KR100316975B1 - 슈도모나스 에스피. 디제이-12에서 4-염화벤조에이트-코엔자임 에이 탈할로겐효소를 코딩하는 클로닝된 에프씨비비 유전자 및 그 유전자의 재조합 플라스미드 벡터 - Google Patents

슈도모나스 에스피. 디제이-12에서 4-염화벤조에이트-코엔자임 에이 탈할로겐효소를 코딩하는 클로닝된 에프씨비비 유전자 및 그 유전자의 재조합 플라스미드 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 슈도모나스 sp. DJ-12에서 4-염화벤조에이트-코엔자임A탈할로겐효소를 코딩하는 클로닝된 fcbB 유전자, fcbB 유전자가 재조합된 벡터, 재조합 벡터로 형질전환된 세포 그리고 숙주세포에서 발현된 4-염화벤조에이트-코에이 탈할로겐효소에 관한 것으로, 상기 클로닝된 fcbB 유전자를 대량 발현시켜 생성된 단백질효소를 이용하여, 환경오염 물질인 할로겐된 방향족화합물을 분해하는 등의 효과를 갖는다.

Description

슈도모나스 에스피. 디제이-12에서 4-염화벤조에이트-코엔자임 에이 탈할로겐효소를 코딩하는 클로닝된 에프씨비비 유전자 및 그 유전자의 재조합 플라스미드 벡터{Cloned fcbB gene encoding 4-chlorobenzoate-Coenzyme A dehalogenase from Pseudomonas sp. DJ-12 and recombinant plasmid vector harboring the gene}
본 발명은 4-염화벤조에이트-코엔자임 A 탈할로겐효소 (chlorobenzo ate-Coenzyme A dehalogenase)를 코딩하는 fcbB 유전자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 슈도모나스 (Pseudomonas) sp. DJ-12에서 4-염화벤조에이트-코엔자임 A 탈할로겐효소를 코딩하는 클로닝된 fcbB 유전자, fcbB 유전자가 재조합된 벡터, 재조합 벡터로 형질전환된 세포 그리고 숙주세포에서 발현된 4-염화벤조에이트-코에이 탈할로겐효소 단백질에 관한 것이다.
일반적으로, 할로겐화된 지방족이나 방향족 탄화수소화합물들은 살충제, 제조체 등으로 제조되고 사용된다. 이들 위험한 화학물질은 생산과정, 사용과정, 폐기과정에서 환경으로 들어간다. 특히, 염소화된 방향족화합물은 그들의 독성, 생체축적, 환경에서의 지속성 때문에 학계에서 뿐 아니라 일반인들의 관심을 일으켜 왔으며, 이들 할로겐화된 방향족화합물의 분해나 제거에 대해 상당한 노력들을 기울이고 있다.
할로겐방향족화합물의 분해나 제거를 달성하는 방법으로는 알카리 존재하에서 일어나는 반응과정을 이용하고 있다. 미국 특허 제 2,951,804에 는 알킬 또는 알킬렌 설포사이드와 폴리올의 혼합물내에서 알카리와 폴리염화 바이페닐(PCB)을 반응시키는 것이 나타나 있고, 캐나다 특허 제 1,181, 771에는 용융된 나트륨을 사용하는 방법이 기재되어 있다.
그러나, 이들 방법들은 낮은 농도의 할로겐화된 방향족화합물을 제거하지 못하고, 게다가 이들 공정은 알카리 또는 알카리 금속 존재 하에서 온도를 120℃ 이상에서 진행하므로 용매의 분해나 중합이 촉진되는 단점이 있다.
그리하여, 이들 화합물의 분해에 관여하는 효소와 경로를 갖는 미생물을 이용하는 생물학적 방법에 대한 필요성이 제기되었다. 화합물들의 분해나 제거의 어려움은 할로겐 치환체의 수와 위치와 상관 관계가 있다. 따라서, 이들 화합물의탈할로겐 과정은 이 화합물들의 생물학적 제거에 중요한 단계로 알려져 왔다.
미국특허 제4,452,894호에서는 슈도모나스가 할로겐화된 방향족화합물을 탄소원으로 이용할 수 있다는 것을 기재하고 있다. 그러나, 슈도모나스에서 그 분해기작이나 관여하는 효소와 그 유전자에 대한 특성에 대한 기재가 없다.
한편, 할로겐화된 방향족화합물 중 4-염화벤조에이트는 폴리염화된(polychlorinated) 방향족 물질이나 제초제인 비디신(bidisin)를 미생물이 분해한 부산물로 밝혀졌다. 호기적 조건하에서, 몇 몇 세균 종에서 4-염화벤조에이트-코엔자임 A 연결효소(ligase), 4-염화벤조에이트-코엔자임 A 탈할로겐효소와 4-하이드록시벤조에이트-코엠자임 A 싸이오에스터레이즈의 연속적인 활성에 의하여 4-염화벤조에이트의 할로겐 치환체(substituent)를 하이드록시기로 바꾸어주는 4-염화벤조에이트의 탈할로겐 가수분해에 관여한다는 것이 보고되었다. 특히, 4-염화벤조에이트 탈할로겐효소는 30kDa의 호모트라이머이고(Benning et al., 1996; Schmitz et al., 1992), 4-할로겐벤조일코엠자임 A에서 할로겐화물의 친핵치환(nucleophilic substitution)을 촉매하는 기능 때문에 더더욱 관심이 있었다. 탈할로겐효소의 구조에 대한 최근 보고에 의하면, Phe64, Phe82, Trp89와 Trp137이 방향족 링 잔기에 의한 벤조일 링을 순환(circling)하는 π-전자의 형성에 중요한 역할을 하고, Asp145는 마이젠하이머(Meisenheimer) 중간체의 형성에 관여하는 측쇄 카르복실기를 제공하고, 링에 있는 염화 이온을 물의 수산화 기로 대체하는 데 관여하고, His90은 차후의 가수분해 과정에서 결합된 물분자에서 양성자를 떼어내는 염기로 작용한다는 것이 알려졌다(Benning et al., 1996; Taylor et al., 1997;Yang et al., 1996).
본 발명의 발명자들은 대한민국의 대전 산업 단지에서 분리한 슈도모나스 sp. DJ-12를 이용하여, 이들이 호기적 조건하에서 방향족 링의 메타(meta)위치를 절단하여서 4-클로로바이페닐(4-CB)에서 4-염화벤조에이트를 만들고, 4-염화벤조에이트는 미생물에 의해서 차후에 탈 염소작용을 통하여 4-하이드록시벤조에이트(4-HBA)로 분해된다는 것을 알아냈고, 또한 DJ-12는 4-브로모벤조에이트와 4-요드벤조에이트와 같은 방향족 링의 파라(para)위치에 할로겐물을 갖는 치환된 벤조에이트를 분해한다는 것을 밝혀냈다.
따라서 본 발명의 발명자들은 생물학적방법으로 할로겐화된 방향족화합물의 분해를 용이하게 하기 위해서, 슈도모나스 sp. DJ-12에서 상기 할로겐화합물의 분해에 관여하는 유전자를 유전공학적 방법에 의해서 클로닝하여야 할 필요성이 제기되었다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하고 상기한 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 할로겐화된 방향족화합물의 분해에 관여하는 슈도모나스 sp. DJ-12의 염색체에서 클로닝된 4-염화벤조에이트-코에이 탈할로겐효소를 코딩하는 fcbB 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 fcbB 유전자가 재조합된 벡터를 숙주세포에 형질전환시키고, 형질전환된 숙주세포에서 fcbB 유전자가 발현된 4-염화벤조에이트-코에이 탈할로겐효소를 제공하는 것이다.
도 1은 fcbB 유전자를 포함하는 재조합 프라즈미드의 제한 효소 지도와 4염화벤조에이트에 대한 탈할로겐활성도를 나타낸 도면.
도 2는 재조합 벡터 pKC157을 가진 대장균에 의해 4-염화벤조에이트가 탈염소되어 4-수산화벤조에이트와 염화이온 방출을 나타낸 도면.
도 3은 재조합 벡터 pKC157을 가진 대장균에 의해 4-염화벤조에이트가 탈염소되어 생성된 4-수산화벤조에이트의 메틸에스테르의 매스 스펙트럼을 나타낸 도면.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈도모나스 sp. DJ-12의 4-염화벤조에이트-코에이 탈할로겐효소를 코딩하는 fcbB 유전자를 제공한다.
슈도모나스 sp. DJ-12를 분리하여 호기적 조건으로 배양하고, Sambrook 등의 Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2 판에 기재된 통상적인 방법에 의해 클로닝을 수행한다.
본 발명에 사용하는 슈도모나스 sp. DJ-12은 대전 생명공학연구소에 기탁된 균주(KCTC 8967P)를 사용하였다.
본 발명에 있어서, fcbB 유전자는 [서열 1]의 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명은 fcbB 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터는 원핵생물용 재조합 벡터이다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 바람직하게는 프라즈미드이다. 본 발명의 적당한 프라즈미드 벡터는 pKC1, pKC15, pKC157, pKC158 중 하나이다.
본 발명은 슈도모나스 sp. DJ-12균의 fcbB 유전자를 함유한 상기의 프라즈미드로 형질전환된 숙주를 제공한다. 상기 세포는 바람직하게는 박테리아 세포이며, 본 발명의 적당한 숙주는 대장균 LE392이다.
상기의 재조합 프라즈미드 벡터는 코즈미드(cosmid)를 벡터로 사용하여, 염색체 DNA를 적당한 제한효소로 처리하고, 역시 적당한 제한효소로 처리한 코즈미드와 연결한다. 이 연결된 혼합물을 통상의 프로토콜에 따라 적당한 숙주, 바람직하게는 대장균에 형질전환하였다. 탈염소화 활성을 갖는 클론된 세포를 선택한다. 몇 서브클론은 Sambrook 등의 결손 방법에 의해 만들어진다.
또한 본발명은 fcbB 유전자에 의하여 발현된 [서열 2]의 아미노산 서열을 포함하는 4-염화벤조에이트-코에이 탈 할로겐 효소 단백질을 제공한다.
다음은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다.
그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
(미생물 균주와 성장배지)
본 발명에 사용되는 슈도모나스 sp. DJ-12는 오염된 폐수에서 분리하였다. 이 균은 선택 마커로 앰피실린(50ug/ml)를 갖는 Luria- Bertani (LB)배지 하에서 호기적 조건으로 배양하였다. 탈염소화(dechlorination)에 의한 4-염화벤조에이트에 의해 생성된 염화 이온을 검출하기 위하여 염소가 없는 배지에서 배양(Tsoi et al., 1991)하였다. 이 배지의 조성은 1mM 4-염화벤조에이트, 4g K2HPO4, 0.4g NaH2PO4·H2O, 0.5g (NH4)2SO4, 0.15g MgSO4·H2O, 0.01g Ca(NO3)·H2O, 0.2g trypton과 0.1g 효모 extract를 1L의 증류수에 녹여 사용하였다.
(탈염화 분석)
염화 이온의 방출은 Bergmann과 Sanik의 칼라리메트릭(colorimetric )방법에 의하여 조사하였다. 또한, 각 클론된 세포에 의한 4-염화벤조에이트의 탈염소화는 Arensdorf 와 Focht의 방법에 따른 휴지(resting)세포 분석에 의해서도 조사하였다. Luria -Bertani 배양으로부터 모아진 세포들을 50mM 인산 칼륨 버퍼(pH 7.5)로 3회 씻은 후에 1mM 4-염화벤조에이트를 갖는 같은 버퍼에서 배양한다. 탈염소화를 통하여 4-염화벤조에이트로부터 배출된 염화이온을 칼라리메터릭 방법으로 측정하였다.
(HPLC와 GC-Mass 분석)
4-염화벤조에이트로부터 생성된 대사물질은 역상 C18컬럼을 사용하는 HPLC (Waters, Milford, MA, USA)에 의해 알 수 있었다. 속도는 분당 0.4ml이었고, 이동상으로는 메탄올-물-초산(60:40:1)이 사용되었다. 4-염화벤조에이트와 4-하이드록시벤조에이트를 254nm 파장에서 검출하였다. 대사물인 4-하이드록시벤조에이트는 디에틸에테르(diethyl ether)에서 추출하고 Arensdorf 와 Focht의 방법에서와 같이 디아조메탄(diazomethane)으로 메틸화를 한 후에 J W Scientific Co.(Foisom, CA, USA)에 의해 공급된 DB-5 캐필라리 컬럼(길이 30m; 직경 0.24mm; 두께 0.25㎛)을 이용한 GC-mass 분광계(Hewlett-Packard Co., CA, USA)로 분석하였다. 온도는 70℃(2분 초기 기다리는 시간)에서 210℃로 분당 20℃의 속도로 증가되는 것으로 프로그램하였다.
(4-염화벤조에이트-코에이 탈할로겐효소 유전자의 클로닝)
4-염화벤조에이트의 탈 염소화에 관여하는fcbB 유전자를 슈도모나스 sp. DJ-12균의 염색체 DNA에서 클로닝하였다. 지노믹(genomic)DNA는 Ausubel 등에 의해 기술된 방법으로 추출하였다. 프라즈미드의 분리, 효소 처리와 전기영동 등의 DNA 조작 방법은 Sambrook 등의 Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2 판에 기재된 방법에 의해 수행하였다. pWE15 코즈미드(cosmid)와 대장균 LE392를 각각 벡터와 숙주로 사용하였다. 염색체 DNA를 Sau3AⅠ으로 처리하고, 16℃에서 16시간 BamHⅠ으로 처리한 pWE15 코즈미드와 연결하였다. in vitro에서 만들어진 연결 혼합물을 promega Co.(Madison WI, USA)에 의해 제공된 표준 프로토콜에 따라 대장균 LE392에 형질전환하였다. 탈염소화 활성을 갖는 클론된 세포를 상기의 방법에 의해서 선택하였다. 몇 서브클론을 여러 가지 엔도뉴클레이즈(endonuclease)를 사용하는 Sambrook 등의 결손 방법에 의해 만들었다. 일방향 결손 돌연변이주가 Erase-a-Base system(Promega Co., Madison, WI, USA)를 사용하여서, 서브클론(subclone)인 pKC158의 BamHⅠ단편으로부터 제조되었다.
4-염화벤조에이트-코에이 탈할로겐효소를 코딩하는fcbB 유전자를 갖는 DNA 부분을 자동화된 서열 분석기(Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA)로 분석하였다. 얻어진 염기 서열은 DNASIS, PROSIS와 Clustal W. 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
슈도모나스 sp. DJ-12의 염색체 DNA로부터 fcbB 유전자를 갖는 40kb Sau3AⅠ단편을 클로닝하여서 pKC1으로 명명하였다 (도 1). pKC1 프라즈미드 내의 탈염소화 유전자를 pKC15(36kb), pKC157(22kb)와 pKC158로 더욱 서브클로닝 하였다. 이들 모두는 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 4-염화벤조에이트에 대한 탈염소화 반응을 나타내었다.
클로닝된 세포에 의한 4-염화벤조에이트의 탈 염소화의 대표적인 결과가 도 2에서 보여준다. 도 2에서 ■는 4-염화벤조에이트이고,는 4-하이드록시벤조에이트이고, ▲는 염화이온이다. 4-염화벤조에이트의 양은 시간이 지남에 따라 감소하고, 4-하이드록시벤조에이트와 염화 이온의 양은 시간에 따라 증가하였다. 4-염화벤조에이트의 탈 염소화에 의해 생성된 대사물인 4-하이드록시벤조에이트는 가스 분광계와 매스 분광계를 사용하여 확인하였다. 도 3의 매스 분광계에서 보는 바와 같이 4-하이드록시벤조에이트의 메틸에스터가 확인되었다. 메틸에스터는 m/z 152에서 분자 이온을 m/z 121(M-0CH3)와 m/z93(M-COOCH3)에서 주된 단편 이온들을 갖는다. 이 결과는 4-염화벤조에이트의 가수분해적 탈 염소화에 관여하는 유전자가 클론되고 대장균내에서 잘 발현되었다는 것을 의미하는 것이다. 4-염화벤조에이트-코에이 탈할로겐효소의 염기 서열과 아미노산 서열은 [서열 1]과 [서열 2]에서 잘 나타내고 있다. 4-염화벤조에이트-CoA 탈 할로겐효소를 코딩하는 fcbB 유전자의 오픈 리딩 프레임은 810 bp로 구성되어 있고 구조유전자의 G+C 양은 61.9%이다. 프로모터 서열(-35와 -10 지역)과 라이보좀 결합자리가 유전자의 시작 코돈의 업스트림 쪽에 위치한다.
[표 1] fcbB 아미노산 서열 상동성
세균 종(GenBank 번호) 추론된 아미노산의 일치(%)
fcbA fcbB fcbC
Pseudomonas sp.CBS3(42560) 56 85 64
Arthrobacter sp.SU(M93187) 43 45 12
Arthrobacter sp.TM1(AF042490) 43 45 13
[서열 목록]
서열 번호 : 1
서열의 길이 : 900
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : genomic DNA
기원
생물명 : 슈도모나스 sp.
주명 : DJ-12
서열의 특징
특징을 나타내는 기호 : -35 signal
존재 위치 : 4..9
특징을 결정하는 방법 : E
특징을 나타내는 기호 : -10 signal
존재 위치 : 27..32
특징을 결정하는 방법 : E
특징을 나타내는 기호 : PBS
존재 위치 : 53..58
특징을 결정하는 방법 : S
특징을 나타내는 기호 : Terminator
존재 위치 : 874..876
특징을 결정하는 방법 : S
[서열 1]
CTATTGACTA ATCGAATTTT GGCCGCTATC GTTCGCCTCC ACTACTCGTC ACAAGGAGCA 60
TTTCACATGT ACGAAGCCAT CGGTCACCGC GTTCAGGACG GCGTCGCGGA AATCACGATC 120
AACCTGCCGC GCCATCGGAA TGCGCTGTCG GTCAAGGCGA TGCAAGAGAT CACCGACGCG 180
CTGAATCGAG CCGAGGAAGA CGACGGCGTG GGAGCGGTGA TGATTACCGG CGCTGCTGAC 240
GCGTTCTGCG CTGGCTTCTA CCTGCGCGAG ATTCCGCTCG ACAACGGTGT CGCCGGCATC 300
CGTGACCACT TCCGAGTCGC TGCCCTCTGG TGGCACCAGA TGATCCACAA GATCATTCGT 360
GTGAAGAGGC CGGTGTTGGC GGCCGTTAAT GGCGTCGCAG CCGGCGGCGG CCTGGGCGTG 420
CTGCTGGCCA GCGATATGGC CATCTGTTCA GACAACGCCA AATTCGTGTG CGCCTGGCAC 480
AGCATCGGCA TTGGAAATGA CACGGCGACG AGTTACAGCC TAACGCGCGC AGTTGGTATG 540
CGCAGAGCAA TGGAGCTCAT GCTGACCAAC CGGACGCTGC AGCCGTCGGA GGCCTGCGAC 600
TGGGGCATCG TCAATCGCGT CTATCCCCAG GCGCAATTCC GAGACATCGC GTGGAAGGCT 660
GCTCGCGAAC TCGCATCGGT GCCCACGCAC CTGCAGGTGA TGGCCAAGGA GCGGTTCCAC 720
GCCGGCTGGA TGCAGCCGGT CGAGGAATGC ACGGAGTTTG AGATTCAGAA CGTGATCTCG 780
TCTGTGACCC ATCCGCACTT CATGCCGCGG CTCAAGCGAT TCCTGGACGG CGATAAGGCT 840
GATCGCGCGC AGGTCGAGTT GCCCTCGGGC TTTTGAAGGA ACGGCGGATG CAGACAGTCA
서열 번호 : 2
서열의 길이 : 269
서열의 타입 : 아미노산
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : 단백질
[서열 2]
Ile Thr Ile Asn Leu Pro Arg His Arg Asn Ala Leu Ser Val Lys 30
Ala Met Gln Glu Ile Tyr Asp Ala Leu Asn Arg Ala Glu Glu Asp 45
Asp Asn Val Gly Ala Val Met Ile Tyr Gly Ala Ala Asp Ala Phe 60
Cys Ala Gly Phe Tyr Leu Arg Glu Ile Pro Leu Asp Asn Gly Val 75
Ala Gly Ile Arg Asp His Phe Arg Val Ala Ala Leu Trp Trp His 90
Gln Met Ile His Lys Ile Ile Arg Val Lys Arg Pro Val Leu Ala 105
Ala Val Asn Gly Val Ala Ala Gly Gly Gly Leu Gly Val Leu Leu 120
Ala Ser Asp Met Ala Ile Cys Ser Asp Asn Ala Lys Phe Val Cys 135
Ala Trp His Ser Ile Gly Ile Gly Asn Asp Thr Ala Thr Ser Tyr 150
Ser Leu Thr Arg Ala Val Gly Met Arg Arg Ala Met Glu Leu Met 165
Leu Thr Asn Arg Thr Leu Gln Pro Ser Glu Ala Cys Asp Trp Gly 180
Ile Val Asn Arg Val Tyr Pro Gln Ala Gln Phe Arg Asp Ile Ala 195
Trp Lys Ala Ala Arg Glu Leu Ala Ser Val Pro Thr His Leu Gln 210
Val Met Ala Lys Glu Arg Phe His Ala Gly Trp Met Gln Pro Val 225
Glu Glu Cys Thr Glu Phe Glu Ile Gln Asn Val Ile Ser Ser Val 240
Thr His Pro His Phe Met Pro Arg Leu Lys Arg Phe Leu Asp Gly 255
Asp Lys Ala Asp Arg Ala Gln Val Glu Leu Pro Ser Gly Phe
상기한 구성의 본 발명에 따르면, 자연계에서 독성이 크고, 잘 분해되지 않는 할로겐화된 방향족화합물의 탈할로겐 반응에 관여하는 4-염화벤조에이트-코엔자임 A 탈할로겐 효소를 코딩하는 fcbB 유전자를 클로닝하여, 이를 재조합 벡터에 삽입하고, 숙주세포에서 상기 효소를 대량생산하여, 이 대량 생산된 효소가 할로겐 방향족화합물을 생물학적으로 분해, 제거하는데 관여하여 환경오염 방지 등에 큰 효과를 갖는다.

Claims (5)

  1. [서열 1]에 기재된 염기 서열을 포함하는 슈도모나스 sp. DJ-12 (KCTC 8967P)의 4-염화벤조에이트-코에이 탈할로겐효소를 코딩하는 fcbB 유전자.
  2. 제1항의 상기 슈도모나스 sp. DJ-12의 fcbB 유전자를 포함하는 재조합 프라즈미드 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기의 재조합 프라즈미드 벡터는 pKC1, pKC15, pKC157, pKC158로 이루어진 군에서 선택되는 것인 재조합 프라즈미드 벡터.
  4. 상기 슈도모나스 sp. DJ-12의 fcbB 유전자를 함유한 제 2 항 또는 제 3항 중 하나의 프라즈미드로 형질전환된 대장균 LE392.
  5. 제 1 항의 fcbB 유전자에 의하여 발현된 [서열 2]의 아미노산 서열을 포함하는 4-염화벤조에이트-코에이 탈할로겐효소 단백질.
KR1019990047212A 1999-10-28 1999-10-28 슈도모나스 에스피. 디제이-12에서 4-염화벤조에이트-코엔자임 에이 탈할로겐효소를 코딩하는 클로닝된 에프씨비비 유전자 및 그 유전자의 재조합 플라스미드 벡터 KR100316975B1 (ko)

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