KR100337009B1 - 항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민 및 그의 제조방법 - Google Patents

항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민(HSA) 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 사람혈장알부민에 알칼리성의 pH, 생체와 동일한 칼슘이온 농도 또는 양이온성 계면활성제를 처리하여 항산화 활성을 증진시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 인간 혈액을 포함한 생체 내 혹은 외용의 산화방지제로 사용될 수 있는 HSA의 항산화 활성이 증진되어, 보다 작은 양으로 높은 항산화 활성을 가지는 천연 항산화제로서의 이용을 제고할 수 있다.

Description

항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민 및 그의 제조방법{Human Serum Albumin with Increased Antioxidation Activity and Process for Preparing the Same}
본 발명은 항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 사람혈장알부민에 알칼리성의 pH, 생체와 동일한 칼슘이온 농도 또는 양이온성 계면활성제를 처리하여 항산화 활성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
인체가 각종 물리적, 화학적, 생물학적인 스트레스를 받으면, 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O2), 과산화수소(H2O2), 히드록시 라디칼(hydroxy radical, OH) 등의 유해한 활성산소종으로 변하여 인체에 치명적인 생리적 장애를 일으키고, 심할 경우는 질병을 유발하고 생명을 잃게 한다.
생체는 활성산소종을 제거하는 자기방어기구로서 항산화 기구(antioxidative mechanism)를 발달시키면서 진화하여 왔다고 여겨지지만, 조직의 방어능을 초월한활성산소종의 발생은 단백질, DNA, 효소 및 T세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 각종 질환의 원인이 된다. 또한, 활성산소종은 세포 생체막의 구성 성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화 반응을 일으키고, 이로 인하여 생체내 축적된 과산화지질은 노화와 각종 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다(참조: Halwell, B., Drugs, 42:569, 1991; Fukuzawa, K. and Takaishi, Y., J. Act. Oxyg. Free. Rad., 1:55, 1990; Neuzil, J. et al., Biochem. J., 293:601, 1993; Sies, H., ed., Oxidative Stress, 1985; Steinberg, D. et al., N. Engl. J. Med. 320:915, 1989).
한편, 최근 노화와 성인병 질환의 원인이 활성산소종에 기인한 것이라는 학설이 인정됨에 따라, 활성산소종을 조절할 수 있는 물질로 알려진 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되어, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismuase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 카탈라아제(catalase), 글루타티온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase) 등의 항산화 효소와 토코페롤(tocopherol), 아스코베이트(ascorbate), 카로테노이드(carotenoid), 글루타티온(glutathione) 등의 천연물 유래의 저분자 항산화 물질에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으며(참조: Chang, S. S. et al., J. Food. Sci., 42:1102, 1977; Hammerschmit, P. A. and Pratt, D. E., J. Food. Sci., 29:17, 1964), 2,6'-디-tert-부틸-4-히드록시 톨루엔(2,6'-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene, BHT), 2,6'-디-tert-부틸-4-히드록시 아니졸(2,6'-di-tert-butyl-4-hydroxyanisole, BHA) 등의 합성 항산화제가 많이 개발되어 의약품과 식품분야에서 이용되고 있다(참조: Kitahara, K. et al., Chem.Pharm. Bull. 40:2208, 1992; Hatano, T., Natural Medicines, 49:357, 1995; Masaki, H. et al., Biol. Pharm. Bull., 18:162, 1995). 그러나, 합성 항산화제에 대한 소비자의 기피성향과 합성 항산화제가 대량으로 투여된 동물실험에서 발암성이 보고되어 있으므로(참조: Branen, A. L., JAOCS, 52:59, 1975), 합성 항산화제의 사용이 점점 제한되고 있으며, 이로 인하여 효력이 탁월하고 보다 안전한 새로운 천연 항산화제의 개발이 절실히 요구되었다.
이에, 본 발명자들은 티올 특이적인 항산화 활성을 가지는 사람의 혈장알부민을 정제하였고, 이를 이용하여 혈청 알부민의 인간 혈액을 포함한 생체내 혹은 외용의 산화방지제로서의 용도를 제시한 바 있다(참조: 대한민국 특허공개 제 98-2067). 사람혈장알부민(이하, 'HSA'라 함)은 pH에 의존하여 구조적 변화를 야기하고 이것을 N-B변환(N-B transition)이라 한다. HSA의 구조적인 안정성은 약알칼리 pH에서 약화되어 B형태로 변환되고, 이는 HSA의 도메인 Ⅰ과 도메인 Ⅲ이 형성하는 염다리의 붕괴에 기인하는 것으로 알려졌으며(참조: Kosa, T. et al., Pharm. Res., 15:592, 1998), 이러한 구조의 변화가 HSA의 항산화 활성에 영향을 미치는 것으로 여겨졌다.
따라서, HSA가 항산화 활성을 나타날때 가지는 구조적인 특징을 파악하고, 이를 활용하여 항산화 활성을 증진시키는 조건을 확립함으로써, 보다 작은 양으로 높은 항산화 활성을 가지는 천연 항산화제로서의 이용 효율을 높이며, 또한 이를 유효성분으로 하는 항산화제를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 HSA의 항산화제로서의 활성을 증진시키고자 예의 노력한 결과, 알칼리성의 pH, 생체와 동일한 칼슘이온 농도 또는 양이온성 계면활성제를 처리하였을때 HSA의 항산화 활성이 월등하게 증진되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 방법에 의해 제조된 활성이 증진된 사람혈장알부민을 제공하는 것이다.
도 1은 사람혈장알부민(HSA)의 티올 특이적인 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 HSA에 빌리루빈(bilirubin)을 첨가하여 변화된 티올 특이적인 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 HSA에 지방산인 카프린산(caprylate)을 첨가하여 변화된 티올 특이적인 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 HSA에 양이온성, 중성 또는 음이온성 계면활성제를 첨가하여 변화된 티올 특이적인 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 양이온성 계면활성제인 염화세틸트리메틸암모니윰(cetyltrimethylammonium chloride)을 첨가한 HSA의 항산화 활성의 pH 의존도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 트리아이오도벤조인산(triiodobenzoic acid)이 HSA에 결합했을 때 감소한 티올 특이적인 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민의 제조방법은, 사람혈장알부민에 알칼리성의 pH, 생체와 동일한 칼슘이온 농도 또는 양이온성 계면활성제를 처리하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명의 사람혈장알부민(HSA)의 항산화 활성을 증가시키는 방법을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
우선, 본 발명자들은 HSA의 티올 특이적인 항산화 활성을 증가시키는 조건을 찾기 위하여, HSA의 N-B변환이 pH의 범위에 의존하여 이루어 진다는 사실에 근거하여, HSA 완충액의 조성을 변화시키며 처리하였다. HSA의 티올 특이적인 항산화 활성은 중성의 pH에서 극히 낮다가, 약알칼리성, 바람직하게는 pH 7.8로 점차 증가함에 따라 항산화 활성이 증진되며, 이는 HSA의 구조적인 변화가 항산화 효소로서의 기능증진과 연관이 있음을 알 수 있었다. 이때, 알칼리성의 pH는 인산(phosphate), 파이로인산(pyrophosphate), 탄산(carbonate), 중탄산(bicarbonate) 또는 붕산(borate) 등의 완충액을 처리하여 유도될 수 있다. 또한, 생리적 농도 하에서 칼슘이온은 혈장단백질을 보다 쉽게 B형태로 변환시킨다고 보고되어진 바(Bos et al., J. Biol. Chem., 264:953, 1989; Harmsen et al., Biochemistry, 10:3217, 1971), 2.0 내지 3.0mM, 바람직하게는 2.5mM의 칼슘이온을 티올 특이적인 항산화 반응액에 첨가함에 따라 HSA의 항산화 활성을 변화시킴을 확인할 수 있었다. 이때, 생체와 동일한 칼슘이온의 농도는 탄산칼슘, 염화칼슘, 수산화칼슘, 또는 인산칼슘의 완충액을 처리하여 유도될 수 있다. 또한, HSA는 염기성의 아미노산 잔기를 포함하고, 이는 티올 특이적인 항산화 활성을 측정함에 있어서, 티올레이트 이온(thiolate ion)을 안정화시키므로, 양이온성 계면활성제를 항산화 반응액에 첨가하여 HSA를 둘러싼 미세환경의 변화를 제공함으로써 항산화 활성을 증진시킬 수 있었다. 이때, 양이온성 계면활성제는 세트리모니움염(cetrimonium salt), 벤잘코니움염(benzalkonium salt) 또는 벤즈에타니움염(benzethanium salt)의 완충액을 처리하여 유도될 수 있다.
한편, HSA의 항산화 효과는 티올-MCO시스템(metal-catalyzed oxidation:Fe3+, O2및 DTT로 구성)의 방법에 따라, 대장균의 글루타민 합성효소(glutamine synthetase)의 불활성 억제정도를 측정함으로써 파악하였다: 즉, 티올-MCO 시스템에 대장균의 글루타민 합성효소 5μg, 100mM 염화나트륨, 100mM 헤페스(HEPES)-수산화나트륨 완충용액(pH 7.0) 및 전기 변형된 HSA로 구성된 50μl의 반응혼합액을 37℃에서 반응시킨 다음, 5μl의 반응 혼합액을 취하고, 여기에 2ml의 γ-글루타밀트랜스퍼라아제(γ-glutamyltransferase) 반응액을 가하여 잔존하는 글루타민 합성효소의 활성을 측정함으로써, HSA의 항산화 효과를 파악할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 사람혈장알부민(HSA)의 정제
사람의 혈장으로부터 HSA를 정제하기 위하여, 사람의 혈액을 채취하는 즉시 헤파린을 처리하고, 혈장을 수득하였다. 이어, 황산암모늄을 70%(w/v) 농도로 처리하고, 원심분리하여 수득한 침전물을 50mM 트리스 완충용액(Tris-HCl, pH 7.6)에 현탁시키고 동일 완충용액으로 충분히 투석한 다음, 전기 완충용액으로 평형이 유지된 DEAE-셀룰로스 컬럼에 주입하였으며, 250mM 근처의 염화칼륨농도에서 항산화 단백질을 용출시켰다. 용출 분획들을 모아 70% 황산암모늄으로 침전시키고, 그 침전물을 100mM 염화칼륨을 함유한 100mM 헤페스 완충용액(Hepes, pH7.4)에 용해시킨 다음, 전기 완충용액으로 평형이 유지된 세파덱스 G-75 컬럼에 주입하였다. 항산화 단백질의 활성을 나타내는 분획들을 모아 70%의 황산암모늄으로 침전시키고, 침전물을 1.0M 황산암모늄을 함유한 100mM 헤페스-수산화나트륨 완충용액(pH 7.4)에 용해시킨 다음, 동일 완충용액으로 평형이 유지된 페닐 세파로스 CL-4B 컬럼에 주입하였다. 이어, 0.5M 내지 0.7M의 황산암모늄에서 용출된 항산화 단백질의 분획들을 모아 70% 황산암모늄으로 침전시켰다. 다음으로, 침전물을 상기한 G-75 크로마토그래피에서 사용된 동일한 완충용액에 용해시켜 세파덱스 G-100 컬럼에 주입하고, 항산화 단백질의 활성을 나타내는 분획들을 모아 농축한 다음, 환원 조건에서의 8% SDS-PAGE를 실시하여 분자량 65KD의 항산화 단백질인 HSA를 순수정제 하였음을 확인하였고, 정제과정 중의 항산화 단백질의 활성은 티올-MCO 시스템을 이용하여 대장균의 글루타민 합성효소의 불활성 억제정도로서 측정되었다.
실시예 2: 완충액의 처리에 따른 HSA 항산화 활성의 변화
실시예 2－1: pH 및 칼슘이온
HSA의 항산화 활성에 미치는 pH 및 칼슘이온의 역할을 알아보기 위하여, pH의 변화 및 칼슘이온의 첨가에 따른 HSA의 티올 특이적인 항산화 활성의 프로필을 실시예 1에서와 같이 티올-MCO 시스템을 이용하여 측정하였다: 반응액 30㎕에 3㎍의 GS, 5μM의 염화철, 10mM의 DTT 및 실시예 1에서 정제한 HSA를 첨가하고, 37℃에서 불활성화시켰다. 이때, 완충액으로는 200mM 헤페스-수산화나트륨 용액을 사용하였고, 불활성화의 시간은 반응 완충액의 pH가 증가함에 따라 증가시켰으며, 불활성화 후에 500㎕의 γ-글루타밀트랜스퍼라아제 반응액(glutamyltransferase assay mixture)을 첨가하여 GS의 남아있는 활성을 측정한 결과, 반응액의 pH가 pH 7.2 에서 pH 7.8로 증가함에 따라 HSA의 항산화 활성은 크게 증가하는 것으로 나타났고, 2.5mM의 칼슘이온을 첨가하였을 때 HSA의 pH 의존성 항산화 활성 프로필을 낮은 pH 쪽으로 변화시키는 것이 확인되었다(참조: 도 1). 도 1에서, (○)는 칼슘이온을 넣지 않은 HSA의 항산화 활성 프로필; 및, (●)은 2.5mM 칼슘이온을 넣은 HSA의 항산화 활성 프로필을 나타내었는 바, HSA의 항산화 활성은 알칼리 pH에서 증가하며, 칼슘이온을 첨가하였을 경우(●)는 첨가하지 않았을 경우(○)의 항산화 활성 프로필을 낮게 이동시키는 것을 보여주고, 이것으로 칼슘이온이 항산화 활성을 증가시키는 것이 확인되었다.
실시예 2-2: 빌리루빈(bilirubin) 또는 지방산(fatty acid)
HSA에 결합되어 있는 빌리루빈 또는 지방산이 HSA의 항산화 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 실시예 1에서 정제된 HSA에 활성탄(pH 3)을 처리하여 탈지시켰다. 탈지된 HSA를 25μM의 농도로 200mM의 헤페스 완충액(pH 7.4)에 용해하고, 여기에 50mM의 수산화나트륨용액에 용해된 빌리루빈을 0, 1, 2, 3, 4 및 5의 HSA에 대한 몰비로 첨가하여 실온에서 12 내지 18시간 동안 반응시킨 다음, 실시예 2－1에서와 같은 방법으로, 티올 특이적인 항산화 활성의 프로필을 측정하였다. 도 2a는 빌리루빈이 결합되었을 때의 HSA의 항산화 활성 프로필을 나타내었는 바, HSA의 항산화 활성이 빌리루빈이 결합됨에 따라 감소되는 것을 보여준다. 또한, 전기 탈지된 HSA를 25μM의 농도로 200mM의 헤페스 완충액(pH 7.4)에 용해하고, 여기에 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0mM 의 카프린산을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 실시예 2-1에서와 같은 방법으로, 티올 특이적인 항산화 활성의 프로필을 측정하였다. 도 2b는 카프린산이 결합되었을 때의 HSA의 항산화 활성 프로필을 나타내었는 바, HSA의 항산화 활성이 카프린산이 결합됨에 따라 감소되는 것을 보여준다.
실시예 2-3: 계면활성제
HSA의 티올 특이적인 항산화 활성에 HSA를 둘러싼 미세환경의 변화가 미치는 영향을 알아보기 위하여, 양이온성, 중성 또는 음이온성 계면활성제를 처리하였다: 실시예 1에서 정제한 HSA를 200mM 헤페스 완충액(pH 7.2)에 용해한 양이온 계면활성제의 일종인 염화세틸트리메틸암모늄(cetyltrimethylammonium chloride, 'CTAC'), 중성 계면활성제의 일종인 트리톤(Triton)X-100 또는 음이온 계면활성제의 일종인 소디움도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)를 각각 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0mM의 농도로 첨가하여 실시예 2－1에서와 같은 방법으로, 티올 특이적인 항산화 활성을 측정하였다. 도 3a에서 (●)는 양이온 계면활성제인 CTAC의 여러 농도에 의한 HSA의 항산화 활성 변화; (■)는 중성 계면활성제인 트리톤-100의 여러 농도에 의한 HSA의 항산화 활성 변화; 및, (▲)은 음이온 계면활성제인 SDS의 여러 농도에 의한 HSA의 항산화 활성 변화를 나타낸다. 또한, (○), (□) 및 (△)는 각각 EDTA, HSA 및 계면활성제 자체가 항산화 측정 시스템인 GS 활성에 미치는 영향을 나타낸다. 도 3a에서 보듯이, 양이온성 계면활성제인 CATC에 의해서만 HSA의 항산화 활성이 증가됨을 알 수 있다. 이러한 사실을 바탕으로, CTAC 존재하에 HSA의 항산화 활성의 pH 의존도를 조사하였다: 0.5mg/ml의 HSA와 0.25mM의 CTAC를 여러 pH로 조정한 200mM 헤페스 완충액에서 반응시킨 다음, 실시예 2－1에서와 같은 방법으로, 티올 특이적인 항산화 활성을 측정하였다. 도 3b는 CTAC가 있는 조건(●) 및 CTAC가 존재하지 않는 조건(○)에서 HSA의 항산화 활성의 pH 의존도를 나타내었는 바, CTAC 존재 하에서 HSA의 항산화 활성이 pH에 덜 민감한 것을 보여준다.
실시예 2-4: 약제의 처리
HSA의 약제 결합능력을 평가하기 위하여, 결합 메카니즘이 잘 밝혀진 트리아이오도벤조익산(triiodobenzoic acid, 'TIB')이 HSA의 항산화 반응에 미치는 영향을 조사하였다: 1mg/ml의 HSA를 200mM 헤페스 완충액(pH 8.0)에 용해하고, TIB를 0.0, 0.2, 0.4, 0.8 및 1.0mM의 농도로 첨가하여 실시예 2－1에서와 같은 방법으로, 티올 특이적인 항산화 활성의 프로필을 측정하였다. 도 4는 TIB를 처리하였을 경우, HSA의 항산화 활성을 나타내었는 바, TIB의 농도가 증가함에 따라 HSA의 항산화 활성이 점차 감소하여 활성을 상실하는 것을 보여준다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민의 제조방법 및 항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민을 제공한다. 본 발명에 의하면, 인간 혈액을 포함한 생체 내 혹은 외용의 산화방지제로 사용될 수 있는 HSA의 항산화 활성을 증진시켜 보다 작은 양으로 높은 항산화 활성을 가지는 천연 항산화제로서의 이용 효율을 제고할 수 있다.

Claims (5)

  1. 사람혈장알부민에 인산(phosphate), 파이로인산(pyrophosphate), 탄산(carbonate), 중탄산(bicarbonate) 또는 붕산(borate) 완충액을 처리하여 pH 7.6 내지 8.0으로 적정하거나 또는 양이온성 계면활성제를 처리하는 단계를 포함하는 항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    양이온성 계면활성제는 세트리모니움염(cetrimonium salt), 벤잘코니움염(benzalkonium salt) 또는 벤즈에타니움염(benzethanium salt)의 완충액을 처리하여 유도되는 것을 특징으로 하는
    항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민의 제조방법.
  5. 삭제
KR1019990032438A 1999-08-07 1999-08-07 항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민 및 그의 제조방법 KR100337009B1 (ko)

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