KR100343976B1 - 무화과나무를 이용한 천연고무생산물 및 그 생산방법 - Google Patents
무화과나무를 이용한 천연고무생산물 및 그 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
무화과나무(Ficus carica)를 아세톤/벤젠에서 균질화하고 원심분리로 고무 함유상을 분리하여 천연고무생산물을 얻었다. 무화과나무는 유액에 약 4%(w/v)의 천연고무를 함유하고 나무껍질, 잎과 열매에 각각 0.3%, 0.1%, 0.1%의 천연고무를 함유한다. 무화과나무의 천연고무의 분자량은 약 128kD이다. 무화과나무의 유액세럼은 48kD과 25kD 단백질을 주단백질로 하여 단지 소수의 단백질만을 포함한다. 브라질 고무나무와 구아율과 같이, 무화과나무의 고무생합성에 참여하는 단백질은 고무입자들과 단단하게 결합되어 있다. 무화과나무의 유액세럼과 유액, 잎, 나무껍질 및 열매의 단백질을 사용하여 천연고무를 얻는다.
Description
본 발명은 무화과나무의 전체 식물, 유액세럼, 단백질들을 이용한 고무생산에 관한 것이다.
천연고무는 헤드-투-테일(head-to-tail) 형태로 효소에 의해 결합된 320-35,000개의 이소프렌 분자들로 이루어진 중합체이다. 브라질 고무나무(Hevea brasiliensis), 구아율(Parthenium argentatum) 및 인디안 고무나무(Ficus elastica)를 포함하는 다수의 식물종들이 고무를 생합성한다. 고무는 이들 식물들에서 이소프레노이드 경로의 한 과정으로서 합성된다. 고무전이효소와 고무신장인자를 포함하는 단백질들은 신장하는 폴리이소프렌 사슬에 이소펜테닐 피로인산 단위들을 연속적으로 추가하여 고분자량의 중합체를 제공하는데 필요하다. 브라질 고무나무, 구아율 및 인디안 고무나무에서 고무전이효소와 고무신장인자는 사슬신장반응이 일어나는 고무입자들과 단단히 결합되어 있다{Madhavan and Benedict, Plant Physiol. 75: 908-913 (1984); Light and Dennes, J. Biol. Chem. 264: 18589-18597 (1989); Siler and Cornish, Phytochem. 32: 1097-1102 (1993)}.
천연고무(시스-1,4-폴리이소프렌)는 매우 튼튼한 타이어들과 탄력성, 유연성 및 복원성이 요구되는 다른 공업적 용도들에 대한 특선의 생원료이다. 천연고무를 생산하는 2,000개 이상의 식물종들 중에서{Backhaus, Israel J. Botany 34: 283-293 (1985)}, 브라질 고무나무(Hevea brasiliensis)가 유일하게 공업적으로 이용 가능한 천연고무의 원천이다. 그러나 수요의 증가와 더불어 고무 재배원의 면적이 감소하고 브라질 고무나무에 의한 과민성 개체의 생명을 위협하는 유액 알레르기로 인해 다른 고무 원천의 개발이 필요하게 되었다. 최근 몇 년 동안 연조직 세포에 고무를 축적하고 브라질 고무나무에 필적하는 고분자량의 고무를 함유하는 구아율(Parthenium argentatumGray)이 공업적으로 이용가능한 저자극성 유액에 대한 고무 원천으로써 검토되어 왔다(Cornish, US patent No 571750; 5580942). 그러나, 구아율은 고무 입자의 양이 적고 부피 성장이 느리기 때문에 대체 고무작물로써 한계가 있다. 따라서 대체할 효율적인 고무생산 식물에 대한 탐색이 계속되었다. 본 발명은 고무식물 대체원천의 천연고무 합성에 관한 것이다.
본 발명에서는 무화과나무(Ficus carica)가 천연고무를 생산하고, 그 전체 유액 및/또는 고무 입자들과 관련된 단백질들이 알릴 이인산 개시제와 이소펜테닐 이인산으로부터 고분자량의 고무를 생산할 수 있다는 것을 발견하였다. 이 발견에 따라 본 발명의 목적은 이러한 대체 원천에서 얻은 유액세럼과 단백질들을 이용한 고무 제조방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 그 방법에 의해 제조된 고무 생산품을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 다음의 설명에서 명백히 나타날 것이다.
도 1a는 무화과나무, 도 1b는 브라질 고무나무의 천연고무의13C NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로써, 약 5,000개의 스캔이 20,000Hz의 주파수를 갖는 스펙트럼으로 집적되어있고, 시스-1,4-폴리이소프렌에 대한 대표적인 피크가 나타나 있다.
도 2는 무화과나무의 유액세럼(검은 막대)과 세척된 고무입자(흰 막대)의 고무생합성 활성을 나타낸 것으로써, 100mM의 트리스-염산, pH7.5, 1mM의 황산마그네슘, 1mM의 DTT, 20μM의 FPP, 80μM의 [14C]IPP(55mCi mmol-1)과 유액세럼 또는 세척된 고무입자를 포함하는 반응혼합물을 25℃에서 6시간 동안 반응시키고 벤젠으로 고무를 추출하여14C로 라벨된 고무의 방사능을 액체섬광계수기로 측정하였다; +EDTA는 25mM의 EDTA를 첨가한 것; 가열은 세척된 고무입자를 5분 동안 가열한 것; 0은 0℃에서 반응시킨 것을 나타낸다.
도 3은 무화과나무의 유액과 고무입자 단백질의 SDS-12% PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. 0.1% 트리톤 X-100과 1% SDS를 포함하는 계면활성제 용액에서 전체 유액을 배양함으로써 고무입자 단백질을 용해하였다. 전기영동후에 단백질들을 쿠마시 블루 염색(Coomassie Blue staining)으로 검출하였고; L은 무화과나무 유액; RP는 세척된 고무입자; H는 브라질고무나무 유액; M은 단백질 분자량 표준물질을 나타낸다.
도 4는 무화과나무와 브라질 고무나무의 유액에서 고무 전이효소 활성에 대한 (a)EDTA, (b)플로르화나트륨 및 (c)염화아연과 요오드아세트산의 영향을 나타낸 것으로써, 유액세럼과 지시된 양의 화합물을 포함하는 반응혼합물에서 도 2와 같이 반응을 수행하였고; ■는 무화과나무; ◆는 브라질 고무나무; ▲는 3k 막 센트리콘(centricon)으로 여과하여 마그네슘이온을 포함하는 작은 분자들을 제거한 무화과나무 유액; □는 요오드아세테이트; ●는 염화아연을 나타낸다.
도 5는 시험관내 합성한14C로 라벨된 고무의 분자량 분포를 나타낸 것으로써, 30mg WRP를 포함하는 반응혼합물에서 도 2에 설명된 것과 같이 반응을 수행하였다. 시험관내 합성된 고무를 벤젠으로 추출하여 겔 투과 크로마토그래피를 수행하였다. ELSD로 모니터하여 유출물을 0.5분 간격으로 모아서 방사능을 측정하였다.
무화과나무(Ficus carica)에서 고무를 아세톤과 벤젠으로 연속적으로 추출하여 얻었다. 시료에 대한 FTIR 및13C NMR 분석으로 벤젠에 용해된 잔기들이 시스-1,4-폴리이소프렌인 천연고무라는 것을 확인하였다. 무화과나무의 유액은 고무함량이 약 4%이고 나무껍질, 잎 및 열매의 고무함량은 각각 0.3%, 0.1%, 0.1%이다. 겔 투과 크로마토그래피에 의해 무화과나무의 천연고무의 분자량이 약 128kD로 나타났다. SDS-PAGE 분석으로 무화과나무의 유액세럼은 48kD과 25kD 단백질을 주단백질로 하여 단지 소수의 단백질을 포함하는 것으로 나타났다. 브라질 고무나무(Heveabrasiliensis)와 구아율(Parthenium argentatumGray)과 같이 고무 생합성에 관련된 효소들이 무화과나무의 고무 입자들과 단단하게 결합되어 있다. 시험관내 고무 생합성의 분석결과 전체 유액 및/또는 고무 입자들과 관련된 단백질들이 알릴 이인산 개시제와 이소펜테닐 이인산으로부터 고분자량의 고무를 생산한다는 것이 나타났다. 무화과나무와 브라질 고무나무의 시험관내 고무 생합성에 대한 EDTA와 플로르화나트륨의 영향을 비교한 결과는 유액세럼에 존재하는 2가의 금속이온들과 피로인산이 무화과나무와 브라질 고무나무에서 각기 다른 고무 생합성의 활성을 결정하는데 있어서 중요한 인자라는 것을 암시한다.
무화과나무(Ficus carica)는 남반구 온대지방에서 열매를 맺는다. 그것을 자르면 매우 많은 양의 유백색 유액이 조직으로부터 유출된다. 무화과나무는 유액의 양이 많고 성장속도가 빠르며 유전공학적으로 조작된 나무를무성 번식시키는데 적합하기 때문에 대체 고무작물로 개발하는데 유리하다. 무화과나무에 존재하는 단백질분해효소, 아미노산, 무기물, 당, 트리테르펜 및 유기산에 관해서는 많은 화학적 분석결과들이 보고되어 있다.{Oner and Akar, Lebensm-Wiss Technol. 26: 318-321 (1993); Kim et al., J. Kor. Agric. Chem. Soc. 35: 51-54 (1992); Ahmed et al., Planta Med. 54: 481 (1988); Shiraishi et al., J. Faculty Agric. Kyushu Univ. 41: 29-33 (1996)}. 그러나 이 종들의 고무 함량에 대해서는 보고된 바가 없었다. 무화과나무에서 생산되는 고무의 양과 품질을 결정하고 유액세럼에서의 고무생합성 활성을 특징지우는 것은 대체 고무작물로서 이 종들의 향상을 위한 토대를 제공할 것이다.
본 발명에서는 무화과나무에서 시스-1,4-폴리이소프렌의 함량과 품질을 결정하고 그것을 천연고무생산 식물인 브라질 고무나무와 인디안 고무나무와 비교하였다. 또한 본 발명에서는 무화과나무에서 유액세럼의 고무생합성 활성과 고무입자들에 관련된 단백질들의 고무생합성 활성을 조사하였다. 다른 고무생산 식물들과 같이 무화과나무에서도 고무생합성에 관련된 효소들은 고무입자들과 단단하게 결합되어 있다. 본 발명은 무화과나무의 전체 식물(유액, 잎, 나무껍질 및 열매), 유액세럼, 단백질들을 이용한 고무생산에 관한 것이다. 본 발명에서는 무화과나무를 대체 고무식물로 확인하고, 대체할 고무생산 온대성식물로써 무화과나무의 개발에 대한 중요한 정보를 제공한다.
무화과나무를 이용한 고무생산에 대한 첫 번째 연구법에서는 들이나 화분에서 자란 무화과나무를 절단하여 유액을 얻었다. 아세톤과 벤젠으로 연속적으로 추출하여 천연고무를 얻고 FTIR과13C NMR을 이용하여 벤젠추출물이 천연고무라는 것을 확인하였다(도 1). 무화과나무에서 천연고무의 분자량은 128kD이다. 무화과나무의 유액은 약 4%(w/v)의 고무를 포함한다. 그러나, 무화과나무의 다른 부분인 나무껍질, 잎과 열매는 단지 0.1-0.3%(w/v)의 고무를 함유한다. pH 7.5의 트리스(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)-염산 완충용액, 마그네슘이온, DTT(Dithiothretol), 파네실 피로인산(farnesyl pyrophosphate, FPP), 이소펜테닐 피로인산(IPP) 및 적당량의 유액을 포함하는 반응 칵테일에서 시험관내 고무합성을 실시하였고 그 생성물을 분석하여 합성된 고무량을 결정하였다(도 2).
두 번째 연구법에서는 유액을 40,000배 g으로 1시간 동안 원심분리하여 수용액상으로부터 고무입자들을 포함하는 크림같은 상층(top creamy fraction)을 분리하고 수용액상을 C-세럼이라 명명하였다. 크림같은 상층을 완충용액으로 반복 세척하여 세척된 고무 입자들을 얻었다. 도 3은 무화과나무의 유액에 25kD와 48kD의 단백질이 가장 풍부하고 몇몇 다른 단백질들이 소량 존재한다는 것을 나타낸다. 이러한 단백질들은 천연고무의 중합을 촉매하는 고무입자들의 효소적 작용에 밀접하게 관련되어 있다. 무화과나무 유액의 단순한 단백질 프로파일은 100개 이상의 크기가 다른 단백질을 포함하는 브라질고무나무 단백질 프로파일과 대조된다.
상기에서 설명된 시험관내 고무생합성 분석은 유액세럼 또는 세척된 고무입자들을 효소공급원으로 사용하여 합성된 고무를 나타낸다(도 2).
브라질 고무나무와 무화과나무의 고무생합성 활성을 실험하여 무화과나무를 브라질 고무나무에 비교한 결과 고무생합성 활성이 다른 양상을 지닌다는 것을 발견하였다. 시험관내 고무생합성 분석을 하는 동안 무화과나무의 반응혼합물에 첨가된 EDTA가 고무로의 [14C]IPP의 결합을 저해하지 않고 다소 증가시킨다는 흥미로운 현상을 관찰하였다. 따라서 무화과나무와 브라질 고무나무의 유액의 고무생합성에 대한 EDTA와 마그네슘이온의 영향을 주의하여 시험하였다. 도 4에 나타난 것과 같이 무화과나무의 유액에 5mM 이하의 EDTA를 첨가하였을 때는 고무로의 [14C]IPP의 결합이 증가하고 EDTA 농도가 높아짐에 따라 [14C]IPP의 결합이 점차적으로 감소하는 것으로 나타났다. EDTA가 [14C]IPP의 결합을 증가시키는 영향은 막(분자량 3,000으로 분리)을 통해 세척하여 고무전이효소 활성에 필요한 2가이온들을포함하는 작은 분자들이 제거된 무화과나무의 유액시료에서는 관찰되지 않았다. 반면에, 5mM과 그 이상의 EDTA를 첨가한 브라질 고무나무의 유액에서는 [14C]IPP의 결합의 현저한 감소가 관찰되었다. 이러한 결과는 무화과나무와 브라질 고무나무에서 2가이온의 농도를 포함하는 상이한 생리적 조건이 이러한 두 식물종에서의 고무생합성에 다른 영향을 미친다는 것을 암시한다. 무화과나무와 브라질 고무나무에서 다른 생리적 환경이 시험관내 고무생합성 활성에 영향을 미치는지에 대해 더 연구하기 위하여, 플루오르화나트륨을 반응혼합물에 첨가하여 고무생합성 활성에 대한 영향을 평가하였다. 도 4에 나타난 것과 같이 반응혼합물에 플루오르화나트륨을 첨가하면 무화과나무와 브라질 고무나무의 유액이 포함된 반응혼합물에서 [14C]IPP의 고무로의 결합이 감소하였다. 그러나 상기에 논의된 EDTA와는 반대로 플루오르화나트륨은 브라질 고무나무의 유액에서보다 무화과나무에서 더욱 심각하게 고무생합성을 저해하였다. 무화과나무의 유액을 포함하는 반응혼합물에 프레닐전이효소의 저해제로 잘 알려진 요오드아세테이트와 염화아연을 첨가한 결과 [14C]IPP 결합이 현저하게 감소하였다(도 4).
[실시예]
다음의 실시예는 본 발명의 특징을 더 자세히 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정짓는 것은 아니다.
(실시예1)
무화과나무의 유액을 이용한 고무생산
무화과나무의 유액을 pH 7.5, 100mM의 트리스-염산, 5mM의 황산마그네슘, 10mM의 DTT 및 0.1mM의 PMSF를 포함하는 얼음으로 냉각한 완충용액내에 직접 모았다. 100mM의 트리스-염산, pH 7.5, 80μM의 [14C]IPP, 20μM의 FPP, 1mM의 황산마그네슘, 1mM의 DTT 및 5μL의 유액을 포함하는 50μL의 반응혼합물을 25℃에서 6시간동안 반응시켜 시험관내 고무생합성 활성을 결정하였다. 대조군 실험에서는 고무전이효소의 활성에 필요한 마그네슘이온과 킬레이트화합물을 형성하도록 25mM의 EDTA를 반응혼합물에 첨가하였다. 그 반응을 25mM의 EDTA를 첨가함으로써 종료하였다. 그 결과 생성된 [14C]IPP가 결합된 고무는 여과법 또는 벤젠 추출법을 사용하여 양을 결정하였다. 여과법에서는 반응혼합물을 0.02 또는 0.1㎛의 아노디스크 막(anodisc membrane)을 통하여 여과하고 필터는 1M의 염산과 95% 에탄올로 반복하여 세척하였으며 세척된 필터에 잔존하는 방사능을 액체 섬광계수기로 측정하였다. 벤젠 추출법에서는 반응혼합물을 2배 부피의 벤젠으로 3회 추출하고 그 벤젠 추출물을 레디 솔브 HP 섬광 칵테일(Ready Solv HP scintillation cocktail)과 혼합하여 방사능을 액체 섬광계수기로 측정하였다.
(실시예 2)
무화과나무의 세척된 고무입자를 사용한 고무생산
무화과나무의 유액을 40,000배 g으로 1시간동안 원심분리하여 표면층의 고무입자를 수집하였다. 그 고무입자들을 원심분리에 의하여 pH 7.5, 100mM의 트리스-염산, 5mM의 황산마그네슘 및 10mM의 DTT를 포함하는 세척 완충용액으로 연속적으로 세척하였다. 효소 공급원으로 세척된 고무입자를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 같은 방법을 사용하여 그 결과 생성된 [14C]IPP가 결합된 고무는 여과법 또는 벤젠 추출법을 사용하여 양을 결정하였다. 시험관내 합성된 고무의 분자량 구분은 겔 투과 크로마토그래피로 산정하였다. 시험관내 합성된 고무의 평균분자량은 무화과나무에 존재하는 내생고무의 평균분자량과 비슷하다(도 5).
본 발명은 무화과나무의 전체 식물, 유액세럼, 단백질들을 이용한 고무생산에 관한 것이다. 수요의 증가와 더불어 고무 재배원의 면적이 감소하고 브라질 고무나무에 의한 과민성 개체의 생명을 위협하는 유액 알레르기로 인해 다른 고무 원천의 개발이 필요하게 되었다. 무화과나무는 유액의 부피가 크고 성장이 빠르며 생명이 길고, 유전공학적으로 조작된 나무를 무성번식시키는데 적합하기 때문에 대체 고무작물로써 유리하다.
Claims (5)
- 무화과나무를 아세톤과 벤젠이 함유된 용매상에서 마쇄하여 균질화하고, 고무를 함유하는 벤젠을 수거한 후 벤젠으로부터 고무를 분리하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 무화과나무를 이용한 천연고무생산물.
- pH 7.0∼8.0의 트리스-염산 완충용액, 이소펜테닐 피로인산 기질 및 파네실 피로인산 개시제를 포함하는 배지에 무화과나무의 식물 기관을 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 무화과나무를 이용한 천연고무의 생산방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 식물 기관은 무화과나무의 유액, 잎, 나무껍질 및 열매 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 무화과나무를 이용한 천연고무의 생산방법.
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