KR100318254B1 - Gap Vectors for E.coli Stop Codon Assay and Method for Detecting Heterozygous Truncating Mutation Thereby - Google Patents
Gap Vectors for E.coli Stop Codon Assay and Method for Detecting Heterozygous Truncating Mutation Thereby Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 절단형 돌연변이(truncating mutation)을 나타내는 유전자의 엑손(exon) 일부를 대장균용 낮은 복제수 플라스미드에 클로닝한 다음, 이를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 작제될 수 있는 대장균 정지코돈 검정법(E.coli stop codon assay, ESC)용 갭벡터 및 그를 이용한 이형접합 돌연변이(heterozygous truncating mutation)의 검정방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 기존의 정지코돈 검정에 사용되던 효모 대신에 대장균을 사용함으로써, 시간과 비용을 줄일 수 있으며, PCR 반응을 이용하여 용이하고 정확하게 갭벡터를 작제할 수 있기 때문에, 전체적인 검정방법이 간단해지고 효율성이 높은 이형접합 돌연변이의 검정이 가능해진다. 특히, 본 발명에서 제공하는 대장균 정지코돈 검정법은 단순히 형질전환된 대장균 콜로니의 색깔 비교를 통하여 돌연변이의 여부를 정확하게 검정할 수 있다.The present invention clones a portion of an exon of a gene that exhibits a truncating mutation into a low copy plasmid for Escherichia coli, and then uses it as a template to be constructed by polymerase chain reaction (PCR). The present invention relates to a gap vector for an E. coli stop codon assay (ESC) and a method for assaying a heterozygous truncating mutation using the same. According to the present invention, by using E. coli instead of the yeast used in the conventional stop codon assay, time and cost can be reduced, and since the gap vector can be constructed easily and accurately using a PCR reaction, the overall assay method is Simple and efficient assays for heterozygous mutations are possible. In particular, the E. coli stop codon assay provided by the present invention can accurately assay for the presence of mutations simply by comparing the color of the transformed E. coli colonies.
Description
본 발명은 대장균 정지코돈 검정용 갭벡터 및 그를 이용한 이형접합 돌연변이의 검정방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 절단형 돌연변이(truncating mutation)을 나타내는 유전자의 엑손(exon) 일부를 대장균용 낮은 복제수 플라스미드에 클로닝한 다음, 이를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 작제될 수 있는 대장균 정지코돈 검정법(E.coli stop codon assay, ESC)용 갭벡터 및 그를 이용한 이형접합 돌연변이(heterozygous truncating mutation)의 검정방법에 관한 것이다.The present invention relates to a gap vector for Escherichia coli stop codon assay and a method for assaying heterozygous mutations using the same. More specifically, the present invention clones a portion of an exon of a gene exhibiting a truncating mutation into a low copy plasmid for Escherichia coli, and then uses it as a template to polymerase chain reaction (PCR). It relates to a gap vector for E. coli stop codon assay (ESC) and heterozygous truncating mutations using the same.
일반적으로 유전자 돌연변이를 찾아내기 위한 검색 또는 검증방법으로는 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 SSCP(single strand conformation polymorphism), RPA(RNase protection assay), DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis), Mismatch detection(non-isotopic RNase cleavage assay), CFLP(cleavage fragment length polymorphism), 그리고 PTT(protein truncation test) 등이 있으며, 이렇게 다양한 검색 방법을 통해 돌연변이 검색을 한 다음, 다시 DNA 염기서열을 결정하여 염기변화를 확인하는 방법이 널리 응용되고 있다.In general, detection or verification methods for detecting genetic mutations include single strand conformation polymorphism (SSCP) using polymerase chain reaction (PCR), RNase protection assay (RPA), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), and mismatch detection (non-). isotopic RNase cleavage assay (CFLP), cleavage fragment length polymorphism (CFLP), and protein truncation test (PTT). These mutations are searched through various search methods, and then the DNA sequence is determined again to confirm the base change. This is widely applied.
이러한 유전자 돌연변이 검색 방법들은 각각 장점과 단점들을 가지고 있으며, 연구 목적과 재료에 따라서 다양하게 선택되어 질 수 있는 바, 가령, 대장암으로 이행하는 가족성 용종증(familial adenomatous polyposis, FAP)과 유전성 유방암 및 난소암에 관련된 APC 유전자 또는 BRCA1 유전자의 돌연변이 검정방법으로는 비교적 절차가 간단하다는 이유로 SSCP, RPA 또는 DGGE 방법이 초기부터 많이 사용되어 왔다. 그러나 이러한 방법은 한번에 검색할 수 있는 유전자의 범위가 제한적이고, 조건에 따라서 돌연변이 DNA를 정상 DNA와 명확하게 구분해내지 못하는 경우가 발생한다는 단점을 가지고 있었다. 또한, 무엇보다도 유전자의 크기가 크고, 돌연변이의 분포가 유전자 전체에 걸쳐서 존재할 경우에는 검사하는 양이 상대적으로 커지게 되는 불편함이 있었다. 암과 관련된 유전자의 경우, 암 억제유전자의 새로운 돌연변이를 동정하는 데 어려움이 있어왔는 바, 이들 유전자들은 대체로 크기가 크며, 이형(heterozygous)이기 때문에, 염기서열 결정으로는 돌연변이를 동정하기가 상당히 어려울 뿐만 아니라, 다량의 검체를 검색하여야 할 때는 비용손실이 크게 발생하게 된다.Each of these genetic mutation detection methods has advantages and disadvantages, and can be selected in various ways depending on the purpose and material of the study, such as familial adenomatous polyposis (FAP), hereditary breast cancer and SSCP, RPA or DGGE methods have been used since the early days because of the relatively simple procedure for mutant assay of APC gene or BRCA1 gene related to ovarian cancer. However, this method has a disadvantage in that the range of genes that can be searched at one time is limited and in some cases the mutant DNA cannot be clearly distinguished from normal DNA. In addition, above all, when the gene is large and the distribution of mutations is present throughout the gene, there is an inconvenience in that the amount to be tested is relatively large. In the case of cancer-related genes, it has been difficult to identify new mutations in cancer suppressor genes. Since these genes are large in size and heterozygous, it is difficult to identify mutations by sequencing. In addition, when a large amount of samples need to be searched, a large cost loss occurs.
한편, 대부분 암 원인 유전자들의 세포내 기능은 잘 알려져 있지 않으나, 이들의 대부분이 주로 절단형 돌연변이(truncating mutation)에 의해 기능이 상실되는 것으로 알려져 있다. APC의 경우는 거의 전부, 또한 BRCA1의 경우 80이상이 절단형 돌연변이에 속하는 넌센스(nonsense) 또는 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이로 인하여 정지코돈이 생성되는 돌연변이형을 보여주며, 현재 이러한 돌연변이의 검정에는 넌센스 또는 프레임쉬프트 돌연변이로 인하여 생성된 절단 단백질을 세포외 조건(in vitro)에서 검정할 수 있는 PTT 검정법이 주로 사용되고 있다. 그러나, 대체적으로 PTT 검정법을 수행하는 데에는 고도의 숙련된 기술이 필요하며, 결과의 불분명으로 인하여 정확한 측정이 쉽지 않다. 또한, 대량으로 검정할 때에는 비용이 많이 드는 단점을 내포하고 있었다.On the other hand, the intracellular function of most cancer-causing genes is not well known, but most of them are known to lose their function mainly by truncating mutations. Almost all of the APCs, and more than 80 for BRCA1, show mutants in which stop codons are generated by nonsense or frameshift mutations belonging to truncated mutations. Alternatively, PTT assays, which can assay in vitro the cleavage protein produced by the frameshift mutation, are mainly used. However, in general, performing a PTT assay requires highly skilled techniques, and the uncertainty of the results makes accurate measurements difficult. In addition, a large amount of test had a disadvantage of high cost.
종래의 이러한 문제점을 극복하는 방법으로, 효모(yeast)를 이용하여 이형접합 돌연변이를 정지코돈 검정법으로 측정하는 방법이 이시오카(Ishioka) 등에 의하여 개시되었는 바, 이들은 대표적인 이형접합 돌연변이에 의한 암 관련 유전자인 APC 및 BRCA1 유전자의 돌연변이를 효모를 이용한 동형재조합(homologous recombination) 방법으로 측정하였다(참조: Ishioka, C, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94(6):2449-2453). 그러나, 효모를 사용하는 방법은 효모의 형질전환 방법이 용이하지 않으며, 검정하는데 상당한 시간과 비용이 소요되기 때문에 불편하여, 보다 형질전환이 간편하고 검정에 소요되는 시간과 비용이 절감될수 있는 방법의 개발이 필요한 상황이었다. 따라서, 효모를 이용할 경우의 상술한 단점을 보완할 수 있는 새로운 돌연변이 검정방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.As a method of overcoming such a conventional problem, a method of measuring heterozygous mutations using yeast using a stop codon assay has been disclosed by Ishioka et al., Which are representative genes related to cancer by heterozygous mutations. Mutations in the APC and BRCA1 genes were measured by homologous recombination using yeast (Ishioka, C, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (6): 2449-2453). ). However, the method of using the yeast is not easy because the transformation method of the yeast is not easy, and because it takes considerable time and cost to test, it is inconvenient, so that the transformation is easier and the time and cost of the test can be saved. There was a need for development. Thus, there is a constant need to develop new mutation assays that can overcome the aforementioned drawbacks of using yeast.
이에, 본 발명자들은 이형접합 돌연변이에 의한 APC 유전자 또는 BRCA1 유전자의 돌연변이형을 효율적으로 측정할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 돌연변이가 발생하는 유전자의 엑손 부분을 대장균용 낮은 복제수 플라스미드에 클로닝하고, 이를 주형으로 하여 클로닝된 엑손의 5' 및 3' 부분 일부서열을 포함하도록 하는 프라이머로 PCR을 통하여 갭벡터를 작제한 다음, 검정하고자 하는 시료의 엑손부분과 갭벡터를 대장균에 동시 형질전환(co-transformation)시킬 경우, 대장균 내에서 동형재조합이 용이하게 유도되고, 이형접합 돌연변이의 경우에는 넌센스와 삽입 및 절단으로 야기되는 프레임쉬프트에 의하여 정지코돈이 생성되어, 유전자의 번역(translation)이 정지되므로, 동시 형질전환 후 대장균 콜로니의 간단한 색 구별만으로도 용이하게 정지코돈 검정법을 수행할 수 있으며, 이에 의하여 신속하고 용이함은 물론, 경제적으로 돌연변이를 검정할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have made efforts to develop a method for efficiently measuring the mutant type of the APC gene or the BRCA1 gene by heterozygous mutations. As a result, the present inventors cloned the exon portion of the gene in which the mutation is generated into a low copy number plasmid for Escherichia coli. Using this as a template, a gap vector was constructed by PCR with a primer to include the 5 'and 3' partial sequences of the cloned exons, and then co-transformed the exon portion and the gap vector of the sample to be assayed into E. coli. Co-transformation facilitates homologous recombination in E. coli, and in the case of heterozygous mutations, stop codons are generated by frame shifts caused by nonsense, insertion, and cleavage, leading to translation of genes. It is stopped, so it is easy to distinguish the E. coli colonies after simple transformation. Stop codon assays can be carried out, thereby confirming that mutations can be assayed quickly and easily as well as economically, completing the present invention.
결국, 본 발명의 주된 목적은 대장균 정지코돈 검정법에 의하여 이형접합 돌연변이를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.After all, the main object of the present invention is to provide a method for measuring heterozygous mutations by E. coli stop codon assay.
본 발명의 다른 목적은 대장균 정지코돈 검정법에 사용할 수 있는 갭벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a gap vector that can be used in E. coli stop codon assay.
도 1은 대장균 정지코돈 검정법(E.coli stop codon assay, ESC)의 개괄적 순서를 나타낸 그림이다.1 is a diagram showing the general sequence of the E. coli stop codon assay (ESC).
도 2는 ESC 검정법에 사용한 대장균용 낮은 복제수 벡터 pZC320의 모식도이다.2 is a schematic of the low copy number vector pZC320 for E. coli used in the ESC assay.
도 3은 플라스미드 pAPC-a의 제한효소 절단 후의 아가로오스 젤 전기영동 사진이다.Figure 3 is agarose gel electrophoresis after restriction digestion of plasmid pAPC-a.
도 4는 플라스미드 pAPC-b의 제한효소 절단 후의 아가로오스 젤 전기영동 사진이다.4 is agarose gel electrophoresis after restriction digestion of plasmid pAPC-b.
도 5는 갭벡터 AV-a 및 AV-b의 모식도이다.5 is a schematic diagram of the gap vectors AV-a and AV-b.
도 6은 플라스미드 pBRCA1-a, pBRCA1-b 및 pBRCA1-c의 제한효소 절단 후의 아가로오스 젤 전기영동 사진이다.Fig. 6 shows agarose gel electrophoresis after restriction digestion of plasmids pBRCA1-a, pBRCA1-b and pBRCA1-c.
도 7은 갭벡터 BV-a, BV-b 및 BV-c의 모식도이다.7 is a schematic diagram of the gap vectors BV-a, BV-b and BV-c.
도 8은 갭벡터 AV-a, AV-b, BV-a, BV-b 및 BV-c의 아가로오스 젤 전기영동 사진이다.8 is agarose gel electrophoresis photographs of the gap vectors AV-a, AV-b, BV-a, BV-b, and BV-c.
도 9는 여러 시료로부터 APC-a 및 APC-b 절편을 PCR로 증폭한 아가로오스 젤 전기영동 사진이다.FIG. 9 is agarose gel electrophoresis photographs obtained by PCR amplifying APC-a and APC-b fragments from various samples.
도 10은 가드너 증후군 가계로부터 APC-b 절편을 증폭한 아가로오스 젤 전기영동 사진이다.10 is agarose gel electrophoresis photographs of amplified APC-b fragments from the Gardner syndrome family.
도 11은 APC 유전자에 대한 ESC 검정법의 결과로 나타난 푸른색 또는 흰색 콜로니로부터 분리된 플라스미드의 제한효소 절단 후의 아가로오스 젤 전기영동 사진이다.11 is agarose gel electrophoresis after restriction enzyme digestion of plasmids isolated from blue or white colonies resulting from the ESC assay for the APC gene.
도 12는 가드너 증후군 가계 구성원의 APC 유전자에서의 돌연변이를 확인하기 위하여 수행한 염기서열 분석결과를 나타낸 그림이다.Figure 12 is a diagram showing the results of sequencing performed to identify mutations in the APC gene of the Gardner syndrome family members.
도 13은 ESC 방법으로 분리된 APC 대립유전자들의 염기서열을 결정한 그림이다.Figure 13 is a figure determining the nucleotide sequence of the APC alleles separated by the ESC method.
도 14는 여러 시료로부터 BRCA1-a, BRCA1-b 및 BRCA1-c 절편을 PCR로 증폭한 아가로오스 젤 전기영동 사진이다.FIG. 14 is agarose gel electrophoresis photographs obtained by PCR amplification of BRCA1-a, BRCA1-b and BRCA1-c fragments from various samples.
도 15는 ESC 방법으로 분리된 BRCA1 대립유전자들의 염기서열을 결정한 그림이다.FIG. 15 shows the nucleotide sequences of the BRCA1 alleles isolated by the ESC method. FIG.
본 발명의 이형접합 돌연변이를 측정하는 방법은 절단형 돌연변이(truncating mutation)를 나타내는 유전자의 엑손 부분을 PCR로 증폭하고, 대장균용 낮은 복제수 플라스미드에 클로닝하는 단계; 전기 엑손 유전자가 클로닝된 플라스미드를 주형으로 하고, 엑손 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 50 내지 200bp 서열이 포함되도록 하는 프라이머로 PCR을 수행함으로써 대장균 정지코돈 검정법용 갭벡터를 작제하는 단계; 측정할 시료로부터 분리한 RNA 또는 gDNA를 주형으로 하여, 전기 증폭된 엑손 부분과 동일한 부위의 유전자 절편을 RT-PCR 또는 PCR로 증폭시키는 단계; 및, 전기 갭벡터와 증폭된 엑손 유전자 절편을 대장균에 동시 형질전환시키는 단계를 포함한다.Methods for measuring heterozygous mutations of the invention include amplifying the exon portion of a gene exhibiting truncating mutations by PCR and cloning it into a low copy number plasmid for Escherichia coli; Constructing a gap vector for an E. coli stop codon assay by performing PCR with a primer having a plasmid cloned with the exon gene cloned thereon and including 50 to 200 bp sequences of the 5 'and 3' ends of the exon gene; Amplifying a gene fragment at the same site as the amplified exon moiety by RT-PCR or PCR using RNA or gDNA isolated from the sample to be measured as a template; And co-transforming the electric gap vector and the amplified exon gene fragment into E. coli.
한편, 본 발명에서 제공하는 갭벡터는 APC 및 BRCA1 유전자에서 절단형 돌연변이(truncating mutation)가 높은 빈도로 나타나는 부위의 엑손 부분을 PCR로 증폭하여, 대장균용 낮은 복제수 플라스미드에 클로닝한 다음, 전기 엑손 유전자가 클로닝된 플라스미드를 주형으로 하여, 엑손 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 50 내지 200bp 서열이 포함되도록 하는 프라이머로 PCR을 수행함으로써 작제된다.On the other hand, the gap vector provided in the present invention by PCR amplifies the exon portion of the site showing a high frequency of truncating mutations in the APC and BRCA1 gene, cloned into a low copy number plasmid for Escherichia coli, and then electric exon Using the cloned plasmid of a gene as a template, it is constructed by performing PCR with a primer which contains 50-200bp sequences of the 5 'end and 3' end of an exon gene.
이하, 본 발명의 이형접합 돌연변이를 측정하는 방법을 단계별로 나누어 좀 더 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the method for measuring heterozygous mutations of the present invention will be described in more detail by dividing step by step.
제 1단계: 엑손 유전자의 클로닝 Step 1 : Cloning the Exon Gene
절단형 돌연변이(truncating mutation)를 나타내는 유전자의 엑손 부분을 PCR로 증폭하고, 대장균용 낮은 복제수 플라스미드에 클로닝한다: 이때, 절단형 돌연변이를 나타내는 유전자는 대표적으로 APC 또는 BRCA1인 바, 유전자가 APC일 경우, 유전자의 엑손 1부터 엑손 14까지의 부분(APC 유전자의 서열번호 19부터 1977까지)이나 엑손 15 부분(APC 유전자의 서열번호 1978부터 5266까지)을 증폭시키며, 유전자가 BRCA1일 경우, 유전자의 엑손 2부터 엑손 10까지의 부분(BRCA1 유전자의 서열번호 99부터 903까지), 엑손 11 부분(BRCA1 유전자의 서열번호 789부터 4217까지) 또는 엑손 12부터 엑손 24까지의 부분(BRCA1 유전자의 서열번호 4089부터 5704까지)을 증폭시켜 사용한다. 이와같이 유전자의 엑손을 몇 부분으로 나누어 사용하는 이유는 비교적 길이가 긴 APC 또는 BRCA1 유전자 전체를 RT-PCR 방법으로 증폭하는 것이, 기술적으로 길이가 긴 유전자 전체를 증폭시키는 것 자체가 어려우며, 긴 염기서열 증폭시에 에러발생 빈도가 더 커지는 등, 오히려 단점을 많이 내포하기 때문이다. 따라서, 이론적으로는 가능하지만, 검정시의 정확성 및 재현성을 유지하기 위하여 유전자를 일정한 크기의 절편으로 나누어 사용하는 것이 더 바람직하다.The exon portion of the gene showing the truncating mutation is amplified by PCR and cloned into a low copy plasmid for Escherichia coli: the gene representing the truncated mutation is typically APC or BRCA1 and the gene is APC. In this case, amplification of exon 1 to exon 14 of the gene (SEQ ID NOs 19 to 1977 of the APC gene) or exon 15 parts (SEQ ID NOs 1978 to 5266 of the APC gene) is performed. Exon 2 to Exon 10 (SEQ ID NOs 99 to 903 of the BRCA1 gene), Exon 11 parts (SEQ ID NOs 789 to 4217 of the BRCA1 gene) or Exon 12 to Exon 24 (SEQ ID NO 4089 of the BRCA1 gene) Up to 5704). The reason why the exon of the gene is divided into several parts is that it is difficult to amplify the entire long length gene by RT-PCR method. This is because the frequency of error occurs during amplification, which is rather large. Thus, although theoretically possible, it is more desirable to divide the gene into fragments of constant size in order to maintain the accuracy and reproducibility of the assay.
다음으로, 증폭된 엑손 유전자를 대장균용 플라스미드에 클로닝하게 되는 바, 갭벡터로 사용시 효과적으로 이형접합체를 분리하려면 매우 낮은 복제수를 유지하는 플라스미드를 사용하는 것이 필수적이므로, 대장균용 낮은 복제수 플라스미드인 pZC320(참조: Jianpeng S. and Donald P. B., Gene, 146:55-58, 1995)에 증폭된 엑손 유전자를 클로닝한다. pZC320 플라스미드는 대장균에서 세포 당 1 내지 1.4개의 매우 낮은 복제수로 존재하는 플라스미드로서, 대립유전자의 분리를 위한 최적의 플라스미드이며, 다른 낮은 복제수 플라스미드를 사용하면, 대립유전자의 분리가 용이하지 않다. 증폭된 유전자의 클로닝은 제한효소 인지부위를 이용하는 방법을 이용하는 것이 바람직한 바, 엑손 유전자의 증폭에 사용되는 프라이머에 미리 클로닝용으로 많이 사용되는 BamHI, EcoRI, HindIII, XbaI, XhoI 또는 SacI 등의 제한효소 인지부위를 포함시키는 것이 좋다.Next, the amplified exon gene was cloned into the E. coli plasmid. As a result, it is essential to use a plasmid that maintains a very low copy number to effectively isolate heterozygotes when used as a gap vector. Therefore, pZC320 is a low copy number plasmid for E. coli. Cloned amplified exon gene (Jianpeng S. and Donald PB, Gene, 146: 55-58, 1995). The pZC320 plasmid is a plasmid present in E. coli at very low copy numbers of 1 to 1.4 cells, and is an optimal plasmid for the isolation of alleles. Using other low copy number plasmids, the allele isolation is not easy. Cloning of the amplified gene is preferably a method using a restriction enzyme recognition site. Restriction enzymes such as BamHI, EcoRI, HindIII, XbaI, XhoI, or SacI, which are frequently used for cloning the primer used for amplification of the exon gene. It is good to include the cognitive area.
제 2단계: 갭벡터의 작제 Step 2 : construct the gap vector
제 1단계에서 수득한 엑손 유전자가 클로닝된 플라스미드를 주형으로 하고, 엑손 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 50 내지 200bp 서열이 포함되도록 하는 프라이머로 PCR을 수행함으로써 대장균 정지코돈 검정법용 갭벡터를 작제한다: 이때, 엑손 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 서열이 50 내지 200bp 길이로 포함될 경우, 검증할 시료 유전자와 갭벡터를 대장균에 동시 형질전환시 동형재조합이 가능하게 되며, 포함되는 서열이 50bp보다 짧으면 동형재조합이 불가능해지고, 200bp보다 길면 동형재조합에 의한 검정은 가능하나 돌연변이를 확인할 수 있는 유전자의 길이가 그만큼 제한되는 것이므로, 50 내지 200bp 길이의 유전자가 포함되도록 프라이머를 합성하는 것이 바람직하다. 상술한 프라이머 및 엑손 유전자가 클로닝된 플라스미드를 이용하여 PCR을 수행하면, 결과적으로 동형재조합이 일어났을 경우, 대장균내에서 복제가 가능하도록 하는 대장균용 낮은 복제수 플라스미드의 모든 구성요소가 포함되며, 단지 증폭된 엑손 유전자의 5' 말단 50 내지 200bp 서열 및 3' 말단 50 내지 200bp 서열만이 포함되고, 그 사이의 유전자 부분이 제외된 하나의 유전자 절편, 즉, 갭벡터가 수득된다.Using the plasmid cloned with the exon gene obtained in step 1 as a template, PCR was carried out with primers containing 50 to 200 bp sequences of the 5 'and 3' ends of the exon gene, thereby obtaining a gap vector for E. coli stop codon assay. In this case, when the 5 'and 3' end sequences of the exon gene are included in a length of 50 to 200 bp, homologous recombination is possible when co-transfection of E. coli with the sample gene to be verified and the gap vector is performed. If it is shorter than 50bp, homologous recombination is impossible, and if it is longer than 200bp, homologous recombination is possible, but since the length of the gene that can identify mutations is limited so much, it is preferable to synthesize primers to include 50-200bp long genes. Do. Performing PCR with the plasmid cloned with the above-described primers and exon genes results in the inclusion of all components of the low copy number plasmid for Escherichia coli which, when homologous recombination occurs, allows replication within E. coli. One gene segment, i.e., a gapvector, is obtained which contains only the 5 'end 50-200 bp sequence and the 3' end 50-200 bp sequence of the amplified exon gene, excluding the gene portion therebetween.
본 발명에서 수득되는 갭벡터는 대장균 내에서 복제가 가능한 플라스미드를 모두 포함하나, 플라스미드의 사이에 갭이 존재하여 유전자 절편의 형태를 가지게 되므로, 대장균 내로 형질전환시 복제가 일어나지 않으며, 대장균 내에서 갭 부분의 유전자와 상동재조합이 일어날 경우에만 플라스미드로서 복제가 가능하다. 따라서, 본 발명의 갭벡터 또는 갭벡터를 포함하는 미생물을 별도로 기탁하지 않았다.The gap vector obtained in the present invention includes all of the plasmids that can be replicated in E. coli, but since there is a gap between the plasmids to form a gene fragment, replication does not occur when transformed into E. coli, and a gap in E. coli Replication is possible as a plasmid only when homologous recombination with a partial gene occurs. Therefore, the microorganism containing the gap vector or gap vector of this invention was not deposited separately.
제 3단계: 엑손 유전자의 증폭 Step 3 : Amplify Exon Genes
측정할 시료로부터 분리한 RNA 또는 gDNA를 주형으로 하여, 제 1단계에서 증폭된 엑손 부분과 동일한 유전자 절편을 PCR로 증폭시킨다: 이때, 측정할 시료는 이형접합돌연변이의 여부를 측정할 시료로서, APC 또는 BRCA1 유전자의 돌연변이를검정하게 될 시료이다. 개체의 혈액, 세포 또는 이로부터 확립시킨 세포주 등으로부터 분리한 RNA로부터 cDNA를 작제하거나 gDNA를 분리한 다음, 제 1단계에서 증폭시킨 유전자 부위와 같은 유전자 절편, 즉 검정할 유전자가 APC일 경우, 유전자의 엑손 1부터 엑손 14까지의 부분이나 엑손 15 부분을 증폭시키며, 검정할 유전자가 BRCA1일 경우, 유전자의 엑손 2부터 엑손 10까지의 부분, 엑손 11 부분 또는 엑손 12부터 엑손 24까지의 부분을 제 1단계에서 사용한 프라이머 또는 상술한 유전자만을 증폭시킬 수 있는 별도의 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 증폭된 유전자는 아가로오스 젤 전기영동 등으로 순수분리하며, 제 2단계에서 작제된 갭벡터와 함께 제 4단계에서 대장균에 동시 형질전환한다.Using RNA or gDNA isolated from the sample to be measured as a template, the same gene fragment as the exon portion amplified in the first step is amplified by PCR: wherein the sample to be measured is a sample to determine whether there is a heterozygous mutation. Or a sample to be tested for mutations in the BRCA1 gene. Constructing a cDNA or separating gDNA from RNA isolated from the blood, cells or cell lines established therein, and then separating the gDNA and, if the gene fragment to be tested, i.e., the gene to be assayed, is APC Amplifies a portion of exon 1 to exon 14 or exon 15 of the gene, and if the gene to be tested is BRCA1, removes exon 2 to exon 10, exon 11 or exon 12 to exon 24 of the gene. Amplify using the primer used in step 1 or a separate primer that can only amplify the gene described above. The amplified gene is purely separated by agarose gel electrophoresis and the like, and co-transformed into E. coli in the fourth step together with the gap vector constructed in the second step.
제 4단계: 동시 형질전환 Step 4 : Simultaneous transformation
제 2단계에서 작제한 갭벡터와 제 3단계에서 증폭된 엑손 유전자 절편을 대장균에 동시 형질전환시킨다: 이때, 각각의 갭벡터 및 그와 짝을 이루는 유전자 절편을 대장균에 동시 형질전환하게 되면, 대장균 내에서 갭벡터에 포함된 유전자의 5' 및 3' 말단의 50 내지 200bp의 유전자 서열과 유전자 절편에 포함된 동일한 서열의 작용에 의하여 동형재조합이 일어나게 되어 갭벡터가 복제가 가능한 플라스미드로 복구된다. 또한, 복구된 플라스미드로부터 유전자가 해독되게 되므로, 이로부터 돌연변이 여부를 쉽게 판별할 수 있게 된다. 즉, 갭벡터에 포함된 유전자의 3' 말단에는 통상의 lacZ 유전자가 위치하므로, 돌연변이가 발생하지 않은 유전자절편이 갭벡터와 동형재조합되었을 경우, lacZ 유전자가 발현되어 X-gal 및 IPTG가 도말된 미생물 배양 플레이트에서 푸른색 콜로니가 형성되지만, 이형접합 돌연변이가 발생한 유전자 절편이 겝벡터와 동형재조합되면 돌연변이에 의하여 유전자에 프레임쉬프트가 발생하고, 이에 의하여 유전자 내에 정지코돈이 생기므로, lacZ 유전자가 발현되지 않아, X-gal 및 IPTG가 도말된 미생물 배양 플레이트에서 흰색 콜로니가 형성된다. 따라서, 본 발명의 대장균 정지코돈 검정용 갭벡터를 이용할 경우, 동시 형질전환 후에 X-gal 및 IPTG가 도말된 미생물 배양 플레이트에서 생성되는 대장균의 색만을 가지고 유전자의 돌연변이 여부를 신속하고 용이하게 판별할 수 있다.The gap vector constructed in the second step and the exon gene fragment amplified in the third step are co-transformed into E. coli: when each gap vector and the paired gene fragment are co-transformed into E. coli, Homologous recombination occurs by the action of the gene sequence of 50 to 200bp of the 5 'and 3' end of the gene included in the gap vector and the same sequence included in the gene fragment, and the gap vector is restored to a plasmid capable of replication. In addition, since the gene is translated from the recovered plasmid, it is easy to determine whether there is a mutation. That is, since the normal lacZ gene is located at the 3 'end of the gene included in the gap vector, when the gene fragment without mutation is homozygous with the gap vector, the lacZ gene is expressed and the X-gal and IPTG are smeared. Although blue colonies are formed on the microbial culture plate, when the gene fragment having a heterozygous mutation is homozygous for the vector, the mutation causes a frame shift in the gene, thereby causing a stop codon in the gene, thereby expressing the lacZ gene. Thus, white colonies form in microbial culture plates smeared with X-gal and IPTG. Therefore, when using the gap vector for E. coli stop codon assay of the present invention, it is possible to quickly and easily determine whether the gene is mutated only by the color of E. coli generated in the microbial culture plate smeared with X-gal and IPTG after simultaneous transformation. Can be.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .
실시예 1: APC 유전자 돌연변이 ESC 검정법용 갭벡터의 작제 Example 1 Construction of GapVector for APC Gene Mutation ESC Assay
실시예 1-1: 대장균용 낮은 복제수 벡터에 APC 유전자 클로닝 Example 1-1 Cloning of APC Gene into a Low Copy Number Vector for Escherichia Coli
APC 유전자 돌연변이 ESC 검정법용 갭벡터 제조시, PCR 반응의 주형으로 이용하게 될 플라스미드를 작제하기 위하여, APC 유전자의 엑손 1부터 엑손 14까지에 해당하는 APC 유전자의 서열번호 19부터 1977까지를 대장균용 낮은 복제수 플라스미드에 클로닝하였으며, 또한, APC 유전자의 엑손 15의 일부인 APC 유전자의 서열번호 1978부터 5266까지의 절편을 대장균용 낮은 복제수 플라스미드에 클로닝하였다:In order to construct a plasmid to be used as a template for PCR reactions in preparing a gap vector for the APC gene mutant ESC assay, sequence numbers 19 to 1977 of the APC genes corresponding to exon 1 to exon 14 of the APC gene were lowered for E. coli. Cloned to a copy number plasmid, and also the fragments from SEQ ID NOs 1978 to 5266 of the APC gene that are part of exon 15 of the APC gene were cloned into the low copy number plasmid for E. coli:
우선, APC 유전자의 엑손 1부터 엑손 14까지의 절편에 해당하는 APC 유전자의 서열번호 19부터 1977까지를 낮은 복제수 벡터에 클로닝하기 위하여, 프라이머 APC-a5Xh: 5'-CCGCTCGAGATGGCTGCAGCTTCATATG-3'(참조: 서열번호 1) 및 프라이머 APC-a3Ba: 5'-CGGGATCCCTGTGGTCCTCATTTGTAGC-3'(참조: 서열번호 2)를 합성하였으며, 우선 HCT116 세포주로부터 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR을 통하여 증폭하였다: 세포주로부터 TriZOL(GIBCO-BRL, U.S.A.)을 사용하여 전체 RNA를 분리한 다음, RT-PCR은 RNA LA PCR 키트(Takara, Japan)를 사용하여 실시하였는 바, 먼저 25mM MgCl24㎕, 10X RNA PCR 완충용액(100mM Tris-HCl (pH 8.3), 500mM KCl) 2㎕, 10mM dNTP 용액 2㎕, 40units/㎕ RNase 억제제 0.5㎕, 5 units/㎕ AMV 역전사 효소 XL 1㎕, oligo d(T)-adaptor 프라이머 1㎕ 및 주형으로서 RNA 400ng을 사용하고, 증류수로 전체 반응양이 20㎕가 되도록 하여 잘 혼합한 다음, 30℃ 10분, 42℃ 40분 및 99℃ 5분으로 1회 반응을 실시하여 cDNA를 합성하였다. 다음으로, APC 유전자의 증폭을 위해 합성된 전기 cDNA 산물 20㎕에 25mM MgCl26㎕, 10X LA PCR 완충용액Ⅱ 8㎕, 멸균수 65.1㎕, TaKaRaExTaq0.5㎕와, 각 10pmol 농도의 APC-a5Xh 및 APC-a3Ba프라이머를 각각 2㎕씩 첨가하여 잘 혼합한 후, 총 100 ㎕의 반응액을 94℃에서 5분동안 변성한 후, 94℃ 30초, 56℃ 30초 및 72℃ 1분인 사이클로 30회 PCR하였다. 증폭된 산물의 크기는 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)를 포함하는 1.5아가로스 젤에 전기영동하여 확인하였으며, 이 산물을 XhoI과 BamHI으로 절단한 후, GENECLEAN Ⅱ 키트(Bio101, U.S.A.)를 사용하여 순수분리하고, 이 절편을 'APC-a'라 명명하였다.First, primers APC-a5Xh: 5'-CCGCTCGAGATGGCTGCAGCTTCATATG-3 '(cloning) for cloning SEQ ID Nos. 19 to 1977 of the APC gene corresponding to segments from exon 1 to exon 14 of the APC gene into low copy number vectors. SEQ ID NO: 1) and Primer APC-a3Ba: 5'-CGGGATCCCTGTGGTCCTCATTTGTAGC-3 '(see SEQ ID NO: 2) were synthesized and first, total RNA was isolated from HCT116 cell line and amplified by RT-PCR: TriZOL (GIBCO) from cell line -BRL, USA) was used to isolate the total RNA, RT-PCR was performed using the RNA LA PCR kit (Takara, Japan), first 25mM MgCl24 μl, 10 μl RNA PCR buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl) 2 μl, 2 μm 10 mM dNTP solution, 40 μl / μl RNase inhibitor 0.5 μl, 5 units / μl AMV reverse transcriptase XL 1 μl, oligo 1 μl of d (T) -adaptor primer and 400 ng of RNA were used as a template, and the mixture was mixed well with 20 μl of distilled water, followed by mixing at 30 ° C. for 10 minutes, 42 ° C. for 40 minutes, and 99 ° C. for 5 minutes. CDNA was synthesized by one time reaction. Next, 25 mM MgCl in 20 µl of the synthesized electric cDNA product for amplification of the APC gene.26 μl, 10 × LA PCR Buffer II 8 μl, sterile water 65.1 μl, TaKaRaExTaq0.5 [mu] l and APC-a5Xh and APC-a3Ba primers at 10 pmol concentration After adding 2 μl each and mixing well, total 100 μl of the reaction solution was denatured at 94 ° C. for 5 minutes, and then PCR was performed 30 times in cycles of 94 ° C. 30 seconds, 56 ° C. 30 seconds, and 72 ° C. 1 minute. The size of the amplified product was confirmed by electrophoresis on 1.5 agarose gel containing ethidium bromide, and the product was digested with XhoI and BamHI and purified using GENECLEAN II kit (Bio101, USA). Were separated and named this fragment 'APC-a'.
한편, APC 유전자의 엑손 15의 일부에 해당하는 APC 유전자의 서열번호 1978부터 5266까지를 대장균용 낮은 복제수 벡터에 클로닝하기 위하여, 프라이머 APC-b5Xh: 5'-CCGCTCGAGCAAATCCTAAGAGAGAACAAC-3'(참조: 서열번호 3) 및 프라이머 APC-b3Ba: 5'-CGGGATCCTGGTCCATTATCTTTTTCAC-3'(참조: 서열번호 4)를 합성하였으며, 정상인으로부터 추출한 gDNA를 주형으로 하는 PCR을 수행하였다: gDNA 1㎍를 주형으로 하여, 프라이머 APC-b5Xh 및 APC-b3Ba를 각각 20pmol의 농도로 첨가하였고, 5㎕의 10X 반응완충용액(100mM Tris-HCl(pH 8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl2)과 Ex.Taq중합효소(Takara, Japan) 2.5unit을 첨가한 다음, 부피를 50㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 이 반응액을 94℃에서 5분동안 변성(denaturation)시킨 다음, 94℃에서 30초간 변성(denaturation), 58℃에서 30초간 혼성화(annealing) 및 72℃에서 2분간 신장(extension)시키는 과정을 30회 반복시키고, 마지막으로 72℃에서 5분간 방치하여 후반응시켰다. 증폭된 산물의 크기는 에티디움브로마이드(ethidium bromide)를 포함하는 1.5아가로스 젤에 전기영동 하여 확인하였으며, 이 산물을 XhoI과 BamHI으로 절단한 후, GENECLEAN Ⅱ 키트(Bio101, U.S.A.)를 사용하여 순수분리하고, 이 절편을 'APC-b'라 명명하였다.On the other hand, primers APC-b5Xh: 5'-CCGCTCGAGCAAATCCTAAGAGAGAACAAC-3 '(cf. 3) and primer APC-b3Ba: 5'-CGGGATCCTGGTCCATTATCTTTTTCAC-3 '(see SEQ ID NO: 4) were synthesized, and PCR was performed using gDNA as a template from normal persons: 1 μg gDNA was used as a template, and primer APC- b5Xh and APC-b3Ba were added at a concentration of 20 pmol, respectively, and 5 μl of 10 × reaction buffer solution (100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 ) and Ex. 2.5 units of Taq polymerase (Takara, Japan) were added, followed by addition of sterile distilled water to a volume of 50 μl. The reaction solution was denatured at 94 ° C. for 5 minutes, then denatured at 94 ° C. for 30 seconds, hybridized at 58 ° C. for 30 seconds, and extended at 72 ° C. for 2 minutes. The reaction was repeated several times, and finally, it was left to stand at 72 DEG C for 5 minutes to react afterwards. The size of the amplified product was confirmed by electrophoresis on 1.5 agarose gel containing ethidium bromide. The product was digested with XhoI and BamHI and purified using GENECLEAN II kit (Bio101, USA). Were separated and named this fragment 'APC-b'.
다음으로, 전기 APC-a 및 APC-b를 클로닝할 대장균용 낮은 복제수 플라스미드로서 pZC320를 선택하였으며(참조: 도 2), pZC320의lacZ유전자 내에 위치한 다중클로닝사이트(multiple cloning site, MCS) 중 XhoI 및 BamHI 부위를 절단하여, APC-a 및 APC-b와 각각 연결반응(ligation)시키고, 대장균인 E.coli DH5α에 도입한 다음, 각각으로부터 파란색 콜로니를 선별하여 플라스미드 DNA를 분리하고, APC-a 절편이 클로닝된 플라스미드를 'pAPC-a' 및 APC-b 절편이 클로닝된 플라스미드를 'pAPC-b'라 명명하였다. 마지막으로, 각각의 분리된 플라스미드 pAPC-a 및 pAPC-b를 제한효소 XhoI 및 BamHI으로 절단하고, 1.5아가로오스 젤에 전기영동으로 전개시켜 절단된 절편을 확인하였다(참조: 도 3 및 도 4). 도 3에서, 제 1레인은 HindIII 처리된 λDNA 분자량 마커; 제 2레인은 XhoI 및 BamHI 절단된 pZC320 플라스미드; 제 3레인은 APC-a 절편; 및, 제 4레인은 XhoI 및 BamHI 절단된 pAPC-a 플라스미드를 나타낸다. 또한, 도 4에서, 제 1레인은 HindIII 처리된 λDNA 분자량 마커; 제 2레인은 XhoI 및 BamHI 절단된 pZC320 플라스미드; 제 3레인은 APC-b 절편; 및, 제 4레인은 XhoI 및 BamHI 절단된 pAPC-b 플라스미드를 나타낸다. 도 3 및 도 4에서 보듯이, APC-a 및 APC-b 절편은 대장균용 낮은 복제수 플라스미드인 pZC320에 각각 성공적으로 클로닝되었음을 확인하였다.Next, pZC320 was selected as the low copy number plasmid for Escherichia coli to clone the electric APC-a and APC-b (see FIG. 2).lacZThe XhoI and BamHI sites in the multiple cloning site (MCS) located in the gene were cleaved to ligation with APC-a and APC-b, respectively. Introduced into E. coli DH5α, blue colonies were isolated from each other to isolate plasmid DNA, and plasmids cloned with APC-a fragments were cloned into 'pAPC-a' and plasmids cloned with APC-b fragments from 'pAPC'. It was named -b '. Finally, each of the isolated plasmids pAPC-a and pAPC-b was digested with restriction enzymes XhoI and BamHI and subjected to electrophoresis on a 1.5 agarose gel to confirm the cleaved sections (see FIGS. 3 and 4). ). In Figure 3, the first lane is HindIII treated lambda DNA molecular weight marker; The second lane comprises XhoI and BamHI cleaved pZC320 plasmid; The third lane comprises an APC-a fragment; And lane 4 represents XhoI and BamHI cleaved pAPC-a plasmids. In addition, in Figure 4, the first lane is HindIII treated lambda DNA molecular weight marker; The second lane comprises XhoI and BamHI cleaved pZC320 plasmid; The third lane comprises an APC-b fragment; And lane 4 represents XhoI and BamHI cleaved pAPC-b plasmids. As shown in Figures 3 and 4, it was confirmed that APC-a and APC-b fragments were successfully cloned into pZC320, a low copy number plasmid for Escherichia coli, respectively.
실시예 1-2: APC용 갭벡터의 작제 Example 1-2 Construction of Gap Vector for APC
실시예 1-1에서 수득한 pAPC-a 및 pAPC-b를 주형으로 하는 PCR을 수행하여, APC-a의 일부분으로서, 5' 말단이 APC 유전자의 서열번호 19부터 153을 포함하고, 3' 말단이 APC 유전자의 서열번호 1828부터 1977까지를 포함하는 갭벡터 및 APC-b의 일부분으로서, 5' 말단이 APC 유전자의 서열번호 1978부터 2163을 포함하고, 3' 말단이 APC 유전자의 서열번호 5089부터 5266까지를 포함하는 갭벡터를 작제하였다: 우선, pAPC-a를 주형으로 수행할 PCR에 대한 프라이머로서, 프라이머 AV-a5: 5'-CTTCATATTAGATGCCTC-3'(참조: 서열번호 5) 및 프라이머 AV-a3: 5'-GCTGATATATGTGCTGTAG-3'(참조: 서열번호 6)를 합성하였으며, pAPC-b를 주형으로 수행할 PCR에 대한 프라이머로서, 프라이머 AV-b5: 5'-GTGCTTTGAATGAATGAG-3'(참조: 서열번호 7) 및 프라이머 AV-b3: 5'-CCTACAGAAGGCAGAAGT-3'(참조: 서열번호 8)를 합성하였다. 다음으로, pAPC-a를 주형으로 이용하는 PCR의 경우, pAPC-a DNA 1㎍ 및 프라이머 AV-a5와 AV-a3를 각각 20pmol의 농도로 첨가하였고, 5㎕의 10X 반응완충용액, 각 2.5mM dNTP 혼합물 8 ㎕를 넣은 다음, 부피 47.75㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 이 반응액을 98℃에서 5분간 변성시킨 후, Ex.Taq중합효소(Takara, Japan) 2.5unit을 첨가하고, 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30 초간 혼성화 및 72℃에서 3분간 신장시키는 과정을 30회 반복 수행하고, 72℃에서 10분간 방치하여 후반응시켰다. 또한, pAPC-b를 주형으로 이용하는 PCR의 경우,주형으로서 pAPC-b 및 프라이머로서 AV-b5와 AV-b3를 사용하는 것을 제외하고는 상술한 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.PCR using pAPC-a and pAPC-b obtained in Example 1-1 as a template was carried out, and as part of APC-a, the 5 'end comprises SEQ ID NOs: 19 to 153 of the APC gene, and the 3' end. As a part of the gap vector and APC-b which include SEQ ID NOs: 1828 to 1977 of this APC gene, the 5 'end includes SEQ ID NOs 1978 to 2163 of the APC gene, and the 3' end is SEQ ID NO: 5089 of the APC gene. A gapvector comprising up to 5266 was constructed: First, primers AV-a5: 5'-CTTCATATTAGATGCCTC-3 '(see SEQ ID NO: 5) and primers AV- as primers for PCR to perform pAPC-a as a template a3: 5'-GCTGATATATGTGCTGTAG-3 '(see SEQ ID NO: 6) was synthesized, and as primer for PCR to perform pAPC-b as a template, primer AV-b5: 5'-GTGCTTTGAATGAATGAG-3' (see sequence) Number 7) and primer AV-b3: 5'-CCTACAGAAGGCAGAAGT-3 '(see SEQ ID NO: 8). Next, for PCR using pAPC-a as a template, 1 μg of pAPC-a DNA and primers AV-a5 and AV-a3 were added at a concentration of 20 pmol, respectively, 5 μl of 10X reaction buffer solution, 2.5 mM dNTP each. 8 μl of the mixture was added, followed by addition of sterile distilled water to a volume of 47.75 μl. The reaction solution was denatured at 98 ° C. for 5 minutes, and then Ex. 2.5 units of Taq polymerase (Takara, Japan) were added, followed by 30 cycles of denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, hybridization at 58 ° C. for 30 seconds, and extension at 72 ° C. for 30 minutes, and left at 72 ° C. for 10 minutes. After reaction. In addition, in the case of PCR using pAPC-b as a template, PCR was performed in the same manner as described above, except that pAPC-b as a template and AV-b5 and AV-b3 as primers were used.
상술한 PCR에 의하여 두가지의 갭벡터가 만들어졌는 바, pAPC-a를 주형으로 사용하여 작제된 갭벡터를 'AV-a' 및 pAPC-b를 주형으로 사용하여 작제된 갭벡터를 'AV-b'로 각각 명명하였다(참조: 도 5). 도 5에는 APC 유전자 돌연변이 ESC 검정법용 갭벡터인 AV-a 및 AV-b의 모식도를 나타내었다.Two gap vectors were produced by the above-described PCR. As a result, a gap vector constructed using pAPC-a as a template and 'AV-b' as a template was used as 'AV-b'. Each named '(see FIG. 5). 5 shows a schematic diagram of AV-a and AV-b, which are gap vectors for the APC gene mutant ESC assay.
실시예 2: BRCA1 유전자 돌연변이 ESC 검정법용 갭벡터의 작제 Example 2 Construction of GapVector for BRCA1 Gene Mutation ESC Assay
실시예 2-1: 대장균용 낮은 복제수 벡터에 BRCA1 유전자 클로닝 Example 2-1 Cloning the BRCA1 Gene into a Low Copy Number Vector for Escherichia Coli
BRCA1 유전자 돌연변이 ESC 검정법용 갭벡터 제조시, PCR 반응의 주형으로 이용하게 될 플라스미드를 작제하기 위하여, BRCA1 유전자의 엑손 2부터 엑손 10까지의 절편에 해당하는 BRCA1 유전자의 서열번호 104부터 904; BRCA1 유전자의 엑손 11 부위에 해당하는 BRCA1 유전자의 서열번호 789부터 4217; 및, BRCA1 유전자의 엑손 12부터 엑손 24까지의 절편에 해당하는 BRCA1 유전자의 서열번호 4089부터 5704를 각각 대장균용 낮은 복제수 플라스미드 pZC320에 클로닝하였다:BRCA1 gene mutants SEQ ID NOs: 104 to 904 of the BRCA1 gene corresponding to segments from exon 2 to exon 10 of the BRCA1 gene to construct a plasmid to be used as a template for PCR reactions in preparing a gap vector for the ESC assay; SEQ ID NOs: 789 to 4217 of the BRCA1 gene corresponding to the exon 11 site of the BRCA1 gene; And SEQ ID NOs: 4089 to 5704 of the BRCA1 gene corresponding to segments from exon 12 to exon 24 of the BRCA1 gene were cloned into the low copy number plasmid pZC320 for E. coli, respectively:
우선, BRCA1 유전자의 엑손 2 내지 엑손 10까지의 절편에 해당하는 BRCA1 유전자의 서열번호 104부터 904까지의 유전자를 pZC320에 클로닝하기 위하여, 프라이머 BRCA1-a5Xh: 5'-CCGCTCGAGAGTTCATTGGAACAGAAAG-3'(참조: 서열번호 9) 및 프라이머 BRCA1-a3H: 5'-CCCAAGCTTGATACTTTTCTGGATGCCT-3'(참조: 서열번호 10)를 합성하였으며, HBL-100 세포주로부터 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR을 통하여 증폭하여 cDNA를 합성하였다. 다음으로, 전기 cDNA 산물 20㎕에 25mM MgCl26㎕, 10X LA PCR 완충용액Ⅱ 8㎕, 멸균수 65.1㎕, TaKaRaExTaq0.5㎕와, 각 10pmol 농도의 BRCA1-a5Xh 및 BRCA1-a3H 프라이머를 각각 2㎕씩 첨가하여 잘 혼합한 후, 총 100 ㎕의 반응액을 94℃에서 5분동안 변성한 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 30초인 사이클로 30회 PCR하였다. 증폭된 산물의 크기는 에티디움 브로마이드를 포함하는 1.5아가로스 젤에 전기영동하여 확인하였으며, 이 산물을 XhoI과 BamHI으로 절단한 후, GENECLEAN Ⅱ 키트(Bio101, U.S.A.)를 사용하여 순수분리하고, 이 절편을 'BRCA1-a'라 명명하였다.First, the primers BRCA1-a5Xh: 5'-CCGCTCGAGAGTTCATTGGAACAGAAAG-3 '(see: No. 9) and primers BRCA1-a3H: 5'-CCCAAGCTTGATACTTTTCTGGATGCCT-3 '(see SEQ ID NO: 10) were synthesized, and total RNA was isolated from HBL-100 cell line and amplified by RT-PCR to synthesize cDNA. Next, 25 mM MgCl in 20 µl of the cDNA product26 μl, 10 × LA PCR Buffer II 8 μl, sterile water 65.1 μl, TaKaRaExTaq0.5 μl and BRCA1-a5Xh and BRCA1-a3H primers at 10 pmol concentration After adding 2 μl each to mix well, a total of 100 μl of the reaction solution was denatured at 94 ° C. for 5 minutes, and then PCR was performed 30 times in cycles of 94 ° C. 30 seconds, 55 ° C. 30 seconds, and 72 ° C. 30 seconds. The size of the amplified product was confirmed by electrophoresis on 1.5 agarose gel containing ethidium bromide. The product was digested with XhoI and BamHI, and then purified using GENECLEAN II kit (Bio101, USA). The intercept was named 'BRCA1-a'.
한편, BRCA1 유전자의 엑손 11 부위에 해당하는 BRCA1 유전자의 서열번호 789부터 4217까지의 유전자를 pZC320 벡터에 클로닝하기 위하여, 프라이머 BRCA1-b5Xh: 5'-CCGCTCGAGGCTGCTTGTGAATTTTCTG-3'(참조: 서열번호 11) 및 프라이머 BRCA1-b3H: 5'-CCCAAGCTTTTGAATCCATGCTTTGCTC-3'(참조: 서열번호 12)를 합성하였으며, HBL-100 세포주로부터 추출한 gDNA를 주형으로 하는 PCR을 수행하였다: gDNA 1㎍를 주형으로 하여, 프라이머 BRCA1-b5Xh 및 BRCA1-b3H를 각각 20pmol의 농도로 첨가하였고, 5㎕의 10X 반응완충용액(100mM Tris-HCl(pH 8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl2)과 Ex.Taq중합효소(Takara, Japan) 2.5unit을 첨가한 다음, 부피를 50㎕가되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 이 반응액을 94℃에서 5분동안 변성시킨 다음, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 혼성화 및 72℃에서 1분 30초간 신장시키는 과정을 30회 반복시키고, 마지막으로 72℃에서 5분간 방치하여 후반응시켰다. 증폭된 산물의 크기는 에티디움 브로마이드를 포함하는 1.5아가로스 젤에 전기영동하여 확인하였으며, 이 산물을 XhoI과 BamHI으로 절단한 후, GENECLEAN Ⅱ 키트(Bio101, U.S.A.)를 사용하여 순수분리하고, 이 절편을 'BRCA1-b'라 명명하였다. 또한, BRCA1 유전자의 엑손 12에서 엑손 24 까지의 절편에 해당하는 BRCA1 유전자의 서열번호 4089부터 5704까지의 유전자를 pZC320 벡터에 클로닝하기 위하여, 상기의 방법과 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하고, 수득된 cDNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, 사용한 프라이머는 각각 BRCA1-c5Xh: 5'-CCGCTCGAGATGAGGCATCAGTCTGAA-3'(참조: 서열번호 13) 및 BRCA1-c3H: 5'-CCCAAGCTTGGCTGTGGGGGATCTGGGG-3'(참조: 서열번호 14)이었으며, PCR 반응은 94℃ 5분으로 변성한 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 1분 30초인 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 증폭된 산물의 크기는 에티디움 브로마이드를 포함하는 1.5아가로스 젤에 전기영동하여 확인하였으며, 이 산물을 XhoI과 BamHI으로 절단한 후, GENECLEAN Ⅱ 키트(Bio101, U.S.A.)를 사용하여 순수분리하고, 이 절편을 'BRCA1-c'라 명명하였다.On the other hand, primers BRCA1-b5Xh: 5'-CCGCTCGAGGCTGCTTGTGAATTTTCTG-3 '(see SEQ ID NO: 11) to clone the genes of the BRCA1 gene corresponding to the exon 11 site of the BRCA1 gene from SEQ ID NOs: 789 to 4217 to the pZC320 vector; Primer BRCA1-b3H: 5'-CCCAAGCTTTTGAATCCATGCTTTGCTC-3 '(see SEQ ID NO: 12) was synthesized, and PCR was performed using a template of gDNA extracted from HBL-100 cell line: 1 μg gDNA as a template and primer BRCA1- b5Xh and BRCA1-b3H were each added at a concentration of 20 pmol, and 5 μl of 10 × reaction buffer solution (100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 ) and Ex. 2.5 units of Taq polymerase (Takara, Japan) were added, followed by addition of sterile distilled water to a volume of 50 μl. The reaction solution was denatured at 94 ° C. for 5 minutes, then denatured at 94 ° C. for 30 seconds, hybridized at 55 ° C. for 30 seconds, and elongated at 72 ° C. for 1 minute and 30 seconds, and finally, at 5 ° C. at 5 ° C. The reaction was left to stand for a minute and then reacted. The size of the amplified product was confirmed by electrophoresis on 1.5 agarose gel containing ethidium bromide. The product was digested with XhoI and BamHI, and then purified using GENECLEAN II kit (Bio101, USA). The intercept was named 'BRCA1-b'. In addition, RT-PCR was carried out by the same method as above to obtain and clone the genes from SEQ ID NOs: 4089 to 5704 of the BRCA1 gene corresponding to fragments of exon 12 to exon 24 of the BRCA1 gene in the pZC320 vector. PCR was performed using the cDNA. The primers used were BRCA1-c5Xh: 5'-CCGCTCGAGATGAGGCATCAGTCTGAA-3 '(see SEQ ID NO: 13) and BRCA1-c3H: 5'-CCCAAGCTTGGCTGTGGGGGATCTGGGG-3' (Reference: SEQ ID NO: 14), respectively, and the PCR reaction was 94 ° C. After denaturation in 5 minutes, cycles of 94 ° C 30 seconds, 55 ° C 30 seconds, and 72 ° C 1 minute 30 seconds were repeated 30 times. The size of the amplified product was confirmed by electrophoresis on 1.5 agarose gel containing ethidium bromide. The product was digested with XhoI and BamHI, and then purified using GENECLEAN II kit (Bio101, USA). The intercept was named 'BRCA1-c'.
다음으로, 전기 BRCA1-a, BRCA1-b 및 BRCA1-c를 pZC320에 클로닝하기 위하여, pZC320의lacZ유전자 내에 위치한 다중클로닝사이트 중 XhoI 및 BamHI 부위를절단하여, BRCA1-a, BRCA1-b 및 BRCA1-c와 각각 연결반응시키고, 대장균 E.coli DH5α에 도입한 다음, 각각으로부터 파란색 콜로니를 선별하여 플라스미드 DNA를 분리하고, BRCA1-a 절편이 클로닝된 플라스미드를 'pBRCA1-a'; BRCA1-b 절편이 클로닝된 플라스미드를 'pBRCA1-b' 및 BRCA1-c 절편이 클로닝된 플라스미드를 'pBRCA1-c'라 각각 명명하였다. 마지막으로, 각각의 분리된 플라스미드를 제한효소 XhoI 및 BamHI으로 절단하고, 1.5아가로오스 젤에 전기영동으로 전개시켜 절단된 절편을 확인하였다(참조: 도 6). 도 6에서, 제 1레인은 HindIII 처리된 λDNA 분자량 마커; 제 2레인은 XhoI 및 BamHI 절단된 pZC320 플라스미드; 제 3레인은 BRCA1-a 절편; 제 4레인은 BRCA1-b 절편; 제 5레인은 BRCA1-c 절편; 제 6레인은 XhoI 및 BamHI 절단된 pBRCA1-a 플라스미드; 제 7레인은 XhoI 및 BamHI 절단된 pBRCA1-b 플라스미드; 및, 제 8레인은 XhoI 및 BamHI 절단된 pBRCA1-c 플라스미드를 나타낸다. 도 6에서 보듯이, BRCA1-a, BRCA1-b 및 BRCA1-c 절편은 대장균용 낮은 복제수 플라스미드인 pZC320에 각각 성공적으로 클로닝되었음을 확인하였다.Next, to clone the electric BRCA1-a, BRCA1-b and BRCA1-c into pZC320,lacZThe XhoI and BamHI sites in the multiple cloning site located in the gene were cut and ligated with BRCA1-a, BRCA1-b and BRCA1-c, respectively. Introduced into E. coli DH5α, blue colonies were selected from each to separate plasmid DNA, and the plasmid cloned with the BRCA1-a fragment was 'pBRCA1-a'; The plasmid cloned with the BRCA1-b fragment was named 'pBRCA1-b' and the plasmid cloned with the BRCA1-c fragment was named 'pBRCA1-c', respectively. Finally, each isolated plasmid was digested with restriction enzymes XhoI and BamHI and subjected to electrophoresis on a 1.5 agarose gel to confirm the cleaved sections (see Figure 6). In Figure 6, the first lane is HindIII treated lambda DNA molecular weight marker; The second lane comprises XhoI and BamHI cleaved pZC320 plasmid; The third lane comprises the BRCA1-a fragment; The fourth lane comprises the BRCA1-b fragment; Lane 5 is a BRCA1-c fragment; Lane 6 includes XhoI and BamHI cleaved pBRCA1-a plasmids; Lane 7 includes XhoI and BamHI cleaved pBRCA1-b plasmids; And lane 8 represents XhoI and BamHI cleaved pBRCA1-c plasmids. As shown in FIG. 6, it was confirmed that the BRCA1-a, BRCA1-b and BRCA1-c fragments were successfully cloned into pZC320, a low copy number plasmid for Escherichia coli, respectively.
실시예 2-2: BRCA1용 갭벡터의 작제 Example 2-2 Construction of a Gap Vector for BRCA1
실시예 2-1에서 수득한 pBRCA1-a, pBRCA1-b 및 pBRCA1-c를 주형으로 하는 PCR을 수행하여, BRCA1-a의 일부분으로서, 5' 말단이 BRCA1 유전자의 서열번호 99부터 203을 포함하고, 3' 말단이 BRCA1 유전자의 서열번호 798부터 903까지를 포함하는 갭벡터; BRCA1-b의 일부분으로서, 5' 말단이 BRCA1 유전자의 서열번호 789부터 932까지를 포함하고, 3' 말단이 BRCA1 유전자의 서열번호 4063부터 4217까지를 포함하는 갭벡터; 및, BRCA1-c의 일부분으로서, 5' 말단이 BRCA1 유전자의 서열번호 4089부터 4217을 포함하고, 3' 말단이 BRCA1 유전자의 서열번호 5619부터 5704까지를 포함하는 갭벡터를 작제하였다: 우선, pBRCA1-a를 주형으로 수행할 PCR에 대한 프라이머로서, 프라이머 BV-a5: 5'-CAGACAGATGGGACACTC-3'(참조: 서열번호 15) 및 프라이머 BV-a3: 5'-GAATTTTCTGAGACGGATGTA-3'(참조: 서열번호 16)를 합성하였으며, pBRCA1-b를 주형으로 수행할 PCR에 대한 프라이머로서, 프라이머 BV-b5: 5'-CACATGCAAGTTTGAAAC-3'(참조: 서열번호 17) 및 프라이머 BV-b3: 5'-TTCTTGATTGGTTCTTCC-3'(참조: 서열번호 18)를 합성하고, pBRCA1-c를 주형으로 수행할 PCR에 대한 프라이머로서, 프라이머 BV-c5: 5'-ACCTAAGTTTGAATCCATGCT-3'(참조: 서열번호 19) 및 프라이머 BV-c3: 5'-ACCCGAGAGTGGGTGTTG-3'(참조: 서열번호 20)를 합성하였다. 다음으로, 각각의 주형 및 프라이머쌍를 포함하는 PCR 반응액을 준비하여, 주형 DNA 1㎍ 및 프라이머쌍 각각 20pmol의 농도를 첨가하였고, 5㎕의 10X 반응완충용액, 각 2.5mM dNTP 혼합물 8 ㎕를 넣은 다음, 부피 47.75㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 이 반응액을 98℃에서 5분간 변성시킨 후, Ex.Taq중합효소(Takara, Japan) 2.5unit을 첨가하고, 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30 초간 혼성화 및 72℃에서 3분간 신장시키는 과정을 30회 반복 수행하고, 72℃에서 10분간 방치하여 후반응시켰다.PCR using pBRCA1-a, pBRCA1-b and pBRCA1-c as a template obtained in Example 2-1 was carried out, and as a part of BRCA1-a, the 5 'end comprises SEQ ID NOs 99 to 203 of the BRCA1 gene; , A gap vector whose 3 ′ end comprises SEQ ID NOs: 798 to 903 of the BRCA1 gene; As part of BRCA1-b, a gap vector whose 5 'end comprises SEQ ID NOs: 789 to 932 of the BRCA1 gene and the 3' end comprises SEQ ID NOs: 4063 to 4217 of the BRCA1 gene; And, as part of BRCA1-c, a gap vector was constructed wherein the 5 'end comprises SEQ ID NOs: 4089 to 4217 of the BRCA1 gene and the 3' end comprises SEQ ID NOs: 5619 to 5704 of the BRCA1 gene: First, pBRCA1 As primers for PCR to perform -a as a template, primers BV-a5: 5'-CAGACAGATGGGACACTC-3 '(see SEQ ID NO: 15) and primers BV-a3: 5'-GAATTTTCTGAGACGGATGTA-3' (see SEQ ID NO: 16) was synthesized and primers BV-b5: 5'-CACATGCAAGTTTGAAAC-3 '(see SEQ ID NO: 17) and primers BV-b3: 5'-TTCTTGATTGGTTCTTCC- as primers for PCR to perform pBRCA1-b as a template Primers BV-c5: 5'-ACCTAAGTTTGAATCCATGCT-3 '(see SEQ ID NO: 19) and primer BV- as primers for PCR to synthesize 3' (see SEQ ID NO: 18) and perform pBRCA1-c as a template. c3: 5'-ACCCGAGAGTGGGTGTTG-3 '(see SEQ ID NO: 20) was synthesized. Next, a PCR reaction solution containing each template and primer pairs was prepared, and a concentration of 1 μg of template DNA and 20 pmol of each primer pair was added, and 5 μl of 10 × reaction buffer solution and 8 μl of each 2.5 mM dNTP mixture were added thereto. Next, sterile distilled water was added to a volume of 47.75 mu l. The reaction solution was denatured at 98 ° C. for 5 minutes, and then Ex. 2.5 units of Taq polymerase (Takara, Japan) were added, followed by 30 cycles of denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, hybridization at 58 ° C. for 30 seconds, and extension at 72 ° C. for 30 minutes, and left at 72 ° C. for 10 minutes. After reaction.
상술한 PCR에 의하여 세가지의 갭벡터가 만들어졌는 바, pBRCA1-a를 주형으로 사용하여 작제된 갭벡터를 'BV-a', pBRCA1-b를 주형으로 사용하여 작제된 갭벡터를 'BV-b' 및 pBRCA1-c를 주형으로 사용하여 작제된 갭벡터를 'BV-c' 각각 명명하였다(참조: 도 7). 도 7에는 BRCA1 유전자 돌연변이 ESC 검정법용 갭벡터인 BV-a, BV-b 및 BV-c의 모식도를 나타내었다.Three gap vectors were prepared by the above-described PCR. As a result, a gap vector constructed using pBRCA1-a as a template was used as 'BV-a' and pBRCA1-b was used as a template. The gap vectors constructed using 'and pBRCA1-c as templates were named' BV-c 'respectively (see FIG. 7). Figure 7 shows a schematic of the gap vectors BV-a, BV-b and BV-c for BRCA1 gene mutant ESC assay.
실시예 1 및 실시예 2에서 작제된 갭벡터를 아가로오스 젤에 전기영동으로 전개시켰는 바, 이 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서, 제 1레인은 HindIII 처리된 λDNA 분자량 마커; 제 2레인은 갭벡터 AV-a; 제 3레인은 갭벡터 AV-b; 제 4레인은 갭벡터 BV-a; 제 5레인은 갭벡터 BV-b; 및, 제 6레인은 갭벡터 BV-c를 나타낸다.The gap vectors constructed in Examples 1 and 2 were electrophoretically developed on the agarose gel, and the results are shown in FIG. 8. In Figure 8, the first lane is HindIII treated λDNA molecular weight marker; The second lane comprises a gap vector AV-a; The third lane comprises a gap vector AV-b; The fourth lane comprises a gap vector BV-a; The fifth lane comprises a gap vector BV-b; And the sixth lane represents a gap vector BV-c.
실시예 3: 갭벡터를 이용한 APC 유전자의 이형접합 돌연변이의 측정 Example 3 Measurement of Heterozygous Mutations in APC Genes Using Gap Vectors
실시예 3-1: APC 유전자의 증폭 Example 3-1 Amplification of APC Gene
갭벡터와 동시 형질전환을 함으로써, 대장균 정지코돈 검정법에 의하여 이형접합 돌연변이를 측정하는데 사용될 APC 유전자인 APC-a 절편 및 APC-b 절편을 PCR로 증폭하였다: 갭벡터 AV-a와 동시 형질전환시킬 APC 유전자의 엑손 1에서 엑손 14번까지의 유전자인 APC-a 절편을 증폭시키기 위하여, 프라이머 APC-a5Xh 및 APC-a3Ba를 사용하였으며, 갭벡터 AV-b와 동시 형질전환시킬 APC 유전자의 엑손 15의 일부분인 APC-b 절편을 증폭시키기 위하여, 프라이머 APC-b5: 5'-CAAATCCTAAGAGAGAACAAC-3'(참조: 서열번호 21) 및 APC-b3: 5'-GTCCATTATCTTTTTCACACG-3'(참조: 서열번호 22)을 합성하였다. APC-a 절편을 증폭시키는 데 사용된 주형으로서는 세포주로서 가드너 증후군(gardner's syndrome, GS) 가계에 해당하는 HCT116 및 가족성 용종증(familial adenomatous polyposis, FAP) 가계에 해당하는 SW480으로부터 RNA를 분리하여 RT-PCR로 작제한 cDNA를 사용하였으며, APC-b 절편을 증폭시키는 데 사용된 주형으로서는 전기 세포주 HCT116, SW480 및 정상인 말초혈액으로부터 분리한 gDNA를 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 유전자를 PCR 반응시킨 다음, 1.5아가로오스 젤에 전기영동으로 증폭을 확인하였다(참조: 도 9). 도 9에서, (a)의 제 1레인은 HindIII 처리된 λDNA 분자량 마커; 제 2레인은 HCT116 세포주로부터 분리한 cDNA를 주형으로 증폭시킨 APC-a 절편; 및, 제 3레인은 SW480 세포주로부터 분리한 cDNA를 주형으로 증폭시킨 APC-a 절편을 나타내며, (b)의 제 1레인은 HindIII 처리된 λDNA 분자량 마커; 제 2레인은 HCT116 세포주로부터 분리한 gDNA를 주형으로 증폭시킨 APC-b 절편; 제 3레인은 SW480 세포주로부터 분리한 gDNA를 주형으로 증폭시킨 APC-b 절편; 및, 제 4레인은 정상인 말초혈액으로부터 분리한 gDNA를 주형으로 증폭시킨 APC-b 절편을 나타낸다. 도 9에서 보듯이, APC-a 절편의 경우 HCT116과 SW480 세포주로부터 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행한 결과, 약 1.9kb 크기의 절편이 증폭됨을 확인하였으며, APC-b 절편은 각 샘플의 gDNA를 분리하여 PCR한 결과, 3.3kb 크기의 절편이 증폭됨을 알 수 있었다. 결과적으로, 각각의 엑손부위를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용할 경우, 여러가지 시료에서 APC 유전자 절편들이 잘 증폭됨을 확인할 수 있었다.By co-transfection with a gapvector, the APC-a and APC-b fragments, APC genes to be used for measuring heterozygous mutations by the E. coli stop codon assay, were amplified by PCR: co-transfection with gapvector AV-a. To amplify APC-a fragments, which are genes exon 1 to exon 14 of the APC gene, primers APC-a5Xh and APC-a3Ba were used and the expression of exon 15 of the APC gene to be co-transformed with gap vector AV-b. To amplify a portion of the APC-b fragment, primers APC-b5: 5'-CAAATCCTAAGAGAGAACAAC-3 '(see SEQ ID NO: 21) and APC-b3: 5'-GTCCATTATCTTTTTCACACG-3' (see SEQ ID NO: 22) Synthesized. As a template used to amplify the APC-a fragment, RNA was isolated from HCT116 corresponding to the Gardner's syndrome (GS) line as a cell line and SW480 corresponding to the familial adenomatous polyposis (FAP) line. CDNA constructed by PCR was used. As a template used to amplify the APC-b fragment, the genes were PCR-reacted in the same manner as in Example 1, using the electric cell lines HCT116, SW480 and gDNA isolated from normal peripheral blood. Next, amplification was confirmed by electrophoresis on 1.5 agarose gel (see FIG. 9). In Figure 9, the first lane of (a) is a HindIII treated lambda DNA molecular weight marker; Lane 2 was an APC-a fragment amplified with a template of cDNA isolated from HCT116 cell line; And, the third lane represents an APC-a fragment obtained by amplifying the cDNA isolated from the SW480 cell line with a template, and the first lane of (b) is a HindIII treated λDNA molecular weight marker; The second lane comprises an APC-b fragment amplified with a template of gDNA isolated from HCT116 cell line; The third lane comprises an APC-b fragment amplified with a template of gDNA isolated from the SW480 cell line; And the fourth lane represents an APC-b fragment in which gDNA isolated from normal peripheral blood was amplified with a template. As shown in FIG. 9, in the case of APC-a fragments, RNA was isolated from HCT116 and SW480 cell lines to perform RT-PCR. As a result, the 1.9-kb fragment was amplified, and the APC-b fragment was the gDNA of each sample. PCR was isolated and found that 3.3 kb fragments were amplified. As a result, when using primers that can specifically amplify each exon region, it was confirmed that the APC gene fragments are well amplified in various samples.
실시예 3-2: 동시 형질전환 Example 3-2 : Co-Transformation
실시예 3-1에서 수득한 유전자 절편과 각각의 갭벡터를 대장균에 동시 형질전환시킴으로써, 동형재조합 기작에 의한 갭 수리(gap repair)를 유도하였으며, 이에 의하여 ESC 검정법을 수행하였다: 실시예 3-1에서 수득한 APC-a 및 APC-b 절편에 대하여, APC-a 절편 2㎕와 AV-a 갭벡터 1㎕ 또는 APC-b 절편 2㎕와 AV-b 갭벡터 1㎕를 각각 E. coli DH5α 컴피턴트 세포에 동시 형질전환시켜 갭 수리를 유도하였으며, 형질전환된 대장균을 X-gal 및 IPTG가 첨가된 고형 LB 배지에 도말한 후, 37℃에서 14 내지 16시간 배양하여 생성된 콜로니의 수와 색깔을 관찰하였다(참조: 표 1).By co-transforming the gene fragment obtained in Example 3-1 and each gap vector into E. coli, gap repair was induced by the homologous recombination mechanism, whereby the ESC assay was performed. For the APC-a and APC-b fragments obtained in Fig. 1, 2 μl of the APC-a fragment and 1 μl of the AV-a gap vector or 2 μl of the APC-b fragment and 1 μl of the AV-b gap vector were respectively E. coli DH5α. The co-transformation of competent cells was induced to induce gap repair, and the transformed Escherichia coli was plated in solid LB medium containing X-gal and IPTG, followed by incubation at 37 ° C. for 14 to 16 hours. Color was observed (see Table 1).
*: APC-a는 세포주 HCT116으로부터 분리한 cDNA를 주형으로 증폭시킨 유전자 절편이며, APC-b는 정상인 말초혈액으로부터 분리한 gDNA를 주형으로 증폭시킨 유전자 절편이다.*: APC-a is a gene fragment that amplifies cDNA isolated from cell line HCT116 with a template, and APC-b is a gene fragment that amplifies gDNA isolated from normal peripheral blood with a template.
표 1에서 보듯이, 갭벡터만 형질전환시킨 경우에는 콜로니가 거의 자라지 않았으며, 갭벡터와 삽입절편을 함께 동시 형질전환시킨 배지에서 콜로니들이 자라는 것을 확인하였다.As shown in Table 1, when only the gap vector was transformed, colonies hardly grew, and the colonies grew in the medium in which the gap vector and the insert were co-transformed together.
실시예 3-3: 가드너 증후군 가계의 ESC 검정 Example 3-3 ESC assay of Gardner syndrome household
가드너 증후군(GS) 가계로 알려진 가족 구성원을 대상으로 하여, AV-b 갭벡터를 이용한 ESC 검정법을 수행하였다: 우선, GS 가계의 가족 구성원 중 아버지(GSI-1)와 세 자녀(GSII-1, GSII-2 및 GSII-3)을 대상으로 ESC 검정법을 실시하였는 바, 각 구성원의 말초혈액으로부터 gDNA를 분리하고, 프라이머 APC-b5 및 APC-b3를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 증폭산물을 아가로오스 젤에 전기영동하였다(참조: 도 10). 도 10에서, 제 1레인은 아버지(GSI-1)의 말포혈액으로부터 분리한 gDNA를 주형으로 증폭시킨 APC-b 절편; 제 2 레인 내지 제 4레인은 각각 세 자녀(GSII-1, GSII-2 및 GSII-3)의 말포혈액으로부터 분리한 gDNA를 주형으로 증폭시킨 APC-b 절편; 제 5레인은 HindIII 처리된 λDNA 분자량 마커; 및 제 6레인은 정상인의 말포혈액으로부터 분리한 gDNA를 주형으로 증폭시킨 APC-b 절편을 나타낸다. 도 10에서 보듯이, PCR 반응에 의하여 모든 시료로부터 3.3kb 크기의 APC-b 절편이 증폭되었음이 확인되었다.A family member known as the Gardner Syndrome (GS) family was subjected to the ESC assay using the AV-b gap vector: first of all the family members of the GS family (GSI-1) and three children (GSII-1, GSII-2 and GSII-3) were subjected to ESC assay. GDNA was isolated from peripheral blood of each member, PCR was performed using primers APC-b5 and APC-b3, and the amplification product was agar. The gel was electrophoresed (see FIG. 10). In Figure 10, the first lane is an APC-b fragment amplified with a template gDNA isolated from the blood cells of the father (GSI-1); Lanes 2 to 4 were APC-b fragments in which amplified gDNA with a template was isolated from malfo blood of three children (GSII-1, GSII-2 and GSII-3), respectively; Lane 5 is a HindIII treated lambda DNA molecular weight marker; And lane 6 shows an APC-b fragment amplified by template with gDNA isolated from horse blood of normal humans. As shown in Figure 10, it was confirmed that 3.3kb size APC-b fragments were amplified from all samples by PCR reaction.
다음으로, 각 시료로부터 증폭된 APC-b 절편과 AV-b 갭벡터를 E. coli DH5α 컴피턴트 세포에 동시 형질전환시켜 갭 수리를 유도하였으며, 형질전환된 대장균을 X-gal 및 IPTG가 첨가된 고형 LB 배지에 도말한 후, 37℃에서 14 내지 16시간 배양하여 생성된 콜로니의 수와 색깔을 관찰하였다(참조: 표 2).Next, APC-b fragments and AV-b gap vectors amplified from each sample were co-transformed into E. coli DH5α competent cells to induce gap repair, and the transformed E. coli was added with X-gal and IPTG. After plating on solid LB medium, the number and color of colonies generated by incubating at 37 ° C. for 14 to 16 hours were observed (see Table 2).
표 2에서 보듯이, 동시 형질전환에 의하여 생성된 콜로니의 수와 색깔을 분석해 본 결과, 파란색 콜로니와 흰색 콜로니로 잘 대별되어 나타나는 것을 확인하였으며, 특히 정상인 시료의 경우에는 흰색 콜로니가 하나도 나타나지 않는다는 것을 알 수 있었다. 또한, APC-b 절편과 AV-b 갭벡터를 동시 형질전환시켜 생성된 콜로니가 갭 수리에 의하여 재조합되었는지를 확인하기 위하여 파란색 콜로니와 흰색 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, XhoI과 BamHI으로 절단한 다음, 아가로오스 젤에 전기영동하였다(참조: 도 11). 도 11에서, 제 1레인은 HindIII 처리된 λDNA 분자량 마커; 제 2 레인 내지 제 5레인은 각 시료의 푸른색 콜로니로부터 분리한 플라스미드 DNA에 XhoI과 BamHI을 처리한 결과; 및, 제 6레인 내지 제 9레인은 각 시료의 흰색 콜로니로부터 분리한 플라스미드 DNA에 XhoI과 BamHI을 처리한 결과를 나타낸다. 도 11에서 보듯이, 모든 레인에서 제한효소 절단에 의한 유전자 절편이 전개되었으며, 이로써 모든 콜로니가 재조합 플라스미드를 지니고 있는 것으로 확인되었다.As shown in Table 2, as a result of analyzing the number and color of colonies generated by the co-transformation, it was confirmed that blue colonies and white colonies appeared well, and in particular, no white colonies appeared in the normal sample. Could know. In addition, plasmid DNA was isolated from blue colonies and white colonies, and digested with XhoI and BamHI to confirm whether the colonies generated by co-transforming APC-b fragment and AV-b gap vector were recombined by gap repair. , Agarose gel electrophoresis (see Fig. 11). In Figure 11, the first lane is HindIII treated lambda DNA molecular weight marker; Lanes 2 to 5 were obtained by treating XhoI and BamHI on plasmid DNA isolated from blue colonies of each sample; And lanes 6 to 9 show the results of treatment of XhoI and BamHI on plasmid DNA isolated from the white colonies of each sample. As shown in FIG. 11, gene segments by restriction enzyme cleavage were developed in all lanes, thereby confirming that all colonies had recombinant plasmids.
상술한 결과를 토대로, 서로 다른 양상을 보이는 각 시료의 gDNA에 이형 돌연변이(heterozygous mutation)가 존재하는지 알아보기 위하여, 프라이머 Seq-F: 5'-TCATCTTTGTCATCAGCTG-3'(참조: 서열번호 23) 및 Seq-R: 5'-AGATAAACTAGAACCCTG-3'(참조: 서열번호 24)를 합성하고, 각 시료의 gDNA를 주형으로 하는 PCR을 수행하여 APC 엑손 15번의 일부분에 해당하는 돌연변이 부분(197bp)을 증폭하였으며, 이를 주형으로 하여 Top™ Sequencing 키트(Bioneer, Korea)를 사용하여 염기서열을 결정하였다(참조: 도 12). 도 12에서, (a)는 GSI-1; (b)는 GSII-1; (c)는 GSII-2; (d)는 GSII-3; (e)는 푸른색 콜로니; 및, (f)는 흰색 콜로니로부터 증폭한 197bp 부분의 염기서열을 나타낸다. 도 12에서 보듯이, GSI-1, GSII-2 및 GSII-3에서 이형 돌연변이가 발견되었으며, GSII-1의 경우에는 돌연변이가 없는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 염기서열 분석결과로 확인한 바와 같이, ESC 검정법에 의하여 이형 돌연변이를 효과적으로 검정할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.Based on the above results, in order to determine whether heterozygous mutations exist in gDNA of each sample showing different patterns, primers Seq-F: 5'-TCATCTTTGTCATCAGCTG-3 '(see SEQ ID NO: 23) and Seq -R: 5'-AGATAAACTAGAACCCTG-3 '(see SEQ ID NO: 24) was synthesized, and PCR was performed using the gDNA template of each sample to amplify the mutant portion (197 bp) corresponding to a part of APC exon 15. Using this as a template, the nucleotide sequence was determined using a Top ™ Sequencing Kit (Bioneer, Korea) (see FIG. 12). In Figure 12, (a) is GSI-1; (b) is GSII-1; (c) is GSII-2; (d) is GSII-3; (e) blue colony; And (f) shows the nucleotide sequence of the 197bp portion amplified from the white colony. As shown in FIG. 12, heterologous mutations were found in GSI-1, GSII-2 and GSII-3, and no mutation was found in GSII-1. Therefore, as confirmed by these sequencing results, it was confirmed that the heterologous mutation can be effectively assayed by the ESC assay.
다음으로, ESC 검정법에 의해 정상 및 이형 돌연변이에 해당하는 대립유전자(allele)가 파란색과 흰색의 콜로니로 정확하게 분리되는지를 확인하기 위하여 파란색 및 흰색의 콜로니로부터 DNA를 추출하여 상기와 같이 염기서열을 분석하였다(참조: 도 13). 도 13에서, (a)는 파란색 콜로니; 및, (b) 내지 (c)는 흰색 콜로니에서 각각 분리한 DNA에 대한 197bp 부분에 대한 염기서열 분석결과이다.도 13에서 보듯이, 파란색 콜로니에서 분리한 재조합 DNA에는 모두 정상 염기서열을 가진 APC-b 유전자 절편이 클로닝되어 있는 반면에, 흰색 콜로니에서 분리한 재조합 DNA에는 APC 유전자의 서열번호 1309 내지 1311번에서 5bp(GAAAA)가 결손된 APC-b 유전자 절편이 클로닝되어 있음이 확인되었다. 따라서, 이 결손 돌연변이(deletion mutation)에 의하여 프레임 쉬프트(frame shift)가 야기되어, 결과적으로 정지코돈이 형성되는 것으로 밝혀졌다.Next, in order to confirm that alleles corresponding to normal and heterologous mutations are correctly separated into blue and white colonies by ESC assay, DNA is extracted from blue and white colonies and the nucleotide sequence is analyzed as described above. (See FIG. 13). In Figure 13, (a) is a blue colony; And, (b) to (c) is a sequence analysis of the 197bp portion of the DNA isolated from each of the white colonies. As shown in Figure 13, all the recombinant DNA isolated from the blue colony APC having a normal sequence While the -b gene fragment was cloned, it was confirmed that the recombinant DNA isolated from the white colony had cloned the APC-b gene fragment lacking 5bp (GAAAA) in SEQ ID NOs: 1309 to 1311 of the APC gene. Thus, it has been found that this deletion mutation causes a frame shift, resulting in a stop codon.
결과적으로, 상술한 결과들에 의하여, 본 발명에서 조사한 GS 가계의 가계도에서, 아버지(GSI-1)와 두 자녀(GSII-2 및 GSII-3)가 APC 유전자의 APC-b 절편에 이형 돌연변이를 지니고 있는 것으로 판명되었으며, 이러한 결과는 반복실험에 의해서도 동일하게 나타났다. 따라서, 본 발명의 ESC 검정법은 단순히 생성된 콜로니의 색깔을 조사함으로써 유전자내의 절단형 돌연변이(truncating mutation)를 용이하고 신속하게 검정할 수 있는 매우 유용한 시스템이라는 사실을 알 수 있었다.As a result, according to the above results, in the family tree of the GS family examined in the present invention, the father (GSI-1) and the two children (GSII-2 and GSII-3) have a heterologous mutation in the APC-b fragment of the APC gene. It was found to have the same result, and the same result was shown by repeated experiments. Thus, the ESC assay of the present invention was found to be a very useful system that can easily and quickly assay for truncating mutations in genes by simply examining the color of the resulting colonies.
실시예 4: 갭벡터를 이용한 BRCA1 유전자의 이형접합 돌연변이의 측정 Example 4 Measurement of Heterozygous Mutations in BRCA1 Gene Using Gap Vectors
실시예 4-1: BRCA1 유전자의 증폭 Example 4-1 Amplification of the BRCA1 Gene
갭벡터와 동시 형질전환을 함으로써, 대장균 정지코돈 검정법에 의하여 이형접합 돌연변이를 측정하는데 사용될 BRCA1 유전자인 BRCA1-a 절편, BRCA1-b 절편및 BRCA1-c 절편을 PCR로 증폭하였다: 갭벡터 BV-a와 동시 형질전환시킬 BRCA1 유전자의 엑손 2에서 엑손 10번까지의 유전자인 BRCA1-a 절편을 증폭시키기 위하여, 프라이머 BRCA1-a5Xh 및 BRCA1-a3H를 사용하고, 갭벡터 BV-b와 동시 형질전환시킬 BRCA1 유전자의 엑손 11 부분인 BRCA1-b 절편을 증폭시키기 위하여, 프라이머 BRCA1-b5Xh 및 BRCA1-b3H를 사용하였으며, 갭벡터 BV-c와 동시 형질전환시킬 BRCA1 유전자의 엑손 12에서 엑손 24번까지의 유전자인 BRCA1-c 절편을 증폭시키기 위하여, 프라이머 BRCA1-c5Xh 및 BRCA1-c3H를 사용하였다. 각 유전자 절편을 증폭시키는 데 사용된 주형으로서는 세포주 HBL-100, HCC1937 또는 정상인의 말초혈액으로부터 분리하여 RT-PCR로 작제한 cDNA 또는 gDNA를 사용하였으며, 실시예 1과 동일한 방법으로 유전자를 PCR 반응시킨 다음, 1.5아가로오스 젤에 전기영동으로 증폭을 확인하였다(참조: 도 14). 도 14에서, (a)의 제 1레인은 HindIII 처리된 λDNA 분자량 마커; 제 2레인은 HBL-100 세포주; 제 3레인은 HCC1937 세포주; 및, 제 4레인은 정상인의 말초혈액으로부터 증폭시킨 BRCA1-a 절편을 나타내며, (b)의 제 1레인은 HindIII 처리된 λDNA 분자량 마커; 제 2레인은 HBL-100 세포주; 제 3레인은 HCC1937 세포주; 및, 제 4레인 내지 제 6레인은 정상인의 말초혈액으로부터 증폭시킨 BRCA1-a 절편을 나타내고, (c)의 제 1레인은 HindIII 처리된 λDNA 분자량 마커; 제 2레인은 HBL-100 세포주; 제 3레인은 HCC1937 세포주; 및, 제 4레인은 정상인의 말초혈액으로부터 증폭시킨 BRCA1-a 절편을 나타낸다. 도 14에서 보듯이, 각 BRCA1 유전자 절편이 PCR에 의하여 용이하게 잘 증폭되는 것을 확인하였다. 결과적으로, 각각의 엑손부위를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용할 경우,여러가지 시료에서 BRCA1 유전자 절편들이 잘 증폭됨을 확인할 수 있었다.By co-transfection with the gapvector, the BRCA1 genes, BRCA1-a fragment, BRCA1-b fragment and BRCA1-c fragment, which will be used to measure heterozygous mutations by the E. coli stop codon assay, were amplified by PCR: gapvector BV-a In order to amplify the BRCA1-a fragments, which are genes from exon 2 to exon 10 of the BRCA1 gene to be co-transformed, primers BRCA1-a5Xh and BRCA1-a3H are used and BRCA1 to be co-transformed with gap vector BV-b. To amplify the BRCA1-b fragment, the exon 11 portion of the gene, primers BRCA1-b5Xh and BRCA1-b3H were used and the genes from exon 12 to exon 24 of the BRCA1 gene to be co-transformed with the gap vector BV-c. To amplify the BRCA1-c fragments, primers BRCA1-c5Xh and BRCA1-c3H were used. As a template used for amplifying each gene fragment, cDNA or gDNA prepared by RT-PCR isolated from cell lines HBL-100, HCC1937 or peripheral blood of normal humans were used, and the genes were PCR-reacted in the same manner as in Example 1. Next, amplification was confirmed by electrophoresis on 1.5 agarose gel (see FIG. 14). In Figure 14, the first lane of (a) is HindIII treated lambda DNA molecular weight marker; The second lane was HBL-100 cell line; The third lane comprises an HCC1937 cell line; And, the fourth lane represents BRCA1-a fragments amplified from peripheral blood of normal persons, and the first lane of (b) is a HindIII treated lambda DNA molecular weight marker; The second lane was HBL-100 cell line; The third lane comprises an HCC1937 cell line; And lanes 4 to 6 represent BRCA1-a fragments amplified from peripheral blood of normal persons, and lane 1 of (c) is HindIII treated λDNA molecular weight marker; The second lane was HBL-100 cell line; The third lane comprises an HCC1937 cell line; And lane 4 represents BRCA1-a fragments amplified from peripheral blood of normal individuals. As shown in FIG. 14, it was confirmed that each BRCA1 gene fragment was easily amplified by PCR. As a result, when using a primer that can specifically amplify each exon region, it was confirmed that the BRCA1 gene fragments are well amplified in various samples.
실시예 4-2: 동시 형질전환 Example 4-2 : Co-Transformation
실시예 4-1에서 수득한 유전자 절편과 각각의 갭벡터를 대장균에 동시 형질전환시킴으로써, 동형재조합 기작에 의한 갭 수리(gap repair)를 유도하였으며, 이에 의하여 ESC 검정법을 수행하였다: 실시예 4-1에서 수득한 BRCA1-a, BRCA1-b 및 BRCA1-c 절편에 대하여, BRCA1-a 절편 2㎕와 BV-a 갭벡터 1㎕, BRCA1-b 절편 2㎕와 BV-b 갭벡터 1㎕ 또는 BRCA1-c 절편 2㎕와 BV-c 갭벡터 1㎕를 각각 E. coli DH5α 컴피턴트 세포에 동시 형질전환시켜 갭 수리를 유도하였으며, 형질전환된 대장균을 X-gal 및 IPTG가 첨가된 고형 LB 배지에 도말한 후, 37℃에서 14 내지 16시간 배양하여 생성된 콜로니의 수와 색깔을 관찰하였다(참조: 표 3).By co-transforming the gene fragment obtained in Example 4-1 and each gap vector into E. coli, gap repair was induced by homologous recombination mechanism, whereby ESC assay was performed. For BRCA1-a, BRCA1-b and BRCA1-c fragments obtained in 1, 2 μl of BRCA1-a fragment and 1 μl of BV-a gap vector, 2 μl of BRCA1-b fragment and 1 μl of BV-b gap vector or BRCA1 2 μl of -c fragment and 1 μl of BV-c gap vector were co-transformed into E. coli DH5α competent cells to induce gap repair, and the transformed Escherichia coli was transferred to solid LB medium containing X-gal and IPTG. After plating, the number and color of colonies generated by incubating at 14 ° C. for 14 to 16 hours were observed (see Table 3).
*: 세포주 HBL-100으로부터 분리한 cDNA를 주형으로 증폭시킨 유전자 절편.*: Gene fragment amplified with a template cDNA isolated from cell line HBL-100.
표 3에서 보듯이, 갭벡터만 형질전환시킨 경우에는 콜로니가 거의 자라지 않았으며, 갭벡터와 삽입절편을 함께 동시 형질전환시킨 배지에서 콜로니들이 자라는 것을 확인하였다.As shown in Table 3, when only the gap vector was transformed, colonies hardly grew, and the colonies grew in the medium in which the gap vector and the insert were co-transformed together.
실시예 4-3: 유방암 세포주의 ESC 검정 Example 4-3 ESC Assay of Breast Cancer Cell Line
BRCA1 유전자의 C-말단 부위에 돌연변이가 있는 것으로 확인된 유방암 세포주인 HCC1937을 이용하여 ESC 검정법의 효능성을 평가하였다: HCC1937 세포주로부터 증폭된 BRCA1-c 절편과 BV-c 갭벡터를 E. coli DH5α 컴피턴트 세포에 동시 형질전환시켜 갭 수리를 유도하였으며, 형질전환된 대장균을 X-gal 및 IPTG가 첨가된 고형 LB 배지에 도말한 후, 37℃에서 14 내지 16시간 배양하여 생성된 콜로니의 수와 색깔을 관찰하였다(참조: 표 4).Efficacy of the ESC assay was assessed using HCC1937, a breast cancer cell line identified as having mutations in the C-terminal region of the BRCA1 gene: BRCA1-c fragments and BV-c gap vectors amplified from the HCC1937 cell line were assayed for E. coli DH5α. The co-transformation of competent cells was induced to induce gap repair, and the transformed Escherichia coli was plated in solid LB medium containing X-gal and IPTG, followed by incubation at 37 ° C. for 14 to 16 hours. Color was observed (see Table 4).
*: 세포주 HCC1937로부터 증폭한 BRCA1-c 유전자 절편*: BRCA1-c gene segment amplified from cell line HCC1937
표 4에서 보듯이, 세포주 HCC1937로부터 증폭한 BRCA1-c 유전자 절편을 갭벡터인 BV-c와 동시 형질전환시켰을 때, 파란색과 흰색의 콜로니로 잘 대별되어 나타나는 것을 확인하였다. 이때, 파란색과 흰색의 콜로니에 실제로 이형 돌연변이(heterozygous mutation)가 반영되었는지 알아보기 위하여, 각 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 합성된 프라이머 BR-Seq: 5'-TATTTCTGGGTGACCCAG-3'(참조: 서열번호 25)를 사용하여 염기서열을 결정하였다(참조: 도 15). 도 15에서, (a)는 정상인의 말초혈액으로부터 증폭된 BRCA1-c 절편; (b)는 푸른색 콜로니로부터 분리한 플라스미드의 BRCA1-c 절편부분; 및, (c)는 흰색 콜로니로부터 분리한 플라스미드의 BRCA1-c 절편부분의 염기서열을 나타낸다. 도 15에서 보듯이, 정상인 말초혈액이나 푸른색 콜로니의 경우와는 달리, 흰색 콜로니에서만 염기 C가 삽입되어 있는 것으로 확인되어 ESC 검정법의 결과와 잘 일치하는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 염기서열 분석결과로 확인한 바와 같이, BRCA1의 경우도 APC의 경우와 마찬가지로 ESC 검정법에 의하여 이형 돌연변이를 효과적으로 검정할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.As shown in Table 4, when the BRCA1-c gene fragment amplified from the cell line HCC1937 was co-transformed with the gap vector BV-c, it was confirmed that the blue and white colonies appeared well. At this time, in order to determine whether the blue and white colonies actually reflected heterozygous mutations, plasmid DNA was isolated from each colony, and the synthesized primers BR-Seq: 5'-TATTTCTGGGTGACCCAG-3 '(see SEQ ID NO: 25) was used to determine the nucleotide sequence (see Figure 15). In FIG. 15, (a) shows BRCA1-c fragments amplified from peripheral blood of normal persons; (b) shows the BRCA1-c fragment of a plasmid isolated from blue colonies; And (c) shows the nucleotide sequence of the BRCA1-c fragment portion of the plasmid isolated from the white colony. As shown in FIG. 15, unlike the case of normal peripheral blood or blue colonies, base C was inserted only in white colonies, which is in good agreement with the results of the ESC assay. Therefore, as confirmed by these sequencing results, it was confirmed that the heterologous mutations can be effectively assayed by the ESC assay in the case of BRCA1 as in the case of APC.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail specific parts of the present invention, it is apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 신속하고 용이함은 물론, 경제적으로 이형접합 돌연변이를 검정할 수 있는 대장균 정지코돈 검정법을 이용한 돌연변이의 검정방법 및 대장균 정지코돈 검정법에 효과적으로 사용할 수 있는 갭벡터를 제공한다. 본 발명에 의하면, 기존의 정지코돈 검정에 사용되던 효모 대신에 대장균을 사용함으로써, 시간과 비용을 줄일 수 있으며, PCR 반응을 이용하여 용이하고 정확하게 갭벡터를 작제할 수 있기 때문에, 전체적인 검정방법이 간단해지고 효율성이 높은 이형접합 돌연변이의 검정이 가능해진다. 특히, 본 발명에서 제공하는 대장균 정지코돈 검정법은 단순히 형질전환된 대장균 콜로니의 색깔 비교를 통하여 돌연변이의 여부를 정확하게 검정할 수 있다. 이에 더하여, 낮은 복제수 플라스미드를 사용함으로써, 효과적으로 대립유전자가 분리되므로, 종래의 돌연변이 검색법으로는 확인하기가 어려웠던 이형접합체 돌연변이의 정확한 구분이 가능해진다. 따라서, 본 발명의 이형접합 돌연변이 검정방법은 종래의 불완전한 검색법을 대체할 수 있을 것이며, 대장균 정지코돈 검정법을 통한 유전자 진단은 각종 유전병과 유전성 암의 조기발견 및 치료에 많은 도움이 될 것으로 기대된다.As described and demonstrated in detail above, the present invention provides a gap vector that can be effectively used for the assay of mutations and the E. coli stop codon assay using E. coli stop codon assay, which can rapidly and easily and economically test for heterozygous mutations. to provide. According to the present invention, by using E. coli instead of the yeast used in the conventional stop codon assay, time and cost can be reduced, and since the gap vector can be constructed easily and accurately using a PCR reaction, the overall assay method is Simple and efficient assays for heterozygous mutations are possible. In particular, the E. coli stop codon assay provided by the present invention can accurately assay for the presence of mutations simply by comparing the color of the transformed E. coli colonies. In addition, the use of a low copy number plasmid effectively separates alleles, allowing accurate identification of heterozygous mutations that were difficult to identify by conventional mutation screening methods. Therefore, the heterozygous mutation assay of the present invention may replace the conventional incomplete detection method, and the genetic diagnosis through the E. coli stop codon assay is expected to be helpful for the early detection and treatment of various genetic diseases and hereditary cancers. .
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019990031647A KR100318254B1 (en) | 1999-08-02 | 1999-08-02 | Gap Vectors for E.coli Stop Codon Assay and Method for Detecting Heterozygous Truncating Mutation Thereby |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019990031647A KR100318254B1 (en) | 1999-08-02 | 1999-08-02 | Gap Vectors for E.coli Stop Codon Assay and Method for Detecting Heterozygous Truncating Mutation Thereby |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010016649A KR20010016649A (en) | 2001-03-05 |
| KR100318254B1 true KR100318254B1 (en) | 2001-12-22 |
Family
ID=19605989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019990031647A KR100318254B1 (en) | 1999-08-02 | 1999-08-02 | Gap Vectors for E.coli Stop Codon Assay and Method for Detecting Heterozygous Truncating Mutation Thereby |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100318254B1 (en) |
-
1999
- 1999-08-02 KR KR1019990031647A patent/KR100318254B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20010016649A (en) | 2001-03-05 |
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