 밖과 env 유전자중 gp41을 코딩하는 유전자 서열에 나누어져 존재하고 RNA 스프라이싱(splicing)에 의하여 완전한 rev RNA가 만들어 지고 다음 Rev 단백질이 합성된다 [Malim 등, 1989, Nature, 338, 254; Felber 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1495].

이러한 HIV는 대단히 위험하여 일반 실험실에서는 다루기가 어렵다. 그러므로 안전성 문제를 극복하고 HIV의 숙주에 대한 감염 특이성을 유지시킬 수 있는 HIV 위형(pseudotype) 바이러스에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 현재 바이러스의 표면 단백질에 대한 유전자만 형질감염(transfection)시키면 특정 바이러스에 대한 위형 바이러스를 만들 수 있는 패키징(packaging) 세포주들이 보고되고 있다. 예를 들면, 프랑스의 코셋(Cosset) 박사팀에서는 MuLV gag-pol 단백질과 리포터(reporter) RNA 유전자(Ψ-nls-β gal 서열을 지님)를 안정하게 발현시키는 세포주인 TELCeB6세포를 개발하였다[Cosset 등, 1995, J. Virol., 69, 7430].상기 세포주는 리포터(reporter) RNA가 MuLV gag 단백질 내에 패키징(packging)되게 고안되었다. 또한, 다른 연구에서 이 세포주를 이용하면 HIV-MuLV 위형 바이러스를 제작할 수 있음이 밝혀졌다[Schnierle 등, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 8640]. 이 연구에서 HIV 표면단백질의 세포질 부위는 MuLV 등 다른 바이러스의 세포질 부위보다 길이가 길어 정상적인 길이를 지닌 HIV 표면 단백질은 위형 바이러스 표면에 실리지 않는 문제점이 있었으며, 이러한 HIV-MuLV 위형 바이러스가 감염된 세포는 X-gal 염색에 의한 β-gal의 활성을 측정하여 검출할 수 있다. 그러나, 이들 연구들은 한 HIV 바이러스 아형의 유전자에 대한 연구로 다양한 HIV에 대한 위형 바이러스제조를 위해서는 간단하게 HIV 표면 단백질을 도입할 수 있는 재조합용 벡터 개발이 필요한 실정이었다.

이에, 본 발명의 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고자 노력한 결과, 모든 HIV env 유전자에 공통적으로 존재하는KpnI 제한효소 부위와 함께 트랜스멤브레인(transmembrane)에 대한 서열과 144 아미노산 절단신호인 정지코돈 사이에ClaI 서열을 삽입한 벡터를 제조한 결과, 다양한 소스의 HIV env 유전자로부터KpnI과ClaI 사이의 서열을 PCR에 의해 증폭시키고 이 서열을 상기 벡터 내에 삽입시키면 쉽게 특정 HIV 균주의 특성을 지닌 표면단백질을 발현시킬 수 있음을 확인하였고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명은KpnI 제한효소 부위와 함께트랜스멤브레인(transmembrane)에 대한 서열과 144 아미노산 절단신호 사이에ClaI 서열을 삽입한 pcKCX 벡터를 제공하는 데에 그 주된 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 pcKCX 벡터를 제조하기 위해 HIV env 유전자에ClaI 부위를 도입하기 위한 서열번호 1의 전방향 프라이머를 포함한다.

도 1은 pcⅢBenvD의 제조방법을 나타낸 개략도이다.

도 2는 pcKCX의 제조 및 도식도이다.

도 3은 PCR에 의해 다양한 HIV의 분자 클론으로부터 표면단백질 중 세포외 부위 및 막 부위에 해당하는 유전자를 pcKCX에 도입하는 과정을 나타낸 개략도이다.

도 4는 도 3에서 만들어진 플라스미드들을 TELCeB6세포에 형질감염(transfection) 시켜 얻어진 HIV-MuLV 위형 바이러스들의 숙주 특이성을 나타낸 것이다.

도 5는 도 3의 플라스미드들이 형질감염(transfection)된 TELCeB6 세포와 숙주세포인 HOS-CD4-CCR5 간의 세포융합 실험 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 도 4에서 얻어진 위형(pseudotype) 바이러스들을 이용하여 기존에 알려진 항 HIV 펩타이드인 C34의 활성을 측정하여 나타낸 것이다.

본 발명은 모든 HIV env 유전자에 공통적으로 존재하는 HIV 표면 단백질 신호서열(signal sequence) 바로 뒤의KpnI 부위와 함께 트랜스멤브레인(transmembrane)에 대한 서열과 144 아미노산 절단신호인 정지코돈(stop codon) 사이에ClaI 서열을 삽입한 벡터를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

일반적으로 HIV 표면 단백질은 매우 변이가 심한 단백질이나, 특징적으로 보통 1 내지 2개KpnI 부위를 갖고 있다. 특히 HIV 표면 단백질 신호서열(signal sequence) 바로 뒤에 존재하는KpnI 부위는 일반적으로 모든 HIV env 유전자에 공통적으로 존재한다. 또한, 대부분의 경우 HIV env 유전자 내에는ClaI 부위가 존재하지 않는다. 그러므로, 모든 HIV env 유전자에 공통적으로 존재하는 HIV 표면 단백질 신호서열(signal sequence) 바로 뒤의KpnI 부위와 함께 트랜스멤브레인(transmembrane)에 대한 서열과 144 아미노산 절단신호인 정지코돈(stop codon) 사이에ClaI 서열을 삽입한 벡터를 만들어 준다면, 다양한 소스의 HIV env 유전자로부터KpnI과ClaI 사이의 서열을 PCR에 의해 증폭시키고 이서열을 이 벡터 내에 삽입시키면 쉽게 특정 HIV 균주의 특성을 지닌 표면단백질을 발현시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명에서는 먼저ClaI 부위를 도입하기 위하여 도입부위를 면밀히 검토한 결과, 표면단백질의 트랜스멤브레인(transmembrane)과 세포질부위 경계에 존재하는 Lys-Ser-Ile을 코딩하는 DNA 서열 CTT-TCT-ATA를 CTA-TCG-ATA (밑줄친 부분이 치환된 부분)로 치환시키면, 아미노산 서열의 변화 없이 ATCGAT의ClaI 부위를 도입할 수 있음을 발견하고, 트랜스멤브레인(transmembrane) 부위와 144 아미노산 절단을 위하여 도입한 정지코돈(stop codon) 사이에 위치한 서열에ClaI 부위를 도입한다. 그러기 위해서, Kpn I 부위와ClaI 부위를 동시에 포함하고 있는 서열번호 1의 전방향 프라이머 gtgtggtaccactatcgatagtgaatag와XhoI 부위를 포함한 서열번호 2의 후방향 프라이머 tagactcgagatgctgc를 사용하여 PCR을 수행하고, PCR DNA를 각각KpnI과Xho I으로 절단하여 벡터에ClaI 부위를 도입한다[도 2a]. 그 결과, 제조된 벡터에는 다양한 HIV env 유전자의 세포외 부위를 상기 전방향 프라이머와 후방향 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시키고,Kpn I및Cla I제한효소 절단 후 바로 유전자를 벡터에 재조합 할 수 있는 벡터시스템을 얻을 수 있다. 이러한 벡터를 사용하여 HIV env 유전자를 패키징(packaging) 세포주에서 발현시키면 원하는 HIV 위형 바이러스의 제작할 수 있게 된다. 이때, HIV 유전자원으로는 HIV 분자 클론, 일차(primary) HIV 입자, 또는 HIV에 감염된 T 세포 등을 이용할 수 있다. 이렇게 재조합된 유전자들은 TELCeB6세포 등 패키징(packaging) 세포에서 HIV 위형 바이러스를 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 플라스미드 pcIIIBenvD의 제작

먼저 HIV 표면단백질의 카르복시 말단 144개 아미노산을 발현시키지 않는 HIV ⅢB형 표면단백질과 rev 유전자를 모두 포함하는 pⅢenvCTdel144(NIH의 Eric Freed 박사로부터 입수)를 먼저SalI으로 절단하고 클레노우(Klenow) 효소로 블런트(blunt) 말단으로 만든 다음XhoI으로 절단한 후 아가로스(agarose) 전기영동에 의해 삽입 DNA를 분리하였다. 벡터 DNA로는 pcDNA3+(Invitrogen)를 사용하였으며,HindⅢ로 절단하고 클레노우(Klenow) 효소로 블런트(blunt) 말단으로 만든 다음XhoI으로 더 절단하고, 전기영동으로 분리하였다. 벡터 DNA와 삽입 DNA는 T4 DNA 라이게이즈(ligase)로 붙인 다음, 대장균(E. coli) HB101에 형질전환시키고, DNA가 들어간 콜로니를 암피실린을 이용하여 찾은 다음, 플라스미드 DNA를 분리하여 pcⅢBenvD로 명명하였다[도 1].

실시예 2: pcKCX의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 플라스미드 DNA, pcⅢBenvD를 모체로 하여KpnI과ClaI 부위 사이에 다양한 HIV 유전자들을 삽입이 가능한 pcKCX의 제조는 다음과 같이 시행하였다. 즉,KpnI 부위와ClaI 부위를 포함한 서열번호 1의 전방향 프라이머 GTGTGGTACCACTATCGATAGTGAATAG와XhoI 부위를 포함한 서열번호 2의후방향 프라이머 TAGACTCGAGATGCTGC를 사용하여 PCR을 수행하고, PCR DNA를 각각KpnI과Xho I으로 절단하고 pcⅢBenvD의KpnI-XhoI 부위에ClaI 부위를 도입하였다 [도 2a]. 이때, 상기 PCR DNA에는 HIV env 유전자 중 144개 아미노산 제거 정지코돈(stop codon)이 들어 있으며, env 유전자의 세포질 부위를 모두 포함하고 있다. 이와 같이 제조된 벡터 pcKCX를 2000년 8월 30일 생명공학연구소 내 유전자은행에 기탁번호 KCTC18044P로 기탁하였다. 따라서, pcKCX는KpnI 부위 앞에 5'-말단 rev 유전자 및 env 유전자 중 신호전달서열을 코딩하는 부위를ClaI 부위 뒤부터XhoI 부위까지에는 rev 유전자의 3' 말단을 포함하는 HIV env 유전자중 세포질 부위에 대한 DNA 서열을 지니고 있다[도 2b]. 그러므로, pcKCX에 HIV env 유전자 중 이 사이의 DNA 서열을 각기KpnI 부위와ClaI 부위가 있는 전방향 및 후방향 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고KpnI과ClaI으로 절단하여 pcKCX의KpnI-ClaI 부위에 삽입하면 144개 아미노산이 절단된 HIV 표면단백질을 발현시킬 수 있다.

실험예 1: HIV-MuLV 위형 바이러스의 제작

HIV AD8, BaL 및 89.6에 대한 env 유전자들에 대해 다음과 같은 서열번호 3인 ATGGGGTACCTGTGTGG 서열(밑줄친 부분은KpnI 부위)을 갖는 전방향 프라이머와 서열번호 4인 CACTATCGATAGTACAGCAAAAACTAT 서열(밑줄친 부분은ClaI 부위)을 갖는 후방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고, 이 PCR DNA들을KpnI 및ClaI으로 절단하고, pcKCX도KpnI과ClaI 으로 절단한 다음 정제하였다. 절단된 각PCR DNA와 pcKCX를 T4 DNA 라이게이즈(ligase)로 붙인 다음, 대장균(E. coli)에 형질전환하고 암피실린을 이용하여 목적하는 플라스미드 DNA를 얻었으며, 각각의 플라스미드들을 pcAD8envD, pcBaLenvD 및 pc89.6envD로 명명하였다[도 3]. 이 플라스미드들이 효과적으로 HIV-MuLV 위형 바이러스들을 만드는 가를 알아보기 위하여 본 발명자들은 이 DNA들을 각각 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum)이 든 DMEM 배지에서 칼슘 포스페이트(calcium phosphate)방법에 의해 TELCeB6 세포 내로 전달한 다음, 1일 후 같은 배지로 교환하였다. 그런 다음 2일 후 배지를 수거하여 상등액 내의 위형 바이러스를 HOS-CD4-CCR5 및 HOS-CD4-CXCR4에 대해 감염성을 분석하였고, 그 결과를 다음 도 4에 요약하여 나타내었다. 이 결과는 R5 트로픽(tropic) HIV 균주(strain)들인 AD8과 BaL에 대한 위형 바이러스들은 CCR5에 대한 감염성은 보였으나, CXCR4 특이 감염성은 나타내지 않았다. 또한, R5X4 트로픽 HIV인 89.6 CCR5 및 CXCR4에 대해 모두 감염성을 나타내었다. 이와 같은 사실들은 본 벡터에 삽입시킨 HIV env 유전자가 TELCeB6 세포 내에서 발현되어 HIV-MuLV 위형 바이러스에 실린다는 것을 제시해 준다.

실험예 2: 벡터에 삽입된 env 유전자의 세포 표면 발현여부 확인

상기 실험예 1에서와 같이 HIV env 유전자가 형질감염된 TELCeB6세포에서 HIV 표면단백질들이 발현되는 가를 알아보고자 하였다. 즉, HIV env유전자가 형질감염된 세포를 형질감염시킨 후 3 내지 5일 후에 트립신(trypsin)-EDTA를 처리하여 떼어내고, HOS-CD4-CCR5 또는 -CXCR4 세포들도 같은 방법으로 떼어내었다.그런 다음, 이 세포들을 섞어준 다음 2일 후에 세포 융합에 의해 다핵세포가 생기는가를 X-gal 염색에 의하여 시행하였다. 그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이 세포융합이 일어나는 것을 관찰 할 수 있었고, 이는 본 연구자들이 제조한 벡터에 삽입된 env 유전자가 발현되어 표면단백질이 만들어지고 세포 표면으로 이동된다는 것을 보여준다.

실험예 3: 항 HIV 활성 측정에의 이용

상기 실험예 1에서 제조된 HIV-MuLV 위형 바이러스가 항 HIV 활성 측정에 이용될 수 있는가를 알아보기 위하여 위형 바이러스를 기존에 항 HIV 활성이 있다고 보고된 HIV IIIB 균주의 C34 펩타이드[Chan 등, 1997, Cell, 89, 263]에 대하여 감염억제능을 분석하였다. 그 결과, 도 6에 보듯이 이들 위형 바이러스들은 C34 펩타이드 농도가 증가할수록 숙주세포의 감염이 억제되어, 본 벡터에 삽입되어 발현된 표면단백질이 실린 HIV-MuLV 위형 바이러스가 항 HIV 활성 측정에 이용할 수 있음을 제시하여 준다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은KpnI 및ClaI 제한효소 부위와 정지코돈(stop codon)이 함께 위치하도록 설계된 인체 면역결핍 바이러스(HIV) 1형 표면단백질 도입용 벡터에 관한 것이다. 따라서, 이러한 본 발명에 따르면 항 HIV 제재 검출이 용이한 HIV 위형 바이러스들을 용이하게 제작할 수 있고, 바이러스의 표면단백질에 따른 숙주 특이성 연구 및 HIV 표면단백질을 타겟(target)으로 하는 백신 제조 시에 실험실내(in vitro) 효능 검사에 이용할 수 있고, 중화항체 제조 시 중화활성 검출에 이용할 수 있는 등 그 용도가 매우 많고, 특히 HIV에 비해 매우 안전하여 일반 실험실 수준에서도 이용할 수 있는 효과가 있다.

Claims

pcKCX 벡터.
pcKCX 벡터를 제조 시, HIV env 유전자에ClaI 부위를 도입하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 서열번호 1의 전방향 프라이머.