KR100358248B1 - Screening method of antivirial agent by protein-priming activity of hepatitis B virus DNA Pol - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 단백질 프라이밍 활성을 이용한 항바이러스제의 스크리닝법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 재조합 HBV DNA 중합효소 유전자를 함유한 베큘로 발현벡터를 제조하고, 곤충세포에 상기 베큘로 전달벡터를 트렌스펙션시켜서, HBV DNA 중합효소를 발현하는 베큘로바이러스를 제조한 후 상기의 곤충세포에서 HBV DNA 중합효소를 분리하여 단백질 프라이밍 활성을 측정하는 단계를 포함하는 항바이러스제 스크리닝 방법에 관한 발명이다. 본 발명은 B형 간염 바이러스에 대한 매우 선택적인 항바이러스제를 발굴하게 할 뿐 아니라, 대량 스크리닝(high-throughput screening)에 이용할 수 있는 장점이 있다.The present invention relates to a method for screening an antiviral agent using protein priming activity of DNA polymerase of hepatitis B virus, and more particularly to preparing a baculo expression vector containing a recombinant HBV DNA polymerase gene, Transfecting the baculotransfer vector to produce a baculovirus expressing HBV DNA polymerase, and then separating the HBV DNA polymerase from the insect cells to measure protein priming activity. The invention relates to a method. The present invention not only allows the discovery of highly selective antiviral agents for hepatitis B virus, but also has the advantage of being available for high-throughput screening.

Description

Ｂ형 간염 바이러스 ＤＮＡ 중합효소의 단백질-프라이밍 활성을 이용한 항 바이러스제 스크리닝방법{Screening method of antivirial agent by protein-priming activity of hepatitis B virus DNA Pol}Screening method of antivirial agent by protein-priming activity of hepatitis B virus DNA Pol}

본 발명은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 단백질 프라이밍 활성을 이용한 항바이러스제의 스크리닝법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 곤충 세포에서 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, 이하 HBV라 칭함)의 DNA 중합 효소를 재조합 형태로 베큘로 바이러스를 이용하여 곤충 세포에서 발현한 후 HBV DNA 중합효소의 특이적 활성인 단백질-프라이밍 활성(단백질 프라이밍)을 간단하고, 재현성있게 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제조된 재조합 HBV DNA 중합효소는 역전사 활성(reverse transcriptase activity) 뿐 아니라 단백질-프라이밍 활성을 갖고 있어 HBV의 DNA 중합효소 활성을 선택적으로 저해하는 물질을 발굴할 수 있으므로, 만성 B형 간염 치료제 개발에 매우 유용한 측정방법을 제공한다. 또 본 발명에서 제조된 재조합 HBV DNA 중합효소는 공지의 문헌에 보고된 HBV DNA 중합효소보다 발현된 용해 단백질량이 약 2배 많은 것으로 추정되며, 활성은 약 10배이상 높은 것으로 추정된다(Lanford et al, J. of Virology 69:4431-4439, 1995; Urban et al., J. of General Virology 79:1121-1131, 1998). 이밖에도 또한 히스티딘-표지를 이용하여 용이하게 분리, 정제될 수 있는 장점이 있다.The present invention relates to a method for screening an antiviral agent using protein priming activity of DNA polymerase of hepatitis B virus, and more particularly to DNA of hepatitis B virus (HBV) in insect cells. The present invention relates to a method for the simple and reproducible measurement of protein-priming activity (protein priming), which is the specific activity of HBV DNA polymerase after expression of a polymerase in recombinant cells using baculovirus in recombinant form. Since the recombinant HBV DNA polymerase prepared in the present invention has a protein-priming activity as well as reverse transcriptase activity, it is possible to find a substance that selectively inhibits DNA polymerase activity of HBV, thereby treating chronic hepatitis B. It provides a very useful measurement method for development. In addition, the recombinant HBV DNA polymerase prepared in the present invention is estimated to have about twice as much amount of soluble protein expressed as HBV DNA polymerase reported in known literature, and its activity is estimated to be about 10 times higher (Lanford et al. , J. of Virology 69: 4431-4439, 1995; Urban et al., J. of General Virology 79: 1121-1131, 1998). In addition, there is an advantage that can be easily separated and purified using histidine-label.

B형 간염 바이러스(HBV)는 만성 간염의 주요 원인 바이러스이며, 이의 감염은 급성 간염, 간경변을 일으킬 뿐 아니라 간암에 이를 수 있는 심각한 질병을 일으키는 바이러스이다(Ganem and Varmus, Annu. Rev. Biochem. 56:651-693, 1987). 또한 전세계적으로 약 5억 명 정도의 사람들이 HBV에 만성 감염되어 있는 것으로 알려져 있다.Hepatitis B virus (HBV) is a major cause of chronic hepatitis, and its infection is a virus that causes not only acute hepatitis, cirrhosis, but also serious diseases that can lead to liver cancer (Ganem and Varmus, Annu. Rev. Biochem. 56 : 651-693, 1987). It is also known that around 500 million people worldwide are chronically infected with HBV.

HBV는 DNA 바이러스이지만 레트로바이러스와 유사하게 RNA를 주형으로 DNA 유전자를 합성하는 역전사 활성을 갖는다(Ganem and Varmus, Annu. Rev. Biochem. 56:651-693, 1987). HBV는 숙주의 세포막에 있는 특정 수용체에 결합하여 세포안으로 진입한 후 바이러스 코아입자가 벗겨지고, 바이러스의 게놈이 세포의 핵 안으로 들어가게 된다. 핵 안에서 HBV 유전자는 숙주 세포의 RNA 중합효소에 의해 바이러스 단백질을 발현하기 위한 mRNA를 전사하게 된다. 이들 전사체로부터 각각 코어(core)단백질, DNA 중합효소, 외피 단백질, 그리고 전사 조절 활성화에 관여하는 X 단백질을 합성하게 된다. 전사체중에서 3.5 kb RNA를 프리게노믹 RNA(pregenomic RNA, 도 1참조)라고 한다. 이 프리게노믹 RNA는 코어단백질과 DNA 중합효소의 mRNA로 작용할 뿐 아니라 HBV DNA 복제의 주형으로도 작용한다(Ganem and Varmus, Annu. Rev. Biochem. 56:651-693, 1987). 이 프리게노믹 RNA는 합성되어진 HBV DNA 중합 효소 단백질과 코어 단백질과 결합하여 바이러스 코아입자 안으로 들어가게 된다. 이후 코아 입자 내에서 HBV DNA 중합효소가 프리게노믹 RNA를 주형으로 자신의 DNA 유전자를 복제하게 된다 (Ganem and Varmus, Annu. Rev. Biochem. 56:651-693, 1987).HBV is a DNA virus, but has a reverse transcription activity of synthesizing DNA genes with RNA as a template, similar to retroviruses (Ganem and Varmus, Annu. Rev. Biochem. 56: 651-693, 1987). HBV binds to specific receptors on the host's cell membrane, enters the cell, and then strips the viral core particle, causing the viral genome to enter the cell's nucleus. In the nucleus, the HBV gene transcribes mRNA to express viral proteins by RNA polymerase in the host cell. From these transcripts, core proteins, DNA polymerases, envelope proteins, and X proteins involved in transcriptional regulation activation are synthesized. 3.5 kb RNA in the transcript is called pregenomic RNA (see Figure 1). This pregenomic RNA not only acts as an mRNA for core protein and DNA polymerase, but also as a template for HBV DNA replication (Ganem and Varmus, Annu. Rev. Biochem. 56: 651-693, 1987). The pregenomic RNA binds to the synthesized HBV DNA polymerase protein and the core protein and enters the viral core particle. HBV DNA polymerase then replicates its DNA gene as a template of pregenomic RNA in core particles (Ganem and Varmus, Annu. Rev. Biochem. 56: 651-693, 1987).

HBV의 증식과 복제에 아주 중요한 역할을 하는 HBV DNA 중합효소는 터미널 단백질(Terminal protein:TP), 스페이서(Spacer:SP), 역전사효소(Reverse transcriptase:RT), 그리고 RNase H의 네 개의 도메인으로 구성되어 있다(도 1참조). HBV DNA 중합효소는 레트로 바이러스의 역전사효소와 유사한 역전사 효소 활성을 가지고 있다(Summers and Mason, Cell 29:403-415, 1982). 그러나, 레트로 바이러스와는 다르게 이 역전사 반응 (Reverse transcription)의 프라이머로는 매우 특이하게도 단백질-프라이밍에 의해 일어난다(Wang and Seeger,Cell71:663-670, 1992). 더욱 특이한 것은 이때 사용되는 단백질 프라이머는 HBV DNA 중합효소 자체이다. 아데노 바이러스와 소아마비 바이러스의 경우에도 유전자 합성의 개시반응(initiation)이 단백질-프라이밍을 하지만 모두 단백질 프라이머가 별도로 존재한다(Salas, M.Ann. Rev. Biochem.60:39-71, 1991). 따라서 단백질-프라이밍 반응은 HBV 복제에 매우 특이한 반응으로 항 바이러스제 발굴의 매력적인 타겟이라고 할 수 있다. 즉, HBV DNA 중합효소는 바이러스의 복제에 직접적으로 관여하므로 바이러스의 HBV DNA 중합효소를 효과적으로 억제할 수 있는 특이성을 가진 저해제를 개발한다면, 숙주 세포의 생물학적인 대사에는 영향을 주지 않고도 HBV의 증식을 효율적으로 저해할 수 있을 것이다 (Hoofnagle and Lau, J. Viral. Hepat.4:41-50, 1997).HBV DNA polymerase, which plays an important role in the proliferation and replication of HBV, consists of four domains: Terminal protein (TP), Spacer (SP), Reverse transcriptase (RT), and RNase H. (See FIG. 1). HBV DNA polymerase has reverse transcriptase activity similar to that of retroviruses (Summers and Mason, Cell 29: 403-415, 1982). However, unlike retroviruses, the primers for this reverse transcription are very specific for protein-priming (Wang and Seeger, Cell 71: 663-670, 1992). More specifically, the protein primer used is HBV DNA polymerase itself. In the case of adenoviruses and polioviruses, the initiation of gene synthesis is protein-priming but both have separate protein primers (Salas, M. Ann. Rev. Biochem. 60: 39-71, 1991). Thus, protein-priming reactions are very specific for HBV replication, making them an attractive target for antiviral discovery. In other words, HBV DNA polymerase is directly involved in the replication of the virus. Therefore, if an inhibitor having a specificity capable of effectively inhibiting the virus's HBV DNA polymerase is developed, HBV proliferation can be prevented without affecting the biological metabolism of the host cell. Efficient inhibition (Hoofnagle and Lau, J. Viral. Hepat. 4: 41-50, 1997).

HBV 감염 환자에 대한 치료제로는 인터페론-α가 사용되어 왔으며, 최근에는 HIV(Human Immunodeficiency Virus) 감염에 의한 후천성 면역결핍증 환자의 치료제로 개발된 라미부딘 (제펙스, Glaxo Inc, USA)이 사용되고 있다(Dienstaget al., N. Engl. J. Med. 333:1657-1661, 1995). 이 치료제는 HIV의 역전사효소에 대한 저해제로서 HBV DNA 중합효소의 역전사 활성도 저해할 수 있다(Hoofnagle and Lau, J. Viral. Hepat. 4:41-50, 1997; Korba, Antiviral Res. 29:49-51, 1996). 하지만 장기복용의 경우에 이 치료제에 대한 내성을 가진 돌연변이 바이러스가 출현하여 치료효과는 매우 제한적인 문제점이 있다(Allenet al.,Hepatology27:1670-1677, 1998; Perrilloet al.,Hepatology29:1581-1586, 1999). 따라서 새로운 HBV 치료제의 등장이 절실히 필요한 실정이다.Interferon-α has been used as a treatment for patients with HBV infection, and recently, lamivudine (Gepex, Glaxo Inc, USA), which has been developed as a treatment for patients with acquired immunodeficiency caused by HIV (Human Immunodeficiency Virus) infection, is used. Dienstag et al ., N. Engl. J. Med. 333: 1657-1661, 1995). This therapeutic agent is an inhibitor of the reverse transcriptase of HIV and may also inhibit the reverse transcriptase activity of HBV DNA polymerase (Hoofnagle and Lau, J. Viral. Hepat. 4: 41-50, 1997; Korba, Antiviral Res. 29: 49- 51, 1996). However, in the case of long-term use, a mutant virus resistant to this therapeutic agent appears, and thus the therapeutic effect is very limited (Allen et al ., Hepatology 27: 1670-1677, 1998; Perrillo et al ., Hepatology 29: 1581-1586, 1999). Therefore, the emergence of new HBV therapeutics is urgently needed.

HBV의 저해제를 스크리닝하기 위하여 최근까지 HBV를 생산하는 HepG2 2.2.15 세포를 이용한 세포배양 측정법이 주로 활용되었다(Korba and Gerin,Antiviral Res.19:55-70, 1992; Korba and Milman,Antiviral Res.15:217-228, 1991). 이 HepG2 2.2.15 세포주는 간암 세포주인 HepG2 세포주에 HBV 유전자를 트랜스팩션하여 지속적으로 HBV 생산이 가능하게 제조한 세포주이다(Sellset al.,Proc. Natl Acad. Sci. USA84:1005-1009, 1987). 그러나 이 세포배양법은 항 바이러스제의 HBV 증식억제능을 측정하기 위하여 유용하게 사용되어왔으나 HBV의 생산이 세포의 성장상태에 따라 변화되므로 이 측정법으로 발굴된 항 바이러스제가 HBV 복제에 선택적이지 못한 단점이 있다. 따라서 이러한 약점을 극복하기 위하여 이종 발현체계(heterologous system)에서의 HBV DNA 중합효소의 발현하려는 많은 시도가 있었다 (Ayolaet al.,Virology194:370-373, 1993). HBV DNA 중합효소에 특이성을 가진 저해제를 개발하기 위해 이 효소를 세균, 효모, 혹은 다른 여러 가지 단백질발현 시스템에서 과 발현하였으나 효소의 활성을 가지지 못하거나, 효소 활성을 표준화하는데 어려움이 있었다. 또한 이러한 시도는 HBV의 동물모델인 duck hepatitis B virus(DHBV) DNA 중합효소의 경우에는 성공적이었으나(Tavis and Ganem,Proc. Natl Acad. Sci. USA90:4107-4111, 1993; Wang and Seeger,Cell71:663-670, 1992), HBV DNA중합효소의 경우에는 그 활성이 있는 효소 발현은 최근에야 비로소 가능하게되었다(Lanford et al,J. of Virology69:4431-4439, 1995; Urban et al.,J. of General Virology79:1121-1131, 1998). 하지만, 상기의 경우에도, 약 95%이상이 비 수용성이며 1 리터의 곤충세포 서스펜션 배양액 당 약 40 ㎍의 HBV DNA 중합효소가 발현되는 정도로 단백질 용해도가 낮아 항 바이러스제 스크리닝에 활용하기에는 실용적이지 못하다(Lanford et al,J. of Virology69:4431-4439, 1995). 따라서, HBV DNA 중합효소의 단백질-프라이밍 활성을 실용적으로 항 바이러스제 스크리닝에 활용하려면 HBV DNA 중합효소의 역전사활성과 단백질-프라이밍 활성을 재현할 뿐 아니라 용해도와 활성이 높은 HBV DNA 중합효소 발현체계가 필요하다.To screen for inhibitors of HBV, cell culture assays using HepG2 2.2.15 cells producing HBV have recently been used (Korba and Gerin, Antiviral Res. 19: 55-70, 1992; Korba and Milman, Antiviral Res. 15: 217-228, 1991). This HepG2 2.2.15 cell line is a cell line that is capable of producing HBV continuously by transfecting the HBV gene into a HepG2 cell line, a liver cancer cell line (Sells et al ., Proc. Natl Acad. Sci. USA 84: 1005-1009, 1987). However, this cell culture method has been usefully used to measure the anti-viral HBV proliferation ability, but since the production of HBV varies depending on the growth state of the cell, the antiviral agent discovered by this assay is not selective for HBV replication. Thus, there have been many attempts to express HBV DNA polymerase in heterologous systems to overcome this weakness (Ayola et al ., Virology 194: 370-373, 1993). In order to develop inhibitors specific for HBV DNA polymerase, the enzyme was overexpressed in bacteria, yeast, or other protein expression systems, but it did not have enzyme activity or difficulty in standardizing enzyme activity. This attempt was also successful with HBV's animal model, duck hepatitis B virus (DHBV) DNA polymerase (Tavis and Ganem, Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 4107-4111, 1993; Wang and Seeger, Cell). 71: 663-670, 1992), in the case of HBV DNA polymerase, the expression of active enzymes has only recently become possible (Lanford et al, J. of Virology 69: 4431-4439, 1995; Urban et al. , J. of General Virology 79: 1121-1131, 1998). However, even in the above case, it is not practical to be used for antiviral screening because about 95% or more of water-soluble and low protein solubility is expressed to about 40 ㎍ of HBV DNA polymerase per 1 liter of insect cell suspension culture (Lanford). et al, J. of Virology 69: 4431-4439, 1995). Therefore, to utilize the protein-priming activity of HBV DNA polymerase in antiviral screening practically, it is necessary not only to reproduce the reverse transcription and protein-priming activity of HBV DNA polymerase, but also to have high solubility and activity of HBV DNA polymerase expression system. Do.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기한 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 HBV DNA 중합효소에 대한 특이성을 가진 저해제를 보다 쉽고 다량으로 스크리닝 할 수 있도록 하는 방법을 제공하는 것이다.The present invention solves the above problems, and the object of the present invention is to provide a method for screening the inhibitors with specificity for HBV DNA polymerase more easily and in large quantities.

도 1은 HBV의 유전자를 프리-게노믹(pre-genomic) RNA를 중심으로 표시하고 또한 HBV DNA 중합효소의 각 도메인을 나타낸 것. HBV는 DNA 바이러스이지만 프리게노믹 RNA로부터 자신의 DNA 중합효소를 이용하여 DNA를 합성하게 된다. HBV 프리게노믹 RNA의 5'과 3' 말단에 각각 엡실론(epsilon) 염기서열이 있으며 4개의 오픈 리딩 프레임(Open Reading Frame)을 가지고 있다. HBV DNA 중합효소(ORF P, polymerase)는 아미노-말단으로부터 터미널 프로틴(Terminal protein), 스페이서(Spacer), 역전사 효소(Reverse transcriptase), RNase H의 4 개의 도메인으로 구성된 832개의 아미노산을 갖고 있다.1 shows genes of HBV centered around pre-genomic RNA and also shows each domain of HBV DNA polymerase. Although HBV is a DNA virus, it synthesizes DNA from its pregenomic RNA using its DNA polymerase. The 5 'and 3' ends of HBV pregenomic RNA have epsilon sequences and four open reading frames. HBV DNA polymerase (ORF P) has 832 amino acids consisting of four domains, from amino-terminus to terminal protein, spacer, reverse transcriptase and RNase H.

도 2는 본 발명에서 사용한 재조합 HBV DNA 중합효소의 유전자 구조. HBV DNA 중합효소를 발현하는 FLAG-PolE 베큘로 바이러스는 DNA 중합효소의 4개 도메인의 유전자를 가지고 있을 뿐 아니라, 코어 입자 안으로 포장되는 과정에 필수적인 캡시드화 신호(encapsidation signal)인 엡실론(epsilon) 구조를 3' 말단에 갖도록 고안하였다. 또한 친화성 크로마토그라피에 의한 단백질 정제를 위해 아미노-말단에 His-6 와 FLAG 표지를 갖도록 고안하였다.Figure 2 is a gene structure of recombinant HBV DNA polymerase used in the present invention. FLAG-PolE baculovirus expressing HBV DNA polymerase contains not only the genes of the four domains of DNA polymerase, but also the epsilon structure, an encapsidation signal essential for packaging into core particles. Was designed to have at the 3 'end. It was also designed to have His-6 and FLAG labels at the amino-terminus for protein purification by affinity chromatography.

도 3은 본 발명에서 사용한 곤충 세포 바이러스 전달 플라스미드의 유전자 지도. 베큘로 바이러스 전달 벡터는 HBV DNA 중합효소 유전자와 그 5' 말단에 His-6와 FLAG 표지를 위한 유전자, 프로모터, 항생제 내성 유전자 등을 가지고 있으며, 베큘로 바이러스 유전자와의 재조합에 필요한 유전자 염기 서열과 재조합 베큘로 바이러스의 스크리닝을 위한 lacZ 절편을 가지고 있다.3 is a genetic map of the insect cell virus delivery plasmid used in the present invention. The baculovirus delivery vector contains the HBV DNA polymerase gene and the gene for His-6 and FLAG labeling, promoter and antibiotic resistance gene at its 5 'end, and the gene sequence necessary for recombination with baculovirus gene. It has lacZ fragments for screening of recombinant baculo virus.

도 4는 곤충세포 내에서 발현된 재조합 HBV DNA 중합효소의 단백질을 웨스턴 불럿으로 확인한 결과를 나타낸 것. 곤충 세포에 FLAG-PolE 베큘로 바이러스를 각각 1x108pfu, 5x108pfu로 감염시킨 후 항 FLAG 항체를 이용한 웨스턴 블럿으로 발현된 FLAG-PolE 단백질을 확인한 것이다. 도면의 화살표는 약 97 kDa의 FLAG-PolE 단백질을 나타내며, 나머지 단백질은 항 FLAG 항체에 특이성 없이 결합되어진 곤충세포 고유의 단백질들이다.Figure 4 shows the result of confirming the western blot protein of the recombinant HBV DNA polymerase expressed in insect cells. After the infection of virus to the FLAG-PolE bekyul in insect cells with each of 1x10 8 pfu, 5x10 8 pfu will check the FLAG-PolE protein expression by Western Blot using anti-FLAG antibody. The arrow in the figure represents a FLAG-PolE protein of about 97 kDa, with the remaining proteins being insect cell-specific proteins bound to anti-FLAG antibodies without specificity.

도 5는 재조합 HBV 중합효소의 단백질-프라이밍 활성을 측정하는 실험방법을 요약한 그림. 재조합 HBV DNA 중합효소 유전자를 가지고 있는 베큘로 바이러스를 곤충 세포에 감염시킨 후 발현된 HBV DNA 중합효소를 항 FLAG 항체를 통해 면역 침전법으로 분리하여 낸다. 이 후 이 단백질을 시험관 안에서 완충용액과 기질인 dNTP 뿐 아니라 방사선 동위원소 표지된 dTTP등을 넣고 반응시킨 다음 방사선으로 표지된 단백질을 SDS-폴리 아크릴아마이드겔에서 전기 영동 한 다음 x-레이 필름에 노출하여 관찰한다.Figure 5 is a summary of the experimental method for measuring the protein-priming activity of recombinant HBV polymerase. The baculovirus containing the recombinant HBV DNA polymerase gene is infected with insect cells, and the expressed HBV DNA polymerase is isolated by immunoprecipitation through an anti-FLAG antibody. Subsequently, the protein was reacted with a buffer solution and a substrate, dNTP, as well as a radioisotope-labeled dTTP, and then electrophoresed on a SDS-polyacrylamide gel and exposed to an x-ray film. Observe by

도 6은 HBV DNA 중합효소의 단백질-프라이밍활성을 측정법의 원리를 설명하는 그림. HBV DNA 중합효소는 DNA 합성 개시부위(initiation site)인 엡실론 구조의 bulge 부위의 UCTT를 주형으로 TGAA를 합성하게된다. HBV DNA 중합효소에 단백질-프라이밍 활성으로 공유결합되는 첫 뉴클레오타이드인 Thymidine base를 원으로 표시하였다.Figure 6 is a diagram illustrating the principle of measuring the protein-priming activity of HBV DNA polymerase. HBV DNA polymerase synthesizes TGAA using UCTT of bulge region of epsilon structure, which is the DNA synthesis initiation site. Thymidine base, the first nucleotide covalently bound to HBV DNA polymerase with protein-priming activity, was circled.

도 7은 재조합 HBV DNA 중합효소의 단백질-프라이밍 활성을 측정한 결과를 SDS-폴리아크릴 아마이드겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 나타낸 그림. 곤충 세포에 FLAG-PolE 베큘로 바이러스를 감염시킨 다음 단백질을 분리하여 도면 5에서와 같이 반응시킨 후 그 단백질-프라이밍 활성을 확인하기 위해 방사선으로 표지된 단백질을 10% SDS-폴리아크 릴 아마이드겔 전기영동을 통해 나타낸 결과이다. 도면의 왼쪽 편에 있는 수치는 단백질의 사이즈 마커이며, 화살표는 약 97 kDa의 FLAG-PolE 단백질의 위치를 나타낸다. 레인1은 감염을 안 한 곤충세포의 시료, 레인 2는 코어를 발현하는 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포의 시료, 레인 3은 FLAG-PolE 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포의 시료, 레인 4는 FLAG-PolE 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포의 시료에 EDTA 첨가 후 반응한 시료, 레인 5는 FLAG-PolE베큘로바이러스가 감염된 곤충세포의 시료에 PFA 첨가 후 반응한 시료, 레인 6은 FLAG-PolE 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포의 시료에 반응 후 DNase I를 처리한 시료, 레인 7은 FLAG-PolE 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포의 시료를 RNase A로 처리한 후 반응한 시료이다.7 is a diagram showing the results of measuring protein-priming activity of recombinant HBV DNA polymerase by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Insect cells were infected with FLAG-PolE baculo virus and then the proteins were isolated and reacted as shown in Figure 5, followed by irradiation of 10% SDS-polyacrylamide amide gel with radiolabeled proteins to confirm their protein-priming activity. This is the result shown through Youngdong. The figure on the left side of the figure is the size marker of the protein, and the arrow indicates the position of the FLAG-PolE protein of about 97 kDa. Lane 1 is a sample of uninfected insect cells, lane 2 is a sample of insect cells infected with baculovirus expressing the core, lane 3 is a sample of insect cells infected with FLAG-PolE baculovirus, and lane 4 is a FLAG- The sample reacted with the addition of EDTA to the sample of insect cells infected with PolE baculovirus, lane 5 is the sample reacted after the addition of PFA to the sample of the insect cells infected with FLAG-PolE baculovirus, and the lane 6 showed the reaction with FLAG-PolE baculovirus. The sample treated with DNase I after reacting with a sample of infected insect cells, and lane 7 is a sample reacted after treating a sample of insect cells infected with FLAG-PolE baculovirus with RNase A.

도 8은 재조합 HBV DNA 중합효소의 단백질-프라이밍 활성을 DE-81 필터를 이용한 측정법으로 측정한 결과를 나타낸 그림. 레인 1(no infection)은 곤충세포 자체를 사용한 제어군이며, 레인 2(core)는 코아단백질을 발현하는 베큘로바이러스가 감염된 곤충세포를 사용한 제어군이고, 레인 3(FLAG-PolE)는 HBV DNA 중합효소를 발현하는 베큘로바이러스에 감염된 곤충세포를 사용한 실험군이다. 레인 4(Act. D)는 FLAG-PolE 효소에 DNA 주형을 이용한 복제를 저해하는 actinomycin D를 처리한 결과이다. 레인 5-7(EDTA, RNase A, ddCTP)는 FLAG-PolE 효소에 각각 HBV DNA 중합효소의 저해제를 처리한 후의 활성을 나타낸 것이며, 레인 8(PFA, phosphonoformate)은 FLAG-PolE 효소에 PFA를 처리한 후의 결과이다.8 is a diagram showing the result of measuring protein-priming activity of recombinant HBV DNA polymerase by a measurement method using a DE-81 filter. Lane 1 (no infection) is a control group using insect cells itself, lane 2 (core) is a control group using insect cells infected with baculovirus expressing the core protein, lane 3 (FLAG-PolE) is HBV DNA Experimental group using insect cells infected with baculovirus expressing polymerase. Lane 4 (Act. D) is the result of the actinomycin D treatment of FLAG-PolE enzyme to inhibit the replication using DNA template. Lanes 5-7 (EDTA, RNase A, ddCTP) show the activity after treatment of HBV DNA polymerase inhibitor with FLAG-PolE enzyme, and lane 8 (PFA, phosphonoformate) with PFA treatment with FLAG-PolE enzyme. The result after that.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FLAG-His-6가 붙어 있는 서열정보 1에 기재된 재조합 HBV DNA 중합효소 유전자를 함유한 베큘로 발현벡터를 제조하고, 곤충세포에 상기의 베큘로 전달벡터를 트렌스펙션시켜서 HBV DNA 중합효소를 발현하는 베큘로바이러스를 제조한 후, 곤충세포에 상기의 베큘로바이러스를 감염시켜 HBV DNA 중합효소를 발현하고, 상기의 곤충세포에서 HBV DNA 중합효소를 분리하여 단백질 프라이밍 활성을 측정하는 단계를 포함하는 항바이러스제 스크리닝 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a baculo expression vector containing a recombinant HBV DNA polymerase gene described in SEQ ID NO: 1 to which FLAG-His-6 is attached, and transfers the baculovirus to the insect cell. Transfected to produce a baculovirus expressing HBV DNA polymerase, and then infected with the baculovirus to insect cells to express HBV DNA polymerase, and isolated HBV DNA polymerase from the insect cells. It provides an antiviral screening method comprising the step of measuring protein priming activity.

또한 본 발명은 항바이러스제를 대량 스크리닝하기 위해서, 단백질 프라이밍 반응 후 반응물을 필터에 흡착 후 정량화하는 단계를 더욱 포함하는 항바이러스제의 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for screening an antiviral agent, further comprising the step of quantifying the reactant after adsorption on a filter after the protein priming reaction, in order to mass screen the antiviral agent.

본 발명에 있어서, 베큘로바이러스 전달벡터는 pBBH-FLAG-PolE인 것이 바람직하며, HBV DNA 중합효소를 발현할 수 있는 베큘로바이러스 프로모터와 항생제 내성유전자를 가지고 있고, 베큘로바이러스 유전자와의 재조합에 필요한 염기서열과 재조합바이러스 스크리닝을 위한 lacZ 절편을 가지고 있다.In the present invention, the baculovirus delivery vector is preferably pBBH-FLAG-PolE, has a baculovirus promoter capable of expressing HBV DNA polymerase and an antibiotic resistance gene, and is suitable for recombination with baculovirus genes. It contains the necessary sequence and lacZ fragment for recombinant virus screening.

이렇게 제작된 재조합전이벡터는 통상의 방법에 의해 HBV DNA 중합효소 유전자를 포함한 재조합바이러스를 제작할 수 있으며, 숙주세포인 곤충세포에 감염시킬 수 있다.The recombinant transfection vector thus prepared can produce a recombinant virus including the HBV DNA polymerase gene by a conventional method, and can infect insect cells which are host cells.

본 발명에서 사용되는 곤충세포는 그의 종류에 특별히 제한되지 않고, 유전자발현을 위한 숙주시스템에서 개발된 것 또는 시판된 것, 예를 들어, sf 계열의 세포, 특히 sf9 세포 등을 사용할 수 있다. 곤충세포에서 HBV DNA 중합효소를 발현하는 베큘로바이러스를 제조하는 방법은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 행할 수 있으며, 본 발명에서는 Bac-N-Blue 트렌스펙션 키트(Invitrogen Cat. No.K855-01)를 이용하여 제조하였다.The insect cell used in the present invention is not particularly limited to its kind, and may be one that is developed or commercially available in a host system for gene expression, for example, an sf-based cell, particularly an sf9 cell. Method for producing a baculovirus expressing HBV DNA polymerase in insect cells can be carried out using a method known to those skilled in the art, in the present invention Bac-N-Blue transfection kit (Invitrogen Cat. No. K855-01 Was prepared using).

곤충세포에서 HBV DNA 중합효소를 과발현하고, 분리, 정제하는 방법은 당업자에게 널리 알려진 방법을 이용하였다. 예를 들면, 곤충세포를 충분한 수가 될 때까지 배양 후, 재조합베큘로바이러스를 감염시키고, 감염된 세포를 다시 48시간 정도 더 배양하였다.Methods of overexpressing, isolating and purifying HBV DNA polymerase from insect cells used methods well known to those skilled in the art. For example, after culturing the insect cells to a sufficient number, the recombinant baculovirus was infected, and the infected cells were further cultured for about 48 hours.

또 HBV DNA 중합효소 단백질을 분리하기 위해서 항체를 이용한 침전법을 사용할 수 있다.In addition, in order to separate HBV DNA polymerase protein, a precipitation method using an antibody can be used.

본 발명에서의 단백질 프라이밍방법은 도 5에 상세하게 설명하고 있다.Protein priming method in the present invention is described in detail in FIG.

또한, 본 발명에서 대량 스크리닝을 위해 사용한 필터는 당업계에서 일반적으로 사용하는 필터를 사용할 수 있으며, 그 중 양이온 필터 또는 글래스 필터가 바람직하며, 글래스필터 사용 시에는 트리클로로아세틱산(trichloroacetic acid)으로 DNA를 침전시키는 단계가 추가된다.In addition, the filter used for mass screening in the present invention may be a filter commonly used in the art, of which a cationic filter or a glass filter is preferable, and when using the glass filter as trichloroacetic acid (trichloroacetic acid) Precipitating DNA is added.

본 발명에서 정량화는 방사능 탐지기를 사용하여 정량화하였다.Quantification in the present invention was quantified using a radioactivity detector.

본 발명에서 특정하지 않은 실험방법은 샘브룩 등의 Molecular Cloning, 2판(Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)을 참조하였다.For experimental methods not specific to the present invention, see Molecular Cloning, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) by Sambrook et al.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

첫째, 활성이 있는 HBV DNA 중합효소를 과 발현할 수 있게 하기 위해 곤충 세포를 이용하였다. 많은 시도에도 불구하고 HBV DNA 중합효소는 대장균에서는 활성을 갖게 발현되지 못하였으나 곤충세포에서는 활성이 있는 HBV DNA 중합효소가 발현되었다 (Lanford et al,J. of Virology69:4431-4439, 1995; Urban et al.,J. of General Virology79:1121-1131, 1998).First, insect cells were used to overexpress active HBV DNA polymerase. Despite many attempts, HBV DNA polymerase was not expressed in E. coli but had active HBV DNA polymerase in insect cells (Lanford et al, J. of Virology 69: 4431-4439, 1995; Urban; et al., J. of General Virology 79: 1121-1131, 1998).

둘째, HBV DNA 중합효소를 곤충 세포에서 과량 발현하고 쉽게 정제할 수 있게 하기 위하여 HBV DNA 중합효소의 아미노 말단에 각각 FLAG tag과 His-6 tag을 가진 단백질을 발현하는 베큘로 바이러스의 제조를 시도하였다.Second, in order to be able to overexpress and easily purify HBV DNA polymerase in insect cells, we tried to prepare baculoviruses expressing proteins having FLAG tag and His-6 tag at the amino terminal of HBV DNA polymerase, respectively. .

셋째, 곤충세포에서 과 발현된 효소를 면역 침전법으로 분리하여 시험관 내에서(in vitro), 그 단백질-프라이밍 활성을 방사선 동위원소를 이용하여 간단하게 측정할 수 있도록 하였다.Third, the overexpressed enzymes from insect cells were isolated by immunoprecipitation method in vitro, so that the protein-priming activity could be easily measured using radioisotopes.

넷째, HBV DNA 중합효소의 단백질 프라이밍 활성을 대량 스크리닝에 (high-throughput screening)이용할 수 있도록 하였다.Fourth, the protein priming activity of HBV DNA polymerase was made available for high-throughput screening.

상술한 전략에 따라 제조된 본 발명의 측정법은 시험관 (in vitro)에서 HBV DNA 중합효소의 단백질-프라이밍 활성을 정량할 수 있는 방법이 제공되며, 이를 통해 새로운 HBV DNA 중합효소 활성 저해제의 스크리닝을 쉽게 수행할 수 있는 방법이 제공된다.The assay of the present invention prepared according to the above strategy provides a method for quantifying the protein-priming activity of HBV DNA polymerase in vitro, thereby facilitating the screening of new HBV DNA polymerase activity inhibitors. A method that can be performed is provided.

또한 본 발명에 따라 곤충 세포 내에서 재조합 HBV DNA 중합효소를 과 발현 할 수 있도록 해주는 베큘로 바이러스(FLAG-PolE, 도 2참조)가 제공된다.Also provided according to the invention is a baculovirus (FLAG-PolE, see FIG. 2) which allows overexpression of recombinant HBV DNA polymerase in insect cells.

본 발명자들은 Bac-N-Blue 벡터 (Invitrogen Inc., USA)에 PCR (PolymeraseChain Reaction)을 통한 Quick change mutagenesis (Clontech Inc., USA)를 이용하여 재조합 HBV DNA 중합효소의 유전자를 클로닝하였다. 상기 서술된 벡터를 곤충 세포 (Sf9 cell)에 리포펙션(lipofection)하여 베큘로바이러스를 제조하였다. 제조된 바이러스 FLAG-PolE을 곤충 세포에 감염시키고, 이로부터 곤충 세포에서 발현된 재조합 HBV DNA 중합효소를 FLAG에 대한 항체를 이용한 면역 침전법으로 분리하고, 그 활성을 방사선 동위원소를 통하여 내부 주형 RNA로부터 합성되는 DNA가 표지 되도록 하였다. 상기 서술된 활성 측정을 토대로 새로운 HBV DNA 중합효소 저해제의 개발을 실용적이고 특이성을 갖도록 할 수 있을 것이다.We cloned the genes of recombinant HBV DNA polymerase into Bac-N-Blue vector (Invitrogen Inc., USA) using Quick change mutagenesis (Clontech Inc., USA) via PolymeraseChain Reaction (PCR). Baculoviruses were prepared by lipofection of the above-described vectors into insect cells (Sf9 cells). The prepared virus FLAG-PolE is infected with insect cells, from which recombinant HBV DNA polymerase expressed in insect cells is isolated by immunoprecipitation using an antibody against FLAG, and its activity is internal template RNA through a radioisotope. DNA to be synthesized was labeled. Based on the activity measurements described above, the development of new HBV DNA polymerase inhibitors can be made practical and specific.

이하 본 발명을 실시 예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예 1: 발현 벡터 pBBH-FLAG-PolE의 제조Example 1 Preparation of Expression Vector pBBH-FLAG-PolE

HBV DNA 중합효소를 발현하는 베큘로바이러스를 만들기 위해 베큘로바이러스 전달 벡터[(이하 pBlueBac His[pBBH] : (Invitrogen Inc, USA)]에 다음과 같은 방법으로 클로닝하였다.In order to make baculovirus expressing HBV DNA polymerase, it was cloned into a baculovirus delivery vector (hereinafter pBlueBac His [pBBH]: (Invitrogen Inc, USA)) as follows.

먼저 재조합 HBV DNA 중합효소를 발현하는 베큘로 바이러스는 제 2도에 나타낸 것과 같이 HBV DNA 중합효소의 4가지 도메인을 모두 갖고 있을 뿐 아니라, 그것의 아미노기 말단에는 His-6와 FLAG 표지를 가지고 있다. 한편, 엡실론(epsilon) 염기서열은 HBV DNA 중합효소의 단백질 folding에 작용하는 것으로 밝혀졌다(Tavis et al., J. of Virology 72:5789-5796, 1998). 따라서, HBV DNA 중합효소의 단백질을 코딩하는 mRNA의 3' 말단에 엡실론(epsilon)을 삽입하였다 (도면 2 참조). 이러한 베큘로 바이러스를 만들기 위한 베큘로 바이러스 전달 플라스미드의 클로닝 방법은 다음과 같다. pBBH2a 벡터를 BglⅡ 제한 효소로 절단한 다음, 야생형의 ayw subtype(Galibert et al, Nature 281:646-650, 1979)의 HBV 유전자 두 개(dimer)가 삽입된 pSV2-neo-(ayw)2 벡터를 BglⅡ 제한 효소로 절단한 단편과 함께 T4 DNA 리가제를 이용하여 연결시킨 후 대장균 DH5α 컴피턴트 세포에 첨가하여 형질전환 시킨 후 LB-엠피실린(Amp. 100㎍/ml) 플레이트에서 대장균 형질전환체를 선별하여 이로부터 pBBH-HBV-pol (BglⅡ 절편) 벡터 DNA를 분리하였고, 플라스미드 DNA 정제법에 따라 이 벡터 DNA를 순수 정제하였다. 이후 pBBH-HBV pol (BglⅡ 절편) 벡터를 다시 SacI, XbaI 제한효소로 절단한 후에, pSV2-neo-(ayw)2 벡터를 주형으로 HBV DNA 중합효소의 N-말단과 SacI 제한효소의 인식부위를 포함하는 Sac-pol 프라이머(5'-CACGAGCTCATGCCCCTATCCTATCAA-3')와 310∼291 프라이머(5'-TTGGCCAAGA CACACGGTAG-3')를 이용하여 핵산 합성기를 통한 핵산 중합효소 반응으로부터 만들어진 단편을 SacI, XbaI 제한효소로 절단한 것과 다시 T4 DNA 리가제로 연결시킨 후 상기 서술한 방법과 같이 수행하여 pBBH-PolE 벡터를 정제하였다. pBBH-PolE 벡터를 HBV DNA 중합효소의 N-말단 앞에 FLAG-tag을 갖도록 하기 위해 FLAG F2 프라이머(5'-GCAAATGGGTCGCGATTAC AAGGACGATGACGATAAG-3')와 FLAG r2 프라이머(5'-CTTATCGTCATCGTCCTTGTAATC GCGACCCATTTGC-3')를 이용하여 퀵 체인지 돌연변이(Quick change mutagenesis [Clontech, USA])를 실시하여 pBBH-FLAG-PolE 벡터를 합성하였다. 이러한 과정으로 완성된 베큘로 바이러스 전달 벡터는, 도 3에 나타난 것과 같이 HBV DNA 중합효소를 발현할 수 있도록 하는 베큘로 바이러스 프로모터와 항생제 내성 유전자를 가지고 있으며, 베큘로 바이러스 유전자와의 재조합에 필요한 염기 서열과 재조합 바이러스의 스크리닝을 위한 lacZ 절편을 가지고 있다.First, the baculovirus expressing the recombinant HBV DNA polymerase has not only all four domains of the HBV DNA polymerase as shown in FIG. 2, but also its His-6 and FLAG labels at its amino terminal. On the other hand, epsilon sequences have been shown to act on protein folding of HBV DNA polymerase (Tavis et al., J. of Virology 72: 5789-5796, 1998). Thus, epsilon was inserted at the 3 'end of the mRNA encoding the protein of the HBV DNA polymerase (see Figure 2). The cloning method of the baculovirus delivery plasmid for making such baculovirus is as follows. The pBBH2a vector was digested with BglII restriction enzymes, and then the pSV2-neo- (ayw) 2 vector containing two HBV genes of the wild-type ayw subtype (Galibert et al, Nature 281: 646-650, 1979) was inserted. The fragments digested with the BglII restriction enzyme were linked with T4 DNA ligase, added to E. coli DH5α competent cells, transformed, and transformed into E. coli transformants in LB-Epicillin (Amp. 100 µg / ml) plates. The pBBH-HBV-pol (BglII fragment) vector DNA was isolated by selection, and the vector DNA was purified purely according to plasmid DNA purification. Subsequently, the pBBH-HBV pol (BglII fragment) vector was digested with SacI and XbaI restriction enzymes. The pSV2-neo- (ayw) 2 vector was used as a template to recognize the N-terminal and SacI restriction enzymes of HBV DNA polymerase. SacI, XbaI restriction enzyme was prepared from a nucleic acid polymerase reaction using a nucleic acid synthesizer using a Sac-pol primer (5'-CACGAGCTCATGCCCCTATCCTATCAA-3 ') and 310 to 291 primers (5'-TTGGCCAAGA CACACGGTAG-3'). The pBBH-PolE vector was purified by digestion with the T4 DNA ligase, followed by the procedure described above. FLAG F2 primer (5'-GCAAATGGGTCGCGATTAC AAGGACGATGACGATAAG-3 ') and FLAG r2 primer (5'-CTTATCGTCATCGTCCTTGTAATC GCGACCCATTTGC-3') for the pBBH-PolE vector to have a FLAG-tag before the N-terminus of HBV DNA polymerase The quick change mutagenesis (Clontech, USA) was carried out to synthesize pBBH-FLAG-PolE vector. The baculovirus delivery vector completed by this process has a baculovirus promoter and an antibiotic resistance gene capable of expressing HBV DNA polymerase as shown in FIG. 3, and a base required for recombination with the baculovirus gene. It contains lacZ fragments for screening sequences and recombinant viruses.

이때 사용된 프라이머는 다음과 같다. (모든 프라이머의 염기서열은 5'→3' 으로 기재하였으며, 제한효소 내지 링커는 밑줄로 표시하였다.)The primer used at this time is as follows. (Base sequences of all primers were 5 ′ → 3 ′ and restriction enzymes to linkers were underlined.)

Sac-pol 프라이머 : 5'-CACGAGCTCATGCCCCTATCCTATCAA-3Sac-pol Primer: 5'-CAC GAGCTC ATGCCCCTATCCTATCAA-3

310-291 프라이머 : 5'-TTGGCCAAGACACACGGTAG-3'310-291 Primer: 5'-TTGGCCAAGACACACGGTAG-3 '

FLAG F2 프라이머 : 5'-GCAAATGGGTCGCGATTACAAGGACGATGACGATAAG-3'FLAG F2 Primer: 5'-GCAAATGGGTCGCGATTACAAGGACGATGACGATAAG-3 '

FLAG r2 프라이머 : 5'-CTTATCGTCATCGTCCTTGTAATCGCGACCCATTTGC-3')FLAG r2 primer: 5'-CTTATCGTCATCGTCCTTGTAATCGCGACCCATTTGC-3 ')

실시예 2: 곤충 세포에서 HBV 단백질을 발현하는 베큘로 바이러스 합성Example 2: Baculo virus synthesis expressing HBV protein in insect cells

Bac-N-Blue 트랜스펙션 키트(Invitrogen Cat. no.K855-01)를 사용하여 곤충 세포(Sf9 cell line)에 베큘로 바이러스 전달 벡터를 트랜스팩션시켜서 HBV DNA 중합효소 단백질을 발현하는 베큘로 바이러스를 제조하였다.Baculovirus expressing HBV DNA polymerase protein by transfecting baculovirus delivery vector into Sf9 cell line using Bac-N-Blue transfection kit (Invitrogen Cat. No.K855-01) Was prepared.

실시예 3: 베큘로 바이러스를 감염 시킨 곤충 세포에서 HBV 단백질의 과 발현Example 3: Overexpression of HBV Protein in Insect Cells Infected with Baculovirus

상기 실시예 2에서 제조한 베큘로 바이러스로부터 HBV 단백질을 과 발현하기 위하여 다음과 같은 방법을 사용하였다. 곤충 세포(Sf9 cell)를 세포수가 1x107이되도록 세포 배양 플라스크(75 cm2)에서 2.5% FBS (Fetal Bovine Serum) + 완전 TNM-FH (Sigma. Cat. no. T-1032)배지와 27℃ 배양기에서 배양한 후에 100ml 현탁 배양 플라스크에 옮겨서 다시 세포수가 2.5x106/ml이 될 때까지 배양하였다. 이후에 실시예 2에서 제조한 베큘로 바이러스를 2-5 M.O.I (Multiplicity Of Infection)로 감염시켰다. 감염된 세포를 다시 48시간 더 배양하여 세포 내에서 베큘로 바이러스가 충분히 증식하도록 하였다. 바이러스에 의해서 세포가 파괴되기 전에 세포들을 50 ml 튜브에 모으고 원심분리기에서 800 rpm, 10분간 원심분리하였다.The following method was used to over-express HBV protein from the baculo virus prepared in Example 2. Insect cells (Sf9 cells) were treated with 2.5% FBS (Fetal Bovine Serum) + complete TNM-FH (Sigma. Cat. No. T-1032) medium at 27 ° C. in a cell culture flask (75 cm 2 ) so that the cell number was 1 × 10 7 . After culturing in an incubator, the cells were transferred to a 100 ml suspension culture flask and cultured again until the cell number became 2.5 × 10 6 / ml. The baculovirus prepared in Example 2 was then infected with 2-5 MOI (Multiplicity Of Infection). Infected cells were incubated for another 48 hours to allow sufficient growth of baculovirus in the cells. Cells were collected in 50 ml tubes and centrifuged at 800 rpm for 10 minutes before cell destruction by virus.

상기 서술된 방법으로 발현된 재조합 HBV DNA 중합효소(FLAG-Pol)를 항 FLAG 단일 클론 항체를 이용하여 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 제 4도에 나타내었다. 제 1레인은 베큘로 바이러스를 감염시키지 않은 곤충세포로부터 얻은 시료를, 제 2레인과 3레인은 각각 다른 양의 FLAG-PolE 베큘로 바이러스를 감염시킨 곤충세포로부터 얻은 시료를 나타내고 있다. 본 발명에서 제조된 FLAG-PolE 베큘로 바이러스로부터 재조합 HBV DNA 중합효소가 발현되는 것을 알 수 있다.The recombinant HBV DNA polymerase (FLAG-Pol) expressed by the above-described method was confirmed by Western blot using anti-FLAG monoclonal antibody. The first lane shows samples obtained from insect cells not infected with baculovirus, and the second and third lanes show samples obtained from insect cells infected with different amounts of FLAG-PolE baculo virus. It can be seen that the recombinant HBV DNA polymerase is expressed from the FLAG-PolE baculo virus prepared in the present invention.

실시예 4: HBV 단백질의 분리와 활성 측정Example 4: Isolation and Activity Measurement of HBV Proteins

프라이밍 활성도 측정을 위한 FLAG-PolE 단백질 분리와 활성도 측정FLAG-PolE Protein Isolation and Activity Measurement for Priming Activity

단백질-프라이밍 활성 측정법은 도 5에 나타낸 방법을 이용하였으며, 더 상세한 설명은 다음과 같다.Protein-priming activity was measured using the method shown in FIG. 5, and the detailed description is as follows.

FLAG-PolE 단백질을 분리하기 위해서 항체를 이용한 침전법(이하immunoprecipitation)을 사용하였다. 상기 서술한 실시예 3에서부터 획득한 시료를 300㎕의 PEB 완충 용액 (인산염 생리식염수; 이후 PBS: phosphate buffered saline, pH 7.4, 10% glycerol, 0.5% NP40, 1 mM PMSF, 10㎍/ml aprotinin, 50 unit RNasin)에 녹인 후 4℃에서 30분간 반응하였다. 반응 후 시료를 12,000 rpm의 속도로 4℃에서 15분간 원심 분리하였다. 분리된 상층액에 항 FLAG 단일 클론항체 (Sigma, F-3165, USA) 10㎍과 프로틴A-아가로스(Santa Cruz Biotechnology, sc-2001, USA) 15㎍을 혼합하여 4℃에서 2시간 반응하였다. 면역 침전법에 의해 침전된 단백질을 15㎕의 TNM 완충 용액 (100 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 30 mM NaCl, 10 mM MgCl2)에 용해시킨다. 용해된 시료에 100μM dATP, dCTP, dGTP와 [α-P32]dTTP 5μCi(Amersham, 3000 Ci/mmol)을 혼합하고 30℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후에 시료를 PBS에서 헹구어낸 다음 SDS-샘플 완충용액 (50 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% Glycerol, 100mM DTT, 0.1% bromo-phenol blue)을 첨가하고 95℃에서 5분간 끓인 후 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 전기 영동하였다. 전기 영동이 끝난 젤을 아세트 산:메탄올:증류수=1:2:7 인 용액에서 고정시킨 후 건조하였다.In order to isolate the FLAG-PolE protein, an antibody precipitation method (hereinafter, immunoprecipitation) was used. Samples obtained from Example 3 described above were prepared in 300 μl of PEB buffer solution (phosphate physiological saline; then PBS: phosphate buffered saline, pH 7.4, 10% glycerol, 0.5% NP40, 1 mM PMSF, 10 μg / ml aprotinin, 50 unit RNasin) and reacted for 30 minutes at 4 ℃. After the reaction, the samples were centrifuged at 4 ° C. for 15 minutes at a speed of 12,000 rpm. 10 μg of anti-FLAG monoclonal antibody (Sigma, F-3165, USA) and 15 μg of protein A-agarose (Santa Cruz Biotechnology, sc-2001, USA) were mixed in the isolated supernatant and reacted at 4 ° C. for 2 hours. . Protein precipitated by immunoprecipitation is dissolved in 15 μl of TNM buffer solution (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 30 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 ). 100 μM dATP, dCTP, dGTP and 5 μCi of [α-P 32 ] dTTP (Amersham, 3000 Ci / mmol) were mixed and reacted at 30 ° C. for 30 minutes. After the reaction, the samples were rinsed in PBS and then SDS-sample buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% Glycerol, 100 mM DTT, 0.1% bromo-phenol blue) was added and 5 minutes at 95 ° C. After boiling, electrophoresis was performed on 10% SDS-polyacrylamide gel. The electrophoretic gel was fixed in a solution of acetic acid: methanol: distilled water = 1: 2: 7 and then dried.

상기 서술한 방법으로 본 발명에서 제조한 재조합 HBV DNA 중합효소의 단백질-프라이밍 활성을 측정한 예를 제 6도에 나타내었다. 본 실시예에서 표식자로 사용된 [α-P32]dTTP는 HBV DNA 합성의 첫 번째 뉴클레오타이드(도면 6 참조)로 이 표식자가 단백질에 공유결합으로 표식됨은 단백질 프라이밍을 의미한다. 도면에서제 1레인은 베큘로 바이러스를 감염시키지 않은 곤충세포의 시료이고, 제 2레인은 코어 입자를 발현하는 베큘로 바이러스를 감염시킨 후에 얻은 시료를 통한 결과이며, 제 3레인에서 8레인까지는 FLAG-PolE 베큘로 바이러스를 감염시키고 활성 측정 시에 마그네슘 킬레이터인 EDTA (제 4레인), 연장(elongation) 저해제인 PFA(phosphonoformate; Hegstrand et al.,Science201:819-821, 1978) (제 5레인)를 각각 처리한 것과, 합성되어진 DNA를 제거하는 DNase I(제 6레인), 주형이 되는 RNA를 제거하는 RNase A(제 7 레인)를 처리한 후에 얻은 결과를 나타낸다. 도면의 결과에서와 같이, 본 발명에 의해 합성되어진 FLAG-PolE 단백질은 단백질-프라이밍 활성을 가지고 있으며 (제 3레인), 역전사 효소의 저해제 및 Nuclease에 의해 그 활성이 저해됨을 확인하였다. 한편, DNA 합성의 elongation inhibitor인 PFA는 역전사활성은 억제하였으나 단백질 프라이밍 활성 자체는 저해하지 않았다(Hess et al.,J. Med. Virol.5:309-316, 1980). 이러한 결과로부터, 본 실시예에서 보여주는 활성이 HBV DNA 중합효소의 고유한 단백질 프라이밍 활성임이 증명되었다.An example of measuring the protein-priming activity of the recombinant HBV DNA polymerase prepared in the present invention by the above-described method is shown in FIG. [Α-P 32 ] dTTP, which is used as a marker in this example, is the first nucleotide of HBV DNA synthesis (see FIG. 6), which means that the marker is covalently bound to the protein, indicating protein priming. In the drawing, the first lane is a sample of insect cells not infected with baculovirus, and the second lane is a result obtained by infecting the baculovirus expressing the core particles, and the third lane to lane 8 is FLAG. -PolE baculovirus infection and activity assay for magnesium chelator EDTA (lane 4), elongation inhibitor PFA (phosphonoformate; Hegstrand et al., Science 201: 819-821, 1978) Lanes), DNase I (sixth lane) to remove synthesized DNA, and RNase A (seventh lane) to remove RNA as a template are shown. As shown in the results of the drawings, the FLAG-PolE protein synthesized by the present invention has a protein-priming activity (lane 3), it was confirmed that the activity is inhibited by an inhibitor of reverse transcriptase and Nuclease. On the other hand, PFA, an elongation inhibitor of DNA synthesis, inhibited reverse transcriptase activity but did not inhibit protein priming activity (Hess et al., J. Med. Virol. 5: 309-316, 1980). From these results, it was proved that the activity shown in this example is the intrinsic protein priming activity of HBV DNA polymerase.

본 발명에서 확립한 프로테인-프라미밍 활성을 항 바이러스제의 대량 스크리닝(high-throughput screening)에 적용하고자 상기와 유사하게 프로테인-프라미밍 활성 반응을 수행한 후 반응물을 양이온이 부착된 DE-81 필터(Whatman, USA)에 흡착한 후 신틸레이션 계수기(scintillation counter)로 특정하였다 (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). 측정 결과를 도면 8에서 나타내었다. 레인 3(FLAG-PolE)는 HBV DNA 중합효소를 발현하는 베큘로바이러스에 감염된 곤충세포를 사용한 실험군이다. 즉, 상기 실시예와 유사하게 DE-81 필터측정법도 제어군(레인 1, 2)보다 약 6-7배 높은 활성을 보였다. 이는 본 필터 측정법을 대량 스크리닝에 활용할 수 있음을 나타낸다. 레인 4(Act. D)는 FLAG-PolE 효소에 DNA 주형을 이용한 복제를 저해하는 actinomycin D를 처리한 결과이다. 즉, actinomycin D 가 본 활성을 저해하지 않음은 HBV DNA 중합효소의 단백질 프라이밍 활성과 일치한다. 레인 8(PFA, phosphonoformate)은 FLAG-PolE 효소에 PFA를 처리한 후의 결과이다. 즉, elongation 저해제인 PFA는 elongation은 저해하였지만 단백질 프라이밍 자체는 저해하지 않았다. 본 실시예의 결과를 요약하면, 본 발명에서 제공하는 FLAG-PolE 효소의 생화학적 특성은 HBV DNA 중합효소의 단백질 프라이밍 활성과 일치한다.In order to apply the protein-priming activity established in the present invention to high-throughput screening of an antiviral agent, the reaction was subjected to a cationic-attached DE-81 filter after performing a protein-priming activity reaction similarly to the above. After adsorption to Whatman, USA), it was specified as a scintillation counter (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). The measurement result is shown in FIG. Lane 3 (FLAG-PolE) is an experimental group using insect cells infected with baculovirus expressing HBV DNA polymerase. That is, similarly to the above example, the DE-81 filter assay showed about 6-7 times higher activity than the control group (lanes 1 and 2). This indicates that this filter measurement method can be utilized for mass screening. Lane 4 (Act. D) is the result of the actinomycin D treatment of FLAG-PolE enzyme to inhibit the replication using DNA template. In other words, the fact that actinomycin D does not inhibit this activity is consistent with the protein priming activity of HBV DNA polymerase. Lane 8 (PFA, phosphonoformate) is the result after PFA treatment with FLAG-PolE enzyme. In other words, PFA, an elongation inhibitor, inhibited elongation but not protein priming itself. Summarizing the results of this example, the biochemical properties of the FLAG-PolE enzyme provided in the present invention are consistent with the protein priming activity of HBV DNA polymerase.

본 발명에서 제조된 베큘로 바이러스로부터 발현된 재조합 HBV DNA 중합효소는 역전사 활성 뿐 아니라 단백질 프라이밍 활성을 갖고 있어 HBV의 DNA 중합효소 활성을 선택적으로 저해하는 물질을 스크리닝할 수 있으므로 만성 B형 간염 치료제 개발에 매우 유용한 측정방법을 제공한다. 또 본 발명에서 제조된 재조합 HBV DNA 중합효소는 이때까지 제조되어진 HBV DNA 중합효소 보다 더 활성이 높고 용이하게 분리, 정제될 수 있다.Recombinant HBV DNA polymerase expressed from the baculovirus prepared in the present invention has a protein priming activity as well as reverse transcription activity, so it can screen a substance that selectively inhibits the DNA polymerase activity of HBV, thus developing a chronic hepatitis B treatment It provides a very useful measurement method. In addition, the recombinant HBV DNA polymerase produced in the present invention can be isolated and purified more highly and easily than the HBV DNA polymerase produced up to this time.

Claims (5)

a) FLAG-His-6가 붙어 있는 서열정보 1에 기재된 재조합 HBV DNA 중합효소 유전자를 함유한 베큘로 발현벡터를 제조하는 단계;a) preparing a baculo expression vector containing the recombinant HBV DNA polymerase gene as set forth in SEQ ID NO: 1 to which FLAG-His-6 is attached; b) 곤충세포에 상기의 베큘로 전달벡터를 트렌스펙션시켜서 HBV DNA 중합효소를 발현하는 베큘로바이러스를 제조하는 단계;b) preparing a baculovirus expressing HBV DNA polymerase by transfecting the baculovirus vector into insect cells; c) 곤충세포에 상기의 베큘로바이러스를 감염시켜 HBV DNA 중합효소를 발현하는 단계; 및c) infecting the baculovirus to insect cells to express HBV DNA polymerase; And d) 상기의 곤충세포에서 HBV DNA 중합효소를 분리하여 단백질 프라이밍 활성을 측정하는 단계를 포함하는 항바이러스제 스크리닝 방법.d) An antiviral screening method comprising the step of separating the HBV DNA polymerase from the insect cells to measure protein priming activity. 제 1 항에 있어서,The method of claim 1, 상기의 d)단계의 단백질 프라이밍 반응 후 반응물을 필터에 흡착 후 정량화하는 단계를 더욱 포함하는 항바이러스제의 스크리닝 방법.The screening method of the antiviral agent further comprises the step of quantifying after the adsorption of the reactant to the filter after the protein priming reaction of step d). 제 1 항에 있어서,The method of claim 1, 상기 a)단계의 베큘로 벡터는 pBBH-FLAG-PolE인 것을 특징으로 하는 항바이러스제의 스크리닝 방법.The method of screening an antiviral agent, characterized in that the baculo vector of step a) is pBBH-FLAG-PolE. 제 1 항에 있어서,The method of claim 1, 상기 c)단계의 곤충세포는 sf9 세포인 것을 특징으로 하는 항바이러스제의 스크리닝 방법.The insect cell of step c) is a screening method of the antiviral agent, characterized in that the sf9 cells. 제 1 항에 있어서,The method of claim 1, 상기의 항바이러스제는 B형 간염바이러스 복제를 저해하는 것을 특징으로 하는 항바이러스제의 스크리닝 방법.The antiviral agent screening method of antiviral agent, characterized in that it inhibits hepatitis B virus replication.
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