KR100301960B1 - Method for Manufacturing Succinic Acid from Whey - Google Patents
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Abstract
본 발명은 낙농 산업에서 나오는 폐기물인 유청을 배양원료로 포함하는 배양배지에 숙신산 발효미생물을 접종하고, 회분식 또는 연속식 배양과정을 통해 배양시킴으로써, 숙신산을 고수율 및 고생산성으로 생산할 수 있는 유청을 이용한 숙신상의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 유청을 이용한 숙신산의 생산방법은, 유청 또는 유당을 배양원료로 포함하는 배양배지에 숙신산 발효미생물을 접종하여 배양하고, 전기 배양물로부터 숙신산을 수득하는 공정을 포함하는 숙신산의 생산방법이다. 본 발명에 의하면, 연속식 배양의 경우, 93%의 수율과 1.35g/L/h의 생산성인 고효율로 숙신산을 유청으로부터 생산할 수 있다. 또한, 유청을 배양원료로 이용하기 위해서는 한외여과 또는 가수분해 등의 전처리 과정이 필요하였으나, 본 발명에서는 이를 거치지 않고 바로 배양원료로 이용할 수 있어, 생산 공정상 원가절감에도 기여할 수가 있으며, 유청은 현재 일부분이 사료 등으로 재사용되고 나머지는 버리게 되어 환경문제를 야기하는 바, 본 발명은 이러한 유청을 이용하여 현재 대부분 화학공정에 의해 생산되는 숙신산을 생산할 수 있기 때문에 더욱 그 가치가 높다고 할 수 있다.The present invention inoculates succinic acid fermentation microorganisms into a culture medium containing whey, which is a waste from the dairy industry, as a cultivation material, and cultivates it through a batch or continuous culture process to produce whey that can produce succinic acid in high yield and high productivity. It relates to the production method of succinity phase used. The production method of succinic acid using whey of the present invention is a method of producing succinic acid comprising the step of inoculating and succinic acid fermentation microorganisms in a culture medium containing whey or lactose as a culture material, to obtain succinic acid from the electric culture. . According to the present invention, in the case of continuous culture, succinic acid can be produced from whey with a high efficiency of 93% yield and a productivity of 1.35 g / L / h. In addition, in order to use whey as a culture raw material, a pretreatment process such as ultrafiltration or hydrolysis was required, but in the present invention, it can be used as a culture raw material without going through it, thus contributing to cost reduction in the production process. Some parts are reused as feed and others are discarded, causing environmental problems. The present invention is more valuable because it can produce succinic acid produced by most chemical processes.
Description
본 발명은 유청을 이용한 숙신산의 생산방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 낙농 산업에서 나오는 폐기물인 유청을 배양원료로 포함하는 배양배지에 숙신산 발효미생물을 접종하고, 회분식 또는 연속식 배양과정을 통해 배양시킴으로써, 숙신산을 고수율 및 고생산성으로 생산할 수 있는 유청을 이용한 숙신상의 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing succinic acid using whey. More specifically, the present invention inoculates succinic acid fermentation microorganisms into a culture medium containing whey, which is a waste from the dairy industry, as a cultivation material, and cultures the succinic acid in high yield and high productivity by batch or continuous culture. The present invention relates to a method for producing succinate using whey that can be produced.
최근 환경규제 등의 강화로 인해 석유화학 제품 및 화학적 합성공정에 대한생산단가, 이용 및 처리비용 등이 급격히 상승한 반면, 미생물 배양기술과 유전공학적 기술의 획기적인 발달에 힘입어 생물학적 방법에 의한 생화학물질 (biochemical)의 생산이 점차 관심을 끌고 있다. 이러한 생물학적 방법에 의한 생화학물질의 생산은 사용원료가 값싼 재생자원(renewable resource)이라는 측면에서 화학합성법보다 경제적인 우월성을 인정받고 있으며(참조: Landucci et al., Appl. Biochem. Biotechnol., l45:678-696 (1994)), 환경친화적 공정이라는 장점이 있으므로, 이를 대량생산에 적용하고 전체적인 원가절감 효과를 얻기 위하여 점차 연구가 확대되고 있는 추세이다. 또한, 최근 들어 생화학물질의 가격이 많이 하락하여 이에 대한 시장성이 매우 높아지고 있는 상태이며, 이러한 이유로 인해 미생물을 이용하여 생물자원(biomass)으로부터 젖산(lactic acid), 초산(acetic acid), 숙신산(succinic acid) 등의 유기산을 생물학적 방법에 의하여 생산하고자 하는 노력이 활발히 이루어지고 있다(참조: 임억규, 생물산업, 5:60-75(1992)).Recently, due to the strengthening of environmental regulations, production costs, utilization and processing costs for petrochemical products and chemical synthesis processes have risen sharply, while biochemicals by biological methods have been improved due to the breakthrough of microbial culture technology and genetic engineering technology. Biochemical production is of increasing interest. The production of biochemicals by these biological methods is recognized to be economically superior to chemical synthesis in that the raw materials are cheap renewable resources (Landucci et al., Appl. Biochem. Biotechnol., L45: 678-696 (1994)), which has the advantage of being an environmentally friendly process, is increasingly being researched in order to apply it to mass production and to obtain an overall cost reduction effect. In addition, the price of biochemicals has recently decreased a lot, and the marketability for this has been increasing. For this reason, lactic acid, acetic acid, and succinic acid are derived from biomass using microorganisms. Efforts have been actively made to produce organic acids, such as acids, by biological methods (Lim Euk-kyu, Bioindustry, 5: 60-75 (1992)).
숙신산의 생물학적 생산에 대한 연구는 1938년 록우드(Lockwood) 등이 미생물인 푸사리움 마티(Fusarium martii)를 이용하여 당으로부터 18%의 수율로 숙신산을 생산한 것을 발표하면서 시작되었다. 그 후, 숙시니비브리오 덱스트리노솔벤스 (Succinivibrio dextrinosolvens), 피브로박터 숙시노겐스(Fibrobacter succinogenes) 또는 루미노코커스 플라비파시엔스(Ruminococcus flavefaciens) 등을 포함한 다양한 종류의 혐기성 미생물(참조: Zeikus, Annu Rev Microbiol, 34:423-464(1980))이 포도당대사를 통하여 숙신산을 최종산물로 생성하는 것으로 보고되었지만, 산업적으로 유용한 경제성이 있는 높은 수율의 숙신산을 생성하는 균주는 보고되지 않았으며, 다만 최근에 다른 숙신산 생산 혐기성 미생물과는 다르게, 과량의 탄산 존재 시에 포도당으로부터 높은 농도와 수율로 숙신산을 생산하는 언에어로바이오스피리움 숙시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succinici producens)가 숙신산을 직접 생산하는 가장 유망한 균주 중의 하나로 밝혀졌다.The study of the biological production of succinic acid began in 1938 when Lockwood et al. Announced the production of succinic acid from sugar by 18% yield using the microorganism Fusarium martii. Thereafter, various types of anaerobic microorganisms (Succinivibrio dextrinosolvens), Fibrobacter succinogenes or Ruminococcus flavefaciens, etc. (see Zeikus, Annu Rev Microbiol (34: 423-464 (1980)) has been reported to produce succinic acid as a final product via glucose metabolism, but no industrially useful strains have been reported producing high yields of succinic acid. Unlike most other succinic acid-producing anaerobic microorganisms, Anaerobiospirillum succinici producens, which produces succinic acid in high concentrations and yields from glucose in the presence of excess carbonic acid, produces the most succinic acid directly. It turns out to be one of the promising strains.
한편, 치즈제조시 생기는 부산물인 유청은 단백질, 유당, 수용성 비타민 및 무기질 등의 유용한 성분을 함유하고 있으므로, 이들 성분의 이용을 위한 다양한 연구가 진행되고 있으나, 현재까지 유청을 원료로서 이용하는 숙신산 생산방법에 대한 연구는 국내외적으로 전무한 실정이다. 또한, 현재 낙농산업에서 생산되는 유청이 대부분 폐기되고 있고, 이에 따른 환경문제가 대두되고 있는 상황에서 유청을 이용한 생화학물질, 특히 숙신산을 생산할 수 있는 기술이 개발된다면 산업적으로는 물론 환경적인 부분에 있어서도 기여하는 바가 클 것이다. 아울러, 숙신산은현재 화학공정에 의한 생산방법과 비교하여 가격경쟁력을 가질 수 있는 것으로 예측되는 몇 가지 대체 생화학물질 중의 하나이므로, 앞으로 숙신산의 제조방법에 대하여 많은 연구가 진행될 것으로 보이나, 아직 생물학적인 방법에 의한 배양공정이나 생산방법에 대한 연구는 많이 수행되지 않은 실정이다.On the other hand, whey, a by-product of cheese production, contains useful ingredients such as protein, lactose, water-soluble vitamins, and minerals. Therefore, various studies have been conducted for the use of these ingredients, but to date, succinic acid production method using whey as a raw material There is no research on domestic and international. In addition, whey produced in the dairy industry is mostly disposed of, and environmental problems are being raised, so if a technology capable of producing biochemicals using whey, especially succinic acid, is developed, both industrially and environmentally. Your contribution will be great. In addition, since succinic acid is one of several alternative biochemicals that are expected to have a price competitiveness compared to the production method by the current chemical process, many studies will be conducted on the method of producing succinic acid in the future, but the biological method Research on the cultivation process or production method by the situation is not carried out much.
생물학적 방법에 의한 숙신산의 생산방법에 대해서는 미국특허 제 5,143,833호 및 미국특허 제 5,143,834호에서 혐기적 조건의 배양에 의한 숙신산의 생산방법 및 분리방법이 개시되어 있으나, 전기 발명에서는 미생물의 에너지원으로 포도당을 이용하였으며, 배양공정도 회분식 배양공정만을 다룸으로써, 단순히 숙신산을 회분식 배양방법에 의하여 생산할 수 있다는 가능성을 제시하였을 뿐, 숙신산의 최적화된 생산방법이나 환경문제를 고려한 원료의 선택 등에 대한 고려는 포함되지 않았다. 한편, 자원으로서 가치가 높게 대두되는 유청을 원료로 이용하는 일반적인 배양공정이 당업계에 공지되어 있으나, 종래의 유청을 이용하는 배양공정에서는 반드시 유청을 한외여과 또는 가수분해 방법에 의하여 전처리하여 이용해야 하는 불편함이 있어왔다.Regarding the production method of succinic acid by biological method, US Pat. No. 5,143,833 and US Pat. No. 5,143,834 disclose a method for producing and isolating succinic acid by culturing under anaerobic conditions. The process of cultivating succinic acid can be produced simply by batch cultivation, and the cultivation process also includes consideration of the optimized production method of succinic acid and the selection of raw materials in consideration of environmental issues. It wasn't. On the other hand, although a general culture process using whey, which has high value as a resource, is known in the art, in the conventional culture process using whey, it is inconvenient to use the whey by pretreatment by ultrafiltration or hydrolysis method. Has been.
따라서, 생물학적 방법으로 숙신산을 생산할 수 있는 숙신산의 최적화된 배양공정 및 조건을 확립하고, 원료로서 유청을 전처리 등의 불편함 없이 효율적으로 이용하여 경제적으로 숙신산을 생산할 수 있는 기술을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.Therefore, there is a need to establish an optimized culture process and conditions for succinic acid that can produce succinic acid by biological method, and to develop a technology that can economically produce succinic acid by using whey as a raw material efficiently without any inconvenience. Constantly emerging.
이에, 본 발명자들은 유청을 효율적으로 이용한 배양공정에 의하여 숙신산을 효과적으로 생산할 수 있는 기술을 확립하고자 예의 노력한 결과, 기존의 배양공정에서 이용한 포도당 대신에, 유청에 다량 포함된 유당을 이용하여 숙신산을 생산할 수 있는 회분식 또는 연속식 배양공정을 개발하고, 이를 이용하여 기존에 보고된 숙신산 수율보다 획기적으로 높은 수율로 숙신산을 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made efforts to establish a technology that can effectively produce succinic acid by the culture process using whey efficiently, instead of glucose used in the existing culture process, to produce succinic acid using lactose contained in a large amount of whey By developing a batch or continuous culture process that can be used, it was confirmed that it can produce succinic acid at a significantly higher yield than the previously reported succinic acid yield, and completed the present invention.
결국, 본 발명의 주된 목적은 유청 또는 유청으로부터 유래된 유당을 배양원료로 이용하여 회분식 또는 연속식 배양공정에 의하여 효과적으로 숙신산을 생산하는 유청을 이용한 숙신산의 생산방법을 제공하는 것이다.After all, the main object of the present invention is to provide a method for producing succinic acid using whey which effectively produces succinic acid by batch or continuous culture process using whey or whey derived from whey as a culture raw material.
도 1은 유청을 이용한 회분식 숙신산 배양 특성을 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the batch succinic acid culture characteristics using whey.
도 2는 유청 및 포도당을 이용한 회분식 숙신산 배양 특성을 나타낸 그래프이다.Figure 2 is a graph showing the batch succinic acid culture characteristics using whey and glucose.
도 3은 숙신산 연속배양기의 구성을 모식적으로 나타낸 그림이다.3 is a diagram schematically showing the configuration of the succinic acid continuous incubator.
도 4는 유청을 이용한 숙신산 연속배양에서의 배양특성을 나타낸 그래프이다.Figure 4 is a graph showing the culture characteristics in succinic acid continuous culture using whey.
도 5는 유청을 이용한 숙신산 연속배양에서의 희석속도에 따른 숙신산 수율 및 숙신산과 초산의 생성비를 나타낸 그래프이다.5 is a graph showing the yield of succinic acid and the production ratio of succinic acid and acetic acid according to the dilution rate in succinic acid continuous culture using whey.
본 발명의 유청을 이용한 숙신산의 생산방법은, 유청 또는 유당을 배양원료로 포함하는 배양배지에 숙신산 발효미생물을 접종하여 배양하고, 전기 배양물로부터 숙신산을 수득하는 공정을 포함하는 숙신산의 생산방법이다.The production method of succinic acid using whey of the present invention is a method of producing succinic acid comprising the step of inoculating and succinic acid fermentation microorganisms in a culture medium containing whey or lactose as a culture material, to obtain succinic acid from the electric culture. .
이때, 유청 또는 유당은 배양배지 리터 당 10 내지 40g 포함시킬 수 있으며, 분말 또는 액체 상태인 유청 또는 유당을 이용할 수 있고, 한외여과 또는 가수분해등의 별도의 전처리 과정 없이 살균된 유청을 바로 숙신산 생산을 위한 미생물 배지성분으로 사용할 수 있다. 숙신산 발효미생물의 배양을 위한 배양배지는 혐기성미생물을 배양할 수 있는 배지면 어느 것이나 사용할 수 있으나, 배지에 폴리펩톤과 효모추출물 성분이 유청 20g 당 2 내지 7g씩 포함되도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 숙신산 발효미생물은 혐기성 숙신산 발효미생물인 언에어로바이오스피리움 숙시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 숙시니비브리오 덱스트리노솔벤스(Succinivibrio dextrinosolvens), 피브로박터 숙시노겐스 (Fibrobacter succinogenes) 또는 루미노코커스 플라비파시엔스(Ruminococcus flavefaciens) 등을 사용할 수 있으나, 가장 바람직하게는 언에어로바이오스피리움 숙시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens)(참조: David et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 26: 498-504(1976))를 사용한다. 그리고, 배양은 회분식 또는 연속식 배양을 이용할 수 있으며, 배양시 35 내지 42℃, 바람직하게는 37 내지 40℃, 가장 바람직하게는 39℃의 온도 및 pH 6.0 내지 7.5 범위에서, 탄산가스를 0.25 내지 0.5vvm의 유속으로 공급하면서 배양을 수행하며, 특히 연속식 배양시에는 먼저 회분식 방법에 의하여 배양을 40시간 내지 70시간동안 진행한 다음, 희석속도(dilution rate, D, 배지흐름속도/전체배양부피)를 변화시키면서 연속식 배양을 수행한다. 또한, 회분식 배양시에는 유청과 함께 포도당을 배양배지 리터 당 4 내지 9g 추가로 포함시키는 것이 바람직하며, 연속식 배양을 이용하여 숙신산 발효미생물을 배양시킬 때에는 희석속도(dilution rate, D, 배지흐름속도/전체배양부피)를 0.02 내지 0.15h-1, 바람직하게는 0.08 내지 0.13h-1, 가장 바람직하게는 0.11h-1로 유지시켜야 고농도 및 고생산성으로 숙신산을 생산할 수 있다.At this time, the whey or lactose may include 10 to 40g per liter of culture medium, and may use powder or liquid whey or lactose, and directly produce succinic acid sterilized without separate pretreatment such as ultrafiltration or hydrolysis. It can be used as a microbial medium component. The culture medium for the culture of succinic acid fermentation microorganisms may be used as long as the medium for culturing anaerobic microorganisms, it is preferable that the polypeptone and yeast extract components 2 to 7g per 20g of whey in the medium. In addition, the succinic acid fermentation microorganisms are Anaerobiospirillum succiniciproducens, Succinivibrio dextrinosolvens, Fibrobacter succinogens or Fibrobacter uccino, which are anaerobic succinic acid fermentation microorganisms. Ruminococcus flavefaciens and the like can be used, but most preferably Anaerobiospirillum succiniciproducens (David et al., Int. J. Syst. Bacteriol. , 26: 498-504 (1976). In addition, the culture may use a batch or continuous culture, at the temperature of 35 to 42 ℃, preferably 37 to 40 ℃, most preferably 39 ℃ and pH 6.0 to 7.5, the carbon dioxide gas 0.25 to The culture is carried out while supplying at a flow rate of 0.5 vvm, and in particular, in the case of continuous culture, the culture is first carried out by a batch method for 40 to 70 hours, and then the dilution rate (D, medium flow rate / total culture volume). The continuous culture is carried out with varying). In addition, in batch culture, it is preferable to include 4 to 9 g of glucose per liter of culture medium together with whey, and dilution rate (D, media flow rate) when succinic acid fermentation microorganism is cultured using continuous culture. / is the total culture volume) of 0.02 to 0.15h -1, preferably 0.08 to 0.13h -1, and most preferably can produce succinic acid with high concentration and high productivity to be maintained 0.11h -1.
본 발명의 유청을 이용한 숙신산의 생산방법에서는 별도의 전처리 과정을 거치지 않은 유청을 배양원료로서 이용하는 바, 유청에 포함된 유당이 숙신산 발효미생물에 의하여 소모되면서 숙신산이 생산된다. 이때, 유청 또는 유당을 배양원료로서 이용하는 것은 종래의 포도당을 이용한 배양공정에서 얻을 수 있는 숙신산 생산성을 상회하는 숙신산 생산을 가능하게 함은 물론, 미생물의 성장에 저해를 유발시키는 초산의 과잉생성을 상대적으로 억제하는 효과를 함께 수반하므로, 고효율 및 고경제성의 숙신산 생산을 가능하게 한다.In the production method of succinic acid using whey of the present invention, barley whey which has not been subjected to a separate pretreatment process is used as a culture raw material. As succinic acid is consumed by succinic acid fermentation microorganisms, succinic acid is produced. At this time, the use of whey or lactose as a culture material enables the production of succinic acid that exceeds the productivity of succinic acid obtained by the conventional glucose cultivation process, as well as the relative overproduction of acetic acid causing inhibition of microbial growth. It is accompanied by the effect of suppressing the succinic acid, which enables high efficiency and high economic efficiency.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .
실시예 1 :유청을 이용한 회분식 배양 Example 1: Batch Culture Using Whey
배양원료로서 유청을 이용하여 회분식 배양을 수행하였다: 균주는 혐기적 미생물인 언에어로바이오스피리움 숙시니시프로두센스(ATCC 29305)를 사용하고, 배양기에서 본배양을 하기 전, 5g/L의 유당, 5g/L의 폴리펩톤, 5g/L의 효모추출물, 3g/L의 K2HPO4, 1g/L의 NaCl, 1g/L의 (NH4)2SO4, 0.2g/L의 CaCl2·2H2O, 0.2g/L의MgCl2·6H2O 및 1g/L의 Na2CO3로 구성된 전배양 배지를 조제한 다음, 혐기적 배양을 위하여 탄산가스를 주입한 100㎖ 플라스크에 균을 접종하고, 39℃에서 14시간동안 전배양을 하였다. 다음으로, 20g/L의 유청, 5g/L의 폴리펩톤, 5g/L의 효모추출물, 3g/L의 K2HPO4, 1g/L의 NaCl, 5g/L의 (NH4)2SO4, 0.2g/L의 CaCl2·2H2O, 0.2g/L의 MgCl2·6H2O, 5mg/L의 FeSO4·7H2O 및 5g/L의 Na2CO3로 구성된 본배양 배지를 조제하고 2.5L의 배양조에 0.9L의 배지를 주입한 다음, 온도 및 pH를 각각 39℃와 6.5로 맞춰주고, 100㎖의 전배양된 숙신산 발효미생물을 접종하였으며, 혐기상태를 유지하기 위하여 탄산가스를 0.25vvm의 유속으로 공급하면서 미생물을 배양하였다. 총 63시간동안 배양을 진행시키면서, 시간별로 배양기로부터 배지를 채취하여 배양액 내의 숙신산, 유당, 초산 및 갈락토오스의 양을 유기산 및 당류를 분석할 수 있는 Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, 미국)을 이용한 HPLC 방법으로 측정하였다(참조: 도 1). 도 1에서, (○)는 숙신산; (■)는 유당; (◇)는 초산; 및 (▽)는 갈락토오스의 배양시간에 따른 농도를 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 20g/L의 유청을 배양원료로서 이용한 회분식 숙신산 발효를 수행하였을 때, 63시간의 배양 후에 유청에 포함된 유당이 거의 소모하였으며, 이때 얻어진 숙신산의 농도는 15.5g/L이고, 숙신산 수율(생성된 숙신산의 양/소모된 유당의 양)은 93%이며, 숙신산의 부피생산성(생성된 숙신산의 양/단위부피/단위시간)은 0.24g/L/h이었다.Batch cultivation was carried out using whey as a culture raw material: the strain was prepared using an anaerobic microorganism, An Aerobiopyridium succinic niprodusense (ATCC 29305), and 5 g / L of lactose before incubation in the incubator. , 5 g / L polypeptone, 5 g / L yeast extract, 3 g / L K 2 HPO 4 , 1 g / L NaCl, 1 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.2 g / L CaCl 2 A preculture medium consisting of 2H 2 O, 0.2 g / L MgCl 2 · 6H 2 O and 1 g / L Na 2 CO 3 was prepared, and then inoculated into a 100 ml flask filled with carbon dioxide for anaerobic culture. And preculture was carried out for 14 hours at 39 ℃. Next, 20 g / L whey, 5 g / L polypeptone, 5 g / L yeast extract, 3 g / L K 2 HPO 4 , 1 g / L NaCl, 5 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , Prepare the main culture medium consisting of 0.2 g / L CaCl 2 · 2H 2 O, 0.2 g / L MgCl 2 · 6H 2 O, 5 mg / L FeSO 4 · 7H 2 O, and 5 g / L Na 2 CO 3 Inject 0.9 L of medium into a 2.5 L culture tank, adjust the temperature and pH to 39 ° C. and 6.5, respectively, inoculate 100 ml of pre-cultivated succinic acid fermentation microorganisms, and add carbon dioxide to maintain anaerobic conditions. The microorganisms were cultured while feeding at a flow rate of vvm. A 63-hour Aminex HPX-87H column (Bio-Rad, USA), in which the medium was taken from the incubator and analyzed the amount of succinic acid, lactose, acetic acid and galactose in organic medium and sugars, was incubated for 63 hours. It was measured by the HPLC method used (see Fig. 1). In Fig. 1, (○) represents succinic acid; (■) is lactose; (◇) acetic acid; And (▽) represents the concentration according to the incubation time of galactose. As shown in FIG. 1, when batch succinic acid fermentation using 20 g / L of whey was used as a culture material, lactose contained in whey was almost consumed after 63 hours of incubation, and the concentration of succinic acid was 15.5 g / L. The yield of succinic acid (amount of produced succinic acid / amount of lactose consumed) was 93%, and the volumetric productivity of succinic acid (amount / unit volume / unit time) was 0.24 g / L / h.
실시예 2 :유청 및 포도당을 이용한 회분식 배양 Example 2: batch culture with whey and glucose
회분식 배양에 있어서, 숙신산을 효율적으로 생산할 수 있는 배양조성을 최적화하기 위하여, 20g/L의 유청 및 7g/L의 포도당을 배양원료로 하여, 실시예 1에서 제시한 배양조건하에서 회분식 배양을 수행하였으며, 총 36시간동안 배양을 진행시키면서, 시간별로 배양기로부터 배지를 채취하여 배양액 내의 숙신산, 유당, 초산 및 포도당의 양을 유기산 및 당류를 분석할 수 있는 Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, 미국)을 이용한 HPLC 방법으로 측정하였다(참조: 도 2). 도 2에서, (○)는 숙신산; (■)는 유당; (◇)는 초산; 및 (▼)는 포도당의 배양시간에 따른 농도를 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 약 8시간의 배양 후에 포도당이 완전히 소모되었고, 이후부터 유청으로부터 유래된 유당이 소모되기 시작하였다. 배양 36시간이 경과한 다음에 얻어진 숙신산의 농도는 17.5g/L이고, 숙신산 수율(생성된 숙신산의 양/소모된 유당과 포도당의 양)은 95%이며, 숙신산의 부피생산성(생성된 숙신산의 양/단위부피/단위시간)은 0.46g/L/h이었다. 결과적으로, 실시예 2에서 얻어진 숙신산의 수율(95%)은 실시예 1에서 얻어진 숙신산 수율(93%)보다 높았으며, 또한 기존에 포도당을 이용하여 생산된 92%의 숙신산 수율(참조: Nghiem, N. P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 57/58; 633-638)보다도 높은 것이었다. 이로써, 실시예 1에서 제시한 회분식 배양공정보다 뛰어난 숙신산 생산능을 확보하기 위해서는, 회분식 배양 공정시, 유청과 함께 포도당을 동시에 배양원료로 이용하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.In the batch culture, in order to optimize the culture composition capable of efficiently producing succinic acid, batch culture was performed under the culture conditions shown in Example 1 using 20 g / L of whey and 7 g / L of glucose as a raw material. While incubating for a total of 36 hours, Aminex HPX-87H column (Bio-Rad, USA) can be used to collect the medium from the incubator and analyze the organic acid and sugars in the culture medium for the amount of succinic acid, lactose, acetic acid, and glucose. It was measured by the HPLC method used (see Fig. 2). In Figure 2, (○) is succinic acid; (■) is lactose; (◇) acetic acid; And (▼) indicate the concentration according to the incubation time of glucose. As shown in FIG. 2, glucose was consumed completely after about 8 hours of incubation, and lactose derived from whey began to be consumed thereafter. After 36 hours of culture, the concentration of succinic acid obtained was 17.5 g / L, the yield of succinic acid (amount of succinic acid produced / amount of lactose and glucose consumed) was 95%, and the volumetric productivity of succinic acid (of succinic acid produced). Volume / unit volume / unit time) was 0.46 g / L / h. As a result, the yield of succinic acid obtained in Example 2 (95%) was higher than the yield of succinic acid obtained in Example 1 (93%), and also 92% of succinic acid yield previously produced using glucose (Nghiem, NP et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 57/58; 633-638). As a result, in order to secure succinic acid production ability superior to the batch culture step shown in Example 1, it was found that it is preferable to use glucose as a culture material simultaneously with whey at the time of the batch culture step.
실시예 3 :유청을 이용한 연속식 배양 Example 3: The continuous culture using the whey
본 발명의 유청을 이용한 숙신산의 생산방법을 연속식 배양에 의하여 수행하였다: 연속배양으로는 배지탱크, 배양조 및 회수탱크의 세부분으로 구성된 1단의 연속배양기를 사용하였으며(참조: 도 3), 배양액의 부피를 500㎖로 하고, 배양 시작시의 배지 및 연속식 배양시 반응기에 공급할 새로운 배지의 조성은 실시예 1의 본배양 배지와 동일하였으며, 혐기적 조건을 만들기 위해서 1일간 산소가 제거된 탄산가스를 약 1vvm의 유속으로 공급한 다음에, 연속식 배양을 시작할 때에는 0.1vvm의 유속으로 탄산가스를 공급하였다. 20g/L의 유청을 포함하는 배양배지에 100㎖의 전배양된 숙신산 발효미생물 언에어로바이오스피리움 숙시니시프로두센스를 접종하여 회분식 방법에 의하여 배양을 54시간동안 수행한 다음, 희석속도(dilution rate, D, 배지흐름속도/전체배양부피)를 변화시키면서 연속식 배양을 시작하여 384시간동안 배양을 진행하였다. 연속식 배양을 수행하면서 희석속도에 따른 유당, 숙신산 및 초산의 농도를 배양배지로부터 HPLC 방법에 의하여 측정하여, 이로부터 숙신산의 생산성(참조: 도 4) 및 숙신산의 수율(참조: 도 5)을 계산하였다. 도 4에서, (○)는 숙신산; (■)는 유당; 및 (◇)는 초산의 연속식 배양에서 희석속도에 따른 농도를 나타내며, (▼)는 숙신산의 희석속도에 따른 생산성을 나타낸다. 또한, 도 5에서, (○)는 숙신산의 희석속도에 따른 수율을 나타내며; 및 (●)는 숙신산과 초산의 비율(ratio of acetic acid to succinic acid)를 나타낸다. 도 4 및 도 5에서 보듯이, 처음조건인 희석속도 0.028h-1인 경우, 숙신산의 농도는 14g/L이었으며, 이때의 숙신산 생산성 및 수율은 각각 0.4g/L/h 와 93%였다. 그러나, 점차 희석속도를 증가시킴에 따라 숙신산의 생산성이 증가되었으며, 희석속도의 변화와는 관계없이 숙신산 수율은 93%로 일정하게 유지되었다. 희석속도가 0.11h-1인 경우, 최고의 숙신산 생산성(1.35g/L/h)을 보였으며, 희석속도를 0.11h-1이상으로 조절하자 숙신산 발효미생물이 유당을 완전히 소비 못하기 시작하여, 그 결과로 숙신산의 생산성, 농도 및 수율이 떨어지기 시작하였다. 따라서, 연속식 배양을 통하여 가장 효율적인 숙신산 생산을 수행하기 위해서는 희석속도를 0.02 내지 0.15h-1, 바람직하게는 0.08 내지 0.13h-1, 가장 바람직하게는 0.11h-1로 조절해야 함을 알 수 있었다. 결과적으로, 회분식 배양보다 훨씬 높은 생산성으로 숙신산을 유청을 이용하여 생산할 수 있었으며, 이는 회분식 배양에서 발생하는 미생물의 적응기(lag period)를 단축한 결과로 여겨진다. 또한, 이 결과로써 기존의 포도당을 배양원료로 이용한 회분식 배양에서 얻을 수 있는 생산성을 상회하는 숙신산 생산을 유청을 이용한 연속식 배양에서 수행할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 16일간의 연속식 배양 조업기간 동안, 오염에 의한 문제가 발생하지 않았으며, 유청을 전처리 없이 사용할 시에 생성되는 침점물이 새로운 배지의 공급선을 막는 현상도 없이 안정적으로 조업되었다. 이러한 결과는 유청을 배양배지로 이용할 시에 전처리 공정을 생략 및 단순화시킬 수 있음을 제시한다.The production method of succinic acid using whey of the present invention was carried out by continuous culture: As a continuous culture, a single-stage continuous culture machine consisting of a medium tank, a culture tank and a recovery tank was used (see FIG. 3). The volume of the culture medium was 500 ml, and the composition of the medium at the start of the culture and the fresh medium to be supplied to the reactor at the time of continuous culturing were the same as the main culture medium of Example 1, and oxygen was removed for 1 day to make anaerobic conditions. The obtained carbon dioxide gas was supplied at a flow rate of about 1 vvm, and then carbon dioxide gas was supplied at a flow rate of 0.1 vmv when continuous culture was started. Inoculate 100 ml of pre-cultured succinic acid fermented microorganisms aerobiopyridium succinicis produsense into a culture medium containing 20 g / L of whey and incubate for 54 hours by batch method, followed by dilution. rate, D, medium flow rate / total culture volume) was started and continuous culture was performed for 384 hours. The concentration of lactose, succinic acid and acetic acid according to the dilution rate was measured by HPLC method from the culture medium while performing continuous culturing, from which the productivity of succinic acid (see FIG. 4) and the yield of succinic acid (see FIG. Calculated. In Figure 4, (circle) represents succinic acid; (■) is lactose; And (◇) represents the concentration according to the dilution rate in the continuous culture of acetic acid, (▼) represents the productivity according to the dilution rate of succinic acid. In addition, in Fig. 5 (○) represents the yield according to the dilution rate of succinic acid; And (●) represents the ratio of succinic acid and acetic acid (ratio of acetic acid to succinic acid). As shown in Figure 4 and 5, the initial dilution rate of 0.028h -1 , the concentration of succinic acid was 14g / L, the succinic acid productivity and yield at this time was 0.4g / L / h and 93%, respectively. However, as the dilution rate was gradually increased, the productivity of succinic acid increased, and the yield of succinic acid remained constant at 93% regardless of the change in dilution rate. When the dilution rate was 0.11h -1 , the highest succinic acid productivity was obtained (1.35g / L / h). When the dilution rate was adjusted to 0.11h -1 or more, the succinic acid fermentation microorganisms began to consume lactose completely. As a result, productivity, concentration and yield of succinic acid began to drop. Therefore, the dilution of 0.02 to 0.15h speed in order to perform the most efficient production of succinic acid by the continuous culture -1, preferably 0.08 to 0.13h-1, can be seen that the most preferably adjusted to 0.11h -1 there was. As a result, succinic acid could be produced using whey with much higher productivity than batch culture, which is believed to result from shortening of the lag period of microorganisms occurring in batch culture. In addition, as a result, it was confirmed that succinic acid production exceeding the productivity obtained in batch culture using glucose as a culture material can be performed in continuous culture using whey. In addition, during the 16-day continuous culture operation, there was no problem caused by contamination, and the deposit produced when the whey was used without pretreatment was stably operated without blocking the supply line of the new medium. These results suggest that pretreatment can be omitted and simplified when using whey as a culture medium.
지금까지 공지된 숙신산과 초산의 배양에 의한 생성비는 회분식의 경우 약4:1(g/g)이었는데, 본 발명의 실시예 3에 의한 연속식 배양의 결과에 의하면, 생성비가 약 5:1 내지 6:1로 증가됨을 알 수 있다(참조: 도 5). 이는 유청을 배양원료로 이용한 연속식 배양시, 미생물의 성장에 저해를 끼치는 과량의 초산 생성이 억제된다는 것으로서, 상대적으로 초산의 생성비가 낮아지면 고농도 배양을 원활하게 수행할 수 있게 된다.The production ratio by culturing succinic acid and acetic acid so far known was about 4: 1 (g / g) in the case of batch, and according to the result of the continuous culture according to Example 3 of the present invention, the production ratio was about 5: 1 To 6: 1 (see Figure 5). This means that when the continuous culture using whey as a raw material, the excessive production of acetic acid, which inhibits the growth of microorganisms, is inhibited. When the production rate of acetic acid is relatively low, high concentration culture can be performed smoothly.
유청을 이용하여 회분식 또는 연속식 배양방법에 의해 숙신산을 생산하는 본 발명의 위와 같은 결과들은, 현재까지의 숙신산 생성에 사용된 포도당을 낙농산업에서 생성되는 폐기물인 유청으로 대체할 수 있는 획기적인 공정으로 여겨지며, 별도의 전처리를 하지 않은 유청을 배양원료로 사용하여, 발효에 의해 고수율 및 고생산성의 최적화된 숙신산 생산을 확립시킨 예는 국내외적으로 처음으로써, 환경적인 측면에서도 긍정적인 평가를 받을 수 있다.The above results of the present invention of producing succinic acid by batch or continuous culture method using whey are a breakthrough process that can replace glucose used to produce succinic acid with whey, a waste produced in the dairy industry. It is considered that this is the first case in which the production of optimized succinic acid with high yield and high productivity by fermentation using whey without pre-treatment as a culture raw material can be positively evaluated in terms of environment. have.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail specific parts of the present invention, it is apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 회분식 또는 연속식 배양을 통하여, 낙농산업의 부산물이며 폐기물인 유청을 이용하여 높은 수율로 숙신산을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 유청을 이용한 숙신산의 생산방법에 의하면, 연속식 배양의 경우, 93%의 수율과 1.35g/L/h의 생산성인 고효율로 숙신산을 유청으로부터 생산할 수 있다. 또한, 유청을 배양원료로 이용하기 위해서는 한외여과 또는 가수분해 등의 전처리 과정이 필요하였으나, 본 발명에서는 이를 거치지 않고 바로 배양원료로 이용할 수 있어, 생산 공정상 원가절감에도 기여할 수가 있으며, 유청은 현재 일부분이 사료 등으로 재사용되고 나머지는 버리게 되어 환경문제를 야기하는 바, 본 발명은 이러한 유청을 이용하여 현재 대부분 화학공정에 의해 생산되는 숙신산을 생산할 수 있기 때문에 더욱 그 가치가 높다고 할 수 있다.As described and demonstrated in detail above, the present invention provides a method for producing succinic acid in high yield using whey which is a by-product and waste of the dairy industry through batch or continuous culture. According to the production method of succinic acid using whey of the present invention, in the case of continuous culture, succinic acid can be produced from whey with a high yield of 93% yield and a productivity of 1.35 g / L / h. In addition, in order to use whey as a culture raw material, a pretreatment process such as ultrafiltration or hydrolysis was required, but in the present invention, it can be used as a culture raw material without going through it, thus contributing to cost reduction in the production process. Some parts are reused as feed and others are discarded, causing environmental problems. The present invention is more valuable because it can produce succinic acid produced by most chemical processes.
Claims (9)
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019990012852A KR100301960B1 (en) | 1999-04-12 | 1999-04-12 | Method for Manufacturing Succinic Acid from Whey |
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|---|---|
| KR20000066030A KR20000066030A (en) | 2000-11-15 |
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| KR (1) | KR100301960B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101539422B1 (en) * | 2013-11-26 | 2015-07-24 | 롯데케미칼 주식회사 | Method of producing succinic acid using splitting inoculation |
-
1999
- 1999-04-12 KR KR1019990012852A patent/KR100301960B1/en not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101539422B1 (en) * | 2013-11-26 | 2015-07-24 | 롯데케미칼 주식회사 | Method of producing succinic acid using splitting inoculation |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20000066030A (en) | 2000-11-15 |
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